CN114460219A - 分离病毒载体的方法 - Google Patents
分离病毒载体的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114460219A CN114460219A CN202111288038.XA CN202111288038A CN114460219A CN 114460219 A CN114460219 A CN 114460219A CN 202111288038 A CN202111288038 A CN 202111288038A CN 114460219 A CN114460219 A CN 114460219A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- buffer solution
- genetic material
- viral vector
- buffer
- targeted genetic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 title claims abstract description 115
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 174
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 126
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 123
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims abstract description 40
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims abstract description 37
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 claims description 31
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 15
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 13
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 claims description 13
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 8
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 6
- 238000000569 multi-angle light scattering Methods 0.000 claims description 6
- 238000005086 pumping Methods 0.000 claims description 5
- MPMBRWOOISTHJV-UHFFFAOYSA-N but-1-enylbenzene Chemical compound CCC=CC1=CC=CC=C1 MPMBRWOOISTHJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 26
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 21
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 19
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 10
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 10
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 8
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 7
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000007872 degassing Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N carbonic acid Chemical class OC(O)=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000000105 evaporative light scattering detection Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000004186 food analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002102 nanobead Substances 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000012609 strong anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 150000003512 tertiary amines Chemical group 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/96—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation using ion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/10—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features
- B01D15/16—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by constructional or operational features relating to the conditioning of the fluid carrier
- B01D15/166—Fluid composition conditioning, e.g. gradient
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/26—Conditioning of the fluid carrier; Flow patterns
- G01N30/28—Control of physical parameters of the fluid carrier
- G01N30/34—Control of physical parameters of the fluid carrier of fluid composition, e.g. gradient
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14151—Methods of production or purification of viral material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
- G01N2030/8809—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample
- G01N2030/8813—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86 analysis specially adapted for the sample biological materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种分离含有病毒载体的液体样品的方法包含使所述液体样品流到阴离子交换柱中。第一病毒载体含有靶向遗传物质,并且第二病毒载体基本上不含遗传物质或含有非靶向遗传物质,其中所述靶向遗传物质不同于所述非靶向遗传物质。可以使流动相流到所述阴离子交换柱中,其中所述流动相包含缓冲溶液A和缓冲溶液B。所述缓冲溶液A和B两者均包含挥发性缓冲盐。可以将所述第一病毒载体和所述第二病毒载体分离,使得所述第一病毒载体和所述第二病毒载体在不同时间从所述阴离子交换柱洗脱,并且然后可以检测所述第一病毒载体和所述第二病毒载体。
Description
背景技术
离子交换色谱(IEC)是用于带电分子的化学分析和分离的广泛使用的分析技术。IEC涉及一种或多种分析物物种与样品中存在的其它基质组分的分离。分析物通常是离子的,使得其可以与固定相发生离子相互作用。在IEC中,用在理想情况下将以不同的亲和力水平与分析物和基质组分相互作用的离子部分使固定相衍生化。当使用盐梯度洗脱时,洗脱液渗透通过固定相并且与分析物和基质组分竞争与离子部分相互作用。当使用pH梯度洗脱时,洗脱液的pH会改变分析物的电荷,并且进而改变分析物与固定相的结合。为了参考,洗脱液是用于描述泵入到色谱柱入口的液体溶液或缓冲溶液的术语。在洗脱过程期间,分析物和基质组分将随着时间的变化从固定相洗脱并且然后在检测器处随后对分析物和基质组分进行检测。一些典型检测器的实例是电导率检测器、UV-VIS分光光度计和质谱仪。多年来,IEC已经发展成强大的分析工具,其可用于创造更健康、更清洁且更安全的环境,在所述环境中可以对复杂的样品混合物进行分离和分析以用于各个行业,如水质、环境监测、食品分析、制药以及生物技术。
使用病毒载体的基因疗法是迅速崛起的领域,有许多治疗方法正在开发中,并且几项最近获得了FDA批准。重组病毒载体可以用于封装基因组材料并将其递送到患者的细胞中以治疗疾病。理想情况下,最终产物由病毒载体颗粒组成,所述病毒载体和颗粒均含有治疗性遗传物质。然而,由于包装效率低或在加工和储存期间基因组材料会排出,因此病毒载体并不总是含有所期望的遗传物质(例如,DNA分子)。这些空病毒颗粒竞争相同的细胞受体,但不具有治疗功能。申请人认为,需要开发一种可以表征一批病毒载体,以确定与不含有靶向遗传物质或含有非靶向遗传物质的载体(例如,错误的遗传物质或靶向遗传物质的截断版本)相比含有遗传物质的载体的产率的方法。进一步地,申请人认为需要开发一种用于用与质谱兼容的工作流表征一批病毒载体的方法。
发明内容
在第一方面中,一种分离含有病毒载体的液体样品的方法包含使所述液体样品流到阴离子交换柱中。所述病毒载体包含第一病毒载体和第二病毒载体。所述第一病毒载体含有靶向遗传物质。所述第二病毒载体i)基本上不含遗传物质或ii)含有非靶向遗传物质。所述靶向遗传物质不同于所述非靶向遗传物质。可以使流动相流到所述阴离子交换柱中,其中所述流动相包含第一缓冲溶液A和第二缓冲溶液B的混合物。所述第一缓冲溶液A包含碳酸氢铵和氢氧化铵。所述第二缓冲溶液B包含乙酸和甲酸。将所述第一病毒载体和所述第二病毒载体分离,使得所述第一病毒载体和所述第二病毒载体在不同时间从所述阴离子交换柱洗脱。用检测器检测所述第一病毒载体和所述第二病毒载体。
关于第一方面中的任何方面,所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B各自不包含溶解在液体中的非挥发性缓冲盐。
关于第一方面中的任何方面,所述使所述流动相流到所述阴离子交换柱中包含从第一储存器泵出所述第一缓冲溶液A,其中所述第一缓冲溶液A具有第一pH值。可以从第二储存器泵出所述第二缓冲溶液B,其中所述第二缓冲溶液B具有第二pH值,并且所述第一pH和所述第二pH不同。可以将所泵出的第一缓冲溶液A和所泵出的第二缓冲溶液B合并以形成所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B的混合物,之后将所述混合物输入到阴离子交换柱中。可以随时间的变化针对所合并溶液改变所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B的比例。
关于第一方面中的任何方面,所述将所述所泵出的第一缓冲溶液A和所述所泵出的第二缓冲溶液B合并包含:在使所述所泵出的第一缓冲溶液A和所述所泵出的第二缓冲溶液B流到所述阴离子交换柱之前,在混合器中混合所述所泵出的第一缓冲溶液A和所述所泵出的第二缓冲溶液B。
在一种分离含有病毒载体的液体样品的方法的第二方面,所述方法包含使所述液体样品流到阴离子交换柱中。所述病毒载体包含第一病毒载体和第二病毒载体。所述第一病毒载体含有靶向遗传物质。所述第二病毒载体i)基本上不含遗传物质或ii)含有非靶向遗传物质,其中所述靶向遗传物质不同于所述非靶向遗传物质。可以使流动相流到所述阴离子交换柱中,其中所述使所述流动相流动进一步包含从第一储存器泵出所述第一缓冲溶液A。所述第一缓冲溶液A包含碳酸氢铵。可以从第二储存器泵出所述第二缓冲溶液B,其中所述第二缓冲溶液B包含氢氧化铵。可以从第三储存器泵出第三缓冲溶液C,其中所述第三缓冲溶液C包含乙酸。来自第四储存器的第四缓冲溶液D,其中所述第三缓冲溶液D包含甲酸。可以将所泵出的第一缓冲溶液A、所泵出的第二缓冲溶液B、所泵出的第三缓冲溶液C、所泵出的第四缓冲溶液D合并以形成混合物,之后将所述混合物输入到所述阴离子交换柱中。可以随时间的变化控制所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D中的每种缓冲溶液的比例。可以将所述第一病毒载体和所述第二病毒载体分离,使得所述第一病毒载体和所述第二病毒载体在不同时间从所述阴离子交换柱洗脱。可以用检测器检测所述第一病毒载体和所述第二病毒载体。
关于第二方面中的任何方面,所述控制所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D中的每种缓冲溶液的所述比例可以随时间的变化进行控制以形成pH梯度。
关于第二方面中的任何方面,所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D各自不包含溶解在液体中的非挥发性缓冲盐。
关于第二方面中的任何方面,所述将所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D合并包含:在使所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D流到所述阴离子交换柱中之前,在混合器中混合所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D。
在一种分离含有病毒载体的液体样品的方法的第三方面,所述方法包含使所述液体样品流到阴离子交换柱中。所述病毒载体包含第一病毒载体和第二病毒载体。所述第一病毒载体含有靶向遗传物质。所述第二病毒载体i)基本上不含遗传物质或ii)含有非靶向遗传物质,其中所述靶向遗传物质不同于所述非靶向遗传物质。可以使流动相流到所述阴离子交换柱中,其中所述使所述流动相流动进一步包含从第一储存器泵出所述第一缓冲溶液A。可以从溶液B从第二储存器泵出第二缓冲液。可以从第三储存器泵出第三缓冲溶液C。可以将所泵出的第一缓冲溶液A、所泵出的第二缓冲溶液B和所泵出的第三缓冲溶液C合并以形成混合物,之后将所述混合物输入到所述阴离子交换柱中。可以随时间的变化控制所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C中的每种缓冲溶液的比例。所述第一缓冲溶液A含有选自由碳酸氢铵、氢氧化铵、甲酸和乙酸组成的组的缓冲组分。所述第二缓冲溶液B含有选自由碳酸氢铵、氢氧化铵、甲酸和乙酸组成的组的缓冲组分。所述第一缓冲溶液A具有与所述第二缓冲溶液B不同的缓冲组分。所述第三缓冲溶液C含有选自由碳酸氢铵、氢氧化铵、甲酸和乙酸组成的组的两种缓冲组分。所述第三缓冲溶液C具有与所述第二缓冲溶液B和所述第一缓冲溶液A不同的缓冲组分。可以将所述第一病毒载体和所述第二病毒载体分离,使得所述第一病毒载体和所述第二病毒载体在不同时间从所述阴离子交换柱洗脱。可以用检测器检测所述第一病毒载体和所述第二病毒载体。
关于第三方面中的任何方面,所述控制所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C中的每种缓冲溶液的所述比例可以随时间的变化进行控制以形成pH梯度。
关于第三方面中的任何方面,所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C各自不包含溶解在液体中的非挥发性缓冲盐。
关于第三方面中的任何方面,所述将所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C合并包含:在使所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C溶液流到所述阴离子交换柱中之前,在混合器中混合所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C。
关于各方面中的任何方面,所述第一病毒载体包含被配置成含有所述靶向遗传物质的第一衣壳,并且所述第一衣壳含有所述靶向遗传物质。所述第二病毒载体包含被配置成含有所述靶向遗传物质的第二衣壳,并且所述第二衣壳i)基本上不含遗传物质或ii)含有所述非靶向遗传物质。
关于各方面中的任何方面,所述靶向遗传物质的至少一部分不同于所述非靶向遗传物质。例如,所述非靶向遗传物质上不存在所述靶向遗传物质上的核苷酸序列。所述靶向遗传物质可以具有预定核苷酸序列或者是使宿主具有所述宿主应掺入所述靶向遗传物质的所期望的性质的特定基因。所述非靶向遗传物质可以具有与所述靶向遗传物质不同的核苷酸序列,并且将不会使所述宿主表达所述宿主应掺入所述靶向遗传物质的所期望的性质。
关于各方面中的任何方面,与所述靶向遗传物质相比,所述非靶向遗传物质可以对应于截短的核苷酸序列。所述非靶向遗传物质可以具有由截短过程引起的所述靶向遗传物质的核苷酸序列的子集。
关于各方面中的任何方面,所述第一载体具有第一pI,并且所述第二载体具有第二pI,其中所述第一pI和所述第二pI不同。所述第一载体和所述第二载体各自包括具有基本上相同的一级蛋白质结构的蛋白质壳体。
关于第一方面中的任何方面,所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B各自仅由溶解在液体中的挥发性缓冲盐组成。所述挥发性缓冲盐被配置成在一个大气压下在18℃到120℃的温度范围下形成气体。
关于第二方面中的任何方面,所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B、所述第三缓冲溶液C和所述第四缓冲溶液D各自仅由溶解在液体中的挥发性缓冲盐组成。所述挥发性缓冲盐被配置成在一个大气压下在18℃到120℃的温度范围下形成气体。
关于第三方面中的任何方面,所述第一缓冲溶液A、所述第二缓冲溶液B和所述第三缓冲溶液C各自仅由溶解在液体中的挥发性缓冲盐组成。所述挥发性缓冲盐被配置成在一个大气压下在18℃到120℃的温度范围下形成气体。
关于各方面中的任何方面,所述检测器选自由以下组成的组:质谱仪、荧光检测器、紫外可见光分光光度计、多角度光散射分光光度计和其组合。
关于各方面中的任何方面,所述阴离子交换柱包含基材,所述基材包含乙基乙烯基苯和二乙烯基苯的交联共聚物。由中性亲水聚合物构成的涂层可以在所述基材上。接枝季铵基团可以连接到所述涂层。
附图说明
并入本文并构成本说明书的一部分的附图展示了本发明的目前优选的实施例,并且与上文给出的一般描述和下文给出的详细描述一起用于解释本发明的特征(其中相似的数字表示相似的元件)。
图1展示了被配置成用至多四个不同的流动相储存器执行梯度洗脱的色谱系统的示意图。
图2A展示了含有缓冲组分A的第一密封容器和含有缓冲组分B的第二密封容器。
图2B展示了含有第一缓冲溶液A的第一容器和含有第二缓冲溶液B的第二容器。
图3展示了用于用阴离子交换色谱柱分析AAV8样品的色谱图,所述AAV8样品含有第一类型的衣壳和第二类型的衣壳,所述第一类型的衣壳含有遗传物质,所述第二类型的衣壳不含遗传物质。一条迹线监测260nm下的流出物,并且另一条迹线监测280nm下的流出物。
图4展示了用于用阴离子交换色谱柱分析两个AAV9样品的两个色谱图,其中一个样品具有填充有遗传物质的衣壳,并且另一个样品具有空的衣壳。
具体实施方式
应参考附图来阅读以下具体实施方式,其中不同附图中的相同元件编号相同。不一定按比例绘制的附图描绘了所选实施例并且不旨在限制本发明的范围。具体实施方式以实例的方式而不以限制的方式来说明本发明的原理。本说明书将清楚地使本领域的技术人员能够制成和使用本发明,并且描述了本发明的若干实施例、修改、变化、替代方案以及用途,包括目前被认为是实施本发明的最佳模式的内容。如本文所使用,用于任何数值或范围的术语“约”或“大致”指示合适的尺寸公差,所述尺寸公差允许组分的部分或集合出于如本文所描述的预期目的而起作用。
用于阴离子交换(AEX)分离的挥发性pH梯度流动相系统被描述为用于将完整病毒载体和空病毒载体分离。分离之后,质谱(MS)检测器可以检测分离的病毒载体,并且提供与如吸光或荧光检测器等其它检测器相比增强的信息。例如,与吸光或荧光检测器不同,MS提供质量数据并且能够生成碎片数据以供结构洞察。然而,MS相容性缓冲液通常需要缓冲组分是挥发性的,使得MS的电离模块不会被堵塞或污染。缓冲组分包含对pH变化,尤其是在帮助使pH保持在pKa值的正负一个pH单位内方面的pH变化有抗性的物质(有时被称为盐)。缓冲组分通常是弱酸或弱碱。弱酸和弱碱各自在溶解在水中时不完全电离。弱酸的pH常介于3与6之间。弱碱的pH通常介于7与10之间。
在一个实例中,描述了一种用于使用pH梯度将空病毒颗粒与完整病毒颗粒分离并且表征空病毒颗粒和完整病毒颗粒的方法。可以使用盐梯度来部分地将空病毒颗粒和完整病毒颗粒分离。然而,盐梯度方法通常使用相对高的盐浓度,并且不允许使用MS来分析这些载体以帮助表征病毒颗粒。如本文所述,利用质谱相容性组分(即,挥发性缓冲盐)产生pH梯度的流动相系统可以允许将空病毒颗粒与完整病毒颗粒分离并且随后通MS表征。
在另一个实例中,MS检测器可以提供整个病毒颗粒的准确质量数据。挥发性缓冲系统可以提供范围为9.2到2.5的pH范围,以洗脱阴离子交换柱上的病毒颗粒。挥发性缓冲液系统可以具有相对低的总缓冲液浓度(例如,流动相A和B一起),例如范围为约10mM到约150mM,优选地范围为约10mM到约100mM,并且更优选地范围为20mM到100mM。即使当使用挥发性缓冲盐时,也期望使用相对低的总缓冲液浓度以降低堵塞或污染MS系统的风险。可以具有20mM碳酸氢铵和15mM氢氧化铵的流动相A的总缓冲液浓度为55mM(35mM铵离子+20mM碳酸氢根离子)。在计算总缓冲液浓度时,氢氧化物不计为缓冲组分。可以具有30mM乙酸和15mM甲酸的流动相B的总缓冲液浓度为45mM(30mM乙酸+15mM甲酸)。当在分离期间将流动相A和B混合在一起时,总缓冲液浓度(例如,A和B两者)可以低于100mM,以帮助维持MS的灵敏度。此流动相系统不限于MS检测,并且可以与UV和荧光检测器组合使用。
用遗传物质填充空病毒载体的过程可能使病毒颗粒的蛋白质壳体发生构象变化,从而揭示蛋白质壳体的表面处的改变pI的新离子位点。为了参考,遗传物质可以包含基因、DNA、RNA、寡核苷酸、包含经修饰的核苷酸的DNA/RNA以及包含核苷酸类似物的DNA/RNA。如此,空瓶颗粒的pI将与填充有遗传物质的病毒颗粒的pI不同。pI的差异可以使空病毒颗粒和填充病毒颗粒以不同的保留时间从阴离子交换柱洗脱。本文所述的方法在相对短的柱(例如,50mm长度圆柱体)上使用pH梯度,并且允许在空病毒颗粒的比例方面对样品进行表征。已发现本文所述的pH梯度分离的色谱解析通常优于MS不相容的盐梯度洗脱方法(利用非挥发性缓冲盐)。可以使用260/280nm处的UV吸光度比率来实现对完整颗粒和空颗粒的检测,其中由于掺入的遗传物质,完整颗粒在260nm处的吸光度更高。分析可以很快,并且使用10分钟以下的短梯度来完成。可替代地,可以使用荧光检测器来实现更高的灵敏度,并且避免使用280nm的UV吸收测量结果中看到的蛋白质信号干扰遗传物质信号。
在一个实例中,可以将完整病毒颗粒和空病毒颗粒从色谱柱直接引入到MS中。由在线MS分析产生的信息还可以提供除了通过UV或荧光检测提供的完整衣壳和空衣壳的比率之外的添加的信息。
除了完整病毒颗粒和空病毒颗粒之外,第一病毒载体可以含有靶向遗传物质,并且第二病毒载体可以含有非靶向遗传物质。病毒载体可以是源自腺相关病毒血清型的AAV载体。靶向遗传物质可以是具有可以在被病毒载体感染之后转移到宿主中的期望的性质的预定基因。非靶向材料不同于靶向遗传物质,并且在一些情况下,可以是靶向遗传物质的截短版本(例如,去除了一部分的靶向遗传物质)。例如,非靶向材料可以具有相比于靶向材料不同的核苷酸序列(DNA或RNA),其中非靶向材料不会导致在宿主中表达期望的性质。第一病毒载体的pI可以与第二病毒载体不同,因为非靶向遗传物质导致蛋白质壳体的构象变化不同。基于不同的pI值,可以用离子交换柱对第一病毒载体和第二病毒载体进行分离。值得注意的是,关于病毒载体的术语“第一”和“第二”仅供参考使用,并且不一定提供其从色谱柱洗脱的洗脱次序。
下面将描述提供pH梯度的缓冲液试剂盒。pH梯度表示基于时间的变化在至少约pH9到约pH 3的pH范围内改变pH值。申请人相信,利用离子交换色谱的pH梯度将提供用于表征如病毒载体等蛋白质的改进方法。
例如,缓冲液试剂盒可以包含缓冲溶液A和缓冲溶液B。请注意,洗脱液溶液、缓冲溶液、所合并缓冲溶液或流动相可以是用于从离子交换固定相洗脱样品的溶液。可以将缓冲溶液A和B(102A和102B)包装到如图2B所示的相应液体容器或小瓶中。为了减轻运输重量并提高长期稳定性,可以将缓冲溶液A的缓冲组分和缓冲溶液B的缓冲组分以浓缩形式包装在如图2A所示的具有可移除盖的密封小瓶中。在缓冲组分是挥发性的情况下,在将其储存在密封容器中时稳定性会提高。一旦测试开始,就可以通过向浓缩缓冲组分容器A和浓缩缓冲组分容器B添加预定量的水来每天或定期制备新鲜缓冲溶液A和B。应当注意,本文所述的缓冲液试剂盒不应限于仅两种缓冲溶液,并且缓冲液试剂盒可以使用另外类型的液体、溶液或其它缓冲溶液实施。例如,容器C和D可以在容器C可以含有水并且容器D可以含有另一种挥发性缓冲盐或有机溶剂的情况下使用。
关于第一缓冲溶液A,其可以包含溶解在液体中的至少两种缓冲盐。第一缓冲溶液A中的所有缓冲盐都是挥发性的,使得其在约一个大气压(例如,101.325kPa或14.7psi的+/-10%)下在约25℃到约120℃的温度范围以及优选地在约一个大气压下在约25℃到约120℃的范围内形成气体,这对应于使用大气压电喷雾将液体样品输入到MS中的典型条件。当缓冲溶液与MS一起使用时,缓冲液通常使用挥发性缓冲盐,使得残留物或盐不会堵塞电离针、输入端口或通常不会污染MS的电离模块。缓冲溶液A可以包含碳酸氢铵和氢氧化铵。缓冲溶液B可以包含乙酸或甲酸。
第一缓冲溶液A的第一pH的范围可以为约8到约10,并且总缓冲盐浓度的范围为约5毫摩尔到约100毫摩尔并且优选地范围为约20毫摩尔到约60毫摩尔。第二缓冲溶液B的第二pH的范围可以为约1.8到约3.8,并且总缓冲盐浓度的范围为约5毫摩尔到约100毫摩尔并且优选地范围为约20毫摩尔到约60毫摩尔。第一缓冲溶液A和第二缓冲溶液B的缓冲盐浓度可以选择为使得缓冲容量大于含有病毒载体的样品和阴离子交换色谱柱两者。第一缓冲溶液A的缓冲盐浓度值的实例是20mM碳酸氢铵和15mM氢氧化铵,并且第二缓冲溶液B的缓冲盐浓度值的实例是30mM乙酸和15mM甲酸。
第一缓冲溶液A可以与第二缓冲溶液B混合以产生不断降低的pH梯度。第一缓冲溶液的第一pH可以大于第二缓冲溶液的第二pH。第一缓冲溶液A可以包含作为第一缓冲盐的碳酸氢铵和作为第二缓冲盐的氢氧化铵。9.2的铵pKa,并且碳酸氢盐的pKa为6.1。第二缓冲溶液B可以包含作为第三缓冲盐的乙酸和作为第四缓冲盐的甲酸。乙酸的pKa为4.8,并且甲酸的pKa为3.8。应当注意的是,除非明确指出处于不同温度下,否则本文所述的所有pKa值均是相对于25℃陈述的。
现在已经描述了缓冲液试剂盒,下面将描述用于与缓冲液试剂盒一起使用的色谱系统,所述色谱系统可以产生用于分离病毒载体的pH梯度。图1展示了被配置成用至多四个不同的流动相类型执行等度洗脱或梯度洗脱的色谱系统100的示意图。色谱系统100可以包含四个流动相储存器(102A、102B、102C、102D)、任选的脱气组合件104、洗脱液比例阀组合件106、管组合件108、泵110、压力换能器112、梯度混合器114、注入阀116、色谱柱118、检测器120、另一检测器140和微处理器122。
泵110可以被配置成通过系统100从一个或多个储存器泵出液体。所泵出的液体可以流过任选的脱气组合件104,并且然后流到洗脱液比例阀组合件106。可以使用洗脱液比例阀组合件106从四个流动相储存器(102A、102B、102C、102D)中的每个流动相储存器提取预定比例的液体,并且将其传输到管组合件108,并且然后传输到泵110。例如,可以分别使用缓冲溶液A和缓冲溶液B的流动相储存器102A和102B以进行梯度洗脱,而不使用流动相储存器102C和102D。泵110包含初级泵头110A和次级泵头110B。洗脱液比例阀组合件106可以引导泵110在四个流动相储存器之一上进行抽取持续预定的时间段,并且然后切换到另一个流动相储存器。通常,泵在活塞循环期间将抽取至少一次所选流动相类型中的每个流动相类型,以形成多个邻接的溶剂体积。例如,四个流动相储存器(102A,102B,102C,102D)可以用于pH梯度洗脱。这将最初形成含有液体体积A、液体体积B、液体体积C和液体体积D的异质溶剂体积(未混合的)。请注意,溶剂体积A、B、C或D可以被称为液体塞,所述液体塞流过导管,使得在这四个塞之间不存在完全均质化。溶剂体积A、B、C或D可以是邻接关系和连续关系。溶剂体积A、B、C或D的比例取决于其中洗脱液比例阀组合件106在特定储存器上进行抽取的定时。异质溶剂体积从泵110输出,并且对应于来自一个泵循环的所输出溶剂。在泵110之后,可以在梯度混合器114中混合异质溶剂体积。注意,溶剂体积A和B的比例可以随时间的变化而变化以形成pH梯度洗脱,并且不使用溶剂储存器C和D。尽管泵110被示出为被配置成呈低压梯度格式的三元泵,但所述泵也可以是被配置成呈高压梯度格式的二元泵。
泵110的输出连续地流到压力换能器112、混合装置114、注入阀116、色谱柱118、检测器120,并且然后流到检测器140。压力换能器112可以用于测量由泵110泵出的流动相的系统压力。注入阀116可以用于将样品的等分试样注入到洗脱液流中。色谱柱118可以用于将存在于液体样品中的各种基质组分与兴趣分析物分离。色谱柱118的输出可以流体地连接到检测器120,并且然后流体地连接到另一传感器140。检测器120和140可以呈用于随时间的变化监测预定波长下的入射光的吸光度的紫外可见光分光光度计(UV)、荧光检测器(FLD)、蒸发光散射检测器、多角光散射检测器(MALS)、质谱仪和其组合的形式。MALS是用于测量由化合物散射到多个角度的光的技术。MALS可以通过检测化合物如何散射光来确定溶液中的分子的摩尔质量和平均大小。
例如,可以在如紫外可见光分光光度计或荧光检测器等上游检测器120中使用非破坏性检测器,以标识完整衣壳或空衣壳。接下来,可以将样品输入到另一检测器140中(检测器120的下游),所述另一检测器可以是用于进一步表征样品的破坏性检测器,如MS。
色谱柱118可以分离在不同保留时间下输出的样品的一种或多种分析物。例如,色谱柱118可以呈阴离子交换柱的形式(具有弱或强阴离子交换位点)。柱内的树脂可以包含基材、基材上的涂层和连接到涂层的接枝阴离子交换基团。基材可以是乙基乙烯基苯和二乙烯基苯的交联共聚物。涂层可以是基材表面上的中性亲水聚合物。接枝阴离子交换基团可以是连接到涂层的季铵基团(或叔胺基团)。可以适用于本文所述的方法的市售阴离子交换柱是Thermo ScientificTM ProPacTM SAX柱(强阴离子交换,粒度为10微米)、ThermoScientificTM DNAPacTM PA100柱、Thermo ScientificTM DNAPacTM PA200柱(具有季铵官能化纳米珠的无孔基材颗粒)、DionexTM IonpacTM AS32-Fast柱(与具有烷醇季铵基团的二乙烯基苯交联的超大孔乙基乙烯基苯聚合物)、Thermo ScientificTM ProSwiftTM SAX-1S柱、Thermo ScientificTM DNASwiftTM SAX-1S寡核苷酸柱、YMC BioProTM IEX QA柱(具有季铵基团的亲水性多孔聚合物珠)、YMC BioProTM IEX QF柱(具有季铵基团的亲水性无孔聚合物珠)和Waters Protein-Pak Hi Res Q(无孔聚甲基丙烯酸酯颗粒基材)。
微处理器122可以包含存储器部分,并且可以用于控制色谱系统100的操作。微处理器122可以集成到色谱系统100中,或者可以是发送用于与色谱系统100通信的信号的个人计算机的一部分。微处理器122可以被配置成与色谱系统的一个或多个组件,如泵110、洗脱液比例阀106、注入阀116以及检测器120和140通信并且对其进行控制。存储器部分可以包含关于如何控制泵110、洗脱液比例阀106、注入阀116以及检测器120和140的软件或固件指令。
既然已经描述了色谱系统,下面将描述分离含有病毒载体的液体样品的方法。所述液体样品可以是从同一制造批次的病毒载体获得的液体等分试样。所述病毒载体可以呈具有特定遗传物质的病毒的形式,其可以高效地将特定遗传物质转运到被病毒感染的细胞中。例如,受感染的细胞可以合并来自病毒的遗传物质,并在某些情况下使受感染的细胞对特定疾病的免疫力提高。
例如,液体样品将含有病毒载体,其中每个病毒载体都含有靶向遗传物质的副本。然而,在实践中,有一定比例的病毒载体是空的而不包含遗传物质。基本上不含遗传物质的病毒载体可以具有无法使用检测器测量的量的遗传物质。可替代地,病毒载体可以具有截短的遗传物质或不是靶向遗传物质的不同遗传物质。
在利用注入阀116将液体样品注入到阴离子交换色谱柱118中之后,可以继续用泵110泵出流动相,并且使流动相流到阴离子交换柱118中以用于洗脱样品组分。流动相可以包含随时间的变化比例不同的缓冲溶液A和缓冲溶液B。缓冲溶液A可以在含有碳酸氢铵和氢氧化铵的洗脱液储存器102A中。缓冲溶液A的pH值的范围可以为8到10,优选地为9。对于缓冲溶液A,碳酸氢铵浓度的范围可以为5到50mM,并且氢氧化铵浓度的范围可以为5到50mM。缓冲溶液B可以在含有乙酸和甲酸的洗脱液储存器102B中。缓冲溶液B的pH值的范围可以为1.8到3.8,优选地为2.8。对于缓冲溶液B,乙酸浓度的范围可以为5到50mM,并且甲酸浓度的范围可以为5到50mM。可以通过使用洗脱液比例阀组合件106随时间的变化而改变缓冲溶液A和缓冲溶液B的比例。
例如,缓冲溶液A和缓冲溶液B各自仅由溶解在液体中的挥发性缓冲盐组成。挥发性缓冲盐在约一个大气压下在25℃到120℃的温度范围下形成气体。挥发性缓冲盐的使用使所述挥发性缓冲盐在用发射器柱(emitter column)对缓冲溶液进行喷雾时进入气相以形成带电气体离子。缓冲溶液A和缓冲溶液B各自不包含溶解在液体中的非挥发性缓冲盐。如果用发射器柱进行喷雾的非挥发性缓冲盐,则所述非挥发性缓冲盐可能形成堵塞和/或干扰电喷雾电离过程的残留物。另外,在流动装置中使用非挥发性缓冲盐导致当与液相色谱柱的流出物连合时需要更频繁地清洁MS。
随着液体样品流过阴离子交换色谱柱,含有遗传物质的第一病毒载体与空的或含有基本上不含遗传物质的第二病毒载体分离。这使第一病毒载体和第二病毒载体在不同时间从阴离子交换柱洗脱。第一病毒载体和第二病毒载体两者均包含蛋白质壳体,所述蛋白质壳体可以被称为衣壳。第一病毒载体可以包含被配置成含有遗传物质的第一衣壳,并且所述第一衣壳基本上不含遗传物质。第二病毒载体可以包含被配置成含有遗传物质的第二衣壳,并且所述第二衣壳含有遗传物质。第一载体和第二载体的蛋白质壳体可以是基本上相同的,其中一级蛋白质结构至少95%相同,并且优选地至少99%相同。
申请人相信,掺入遗传物质导致相对于不含有遗传物质的第二载体至少第一载体的表面电荷发生变化。可替代地,可能的是掺入遗传物质导致相对于不含有遗传物质的第二载体,对第一载体的固定相的可及性发生变化。表面电荷的此变化使第一病毒载体和第二病毒载体对阴离子交换色谱柱的亲和力不同,并且使第一病毒载体和第二病毒载体以不同保留时间从柱洗脱。另外,据信相对于不含有遗传物质的第二载体,掺入遗传物质已导致第一载体的pI发生变化。pI的此变化使第一病毒载体和第二病毒载体以不同保留时间从柱洗脱。例如,第一病毒载体与第二病毒载体之间的pI的差异的范围可以为0.1到0.5,足以提供足够的分辨率来将两个病毒载体彼此分离。在某些情况下,pI的差异可以多于0.5。
除了空载体相比于完整载体之外,申请人认为相比于将不同的非靶向遗传物质并入到第二衣壳中,将靶向遗传物质并入到第一衣壳中可能导致相对于第一载体至少第二载体的表面电荷发生变化。另外,可能的是掺入非靶向遗传物质导致相对于不含有靶向遗传物质的第一载体,对第二载体的固定相的可及性发生变化。所述靶向遗传物质不同于所述非靶向遗传物质。表面电荷的此变化可能使第一病毒载体和第二病毒载体对阴离子交换色谱柱的亲和力不同,并且使第一病毒载体和第二病毒载体以不同保留时间从柱洗脱。另外,据信相对于不含有靶向遗传物质的第一载体,掺入非靶向遗传物质已导致第二载体的pI发生变化。pI的此变化使第一病毒载体和第二病毒载体以不同保留时间从柱洗脱。例如,第一病毒载体与第二病毒载体之间的pI的差异的范围可以为0.1到0.5,足以提供足够的分辨率来将两个病毒载体彼此分离。在某些情况下,pI的差异可以多于0.5。
在将第一病毒载体和第二病毒载体分离后,其可以从柱洗脱,并且然后用第一检测器120检测。通常,第一检测器120是非破坏性检测器,如UV-VIS或FLD。在第一检测器120之后,第一病毒载体和第二病毒载体然后可以朝另一检测器140流动。例如,第一病毒载体和第二病毒载体可以作为完整蛋白质朝另一检测器140流动。以此方式,可以用具有天然状态的蛋白质的MS表征病毒载体。
实例1
以下将描述色谱系统100(德国盖默灵(Germering,Germany)的ThermoScientific Ultimate 300 BioRS)类似于图1的设置。泵110是HPLC泵(德国盖默灵赛默飞科技公司的LPG-3400RS),其被设置为流速为1.75mL/分钟并且压力为2600PSI。将注入阀116(德国盖默灵赛默飞科技公司的WPS-3000TBRS)配置为具有20微升样品环。色谱分离装置118(来自美国加利福尼亚州森尼维尔市Thermo Scientific Dionex的ProPac SAX-10,10μm,4×50mm)是适用于分离蛋白质的强阴离子交换柱。强阴离子交换树脂的粒径为10微米,并且所述柱的径为4mm且长度为50mm。色谱系统100被配置成将色谱分离装置118加热到30℃。检测器120(德国盖默灵赛默飞科技公司DAD-3000RS)呈UV-VIS分光光度计的形式并被设置成波长为260纳米和280纳米,或者检测器120呈荧光检测器(德国盖默灵赛默飞科技公司5078.0020)的形式并且被设置成吸光度波长为280nm且发射波长为330nm。
缓冲溶液A被制备成在pH 9.1下具有以下浓度20mM碳酸氢铵和15mM氢氧化铵。缓冲溶液B被制备成在pH 2.8下具有30mM乙酸和15mM甲酸。
泵110被配置成使用一定比例的缓冲溶液A和缓冲溶液B提供梯度流动相。所述梯度被配置成提供表1中示出的以下参数。
表1.
时间(分钟) | A% | B% |
0 | 80 | 20 |
0.5 | 80 | 20 |
15.5 | 30 | 70 |
15.5 | 0 | 100 |
16 | 0 | 100 |
16 | 80 | 20 |
30 | 80 | 20 |
图3是含有完整病毒载体和空病毒载体的混合物的(使用Virovek公司的杆状病毒Sf9昆虫细胞表达系统生成的)AAV8样品的色谱图,其中检测器在260nm和280nm处进行监测。对于两种波长,空病毒载体在约6分钟时洗脱,并且完整病毒载体在约8.5分钟时洗脱。
实例2
以下将描述使用色谱系统100在与实例1中所述的相似的条件下对AAV9病毒载体样品的测试。在此实例中,梯度被配置成提供表2中示出的以下参数。
表1.
时间(分钟) | A% | B% |
0 | 100 | 0 |
0.5 | 100 | 0 |
15.5 | 20 | 80 |
15.5 | 0 | 100 |
16 | 0 | 100 |
16 | 100 | 0 |
30 | 100 | 0 |
在此实例中,注入体积为2微升,并且检测器为FLD(激发280nm/发射330nm)。图4示出了(使用Virovek公司的杆状病毒Sf9昆虫细胞表达系统生成的)两个不同AAV9样品的两个色谱图,其中一个样品主要对应于含有遗传物质的完整病毒载体,并且另一个样品对应于基本上不含遗传物质的空病毒载体。空病毒载体在约11.5分钟时洗脱,并且完整病毒载体在约8.25分钟时洗脱。
尽管已经在本文中显示并且描述了本发明的优选实施例,但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是,此类实施例仅借助于实例而提供。在不脱离本发明的情况下,所属领域的技术人员现在将意识到许多变型、变化和替代物。尽管已经依据特定变化和说明性附图描述了本发明,但是本领域的普通技术人员将认识到,本发明不限于所描述的变化或附图。另外,当上文所描述的方法和步骤指示某些事件以某种顺序发生时,本领域的普通技术人员将认识到,可以修改某些步骤的顺序,并且此类修改是根据本发明的变化进行的。另外,如上文所描述的,在可能的情况下可以在并行过程中同时进行所述步骤中的某些步骤,以及依次进行。因此,在处于本公开的精神内或与权利要求书中所见发明等效的本发明变型所能达到的程度内,这一专利将意图同样涵盖那些变型。
Claims (13)
1.一种分离含有病毒载体的液体样品的方法,所述方法包括:
a)使所述液体样品流到阴离子交换柱中,其中所述病毒载体包括第一病毒载体和第二病毒载体,所述第一病毒载体含有靶向遗传物质,并且
所述第二病毒载体i)基本上不含遗传物质或ii)含有非靶向遗传物质,其中所述靶向遗传物质不同于所述非靶向遗传物质;
b)使流动相流到所述阴离子交换柱中,其中所述流动相包括第一缓冲溶液A和第二缓冲溶液B的混合物,所述第一缓冲溶液A包括碳酸氢铵和氢氧化铵,所述第二缓冲溶液B包括乙酸和甲酸;
c)将所述第一病毒载体和所述第二病毒载体分离,使得所述第一病毒载体和所述第二病毒载体在不同时间从所述阴离子交换柱洗脱;以及
d)用检测器检测所述第一病毒载体和所述第二病毒载体。
2.根据权利要求1所述的方法,
其中所述第一病毒载体包括被配置成含有所述靶向遗传物质的第一衣壳,并且所述第一衣壳含有所述靶向遗传物质;并且
其中所述第二病毒载体包括被配置成含有所述靶向遗传物质的第二衣壳,并且所述第二衣壳i)基本上不含遗传物质或ii)含有所述非靶向遗传物质。
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述靶向遗传物质的至少一部分不同于所述非靶向遗传物质。
4.根据权利要求2所述的方法,其中所述第二衣壳i)基本上不含遗传物质。
5.根据权利要求2所述的方法,其中所述第二衣壳含有ii)所述非靶向遗传物质。
6.根据权利要求3所述的方法,其中与所述靶向遗传物质相比,所述非靶向遗传物质对应于截短的核苷酸序列。
7.根据权利要求2所述的方法,其中所述第一载体具有第一pI,并且所述第二载体具有第二pI,其中所述第一pI和所述第二pI不同,其中所述第一载体和所述第二载体各自包括具有基本上相同的一级蛋白质结构的蛋白质壳体。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B各自仅由溶解在液体中的挥发性缓冲盐组成,其中所述挥发性缓冲盐被配置成在一个大气压下在18℃到120℃的温度范围下形成气体。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B各自不包含溶解在液体中的非挥发性缓冲盐。
10.根据权利要求1所述的方法,其中所述检测器选自由以下组成的组:质谱仪、荧光检测器、紫外可见光分光光度计、多角度光散射分光光度计和其组合。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述阴离子交换柱包括:
基材,所述基材包含乙基乙烯基苯和二乙烯基苯的交联共聚物;
所述基材上由中性亲水聚合物构成的涂层;以及
接枝季铵基团,所述接枝季铵基团连接到所述涂层。
12.根据权利要求1所述的方法,其中所述使所述流动相流到所述阴离子交换柱中包括:
从第一储存器泵出所述第一缓冲溶液A,其中所述第一缓冲溶液A具有第一pH值;
从第二储存器泵出所述第二缓冲溶液B,其中所述第二缓冲溶液B具有第二pH值,其中所述第一pH值和所述第二pH值不同;
将所泵出的第一缓冲溶液A和所泵出的第二缓冲溶液B合并以形成所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B的所述混合物,之后将所述混合物输入到阴离子交换柱中;以及
随时间的变化针对所合并溶液改变所述第一缓冲溶液A和所述第二缓冲溶液B的比例。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述将所述所泵出的第一缓冲溶液A和所述所泵出的第二缓冲溶液B合并包括:
在使所述所泵出的第一缓冲溶液A和所述所泵出的第二缓冲溶液B流到所述阴离子交换柱之前,在混合器中混合所述所泵出的第一缓冲溶液A和所述所泵出的第二缓冲溶液B。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US17/094,522 US11821000B2 (en) | 2020-11-10 | 2020-11-10 | Method of separating viral vectors |
US17/094,522 | 2020-11-10 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN114460219A true CN114460219A (zh) | 2022-05-10 |
Family
ID=78592652
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202111288038.XA Pending CN114460219A (zh) | 2020-11-10 | 2021-11-02 | 分离病毒载体的方法 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11821000B2 (zh) |
EP (1) | EP3995572A1 (zh) |
CN (1) | CN114460219A (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110166213B (zh) * | 2018-02-13 | 2021-04-16 | 展讯通信(上海)有限公司 | 参考信号的发送及接收方法、基站、终端、存储介质、系统 |
Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050042740A1 (en) * | 2003-05-21 | 2005-02-24 | Guang Qu | Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids |
CN103884816A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 戴安公司 | 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法 |
US20140227766A1 (en) * | 2011-06-08 | 2014-08-14 | Agency For Science, Technology And Research | Purification of biological products by constrained cohydration chromatography |
US20140309408A1 (en) * | 2011-08-02 | 2014-10-16 | Life Science Inkubator Betriebs Gmbh & Co. Kg | Method for purifying virus-like particles (vlp) |
CN107988192A (zh) * | 2009-07-31 | 2018-05-04 | 百深有限责任公司 | 用于纯化重组adamts13和其它蛋白质的方法以及其组合物 |
US20180163183A1 (en) * | 2015-02-09 | 2018-06-14 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography |
US20190002844A1 (en) * | 2015-12-11 | 2019-01-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for aav8 |
US20200284771A1 (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-10 | Waters Technologies Corporation | Methods, compositions and kits useful for ion exchange chromatography and mass spectrometry analysis |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2020315580A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-02-10 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Separation and quantification of empty and full viral capsid particles |
-
2020
- 2020-11-10 US US17/094,522 patent/US11821000B2/en active Active
-
2021
- 2021-11-02 CN CN202111288038.XA patent/CN114460219A/zh active Pending
- 2021-11-09 EP EP21207232.6A patent/EP3995572A1/en active Pending
Patent Citations (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050042740A1 (en) * | 2003-05-21 | 2005-02-24 | Guang Qu | Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids |
CN107988192A (zh) * | 2009-07-31 | 2018-05-04 | 百深有限责任公司 | 用于纯化重组adamts13和其它蛋白质的方法以及其组合物 |
US20140227766A1 (en) * | 2011-06-08 | 2014-08-14 | Agency For Science, Technology And Research | Purification of biological products by constrained cohydration chromatography |
US20140309408A1 (en) * | 2011-08-02 | 2014-10-16 | Life Science Inkubator Betriebs Gmbh & Co. Kg | Method for purifying virus-like particles (vlp) |
CN103884816A (zh) * | 2012-12-21 | 2014-06-25 | 戴安公司 | 产生线性pH梯度的缓冲液试剂盒和方法 |
US20180163183A1 (en) * | 2015-02-09 | 2018-06-14 | Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) | Recombinant adeno-associated virus particle purification with multiple-step anion exchange chromatography |
US20190002844A1 (en) * | 2015-12-11 | 2019-01-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Scalable purification method for aav8 |
US20200284771A1 (en) * | 2019-03-08 | 2020-09-10 | Waters Technologies Corporation | Methods, compositions and kits useful for ion exchange chromatography and mass spectrometry analysis |
Non-Patent Citations (8)
Title |
---|
CHUNLEI WANG, SRI HARI RAJU MULAGAPATI, ZHONGYING CHEN, ET AL.: "Developing an Anion Exchange Chromatography Assay for Determining Empty and Full Capsid Contents in AAV6.2", 《MOLECULAR THERAPY-METHODS & CLINICAL DEVELOPMENT》, vol. 15, 13 December 2019 (2019-12-13), pages 257 - 263, XP055812692, DOI: 10.1016/j.omtm.2019.09.006 * |
FLORIAN FÜSSL, ANGELA CRISCUOLO, KEN COOK, ET AL.: "Cracking Proteoform Complexity of Ovalbumin with Anion-Exchange Chromatography-High-Resolution Mass Spectrometry under Native Conditions", 《JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH》, vol. 18, no. 10, 21 October 2019 (2019-10-21), pages 3689 - 3702 * |
FLORIAN FÜSSL, ANNE TRAPPE, KEN COOK, ET AL.: "Comprehensive characterisation of the heterogeneity of adalimumab via charge variant analysis hyphenated on-line to native high resolution Orbitrap mass spectrometry", 《MABS》, vol. 11, no. 1, 2 January 2019 (2019-01-02), pages 116 - 128, XP093153429, DOI: 10.1080/19420862.2018.1531664 * |
FLORIAN FÜSSL, KEN COOK, KAI SCHEFFLER, ET AL.: "Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》, vol. 90, no. 7, 3 April 2018 (2018-04-03), pages 4669 - 4676, XP055706492, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b05241 * |
HUA YANG, STEPHAN M KOZA, WEIBIN CHEN.: "An Anion-Exchange Chromatography Method for Monitoring Empty Capsid Content inAdeno-Associated Virus Serotype AAV8", 《LC GC NORTH AMERICA》, vol. 38, no. 6, 1 June 2020 (2020-06-01), pages 369 - 370 * |
LIAN SHAN, JAMES A. HRIBAR, XIANG ZHOU, ET AL.: "Gradient Chromatofocusing-Mass Spectrometry:A New Technique in Protein Analysis", 《JOURNAL OF THE AMERICAN SOCIETY FOR MASS SPECTROMETRY》, vol. 19, no. 8, 1 August 2008 (2008-08-01), pages 1132 - 1137, XP023521709, DOI: 10.1016/j.jasms.2008.04.035 * |
QU GUANG, BAHR-DAVIDSON JENNIFER, PRADO JOSEPH, ET AL.: "Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome containing vectors by anion-exchange column chromatography", 《JOURNAL OF VIROLOGICAL METHODS》, vol. 140, no. 1, 24 March 2007 (2007-03-24), pages 183 - 192 * |
WEIHONG QU, MINGXI WANG, YAQING WU, ET AL.: "Scalable Downstream Strategies for Purification of Recombinant Adeno-Associated Virus Vectors in Light of the Properties", 《CURRENT PHARMACEUTICAL BIOTECHNOLOGY》, vol. 16, no. 8, 2 July 2015 (2015-07-02), pages 684 - 695, XP055533837, DOI: 10.2174/1389201016666150505122228 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20220145324A1 (en) | 2022-05-12 |
EP3995572A1 (en) | 2022-05-11 |
US11821000B2 (en) | 2023-11-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Coffman et al. | High‐throughput screening of chromatographic separations: I. Method development and column modeling | |
Ali et al. | Hyphenation in sample preparation: advancement from the micro to the nano world | |
Staby et al. | Comparison of chromatographic ion-exchange resins: IV. Strong and weak cation-exchange resins and heparin resins | |
Yi et al. | Molecularly imprinted solid-phase extraction in the analysis of agrochemicals | |
JP6232067B2 (ja) | タンパク質分離用多次元の液体クロマトグラフィーの分離システム及分離方法 | |
Hagel | Gel filtration: size exclusion chromatography | |
US20210080434A1 (en) | Chromatography System with Guard Columns | |
Molina-Díaz et al. | Solid-phase spectroscopy from the point of view of green analytical chemistry | |
Pereira et al. | Microextraction by packed sorbent: an emerging, selective and high‐throughput extraction technique in bioanalysis | |
Arce et al. | Liquid-phase microextraction techniques for simplifying sample treatment in capillary electrophoresis | |
CN114460219A (zh) | 分离病毒载体的方法 | |
RU2508531C2 (ru) | Способ подготовки образцов для анализа и картридж для него | |
Tempels et al. | Design and applications of coupled SPE‐CE | |
Theodoridis et al. | Automated sample treatment by flow techniques prior to liquid-phase separations | |
CN110118836B (zh) | 高效液相色谱法测定利伐沙班中遗传毒性杂质的方法 | |
CN104345114A (zh) | 一种反相分离衍生化亮氨酸和异亮氨酸的方法 | |
Debets et al. | Electrodialytic sample treatment coupled on-line with column liquid chromatography for the determination of basic and acidic compounds in environmental samples | |
CA2088360A1 (en) | Quantitative analysis and monitoring of protein structure by substractive chromatography | |
Campíns‐Falcó et al. | Solid‐phase extraction and clean‐up procedures in pharmaceutical analysis | |
Gritti et al. | Ultrahigh Resolution Semipreparative Liquid Chromatography: Application to Structure Elucidation of Drug Impurities. | |
Isane et al. | A Review on Method Development, Validation, Optimization and Applications of HPLC | |
US4556538A (en) | Chromatographic apparatus | |
Bhattacharya et al. | Ultra-Performance Liquid Chromatography-An Updated Review | |
Pravin | A Review on RP-HPLC Method Development and Validation for Bulk Dosage Form | |
CN106841419A (zh) | 一种聚肽的快速检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |