CN102656271A - 人体内产生对hiv的广泛t细胞应答 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)及其在治疗和/或预防HIV感染和AIDS中的用途，所述病毒的病毒基因组中包含用于表达HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef，或者选自Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef。

Description

人体内产生对HIV的广泛T细胞应答
本发明涉及用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)及其在治疗和/或预防HIV感染和AIDS中的用途，所述病毒的病毒基因组中包含用于表达HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(HIV)是获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体。与所有的逆转录病毒一样，该病毒的基因组编码Gag、Pol和Env蛋白。此外，该病毒的基因组还编码调节蛋白(即Tat和Rev)以及辅助蛋白(即Vpr、Vpx、Vpu、Vif和Nef)。
尽管公共卫生组织努力控制AIDS传染病的传播，但新发感染的数量仍在增加。世界卫生组织估计2003年底全球有3780万感染者。如果综合预防机制没有进一步改善，预计这十年全球出现的新HIV感染的数量达到4500万(2004年UNAIDS和WHO在The Global AIDS Epidemic上的报告)。
HIV感染是一种慢性感染性疾病，其可以部分地得到控制，但是不能治愈。目前存在预防并发症和延缓发展成为AIDS进程的有效方法。目前，并非所有感染HIV的人都发展成为AIDS，但是一般认为大部分人将会如此。
被称为高效抗逆转录病毒治疗剂(HAART)的几种抗逆转录病毒试剂的组合物已经非常有效地降低了病毒载量，从而能够提高T细胞数量。这还不能治愈HIV，而且进行HAART的人虽然HIV水平受到抑制，但是仍然能够将病毒传染给其他人。但是，有确切的证据表明如果HIV的水平持续受到抑制并且CD4的数量保持大于200，那么生命的质量和寿命可以得到显著提高和延长。考虑到该流行病的稳步传播，已经研发出多种不同的HIV疫苗递送方案，例如新型载体或者佐剂系统，并且在不同的临床前条件以及临床试验中对其进行了评估。已进入III期临床试验的第一个疫苗候选物基于明矾中的包膜蛋白gp120(Francis等，AIDS Res.Hum.Retroviruses 1998；14(Suppl 3)(5)：S325-31)。但是，第一次临床研究的结果并不乐观。
尽管HAART疗法中使用的药物能够降低病毒滴度，但是对于抗逆转录病毒疗法，存在一些担忧。关于HAART的一个主要问题是(长期的)副作用和由此产生的患者依从度。如果患者遗漏几次剂量，就会产生抗药性。并且，抗逆转录病毒药物价格昂贵，世界上大多数感染者都无法获得HIV和AIDS的药物和治疗。
过去经过效果测试的疫苗通常基于单个HIV蛋白，例如Env。然而，即使产生了对该单个蛋白(例如Env)的免疫应答，所述免疫应答经证实并非有效。无效的一个原因是HIV的高突变率，特别是对于Env蛋白，这导致产生了其蛋白不能被疫苗诱导的免疫应答识别的病毒。
由于没有有效的预防性治疗，仍然需要向临床引入有效疫苗。
发明详述
本发明人出乎意料地发现，一种包含HIV-1蛋白Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef的基于MVA的HIV疫苗在人体内，特别是感染HIV的无免疫应答人体内能够诱导对这些HIV蛋白中多达6种蛋白的T细胞应答。该发现之前无法预期，因为已知此种MVA向免疫系统提供免疫显性表位，可以说这使得T细胞应答所需表位被这些免疫显性表位所覆盖。此外，临床试验中发现，接受接种的HIV感染者的免疫应答在首次免疫后20周仍然高于基线。
确实，相比于本发明相，目前还没有人体内的临床试验用以研究HIV疫苗对免疫细胞的作用，而是仅获得了体外数据或者小鼠模型中的体内数据。
实际上，动物研究不及人类好，因为模型通常不能预测人类的应答比例和应答量级。小鼠和兔比人类更具免疫应答性。由于本发明是从感染HIV的人体中获得的数据，因此，对发明人获得的数据必须高度评估，而远不能根据已知的MVA免疫显性现象对其预测。参与所附实施例中描述的临床试验的HIV感染者的CD4数量少于350/μl，并且基于此较低数量，将不能预期对施用于临床试验参与者的基于MVA的疫苗所包含的8种HIV-1蛋白中的6种蛋白产生如此广泛的T细胞应答。
例如，US2006/188961和WO03/097675描述了基于MVA的HIV疫苗。但是，这些文献没有显示对如本文中描述的重组MVA中使用的HIV-1蛋白的广泛T细胞应答。
EP1921146和WO01/47955描述了一种基于MVA的HIV疫苗，其包含Gag、Pol和Nef或者Gag、Pol、Nef、Vpr和Vpu的CTL表位，用以诱导T细胞应答。但是，这些文献没有提供显示广泛T细胞应答的数据，更没有人体中获得的数据。
WO2006/123256与WO01/47955非常相似，但是除了更多的特异性CTL表位之外，并没有提供任何超越WO 01/47955所描述的数据。
WO2008/118936描述了一种基于MVA的HIV疫苗，其包含选自Env、Gag、Nef、RT、Tat和Rev的HIV蛋白。但是，该文献的缺点是仅具有动物模型数据，但由该数据不能合理地推断至人类。
Greenough等(2008)，Vaccine.26：6883-6893报道了包含Env、Tat、Rev、Nef和RT的重组痘病毒HIV-1疫苗的安全性和免疫原性研究，所述疫苗对已感染HIV并且进行HAART的年轻成人施用。然而，作者报道其疫苗可能不能得到进一步开发。
因此，将不能预期对8种HIV蛋白中的6种蛋白产生广泛的T细胞应答，更不要说在无免疫应答的受试者中的免疫应答。特别是无论体外数据还是动物模型均不能形成用于合理预期其在HIV治疗领域的成功的基础。这确实是因为HIV的“真实”模型系统是人，特别是感染HIV的人。
基于动物实验和通过排列多个CTL表位扩大免疫应答(例如WO01/47955或者WO2008/118936)的尝试(不一定产生对期望HIV蛋白的免疫应答)，不能预期在无免疫应答的人体中8种HIV蛋白中的6种蛋白被免疫系统识别。
因此，本发明涉及一种用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达至少3种HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
在一个实施方案中，用作药物或者疫苗的所述重组MVA在病毒基因组中包含用于表达至少6种HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
在另一实施方案中，用作药物或者疫苗的所述重组MVA在病毒基因组中包含表达至少8种HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
在本发明其他具体实施方案中，用作药物或者疫苗的所述重组MVA在病毒基因组中包含用于表达3种或者4种或者5种或者6种或者7种或者8种HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
本发明还包括一种用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef的8种HIV蛋白以及一种或多种额外的结构和/或辅助/调节HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒。
在优选的实施方案中，本发明涉及一种用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达HIV蛋白Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef或者所述蛋白的部分或衍生物的一个或者多个表达盒。
在进一步优选的实施方案中，本发明涉及一种用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达HIV蛋白Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef或者所述蛋白的部分或衍生物的一个或者多个表达盒。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及一种重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含表达至少6种HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。所述MVA用于诱导人类受试者内对选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef中至少3种HIV蛋白的T细胞应答。
在另一特别优选的实施方案中，本发明涉及一种重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达至少6种HIV蛋白或者其部分或者所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef，所述MVA用于诱导人类受试者内对选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef中至少3种HIV蛋白的T细胞应答。
在进一步特别优选的实施方案中，本发明涉及一种重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达至少8种HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef，所述MVA用于诱导人类受试者内对选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef中至少3种HIV蛋白的T细胞应答。
本发明还提供了包含如本文中定义的重组MVA的药物或者疫苗组合物，具体地，所述重组MVA的病毒基因组中包含用于表达至少6种HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
更优选地，本发明的药物或者疫苗组合物包含重组MVA，所述重组MVA的病毒基因组中包含用于表达至少8种HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
在进一步优选的实施方案中，所述组合物包含重组MVA，所述重组MVA的病毒基因组中包含用于表达至少6种HIV蛋白或其部分或者所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
在优选的实施方案中，包含于所述药物或者疫苗组合物中的MVA在所述药物或者疫苗组合物中的剂量是大约2×10TCID50/ml。
在另一个优选的实施方案中，包含于所述药物或者疫苗组合物中的MVA经制备用于在3个间隔时间施用。所述3个间隔时间优选为第0、4和12周。
利用根据本发明的重组MVA可以表达大量的HIV蛋白。这些蛋白能够诱导广泛的免疫应答。因此，产生对不同HIV分离株(isolate)有效的保护性免疫应答的可能性增加。
根据本发明，改良的安卡拉痘苗病毒(MVA)适用于人类和几种动物物种中，例如小鼠和非人灵长类动物。已知MVA非常安全。
本文中使用的术语“受试者”特别地是指人类受试者。本文中所指人类受试者可以是例如由于感染HIV而无免疫应答，即人类受试者感染了HIV感染者，例如感染了HIV-1。本文中所指人类受试者可以表征为其CD4细胞数量少于350/μl。
本文中使用的“无免疫应答”是免疫系统防御或者抵抗感染性疾病的能力受损或者完全丧失的状态。
已经通过使痘苗病毒的安卡拉株(CVA)在鸡胚成纤维细胞中长期连续传代来制备MVA(综述参见Mayr，A.，Hochstein-Mintzel，V.和Stickl，H.[1975]Infection 3，6-14；瑞士专利第568，392号)。已经依照布达佩斯条约的要求保藏并且用于产生根据本发明的重组病毒的MVA病毒株的实例是1994年1月27日保藏在欧洲动物细胞保藏中心(European Collection of Animal Cell Cultures(ECACC)，Salisbury(UK))的保藏号是ECACC 94012707的病毒株MVA 572；2000年12月7日保藏的保藏号是ECACC 00120707的病毒株MVA 575；以及2000年8月30日保藏于ECACC的保藏号是00083008的MVA-BN。
在大量临床试验中已经证明了与在疫苗开发中的用途有关的MVA病毒株的几个优异的性质(Mayr等，Zbl.Bakt.Hyg.I，Abt.Org.B 167，375-390[1987])。在对超过120,000人(包括高风险患者)进行的这些研究中，未发现副作用(Stickl等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974])。
已经进一步发现，在哺乳动物细胞中，MVA在病毒复制周期的晚期被阻断(Sutter，G.和Moss，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89，10847-10851[1992])。因此，MVA完全复制其DNA，合成早期、中期和晚期基因产物，但是不能装配成能够从被感染细胞释放的成熟感染性病毒粒子。由于这个原因，即其复制受限的性质，MVA可以用作基因表达载体。
因此，在本发明的一个实施方案中，重组MVA选自MVA病毒株MVA575、MVA572和MVA-BN。
在一个优选的实施方案中，本发明的重组MVA病毒在人和非人灵长类动物中不能复制。术语在人类和/或非人灵长类动物中“不能复制”的病毒，以及同义术语在人类和/或非人灵长类动物中“不能复制成感染性子代病毒”的病毒均优选是指在接种了所述病毒的人类和/或非人灵长类动物细胞中完全不能复制的MVA病毒。但是，显示由施用了重组MVA病毒的人类和/或非人灵长类动物的免疫系统控制的少量残留复制活性的病毒也在本申请的范围内。
在一个实施方案中，不能复制的重组MVA病毒可以是能够感染用所述病毒作为疫苗的人类和/或非人灵长类动物的细胞的病毒。“能够感染细胞”的病毒是能够与宿主细胞相互作用至如此程度从而使病毒或者至少病毒基因组整合到宿主细胞中的病毒。尽管根据本发明使用的病毒能够感染已接种的人类和/或非灵长类动物的细胞，其不能在已接种的人类和/或非灵长类动物的细胞中复制成感染性子代病毒。
根据本发明，应当理解，能够感染第一种动物的细胞但是不能在所述细胞中复制成感染性子代病毒的病毒可能在第二种动物中表现不同。例如，MVA-BN和其衍生物(见下文)是能够感染人类细胞但是不能在人类细胞中复制成感染性子代病毒的病毒。但是，相同的病毒在鸡中有效复制，即在鸡中，MVA-BN是既能感染细胞又能在这些细胞中复制成感染性子代病毒的病毒。
能够预测一种病毒能否在人体内复制的合适试验公开于WO02/42480(通过引用并入本文)中，并且使用了免疫严重受损的AGR129小鼠株。此外，除了AGR129小鼠之外，可以使用不能产生成熟B和T细胞并因此使免疫严重受损且非常易于感染正在复制的病毒的任何其他小鼠株。据报道，该小鼠模型中获得的结果对人类是指示性的，因此根据本申请，认为在所述小鼠模型中不能复制的病毒是“不能在人体内复制”的病毒。
在其他实施方案中，根据本发明的病毒优选能够在至少一种动物的至少一种细胞类型中复制。因此，可以在向待接受接种和/或处理的动物施用前扩增病毒。作为示例，提及的有能够在CEF(鸡胚成纤维细胞)细胞中扩增的MVA-BN，但是该病毒是不能在人体内复制成感染性子代病毒的病毒。
根据本发明，术语病毒的“衍生物”或者“变体”是指与亲代病毒显示相同特性但是其基因组的一部分或者多个部分显示不同的子代病毒。术语“衍生物”或者“MVA的变体”或者“MVA-BN”描述与MVA相比具有相同功能特性的病毒。例如，MVA-BN的衍生物/变体具有MVA-BN的特性，优选具有保藏于ECACC保藏号是00083008的MVA-BN的特性。MVA-BN或者其变体的这些特性之一分别是其减弱和不能在人细胞系中进行再生性复制，所述人细胞系为例如人角化细胞系HaCaT、人胚肾细胞系293、人骨肉瘤细胞系143B和人子宫颈腺癌细胞系HeLa。
此外和/或可选择地，MVA-BN和其衍生物具有不能在不能产生成熟B和T细胞的小鼠模型中复制的性质，和/或具有在痘苗病毒初级/痘苗病毒加强免疫策略中诱导与DNA初级/痘苗病毒加强免疫策略至少相同水平的特异性免疫应答的能力。
如果在痘苗病毒初级/痘苗病毒加强免疫策略中，经WO02/42480中公开的“测试1”和“测试2”之一或者两者测定的CTL应答与DNA-初级/痘苗病毒加强免疫策略相比时至少基本相同，则认为痘苗病毒(尤其是MVA病毒株)在痘苗病毒初级/痘苗病毒加强免疫策略中诱导与DNA初级/痘苗病毒加强免疫策略相比时至少基本相同水平的免疫。更优选地，施用痘苗病毒初级/痘苗病毒加强免疫后，至少一种测试中的CTL应答高于DNA初级/痘苗病毒加强免疫策略。最优选地，两个测试中的CTL均较高。
根据本发明使用的病毒可以是克隆纯化的病毒，例如单克隆病毒。
根据本发明使用的病毒可以是已经在无血清条件下产生/传代的病毒，以减少感染血清中所含物质的风险。
根据本发明的MVA施用的浓度范围是104至109TCID50/ml，优选浓度范围是例如105至5×108TCID50/ml，更优选浓度范围是例如106至108TCID50/ml或者107至109TCID50/ml，甚至更优选浓度范围是例如108至109TCID50/ml，并且最优选浓度是2×108TCID50/ml。实际浓度取决于病毒类型和接受接种的物种。对于MVA-BN，通过皮下施用于人的常规接种剂量包括5×107TCID50至5×108TCID50，例如大约1×108或者2×108TCID50。
在本发明一个优选的实施方案中，当应用于本发明的用途和方法时，本文中描述的重组MVA施用至少3次。
在本发明另一个优选的实施方案中，当应用于本发明的用途和方法时，所述重组MVA在第0、4和12周施用。
单次施用上文所定义的MVA，特别是病毒株MVA-BN和其衍生物，可诱导免疫应答。通常，可以在同质初级加强免疫策略中施用根据本发明的MVA，特别是MVA-BN和其衍生物，即可以使用重组MVA用于首次接种，和用以通过施用与首次接种中使用的重组MVA相同或者相关的重组MVA而增强首次接种中产生的免疫应答。根据本发明的MVA特别是MVA-BN和其衍生物还可以用于异质初级-加强免疫策略中，并且在所述异质初级-加强免疫策略中，用上文所定义的MVA进行一次或者多次接种，并且其中利另一种类型的疫苗(例如另一种病毒疫苗、蛋白或者核酸疫苗)进行一次或者多次接种。
施用方式可以是静脉内、肌内、皮内、鼻内或者皮下施用。优选静脉内、肌内或者特别是皮下施用。但是，可以使用任何其他的施用方式，例如划痕(scarification)。
本申请文中使用的术语“HIV”是指任何类型的HIV，包括HIV-1和HIV-2以及相应的亚型，例如HIV-1亚型A、B或者C。实例是HIV-1病毒株，例如亚型B。
根据本发明的一个实施方案，由表达盒编码的HIV蛋白是HIV-1蛋白。
本申请中使用的术语“HIV蛋白的部分”是指包含相应全长HIV蛋白的至少10个连续氨基酸的肽或者蛋白，例如所述全长蛋白的至少20、30或者40个氨基酸。作为实例并且不限于所述实施方案，提及的有genebank数据库公开的多个HIV序列，特别是HIV-1分离株HXB2R的序列(genebank登录号是K03455)。
本说明书中使用的术语“HIV蛋白氨基酸序列的衍生物”是指与相应的天然存在的HIV蛋白相比氨基酸序列发生改变的HIV蛋白。改变的氨基酸序列可以是其中HIV蛋白序列的一个或者多个氨基酸被置换、插入或者缺失并且因而突变的序列。更具体地，“HIV蛋白氨基酸序列的衍生物”是当蛋白衍生物的氨基酸序列与已知HIV分离株各自的HIV蛋白的氨基酸序列相比时显示至少50％，例如至少60％、65％、70％、75％，或者至少80％或85％，或者甚至至少90％、95％、98％或者99％同一性的氨基酸序列。即使发现与仅仅一种HIV分离株的相应蛋白具有同源性/同一性，也认为氨基酸序列具有上述的序列同源性或者同一性，而不管其可能与其他分离株中的相应蛋白显示较低的同源性。例如，如果融合蛋白中的Vpr衍生物显示与一种HIV分离株的Vpr序列具有95％的同源性，但是与(所有)其他HIV分离株仅具有50-70％的同源性，则认为所述Vpr衍生物的同源性是至少90％。特别地，术语“HIV蛋白的衍生物”是指显示与HIV-1分离株HXB2R中各HIV蛋白(genebank登录号K03455)具有至少50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或者90％、95％、98％或者99％同源性的氨基酸序列。
HIV蛋白的衍生物和HIV蛋白的部分可以具有完整的活性，活性降低、无活性或者反式显性(transdominant)活性。例如，根据本发明的重组MVA表达HIV调节和/或辅助蛋白。这些蛋白的生物活性可能具有不期望的副作用。因此，由重组MVA表达的一种或者多种HIV蛋白与野生型蛋白相比活性降低，这也在本发明的范围内。
确定HIV蛋白是否具有降低的生物活性的测试是本领域技术人员已知的。
对病毒的体内复制十分关键的Vif蛋白的分子机制仍不为人所知，但是Vif具有强的自结合(self association)趋势。经证明，这种多聚化对Vif在病毒生命周期中的功能十分重要(Yang S.等，J Biol Chem 2001；276：4889-4893)。此外，经证明，vif特异性地与病毒核蛋白复合体结合，这在功能上可能具有重要作用(Khan M.A.等，J Virol.2001；75(16)：7252-65)。因此，活性降低的Vif蛋白显示降低的多聚化和/或与核蛋白复合体的结合。
Vpr蛋白在病毒生活周期中发挥重要作用。Vpr调节病毒前整合复合体的核运输，并且促进感染非分裂细胞，例如巨噬细胞(Agostini等，AIDS Res HumRetroviruses 2002；18(4)：283-8)。此外，Vpr蛋白还具有由与LTR的相互作用介导的反式激活活性(Vanitharani R.等，Virology 2001；289(2)：334-42)。因此，活性降低的Vpr蛋白显示降低的或者甚至无反式激活活性和/或与病毒前整合复合体的相互作用。
与Vpr高度同源的Vpx对于病毒在非分裂细胞中的高效复制也十分关键。Vpx通过与gag前体多聚蛋白的p6结构域的相互作用而被包装在病毒颗粒内。同Vpr一样，Vpx参与将前整合复合体转运至核中(Mahalingam等，J.Virol 2001；75(1)：362-74)。因此，活性降低的Vpx通过gag前体结合前整合复合体的能力下降。
已知Vpu蛋白与CD4的胞质末端相互作用，并引起CD4降解(Bour等，Virology 1995；69(3)：1510-20)。因此，活性降低的Vpu引发CD4降解的能力下降。
经明确表征的Tat蛋白的相关生物学活性是通过与反式激活应答元件(TAR)相互作用而反式激活转录。已经证明Tat能够反式激活缺少除TAR之外的其他HIV序列的异源启动子(Han P.等，Nucleic Acid Res 1991；19(25)：7225-9)。因此，活性降低的Tat蛋白显示通过TAR元件对启动子的反式激活作用减弱。根据本发明，还可以使用反式显性Tat。可以通过下列置换获得反式显性Tat：22(Cys＞Gly)和37(Cys＞Ser)。
Nef蛋白通过诱导细胞表面CD4的下调而对负责疾病发展的病毒复制十分重要(Lou T等，J Biomed Sci 1997；4(4)：132)。这种下调由CD4和Nef的直接相互作用起始(Preusser A.等，Biochem Biophys Res Commun 2002；292(3)：734-40)。因此，功能减弱的Nef蛋白显示与CD4的相互作用减弱。实例是氨基端截短的Nef蛋白，例如缺少N末端19个氨基酸的蛋白。根据本发明，还可以使用截短的Nef，特别是缺失N末端19个氨基酸的Nef。
Rev的相关功能是由与病毒RNA的Rev应答元件(RRE)相互作用起始的转录后反式激活作用(Iwai等，1992；Nucleic Acids Res 1992；20(24)：6465-72)。因此，活性降低的Rev显示与RRE的相互作用减弱。
根据本发明的一个实施方案，以单个蛋白表达一种或者多种HIV蛋白。
根据进一步的实施方案，以融合蛋白表达两种或者多种HIV蛋白。优选地，以融合蛋白表达两种或者更多种HIV辅助/调节蛋白。
在本文中参考WO03/097675，其内容通过引用随同并入。
作为实例，根据本发明的重组MVA，例如MVA-BN和其衍生物，可以(i)以融合蛋白以此顺序或者不同顺序表达Vif-Vpu-Vpr-Rev，其中Vif、Vpu、Vpr和Rev表示全长蛋白或者全长蛋白的部分或衍生物(参见上文的定义)，(ii)Nef或其部分或衍生物，特别是N末端氨基酸(例如前19个氨基酸)缺失的Nef蛋白，即N末端截短的Nef，(iii)Tat或其部分或衍生物，特别是反式显性Tat，和(iv)以例示顺序或相反顺序(Pol-Gag)排列的Gag-Pol融合蛋白，其中Gag和Pol表示全长蛋白或者全长蛋白的部分或衍生物。
表达HIV蛋白的表达盒数量并不重要。作为实例，可以由2至5个表达盒表达HIV蛋白。一个表达盒可以以融合蛋白表达以此顺序或者不同顺序的Vif-Vpu-Vpr-Rev，其中Vif、Vpu、Vpr和Rev表示全长蛋白或者全长蛋白的部分或衍生物(参见上文的定义)，第二表达盒可以表达Nef或其部分或衍生物，特别是N末端氨基酸(例如前19个氨基酸)缺失的Nef蛋白，第三表达盒可以表达(iii)Tat或其部分或衍生物，特别是反式显性Tat，第四表达盒可以表达以例示顺序或相反顺序(Pol-Gag)排列的Gag-Pol融合蛋白，其中Gag和Pol表示全长蛋白或者全长蛋白的部分或衍生物。优选地，编码Gag-Pol融合蛋白的表达盒与编码Tat的表达盒被插入到相同的插入位点中。
异源核酸序列的表达优选但不是排他性地处于痘病毒启动子的转录控制下。合适的痘病毒启动子的实例是牛痘ATI启动子(参见WO03/097844)。每个表达盒的表达均可以由不同启动子控制。可选地，所有表达盒可以由相同启动子的拷贝控制。作为实例，本发明涉及的重组病毒中所有的HIV表达盒(例如上文例示的4个表达盒)由WO03/097844中定义的牛痘ATI启动子或者其衍生物控制。
在根据本发明的重组MVA(例如MVA-BN和其衍生物)中，可以将表达盒插入到病毒基因组内1至10个插入位点中。
意外地发现，如果不是所有的表达盒均被插入到相同的插入侧，则可以容易地获得用于表达HIV蛋白或者其部分或衍生物的重组MVA(特别是MVA-BN和其变体)。因此，可以将不同的表达盒插入到病毒基因组内1至5、或者2至8、或者3至5、或者3个插入位点中。
可以将异源核酸序列插入到病毒基因组非关键区域中。根据本发明的另一实施方案，将异源核酸序列插入到MVA基因组的天然缺失位点(公开于PCT/EP96/02926中)。根据进一步的可选方案，可以将异源序列插入到痘病毒基因组的基因间区域(参见WO03/097845)。本领域技术人员知晓将异源序列插入到痘病毒基因组中的方法。作为实例，可以将表达盒插入到MVA基因组(特别是MVA-BN和其衍生物的基因组)的一个或者多个基因间区域IGR 07/08、IGR I4L/I5L和IGR 136/137中。
根据本发明的一个优选的实施方案，重组MVA是MVA-BN或者其衍生物，并且将下列表达盒插入到下列插入位点中：(i)将以融合蛋白表达以此顺序或者不同顺序的Vif-Vpu-Vpr-Rev的表达盒插入到基因间区域IGR 07/08中，其中Vif、Vpu、Vpr和Rev表示全长蛋白或者全长蛋白的部分或衍生物(参见上文的定义)；(ii)将表达Nef或其部分或衍生物，特别是缺失N末端氨基酸(例如前19个氨基酸)的Nef蛋白的第二表达盒插入到IGR I4L/I5L中，(iii)将表达Tat或其部分或衍生物，特别是反式显性Tat的第三表达盒和表达Gag-Pol融合蛋白的第四表达盒插入到IGR 136/137中，其中Gag和Pol表示全长蛋白或者全长蛋白的部分或衍生物。在该实例中，第三和第四表达盒被插入到相同的整合位点，其中这两个表达盒可以以两种可能的顺序排列。对于IGR的编号参见WO03/097845。需要考虑的是，位于一侧的IGR I4L/I5L和位于另一侧的IGR 136/137、IGR 07/08属于两种不同的编号系统，这在WO03/097845中有解释。
最优选地，本发明的重组MVA是病毒基因组中包含下列表达盒的重组MVA：
(i)以融合蛋白表达Vif-Vpu-Vpr-Rev的表达盒，其被插入到基因间区域IGR07/08中，
(ii)表达缺失N末端前19个氨基酸的Nef蛋白的第二表达盒，其被插入到IGR I4L/I5L中，
(iii)表达反式显性Tat的第三表达盒和表达Gag-Pol融合蛋白的第四表达盒，其均被插入到IGR 136/137中。
根据本发明的重组病毒可以诱导保护性免疫应答。术语“保护性免疫应答”是指经接种的受试者能够以某种方式控制接种所针对的病原体的感染。通常，已经产生“保护性免疫应答”的动物比未接种受试者的临床症状温和和/或疾病的进展被缓解。
本发明进一步涉及包含如上文所定义的重组MVA以及任选地药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或添加剂的药物组合物或者疫苗。
本领域技术人员知晓多种制备痘病毒制剂的方法以及储存方式。此处参考WO03053463。
辅助物质的非限定性实例是水、盐溶液、甘油、乙醇、润湿剂或者乳化剂、pH缓冲物质、防腐剂或稳定剂等。适合的载体通常选自包含代谢缓慢的大分子的组，所述大分子为例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、多聚氨基酸、氨基酸共聚物或脂质聚合物等。
为了制备疫苗，将根据本发明的重组MVA病毒转化为生理上可接受的形式。这可以基于在针对天花的接种中使用的痘病毒疫苗的制备经验而进行(如Stickl，H等，Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392[1974]有描述)。例如，将经纯化的病毒配制于10mM Tris、140mM NaCl(pH7.4)中，滴度为5×108TCID50/ml，储存于-80℃。
在一个实施方案中，根据本发明的MVA病毒用于制备疫苗针剂。例如，将大约102至大约108个病毒颗粒冻干在含具有2％蛋白胨和1％人白蛋白的100ml磷酸盐缓冲液(PBS)的安瓿瓶，优选玻璃安瓿瓶中。在另一个非限定性实例中，通过使包含病毒的制剂逐步冷冻-干燥，而生产疫苗注射针剂。在某些实施方案中，该制剂可以含有额外的添加剂，例如甘露醇、葡萄聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或者适于体内施用的其他辅料，例如抗氧化剂或者隋性气体、稳定剂或者重组蛋白(例如人血清白蛋白)。接着将玻璃安瓿瓶密封，其可以在4℃至室温之间储存数月。但是，只要不是急需，安瓿瓶优选在-20℃以下储存。
为了接种或者治疗，可以将冻干物溶解于0.1至0.5ml水溶液，优选生理盐水或者Tris缓冲液中，并且全身性或者局部施用，即通过胃肠外、皮下、肌内、经划痕或者本领域专业人员已知的任何其他施用途径施用。本领域技术人员可以用已知方法对施用方式、施用剂量和数量进行优化。但是，最常见的是，患者在首次接种针剂后约1个月至6周时接种第二针剂。第三注射和随后的注射优选在前次注射后4-12周给予。
本发明人惊奇地发现，利用本发明的重组MVA能够诱导针对多于一种重组表达的HIV蛋白的强的抗原特异性T细胞应答。如上文已经显示的，考虑到观察到的称为免疫显性的现象，这是出乎意料的结果，由此使宿主免疫系统仅给定免疫原中多个可能表位中的几个表位产生应答。对于MVA载体，之前的研究已经表明非重组载体表位的免疫显性阻止诱导针对重组抗原的强的CD8T细胞应答(Smith等，Immunodominance of poxviral-specific CTL in a human trial ofrecombinant-modified vaccinia Ankara.J.Immunol.175：8431-8437，2005)。经证明，疫苗引导的T细胞应答主要针对痘病毒表位而引导。相比而言，使用本发明的重组MVA引起对多种重组HIV蛋白的强且广泛的T细胞应答。此外，对于诱导应答的所有HIV蛋白，在接受首次接种后20周，免疫应答仍高于基线水平。考虑到由于针对天花的较早接种而产生的针对骨架病毒载体的潜在的预先存在的免疫性和中和抗体的形成，这是进一步出乎意料的结果。
因此，本发明进一步涉及如上文所定义的重组MVA或者包含如上文所定义的重组MVA的药物组合物或疫苗，用于诱导人类受试者体内对至少3种、优选至少4种、至少5种或者6种HIV蛋白的T细胞应答，其中所述蛋白选自HIV Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
本发明还涉及如上文所定义的重组MVA或者包含如上文所定义的重组MVA的药物组合物或疫苗用于制备药物的用途，所述药物用于诱导人类受试者体内对一种或者多种HIV蛋白的T细胞应答，特别是对3种、4种、5种、6种或者更多HIV蛋白的T细胞应答，优选对至少3种、至少4种、至少5种或者至少6种HIV蛋白的T细胞应答，其中所述蛋白选自HIV Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
同样地，本发明还涉及用于诱导人类受试者体内对至少3种HIV蛋白的T细胞应答的方法，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef，该方法包括施用如上文所定义的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。
优选待施用的重组MVA为有效量，以使其在人类受试者体内诱导期望的效应，即对至少3种HIV蛋白的T细胞应答，优选对至少4种，更优选至少5种，甚至更优选至少6种HIV蛋白的T细胞应答，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
在特别优选的实施方案中，本发明涉及如上文所定义的重组MVA，其中所述MVA诱导人类受试者体内对至少4种HIV-1蛋白的T细胞应答，所述HIV-1蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
在更加特别优选的实施方案中，本发明涉及如上文所定义的重组MVA，其中所述MVA诱导人类受试者体内对至少5种HIV-1蛋白的T细胞应答，所述HIV-1蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
在甚至更加特别优选的实施方案中，本发明涉及如上文所定义的重组MVA，其中所述MVA诱导人类受试者体内对至少6种HIV-1蛋白的T细胞应答，所述HIV-1蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
在优选的实施方案中，本文中定义的MVA诱导对选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef的蛋白的T细胞应答所针对的HIV-1蛋白包括Gag、Pol和Nef。
在优选的实施方案中，所述至少3种HIV蛋白是Gag、Pol和Nef。在另一优选的实施方案中，所述3种HIV蛋白之一是选自由Gag、Pol、Nef、截短Nef、Vpr、Vpu和Rev组成的组中的一种。
本发明进一步涉及如上文所定义的重组MVA或者包含如上文所定义的重组MVA的药物组合物或疫苗，其用于治疗和/或预防HIV感染和/或AIDS。
本发明还涉及如上文所定义的重组MVA或者包含如上文所定义的重组MVA的药物组合物或疫苗在制备用于制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防HIV感染和/或AIDS。
需要指出的是，术语“预防HIV感染和/或AIDS”(或“HIV感染和/或AIDS的预防”)并不是指重组MVA在所有条件下在所有受试者中均预防HIV感染和/或AIDS。相反，该术语包括任何统计学上具有显著意义的保护性作用，即使这种作用非常低。
在进一步优选的实施方案中，重组MVA的施用剂量是105至5×108TCID50/ml，优选剂量是2×108TCID50/ml。
在另一优选的实施方案中，经静脉内、肌内或者皮下施用所述重组MVA。
附图简述
图1：表达8种HIV蛋白Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef的
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构建体(MVA-mBN120B)。
图2：HIV特异性T细胞应答者比例。应答者的百分数由n(作为应答者的受试者数量)并且基于N＝15的组计算得到。RT＝逆转录酶，CTL＝细胞毒性T淋巴细胞，HTL＝辅助性T淋巴细胞。
图3A-D：所示HIV-1蛋白的中值SFU/1×106PBMC。箭头表示接种。
实施例
以下实施例将进一步阐述本发明。本领域技术人员将充分理解，所提供的实施例不能被解释为将本发明提供的技术的应用性限定于这些实施例。
实施例1：
重组MVA-BN的产生(该重组MVA-BN的病毒基因组中包含均处于ATI启动子调控下的截短的nef基因、gag-pol融合基因、反式显性Tat基因和Vif-Vpr-Vpu-Rev融合基因)
按照美国专利第7,501,127号中的描述产生MVA载体mBN87，所述美国专利通过引用并入本文。简而言之，利用PCR从感染HXB2的细胞的DNA获得gag-pol融合基因。利用PCR从MVA-nef(LAI)的DNA扩增nef基因，以获得截短形式。去除前19个氨基酸，得到截短的Nef。利用RT-PCR从原始分离株MvP-899的HIV RNA获得vif和vpu基因，而vpr、rev和tat基因则通过基于HXB2的序列的寡核苷酸退火合成。通过在Tat中引入两个突变而产生突变的Tat蛋白，所述突变没有定位于重要表位处但会导致丧失反式激活活性。所述突变是下列取代：22(Cys＞Gly)和37(Cys＞Ser)。将DNA构建体克隆到重组载体中。
在5轮斑纯化后，通过PCR证实外源DNA的插入(截短的nef基因、gag-pol融合基因、反式显性Tat基因和Vif-Vpr-Vpu-Rev融合基因)以及野生型病毒的消失。所产生的重组病毒克隆被命名为mBN87A。在非选择性条件下进行5轮斑纯化后，可以分离出缺少选择盒的重组病毒MVA-mBN87B。利用标准方法证实重组载体的身份。在MVA-mBN87B中，Vif-Vpr-Vpu-Rev基因在末端没有终止密码子，这导致31个非特异性氨基酸的加入。因此，将终止密码子加入该融合基因中，克隆出新的重组病毒MVA-mBN120B。该构建体(还参见图1)用于在小鼠体内的临床前研究和在人体内的临床研究中。
实施例2：
在小鼠体内的临床前研究
研究MVA-mBN120B是否能够在成年非转基因小鼠(BALB/c)中发动(mount)HIV特异性细胞免疫应答。选择最有希望的表位，并且对于每种蛋白合成两种CD4细胞和两种CD8T细胞的肽。在第0和21天，对小鼠皮下(s.c.)施用作为对照的500μl TBS(第1组)或者大约4×108TCID50MVA-mBN120B(第2组)。在第35天，通过眼窝后穿刺从所有动物收集血液样品，并进行处理，以使血清用于未来可能的分析。血液采样后，通过颈椎脱位处死小鼠，并解剖出脾脏，以用于利用IFNγ-ELISpot试验对由疫苗插入物中编码的HIV特异性肽对脾细胞的再刺激产生的细胞免疫应答进行随后分析。
通过用特异性肽对脾细胞的再刺激以及随后通过ELISpot试验对由脾细胞释放的IFNγ的检测，确定HIV蛋白特异性细胞免疫应答。所述肽如下所示，显示肽名称、T细胞限制和肽序列：
简而言之，首先将含有500μg各肽的试样溶解于小体积的二甲基亚砜中，接着用RPMI培养基进一步稀释，以获得1mg/ml的储存液(额外需要体积为5至25μl的乙酸以确保肽#4、14、20和21的完全重建；额外需要5至25μl的体积以确保肽#20、22、23和24的完全重建)。
利用“Saw 03”程序在Dispomix管中进行脾脏匀浆化。匀浆化后，将细胞悬液转移至50ml管中，离心，并用红血细胞裂解液使红细胞裂解5分钟。在两次清洗步骤后，将细胞悬液的小试样与台盼蓝混合，并利用计数室(Madaus)通过手动计数计算细胞浓度。针对单独的脾细胞悬液，调整细胞密度。在将细胞铺在ELISpot板(预先包被有抗IFNγ抗体)中后，加入终浓度为2.5μg/ml的肽。在具有被水平铺板的不同小鼠的脾细胞和被垂直铺板的不同刺激物(即板1+5、2+6、3+7、4+8分别覆盖用肽#1-8、9-16、17-24、25-32的刺激)的水平朝向的ELISpot板上进行每孔2.5×105个脾细胞一式双份的孵育。在板5和10上，在第B、E或者H行分别用0.5μg刀豆球蛋白A(ConA)和0.5μg/ml葡萄球菌肠毒素B(SEB)作为阳性对照或者用培养基对照作为阴性对照进行孵育。过夜孵育19小时后，按照生产商的建议使ELISpot板显色。
n.a.＝不适用
鉴定出3种肽能够发动HIV特异性细胞应答。从这些肽中，测得在用H2-Kd限制性CD8T细胞特异性肽“Gag-CD8-1”刺激后的最高IFN1应答。这并不令人惊讶，因为该肽被频繁引用于文献中(例如Liu等，Vaccine，2006，24，第3332页)。第二种Gag特异性CD8T细胞限制性肽“Gag-CD8-2”也能够在所有小鼠中诱导良好的特异性IFN1释放。至今该肽仅被Shinoda等描述(Vaccine，2004，22，第3676页)，用以在较长肽的背景下诱导特异性CTL应答。但是，该文献中描述的较长肽不仅含有CD8T细胞表位，还含有额外可预测(因而是潜在的)的CD8以及CD4T细胞表位。因此，首次证明“Gag-CD8-2”能够诱导特异性INF1释放。基于表位预测，“Gag-CD8-2”是H2-Dd限制性CD8T细胞表位。第三种应答性肽“Nef-CD4-2”能够在大多数BALB/c小鼠中诱导特异性IFN1释放。该肽已经被Mitchel等描述(AIDS Research and Human Retroviruses，1992，8，第469页)为可能决定增殖性应答和细胞溶解活性的肽。基于所述表位预测，该肽被鉴定为主要限制于CD4T细胞(在PredBALB/C数据库中鉴定I-Ed分子的分值是9.6，IAd的分值是9.1，而CD8T细胞限制性H2d分子的分值低于7.9)。令人惊讶的是，发现除了这3种应答性肽以外，其他肽(例如基于已报道的文献的结果所选择的“Nef-CD4-1”或者“Tat-CD8-1”)并不能诱导特异性IFN1释放。这种矛盾的原因仍不为人所知。
总的来讲，用MVA-mBN120B在BALB/c小鼠中的免疫原性研究不仅证明HIV-多价抗原MVA-构建体具有免疫原性，还揭示所引导的免疫应答针对重组MVA产物中编码的至少2种蛋白(即检测到Nef和Gag特异性应答)，CD8T细胞限制性免疫应答不限于单个CD8T细胞分子(因为诱导产生H2-Kd和H2-Dd应答两者)，并且由MVA构建体诱导CD8以及CD4T细胞限制性应答两者。此外，这些结果表明，至少Nef基因和Gag基因在体内由载体表达。
实施例3：
人体内的临床研究
在I期研究中，在15名感染HIV-1的受试者中对重组疫苗的安全性、致反应性和免疫原性进行评估，所述疫苗表达HIV-1亚型B亚群的9个基因中的8个基因(包括Gag-pol融合基因、vpr、vpu、vif、rev、tat和nef)。该安全性测试包括分析征求的和主动提供的局部及全身性不适反应。此外，还测定了对载体的细胞和体液免疫应答。为了确定这种同质初免-加强免疫法诱导针对不同HIV抗原的广泛的由细胞介导的应答的潜力，所收集的样品还用于开发用以具体分析由所研究的疫苗MVA-mBN120B诱导的HIV特异性免疫应答的试验。
在该I期试验中，使在HAART(高活性抗逆转录病毒疗法)中稳定且CD4数量＞350/μl的15名HIV-1感染患者在第0、4和12周接受用2×108
Figure BPA00001522692500211
的3次接种。在整个研究过程中在日志卡上记录征求的不良事件(AE)，并获得主动提供的AE以及心脏指征和症状，直至第20周的随访。测定疾病特异性参数，例如患者的血浆HI病毒载量和CD4数量。利用ELISA测定牛痘(vaccinia)特异性体液免疫应答；在分批分析中分别利用具有作为刺激物的11个氨基酸重叠的15-mer的肽(用于诱导HIV应答)以及感染复数(MOI)为1的
Figure BPA00001522692500212
(用于诱导牛痘应答)由干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定对针对HIV-1插入物以及对牛痘的细胞免疫应答进行评估。
所述研究是单中心开放标记的I期试验，进行该试验是为了评估重组MVAHIV多价抗原疫苗在CD4数量＞350细胞/μl的HIV感染受试者中的安全性和致反应性。
受试者在第0天以及4周和12周后接受剂量为2×108半数组织培养感染剂量(TCID50)的MVA-mBN120B接种。疫苗经皮下施用。
本研究由长达3周的筛选期和长达20周的活性研究期(12周的初级期和8周的加强期)组成。每名受试者进行研究的总持续期长达23周。
合格的受试者进入以第1次访视起始的活性研究期。在第1次访视时，所有受试者都经皮下施用途径接受首次MVA-BN120B接种。所有受试者都在4周后的第3次访视时接种第二次接种，并在12周后(第1次访视后)的第5次访视时接种第三次接种。每次免疫由两次MVA-mBN120B施用组成，每次的施用剂量均是1×108TCID50。通过将0.5ml MVA-mBN120B注射到各臂的三角形区域(deltoid region)内而皮下施用疫苗。受试者接受3次免疫：第0周一次，4周后一次，12周后一次。记录接种过程中或者接种后出现的任何不良事件(AE)。
在各次例行访视时进行以下步骤和研究。在用活的痘苗病毒(VV)：改良的安卡拉痘苗病毒-Bavarian Nordic
Figure BPA00001522692500213
或者痘苗病毒WesternReserve(VV-WR)刺激后，进行酶联免疫斑点(ELISPOT)测定，用于体外定量测定冷冻储存的外周血单核细胞(PBMC)中产干扰素-γ(IFN-γ)的细胞。
简而言之，用捕获抗体(抗IFN-γ，根据生产商的说明(BD Biosciences，IFN-γELISPOT pair)使用)于4℃过夜包被96孔过滤板(HTS板，Millipore)。接着向孔内加入浓度为200,000细胞/200μl终体积的已复苏PBMC以及MOI为1的
Figure BPA00001522692500221
孵育一段时间(在37℃/5％CO2下过夜)后，清洗孔，并加入含生物素标记的检测抗体的PBS/9％FCS。用PBS/0.05％Tween 20清洗后，将链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶(HRP，BD Biosciences)加入孔中，随后清洗并加入沉淀物质(AEC，3-氨基-9-乙基咔唑，BD Biosciences)。通过利用CTL S5Microanalyzer对斑点进行计数，从而测定产生细胞因子的细胞数量。所报道的数值是经过背景校正的，并针对1×106个PBMC进行标准化。
为了评估牛痘特异性细胞应答，用MOI为1的活
Figure BPA00001522692500222
刺激细胞。
为了评估HIV特异性细胞应答，用肽库(15个氨基酸，其中有11个氨基酸重叠)刺激细胞，其中每种肽的终浓度均为5μg/ml。
用15个肽库进行刺激，并描述于表2。
Figure BPA00001522692500231
经高效液相色谱(Metabion，Martinsried，Germany and Proimmune，UK)证实以大于90％的纯度合成肽。
将载体或者HIV-MAG特异性信号定义为经背景校正后(减去SFU/1×106个未刺激细胞/高于背景≥2倍)每1×106个细胞至少50SFU的频率。报道了经背景校正后每1×106个细胞的SFU数量。
将载体或者HIV-MAG特异性T细胞应答定义为基线时无信号的受试者中信号的出现，或者基线时有信号的受试者中比基线数值高至少1.7倍的相对提高。
将在一次或者多次基线后访视中出现应答的受试者定义为应答者。
将特异性信号(对于每位受试者、每次访视和每种刺激条件)定义为实验(受刺激)孔中出现的形成斑点的细胞数量减去相应的背景(未刺激)孔中形成斑点的细胞数量。为了对应答进行计算，将少于50个斑点形成单位(SFU)的特异性信号归为零。
将阳性特异性应答定义为之前基线(V1)时低于测试截断值(50SFU/1×106PBMC)的受试者中出现等于或者高于测试临界值的阳性特异性信号，或者定义为基线(V1)信号等于或者高于测试临界值的受试者中SFU的数量比基线(V1)信号升高至少1.7倍。否则，除了在各基线后或者基线值丢失的情况下将应答情况定义为丢失外，将应答定义为阴性。
受试者可以在多次基线后访视中出现多于一次应答，但是仅需要一次应答即可认为其是特异性应答者。
利用刺激库(1-15)、蛋白/多聚蛋白(gag、pol、nef、tat、vif，混合物)和疫苗(即包括所有的HIV蛋白)，在3个水平上对所有受试者的HIV肽刺激进行分析，并且仅对应答者进行单独分析。
对于所有取样点，由刺激条件(包括用HIV-MAG肽和活
Figure BPA00001522692500241
刺激)衍生描述性统计数据，其包括观察数量、算术平均值以及标准偏差(SD)、SFU的中值和数量范围。在所有3个分析水平上对所有受试者进行上述分析，并仅对应答者进行单独分析(即在库水平、蛋白/多聚蛋白水平，以及疫苗水平上对应答者进行分析)。对于每个库、每种蛋白/多聚蛋白和全部HIV-MAG疫苗以及
Figure BPA00001522692500242
列表显示阳性特异性应答者的数量和百分比(应答者比例)以及95％Clopper-Pearson置信区间。基于具体分析中包括的受试者数量计算百分比。受试者仅需要在蛋白/多聚蛋白和疫苗水平上对一个库产生应答，即可以被认为是应答者。对于利用仅仅一种刺激条件(由
Figure BPA00001522692500243
刺激)测定的载体特异性应答者比例也是如此。
利用以下分类通过受试者对蛋白/多聚蛋白应答的累计描述表示HIV特异性应答的范围：对1种或者更多种、2种或者更多种、3种或者更多种、4种或者更多种、5种或者更多种以及6种蛋白/多聚蛋白产生应答的受试者数量。
接种前，如ELISPOT所测定的，87％的受试者对gag产生细胞免疫应答，60％的受试者对nef产生细胞免疫应答，53％的受试者对CTL表位产生细胞免疫应答，40％的受试者对混合蛋白和HTL表位产生细胞免疫应答，33％的受试者对pol产生细胞免疫应答，仅7％的受试者对tat和vif产生细胞免疫应答。
将每个肽库、蛋白/多聚蛋白以及HIV疫苗(HIV-MAG)的应答者比例总结于表3中，并且还显示了检测到应答的时间点。单次应答用以定义应答者的用途定义于SAP中，这是检测应答的灵敏度较高的方法；但是，该方法易于产生较高的假阳性率。因此，利用对应答者的更严格的定义进行补充分析，需要两次应答用以被定义为应答者。
同时如图2所显示，对
Figure BPA00001522692500251
疫苗载体中编码的HIV蛋白的应答比例(意味着新出现的应答或者比基线值增加的应答)很高，87％(13/15)的受试者产生应答。甚至在利用对应答者的较为严格的定义时，80％的受试者是HIV组分的应答者。对gag产生应答的受试者比例最高(73％，11/15，参见图2)。在gag中，p24的应答者比例(两个gag p24库分别为40％和47％)高于p17(20％)。甚至利用对应答者的较为严格的定义时，60％的受试者对gag产生应答。pol和混合蛋白库的应答者比例相近(53％，8/15，也参见图2)，并且在pol中，蛋白酶和RT具有最高且相等的应答者比例(27％)，其后是应答者比例为20％的整合酶。由于混合库含有来源于多种蛋白的肽，不能确定哪个是最具免疫原性的肽。利用对应答者比例的较为严格的定义时，pol(33％)和混合库(40％)的应答者比例仍然很高。Nef的应答者比例是40％(6/15，参见图2)，其中对库4的应答最高(27％)。利用对应答者比例的较为严格的定义时，Nef应答是27％。总共7名受试者(46.7％)和1名受试者(6.7％)对HTL和CTL多面体(polytope)肽产生应答，对于Tat和Vif均没有检测到应答者。
表3：访视和刺激条件下ELISPOT应答者比例(库，蛋白和HIV-MAG，N＝15)
Figure BPA00001522692500261
a对蛋白的应答。如果受试者在基线后访视时对至少一个蛋白库产生至少一次阳性应答，则该受试者是蛋白特异性应答者。
b对HIV-MAG的应答。如果受试者在基线后访视时对至少一种HIV蛋白(gag、pol、nef、tat、vif或者其混合物[p2p7、rev、vpr])产生至少一次阳性应答，则该受试者是HIV-MAG特异性应答者。
N＝特定组中的受试者数量，n＝应答者数量，％＝基于N的百分比。
在第0周、第4周和第12周进行免疫。
HIV特异性T细胞应答的范围(breadth)是指受试者产生新的T细胞应答或者提高的T细胞应答的蛋白/多聚蛋白的数量。表4显示对HIV蛋白的应答范围。接种使得大多数受试者对几种蛋白产生应答。对包括gag、pol、tat、vif、nef和混合物(p2p7、vpr、rev)的多达4种不同蛋白/多聚蛋白的应答显示于表4中。在所有受试者中，66.7％应答于至少2种蛋白/多聚蛋白，46.7％应答于至少3种蛋白/多聚蛋白。
N＝特定组中的受试者数量，R+＝作为上述任意蛋白的应答者的受试者数量，％＝基于N的百分比，95％CI＝Clopper-Pearson置信区间，下限和上限
所有15名受试者都接受3次接种，并对其进行随访，直至研究结束。没有严重AE的报道，也没有测试受试者由于相关AE而退出。所有受试者都报告有一般性(最常见的是恶心)和局部反应(最常见的是硬化)，具有一个3级事件(注射位点疼痛)。因此，HIV-1感染受试者对施用
Figure BPA00001522692500282
的耐受性良好。
所有受试者均应答于牛痘。图4A-D显示所示HIV-1蛋白的SFU/1×106PBMC中值。箭头表示接种。结果总结如下：
Gag应答者(11/15名受试者)：第13周时(第3次免疫后1周)中值峰为437SFU/1×106PBMC。
Pol应答者(8/15名受试者)：第13周时(第3次免疫后1周)中值峰为80SFU/1×106PBMC。
Nef应答者(6/15名受试者)：第12周时(第2次免疫后8周)中值峰为276SFU/1×106PBMC。
混合库(p2p7、vpr、rev)应答者(8/15名受试者)：第12周时(第2次免疫后8周)中值峰为65SFU/1×106PBMC。
首次免疫后20周，Gag、pol、nef和混合库应答性IFN-γ分泌型PBMC保持高于基线。
第12周时(第2次免疫后8周)，牛痘特异性应答者的SFU中值达到350SFU/1×106PBMC的峰，并且第3次接种后没有继续增加。如所观察到的HIV应答，首次免疫后20周，牛痘应答性IFN-γ分泌型PBMC的数量保持高于基线。第5周时(第2次接种后1周)抗牛痘抗体的血清转化率达到100.0％，并且在试验持续期内保持在100％。ELISA GMT结果显示首次接种后1周略有增加和强的加强应答。第3次免疫后1周，牛痘特异性抗体的滴度达到峰值876，并且在首次免疫后20周保持显著高于基线。
HIV-1感染受试者对
Figure BPA00001522692500291
疫苗候选物的耐受性良好。HIV特异性T细胞应答者比例是86.7％，牛痘特异性应答者比例是100％。观察到了对4种HIV蛋白/多聚蛋白库(gag、pol、nef和混合库[p2p7-vpr-rev])的广泛的细胞免疫应答；所有受试者中，66.7％应答于至少2种蛋白/多聚蛋白，46.7％应答于至少3种蛋白/多聚蛋白。对于诱导应答的所有HIV蛋白，首次免疫后20周时T细胞应答的中值保持高于基线。对于牛痘特异性T细胞应答也是如此。因此，疫苗能够诱导对多种HIV-1蛋白和牛痘产生广泛的免疫应答，并且接受首次免疫后20周时应答仍然高于基线。
本发明还包括以下项：
1.用作药物或者疫苗的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达至少3种HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
2.根据第1项所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达至少6种HIV蛋白或者其部分或衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
3.根据第1或2项所述的重组MVA，其中所述HIV蛋白的部分是指包含相应全长HIV蛋白的至少10个连续氨基酸的蛋白。
4.根据上述任一项所述的重组MVA，其中所述HIV蛋白的衍生物是指与HIV-1分离株HXB2R(genebank登录号是K03455)中各HIV蛋白显示至少50％同源性的氨基酸序列。
5.根据上述任一项所述的重组MVA，其中所述MVA基因组包含编码含有Vif、Vpu、Vpr和Rev的融合蛋白的表达盒，编码Nef的表达盒，编码Gag-Pol融合蛋白的表达盒以及编码Tat的表达盒。
6.根据上述任一项所述的重组MVA，其中所述Nef是N末端截短的Nef和/或其中所述Tat是反式显性Tat。
7.根据上述任一项所述的重组MVA，其病毒基因组中包含：
(i)作为融合蛋白表达Vif-Vpu-Vpr-Rev的表达盒，其被插入到基因间区域IGR 07/08中，
(ii)表达N末端前19个氨基酸缺失的Nef蛋白的第二表达盒，其被插入到IGR I4L/I5L中，
(iii)表达反式显性Tat的第三表达盒和表达Gag-Pol融合蛋白的第四表达盒，其均被插入到IGR 136/137中。
8.包含根据第1至7项中任一项所述的重组MVA以及任选地药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或添加剂的药物组合物或疫苗。
9.根据第1至7项中任一项所述的重组MVA或者根据第8所述的药物组合物或疫苗，其用于诱导人类受试者体内对至少3种HIV蛋白的T细胞应答，其中所述蛋白选自HIV Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
10.根据第1至7项中任一项所述的重组MVA或者根据第8所述的药物组合物或疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于诱导人类受试者体内对至少3种HIV蛋白的T细胞应答，其中所述蛋白选自HIV Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
11.根据第9项所述的重组MVA、药物组合物或疫苗或者根据第10所述的用途，其中所述HIV蛋白是Gag、Pol和Nef。
12.根据第9项所述的重组MVA、药物组合物或疫苗或者根据第10所述的用途，用于诱导对至少4种HIV蛋白的T细胞应答，其中所述蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
13.根据第9或12项所述的重组MVA、药物组合物或疫苗或者根据第10或12所述的用途，用于诱导对HIV蛋白Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef的T细胞应答。
14.根据第1至7项中任一项所述的重组MVA或者根据第8所述的药物组合物或疫苗，用于治疗和/或预防HIV感染和/或AIDS。
15.根据第1至7项中任一项所述的重组MVA或者根据第8所述的药物组合物或疫苗在制备的药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防HIV感染和/或AIDS
Figure ISB00000780146400021
Figure ISB00000780146400031
Figure ISB00000780146400041
Figure ISB00000780146400051

Claims (25)

1.一种重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其病毒基因组中包含用于表达至少6种HIV蛋白或者其中包含对应于全长蛋白的至少10个连续氨基酸的所述蛋白的一部分或所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef，所述病毒用于诱导人类受试者体内对选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef中至少3种HIV蛋白的T细胞应答，其中HIV蛋白氨基酸序列的衍生物是显示与已知HIV分离株中相应HIV蛋白的氨基酸序列具有至少50％同源性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其中所述病毒基因组包含用于表达至少6种HIV蛋白或其部分或所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
3.根据权利要求1或2所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)，其中所述病毒基因组包含用于表达至少8种HIV蛋白或其部分或所述蛋白的衍生物的一个或者多个表达盒，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Tat、Vif、Vpu、Vpr、Rev和Nef。
4.权利要求1至3中任一项所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)在制备药物或者疫苗中的用途，所述药物或者疫苗用于诱导人类受试者体内对至少3种HIV蛋白的T细胞应答，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef。
5.一种诱导人类受试者体内对至少3种HIV蛋白的T细胞应答的方法，所述HIV蛋白选自Gag、Pol、Vpr、Vpu、Rev和Nef，所述方法包括施用权利要求1至3中任一项所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)。
6.根据权利要求1至3中任一项的所述重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、权利要求4所述的用途或者权利要求5所述的方法，其中所述MVA诱导人类受试者体内对至少4种HIV-1蛋白的T细胞应答。
7.根据权利要求1至3和6中任一项所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、权利要求4或6所述的用途或者权利要求5或6所述的方法，其中所述MVA诱导人类受试者体内对至少5种HIV-1蛋白的T细胞应答。
8.根据权利要求1至3、6和7中任一项所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、权利要求4、6和7中任一项所述的用途、或者权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述MVA诱导人类受试者体内对至少6种HIV-1蛋白的T细胞应答。
9.根据权利要求1至3和6至8中任一项所述的重组的改良安卡拉痘苗病毒(MVA)、权利要求4和6至8中任一项所述的用途、或者权利要求5至8中任一项所述的方法，其中MVA诱导的人类受试者体内的T细胞应答所针对的HIV-1蛋白包括Gag、Pol和Nef。
10.根据权利要求1至3和6至9中任一项所述的重组MVA、权利要求4和6至9中任一项所述的用途、或者权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述受试者是无免疫应答的。
11.根据权利要求1至3和6至10中任一项所述的重组MVA、权利要求4和6至10中任一项所述的用途、或者权利要求5至10中任一项所述的方法，其中所述受试者感染了HIV-1。
12.根据权利要求1至3和6至11中任一项所述的重组MVA、权利要求4和6至11中任一项所述的用途、或者权利要求5至11中任一项所述的方法，其中所述受试者的CD4细胞数量少于350/μl。
13.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中所述MVA的基因组包含编码含有Vif、Vpu、Vpr和Rev的融合蛋白的表达盒、编码Nef的表达盒、编码Gag-Pol融合蛋白的表达盒以及编码Tat的表达盒。
14.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中所述Nef是N末端截短的Nef和/或其中所述Tat是反式显性Tat。
15.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中病毒基因组中包含：
(i)表达作为融合蛋白的Vif-Vpu-Vpr-Rev的表达盒，其被插入到基因间区域IGR 07/08中，
(ii)表达缺失N末端前19个氨基酸的Nef蛋白的第二表达盒，其被插入到IGR I4L/I5L中，
(iii)表达反式显性Tat的第三表达盒和表达Gag-Pol融合蛋白的第四表达盒，其均被插入到IGR 136/137中。
16.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA，其任选地与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或添加剂一起施用。
17.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，用于在治疗和/或预防HIV感染和/或AIDS。
18.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法在制备药物中的用途，所述药物用于治疗和/或预防HIV感染和/或AIDS。
19.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中向人类受试者施用剂量为107至109TCID50/ml的所述重组MVA。
20.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中向人类受试者施用剂量为108至109TCID50/ml的所述重组MVA。
21.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中向人类受试者施用剂量为2×108TCID50/ml的所述重组MVA。
22.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中所述重组MVA被施用至少3次。
23.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中在第0、4和12周施用所述重组MVA。
24.根据上述权利要求任一项所述的重组MVA、用途或者方法，其中所述重组MVA是MVA-BN。
25.包含如上述权利要求任一项中所述的重组MVA的药物组合物或者疫苗组合物。
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