CN102648003A - 选择性裂解的全细胞疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供了免疫原性组合物和制备免疫原性组合物的方法，所制备的免疫原性组合物具有灭活的、全细胞肺炎链球菌的、诱导多重免疫力的部分，所述方法通过以下述方式选择性裂解全细胞细菌制剂来制备所述免疫原性组合物：将主要诱导抗体应答的可溶部分和主要诱导抗体非依赖性应答的细胞部分保留在该免疫原性组合物中。

Description

选择性裂解的全细胞疫苗

相关申请的交叉引用

本申请依据美国法典35U.S.C.§119(e)，要求2009年10月9日提交的美国临时专利申请No.61/250,348和2010年9月7日提交的美国临时专利申请No.61/380,429的优先权，以引用的方式将二者的内容整体并入本文。

政府支持

本发明是在美国国立卫生研究院给予的R01AI066013、AI067737-01和AI51526-01的美国政府支持下完成的，美国政府对本发明持有一定权利。

技术领域

本发明涉及分子遗传学、免疫学和细菌学。具体而言，本发明的实施方式提供了全细胞免疫原性制剂，该制剂赋予了抗体介导和T淋巴细胞介导相协同的免疫应答。就肺炎双球菌（pneumococci）而言，该全细胞免疫原性制剂诱发了抗体介导和T淋巴细胞介导（包括IL-17A介导的）相协同的针对致死性感染和粘膜肺炎双球菌定殖（colonization）的防护作用。

背景技术

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae；肺炎双球菌）感染是世界范围内发病和死亡的主要原因，并在儿童和老年人中引发重病（包括肺炎、脑膜炎和菌血症）和一些不太严重的感染（如中耳炎）。在发展中国家，每年几乎有一百万儿童死于肺炎双球菌疾病的感染。

肺炎链球菌多药耐药菌株的快速出现限制了抗生素的效力并鼓舞了利用疫苗预防肺炎双球菌感染的新一轮兴趣。获批的肺炎双球菌疫苗由血清型特异性的荚膜多糖或荚膜多糖-蛋白缀合物的可注射多价混合物组成，并因此仅对所包含的血清型有效。例如，尽管7价肺炎双球菌缀合物疫苗（PCV7）显著地降低了疫苗型（VT）菌株引起的侵袭性肺炎双球菌疾病的发病率，但是最近的研究显示出非VT血清型逐步取代了VT血清型，潜在地限制了疫苗的有用性。这使得对如下内容进行了评估：是否可通过血清型非依赖性抗原（serotype-independent antigens）的免疫接种来预防肺炎双球菌的定殖。例如，用在整个肺炎链球菌种中广泛保守的某些蛋白进行的粘膜免疫显示出诱发全身性的、粘膜抗体并赋予了针对肺炎双球菌疾病和定殖的防护作用。

继续对免疫原性组合物（包含肺炎链球菌多糖和蛋白）的鉴定进行研究，所述组合物针对所有血清型均引起抗体介导的免疫应答和T淋巴细胞介导的强免疫应答这两种免疫应答。可选策略使用了灭活的肺炎双球菌细胞（提呈多种血清型非依赖性的抗原）作为廉价疫苗，但是此前未对这些组合物的免疫原性进行足够的探究。因此，对制备全细胞肺炎双球菌疫苗的新策略和了解相关免疫机理存在需要。

发明内容

本文中给出的实施方式提供了包括革兰氏阳性细菌（例如肺炎双球菌）细胞制剂的免疫原性组合物，所述制剂已通过具有如下特点的方法灭活：增加了经传统方法灭活的制剂中未发现的免疫原性组分的暴露，并且保留了细菌尺寸颗粒的优点用于抗原摄取。所述免疫原性组合物包括灭活的、全细胞制剂的细胞部分（cellular fraction）和上清液（例如，溶剂或水相）部分，该组合物与分别给予的细胞部分和可溶部分（solublefraction）相比，显示出协同的免疫原性性质。这些免疫原性组合物并不依赖于肺炎双球菌的荚膜多糖，提供荚膜血清型非依赖性的免疫原性。

在某些实施方式中，所述肺炎双球菌为无荚膜的变体。在某些实施方式中，所述肺炎双球菌为缺乏lytA基因（指定（specifies）主要的自溶素）的变体，因此，这一肺炎双球菌变体的培养物可生长到相对高的密度而不自溶。在其它实施方式中，已对肺炎链球菌溶血素（PdT，细胞毒素）的基因进行了取代以指定突变的蛋白PdT，所述突变蛋白PdT无毒，但仍然是TLR4激动剂（具有引发（engage）固有免疫系统的能力）。

在本发明的一个实施方式中，用试剂（如β-丙内酯（BPL））对肺炎双球菌细胞进行处理（灭活）：（a）该试剂以释放出多种保护性免疫原的方式使细胞部分裂解，所述免疫原经验证为可溶分子；（b）该试剂可被除去而不用对收集的细胞进行漂洗，从而使释放入悬浮液中的免疫原可容易地被保留在制剂中；以及（c）该试剂维持了肺炎双球菌细胞的整体结构，以促进通过对具有TLR配体的细菌尺寸颗粒进行应答的免疫系统的传入支（afferent limb）的那些组件进行的摄取。在类似的实施方式中，所述试剂为氯仿或三氯乙烯。

在另一实施方式中，通过包括声波处理的方法来制备所述全细胞免疫原性组合物制剂。

可通过注射、也可通过鼻腔途径、舌下途径、颊（buccal）途径或透皮途径给予本发明的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可与适当的佐剂（如铝佐剂（alum）或肠毒素相关分子（例如霍乱毒素））联合使用。

本文所述的肺炎双球菌免疫原性组合物制造起来相对简单且廉价，并且比之前所述的肺炎双球菌疫苗更加有效。例如，少至1.7μg的剂量显著地使小鼠免于致死实验性肺炎。

附图说明

图1A显示出在所示剂量时（x轴），与经乙醇处理的细胞制备的肺炎双球菌全细胞（WC）疫苗（WCE）相比，使用氯仿处理的细胞制备的肺炎双球菌全细胞（WC）疫苗（WCC）增强的保护作用。每隔一周，将疫苗以所示剂量经鼻内给予小鼠，共给予两次，所述疫苗使用1μg的霍乱毒素（CT）作为佐剂。在最后一次免疫接种3周后，用不同的血清型（血清型6B）经鼻内对小鼠进行激发（challenged）。在激发1周后，对每鼻腔洗涤物的菌落形成单位（CFU）进行测定。在比WCE的剂量低10-100倍时，WCC具有显著的保护作用。图1B显示出在10⁸剂量时WCB（使用β-丙内酯制备的WC疫苗）的保护作用（图6A和图6B显示出其在单独的测试中具有与WCC等同的效力）。图1C给出了WCE、WCC以及WCC离心后的上清液部分（WCCsu）的比较；剂量为10⁸的WCE或10⁸的WCC或等价量的WCC上清液。所示的组接受CT（霍乱毒素）作为佐剂；一个对照组接受盐水而不是CT；WCCsu的保护作用大于WCE，具有统计显著性。图1D显示出裂解物具有同等的保护作用，图1E显示出通过血细胞检测的，该裂解物同等地在体外致敏了IL-17A的应答，IL-17A为定殖模型中的保护作用的相关物（correlate）。

图2A-图2B显示出激发前免疫应答与定殖和吸入性脓毒病模型中的保护作用的关系。将剂量为1μg、10μg或100μg的WCB(使用β-丙内酯制备的WCV)吸附至Al(OH)₃(0.21mg Al/剂)，并每隔两周经皮下注射一次，共注射三次。图2A显示出血清型6B的定殖与IL-17A应答的关系；定殖与IL-17A的激发前浓度呈反相关。图2B显示出吸入性脓毒病模型中的存活率与抗WCA(全细胞抗原)IgG的激发前滴度范围的关系。在第三次给药8天后，将小鼠用异氟醚麻醉并经鼻内(i.n.)给予处于100μL PBS中的10⁶CFU的血清型3菌株WU2。这一模型一般在激发后的1周内在大多数(＞90%)首次接受试验的小鼠(

mice)体内诱发脓毒病。存活率随滴度升高而增高，并且在滴度＞10,000任意单位(arbitrary units)时，存活率为100%。

图3A和图3B显示出由肺炎双球菌细胞(具体地，RM200细胞)释放的蛋白的SDS-PAGE的放射显影照片。图3A显示出经氯仿灭活的细胞悬液离心(16,000×g；5min)后的上清液(su)(WCCsu)或经另一有机溶剂三氯乙烯灭活的细胞悬液离心(16,000×g；5min)后的上清液(WCTsu)；这两种制剂在灭活后均未漂洗。将其与用乙醇灭活的疫苗悬液的上清液(WCEsu)进行比较，该疫苗在传统疫苗制备过程中进行了漂洗；仅残余了痕量的上清液蛋白。图3B显示出经β-丙内酯灭活的细胞的上清液(WCBsu)，类似地，该上清液在灭活后未漂洗。

图4A和图4B显示出通过WCB上清液或沉淀物(pellet)(细胞)部分的诱导，致敏IL-17A对WCA的应答(图4A)和抗体对WC抗原的应答(图4B)。通过在16,000×g离心30min制备所述上清液(WCBsup)。将抗原吸附至Al(OH)₃(0.24mg Al/剂)。各小鼠每次免疫接种时接受30μg的剂量(蛋白含量)。将小鼠每隔两周进行免疫接种，共免疫接种两次，在第二次免疫接种1周后取血样用于分析。细胞部分在诱发IL-17A的应答中更加有效，而上清液在诱发抗体应答中同样有效或更有效。

图5A-图5C显示出Al(OH)₃吸附对WCC的免疫原性的影响。将抗原在4℃孵育18h，同时轻缓地混合，从而提供1μg、10μg或100μg的蛋白和0.21mg Al/0.2ml剂。将吸附或未吸附的抗原或者单独的Al(OH)₃每隔两周于下背区域(lower back area)的皮肤下注射到小鼠体内，共注射三次。在第三次注射2周后，用肺炎双球菌6B型菌株0603激发小鼠。在激发10天后，对从鼻腔洗涤物样品中回收的CFU进行测定。在第8列数据中，WCC-Al(OH)₃制剂在37℃孵育了1个月，在注射前储存于4℃（Δ标出）。图5A显示出通过第二次注射两周后所取血样检测的在体外致敏IL-17A对WCA的应答；图5B为在那些血样中通过ELISA测定的抗WCA的IgG抗体。图5C显示出将血清型6B从鼻咽的清除。除非标明，在该图和随后的图中，通过Mann-Whitney U计算出的与单独的佐剂相比较的差异显著性以星号示出：*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。依据所有三个标准，Al(OH)₃都使得免疫原性极大地增高。

图6A-图6B给出了WCC与β-丙内酯灭活细胞（WCB）制成的抗原之间的比较；以及CD4+细胞在定殖模型中的作用。实验安排、分析和激发与图5中一样。图6A显示出IL-17A的致敏；剂量-应答显示出WCB与WCC的免疫原性相当。图6B显示出对将血清型6B菌株从鼻咽的清除；依据这一标准，WCB和WCC同样有效。通过在激发前1天和激发后2天、5天、8天给予CD4抗血清，对WCC免疫动物组的CD4+细胞依赖性进行评价（在标注α-CD4的列中）；在这些动物中，上述增强的清除被消除。

图7A-图7C显示出WCB的3次注射实验安排或2次注射实验安排对致死的血清型3吸入性脓毒病的影响。将剂量为1μg、10μg或100μg的WCB吸附至Al(OH)₃（0.21mg Al/剂）并每隔两周给予。图7A显示出在3次注射实验安排中，在第三次给药8天后，将小鼠用异氟醚麻醉并经鼻内给予处于100μL PBS中的10⁶CFU的菌株WU2。示出了存活曲线。将7天后仍活着的小鼠处死，并培养以验证肺炎双球菌菌血症：仅有的菌血症动物为单用Al(OH)₃的三个对照中的两个。与100μg的剂量一样，10μg的剂量具有完全的保护作用。在所示组中评价保护作用对CD4+细胞的依赖性，在激发前1天和激发后3天向所示组给予CD4抗血清；与定殖模型相反，没有可检测到的保护作用的消除，表明单独的抗体应答对保护作用来说是足够的。图7B和图7C显示出更简单的2次注射实验安排。图7C显示出在激发前2天所取的血浆样品中，给予了100μg剂量的所有动物具有超过10,000的滴度，而给予了10μg剂量的动物中并非所有的动物都具有超过10,000的滴度。在第二次给药9天后，小鼠被激发，如同图7A中一样将存活率绘制成图表；对于10μg剂量，保护作用是部分的，对于100μg剂量，保护作用是完全的，这与抗体应答的情况一致。

图8A-图8C显示出兔子免疫接种研究的结果。在第1天、第15天和第29天，经肌内注射向各包括三只雌性新西兰白兔的组分别给予：盐水；单独的Al(OH)₃（0.6mg Al）；剂量为50μg、500μg或5000μg的Al(OH)₃吸附的WCB；或DTwP疫苗（毒性对照）。在免疫接种前和在第43天取血清。图8A显示出在第43天时抗WCA的血清IgG抗体的滴度剂量依赖性地增高。图8B反映了被动保护：利用来自兔子的第45天的混合血清（pools of sera）检测血清型3小鼠肺炎模型中的被动保护，所述兔子用Al(OH)₃和Al(OH)₃吸附的WCB以500μg的剂量进行了免疫接种。将血清在56℃加热30min以使补体失活。如图7A中所述，在用菌株WU2激发前一天，经腹膜内向小鼠给予200μL的其中一种混合血清和300μLPBS。存活曲线显示出了免疫血清的完全保护作用。图8C显示出调理吞噬（opsonophagocytic）灭活分析。将来自于用单独的铝佐剂或铝佐剂吸附的WCB（500μg/剂）免疫接种了三次的兔子的血清经加热处理后，用于使用血清型6B肺炎双球菌菌株（0603）进行的表面灭活分析中。在所测试的三个稀释度（1/5、1/20和1/80）下，与处在同样稀释度的免疫前血清相比，免疫血清显著地增高了肺炎双球菌的调理吞噬灭活。通过Mann-Whitney U检验，**P<0.008。

图9A-图9B详细地示出了小鼠对Al(OH)₃吸附的WCB（通过皮下注射给予三次）的剂量-应答。图9A：IgG抗体应答；图9B：IL-17A应答。依据这两种标准，基于灭活前的活细胞计数，最佳剂量为3.3E7，对应的蛋白剂量为33μg。通过3.3μg而非1μg产生了统计上显著的IL-17A应答，而显著的抗体应答是由少至1μg产生的。除非另作说明，如本文所使用的并贯穿本申请文件的E5=10⁵、E6=10⁶、E7=10⁷、E8=10⁸、E9=10⁹、E10=10¹⁰，依此类推。

图10A-10B显示出在所示剂量时，经颊途径和舌下途径的WCC抗原的免疫原性（基于灭活前的活细胞计数），利用10μg双重突变的LT佐剂R192G/L211A（dmLT）一起进行测试。以周为间隔免疫接种三次。如图2中所述进行激发。图10A绘制了抗全细胞抗原（WCA）血浆抗体的滴度（这里，颊途径被称作“口腔”途径）；如左侧所示，尽管比皮下途径低得多，但是经上述两种途径都存在着可测的对WCC的抗体应答；图10B反映了通过血细胞检测的在体外致敏IL-17A对WCA的应答（pg/ml，y轴）；上述两种途径都存在着剂量依赖的应答。

图11A显示出颊途径和舌下途径都诱导了剂量依赖性地增高的将血清型6B从鼻咽的清除。图11B显示出IL-17A生成和定殖之间的相关性。图11C显示出血清型应答和定殖之间的相关性。

图12A和图12B给出了当将WCC与大肠杆菌（E.coli）不耐热毒素（LT）一起给予时的免疫原性数据（抗WCA IgG和IL-17A）。图12C和图12D显示出超声产生的WCC片段经透皮途径（TCI）的免疫原性。以等同于10⁸细胞的剂量，将在纱布贴剂中的平均直径为100nm或20nm的片段连同1μgLT佐剂（如果示出）一起施用到被轻轻摩擦以去除角质层的背部皮肤上。将所述贴剂留在原位18h。以两周为间隔将这一免疫接种进行三次。在第三次免疫接种10天后取血样用于IL-17A的分析，在6天后进行肺炎双球菌的激发。图12C显示出对于经TCI和经i.n.给予，通过血细胞检测的在体外致敏IL-17A对WC抗原的应答的数据的比较。图12D：TCI给药和i.n.给药间的血清型6B定殖清除数据的比较。对于其他细节，参见图1A-图1E的描述。*P<0.05、**P<0.005、***P<0.0005。

图13A-图13C显示出免疫接种的次数和剂量与抗体应答（图13A）、IL-17A应答（图13B）以及定殖（图13C）之间的关系。

图14显示出IL-17A刺激（stimulation）数据，其中，“sup”表示利用WCB离心后收集的上清液进行刺激。

图15显示出与盐水相比，单独给予的佐剂显示出了加速肺炎双球菌清除的迹象（虽然统计学上并不显著），该迹象为这一模型中的预期结果，在这一模型中接种和激发通过相同的途径进行。然而，当和10⁸的WCE一起给予时，mLT可提供出色的保护作用。

具体实施方式

本文的发明并不限于本文所述的和那些可变化得到的具体方法学、方案和试剂等。本文所使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而并不意图限制本发明的范围，本发明的范围只通过权利要求进行限定。

除非上下文中清楚地另有所示，本文和权利要求中所使用的单数形式包括复数的情况，反之亦然。除了在操作实施例中以外，或另有所示，本文所使用的所有表示成分的量或反应条件的数字均应被理解为在所有情况下由术语“大约”修饰。

为了描述和公开的目的，所有的专利和其它已确定的出版物在此明确地引入本文作为参考，例如，所述出版物中描述的方法学的使用可能与本发明相关。这些出版物仅因为它们的公开早于本发明的申请日而提供。这方面的任何内容不应视为承认发明者没有权利借助于先前的发明或因为任何其它原因而将公开的内容提前。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息，并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。

除非另有定义，本文所使用的所有科技术语具有与本领域普通技术人员通常的理解相同的、与本发明有关的含义。尽管任何已知的方法、设备和原料可被用于本发明的实际操作或测试中，就这一点而言，本文已对这些方法、设备和原料进行了描述。

本发明与全细胞肺炎双球菌制剂的选择性裂解有关。尽管在本领域中已知许多微生物失活试剂，但是本发明以如下方式提供选择性裂解和失活：使得在诱发T-淋巴细胞介导的免疫应答和抗体介导的免疫应答中高度有效的免疫原制剂成为可能。以本文所述的方式利用技术和试剂使细菌制剂选择性失活和裂解并显示出出乎意料的免疫原性，这在本领域中并不是已知的。

在低收入国家中，肺炎链球菌（肺炎双球菌）在儿童中造成了主要的疾病负担（O’Brien等，Lancet，374，893（2009））。荚膜多糖缀合物疫苗提供了血清型特异性保护，但该疫苗具有如下缺点：有限的血清型覆盖度；血清型替代；以及高的生产、贮存成本；和注射（Hanage，FutureMicrobio.23（2008）；Ray，Vaccines，1，65（2002））。因此，开始探索基于种共有的（species-common）蛋白抗原的、可能更经济的血清型非依赖性疫苗（serotype-independent vaccines）（Tai，Crit.Rev.Microbio.，32，139（2006））。在一种这类方法中，出于最大化地暴露种共有的荚膜下抗原的目的，对无荚膜肺炎双球菌的灭活细胞进行了研究。已经熟知可将失活的细菌细胞用作疫苗；已将通过加热、酚、甲醛或紫外辐射灭活用于这类失活。然而，对于肺炎双球菌的无荚膜细胞，比起传统的失活方法（如加热等），用70%（体积/体积）乙醇在4℃灭活该细胞产生了免疫原性更强的抗原。这一抗原制剂被称作“全细胞抗原”（WCA），当用合适的佐剂进行配制时，被称作“全细胞疫苗”（WCV）。这里要澄清的是，这一抗原被叫做WCE是为了表示用乙醇进行了失活。因为鼻内（i.n）应用途径对诱导全身性免疫和粘膜免疫都是有效的，因此最初对鼻内（i.n）应用进行了检测。利用WCE外加作为粘膜佐剂的霍乱毒素（CT）进行的鼻内免疫接种预防了大鼠中致死的血清型3肺炎，并减少了用血清型6B肺炎双球菌进行的小鼠的非致死鼻内激发产生的鼻咽（NP）定殖（Malley等，Infect.Immun.，69，4870（2001））。后一激发之所以有意义是因为，众所周知的是，鼻咽定殖是肺炎双球菌感染中必要的第一步骤（Austrian，J.Antimicrob.Chemother.，18(A)，35（1986））。无论是通过血清型6B的菌株还是通过血清型23F的菌株，这一激发引起中耳定殖和NP定殖，二者均可通过WCE得以减少（Malley等，Infect.Immun.，72，4290（2004））。尽管通过i.n.接种提高了血清抗体的水平，但是在无抗体时，通过CD4T细胞依赖的、白细胞介素17A（IL-17A）介导的机制，在小鼠体内诱导了针对定殖的防护作用（Lu等，PLoS Pathog.，4，e1000159（2008）；Malley等，PNAS，102，4848（2005））。在该定殖模型中，少至10⁷个细胞（大约10μg蛋白）的WCE（顺序给予三次）具有保护作用（Trzcinski等，Infect.Immun.，76，2678（2008））。这些在先研究中，用表达天然肺炎链球菌溶血素（有效的溶细胞素）的菌株Rx1AL制得WCE。作为本文所述的可选策略并预期了人类研究，可使用具有突变W433F、D385N和C428G的肺炎链球菌溶血素（PdT）的衍生物，所述突变致使分子变为非溶血性的并且不能激活补体（Berry等，Infect.Immun.，63，1969（1995）），但是维持了其TLR4激动剂性质（Malley等，PNAS，100，1966（2003））。此前，细胞在Todd-Hewitt-酵母肉汤中生长，该肉汤含有牛心浸液。此外，为避免牛成分的任何危害，可使用生长在大豆基培养基（Liberman等，J.Ind.Microbio.Biotech.，35，1441（2009））中的细胞。

WCE的一个缺点是必须从灭活细胞中分离出上述的70%乙醇，例如通过离心分离。本发明还提供了规避安全操控和处理大体积乙醇的挑战的技术，提供了至少三种可选的在低浓度下具有杀菌性的失活试剂：氯仿、三氯乙烯和β-丙内酯。由于氯仿和三氯乙烯二者均是高挥发性的、而β-丙内酯可通过加热失活，所以无需在失活后将细胞从水相中分离，便可将这些试剂除去，这也使得首次可方便地对由所述灭活细胞释放的可溶组分进行检测。如本文所给出的，还对由声波处理产生的可溶组分进行了检测。

肠毒素作为佐剂的可能的副作用（Mutsch等，N.Engl.J.Med.，350，896（2004））以及鼻内接种的其它问题促使对遗传上去毒的肠毒素衍生物和颊给药途径及舌下给药途径进行考虑。还用声波处理的抗原制剂对透皮免疫接种进行了检测。检测了这些不同的免疫接种程序对定殖的防护作用，证实加速了用血清型6B菌株进行鼻内激发后的鼻咽定殖清除（Lu等，2008）。本文给出的结果表明了可通过多种试剂使细胞失活以生成有效的全细胞抗原，可以多种方式给予所述全细胞抗原从而顺应具体接种计划的偏好。

例如，将β-丙内酯（BPL）用于无荚膜全细胞肺炎链球菌菌株的裂解。BPL处理产生具有免疫原活性的两种组分。在BPL处理后，部分裂解的细胞作为细胞部分在结构上仍然是完整的。这一细胞部分在抗体诱导中略微有效，而在IL-17A诱导中极其有效，因此，促进了病原细菌的吞噬灭活（例如通过多形核白细胞）及随后的抗原提呈。此外，肺炎链球菌的BPL裂解使抗原释放入可溶（水性的）部分中，所述可溶部分以血清型非依赖性的方式发挥保护作用。通过水解BPL、并取消将它们从细胞中除去所需要的步骤，可将这些可溶组分保留在免疫原性组合物中。本文还在实验上证明了这一可溶部分的有效性。因此，当接种经处理的细菌制剂时，引发了独特且血清型非依赖性的双管齐下的（two-pronged）、T淋巴细胞介导的免疫和抗体介导的免疫。

此前，用与肠毒素相关佐剂一起给予的灭活全细胞肺炎双球菌疫苗进行的粘膜免疫已经显示出，赋予了抗小鼠体内的中耳定殖和鼻咽定殖的多血清型保护作用。除可能难以实施的新的粘膜免疫策略外，本发明的实施方式提供皮下注射或肌内注射。例如，将肺炎双球菌菌株RM200进行工程化，使之无荚膜、无自溶素、并表达无毒的突变型肺炎链球菌溶血素类毒素（pneumolysoid）。培养物在无牛成分的大豆基培养基中生长，用氯仿或β-丙内酯进行灭活，并注射入C57131/6小鼠中，同时注射或不注射铝佐剂。

在激发时，定殖防护作用从机理上取决于CD4+T细胞的存在；相比之下，在3型吸入性脓毒病模型中，在激发时对于保护作用来说不需要CD4+T细胞，表明单独的抗体足以抵御这一模型中的死亡。在试验性的毒性研究中，接受了顺序肌内注射的兔子在注射部位表现出局部反应原性但无临床征象。由此产生的兔抗血清在体外吞噬灭活分析中有活性，并在3型吸入性脓毒病模型中对小鼠进行被动保护。

本发明解决了肺炎双球菌疫苗领域中的主要需求：现行的疫苗组合物利用了血清型特异性荚膜多糖以对特异的血清型进行免疫，而本发明并不是基于荚膜多糖诱导的应答。因此，可联合使用所得到的裂解细胞和可溶抗原以赋予多血清型疫苗可应用性的优点。特别是在其它疫苗由于血清型选择性而对覆盖度的缺口敏感时，这一点十分有用。其次，

（常用的疫苗）的市价为65$每剂，而经估计，本文所述疫苗的生产成本为0.20$每剂。因此，本实施方式满足了本领域中潜在的生物学需求和经济需求。

具体而言，已知当经鼻内给予时，WCE通过致敏引起促吞噬作用细胞因子IL-17A的确立来保护小鼠免于NP定殖（如用血样进行的体外分析所表明的）；还已知伴随的抗体应答是不必要的（Lu等，PLoS Pathog.，4，e1000159（2008）；Malley等，PNAS，102，4848（2005））。在本发明中，分别通过氯仿（C）、三氯乙烯（T）或β-丙内酯（B）对肺炎双球菌疫苗菌株RM200进行灭活以制造WCC、WCT和WCB制剂。对于接种实验，将灭活的细胞悬液以单次使用的小份冻干并以蔗糖作为稳定剂，在临试验前进行再水化。

以CT为佐剂，将这些制剂与WCE各经i.n.给予两次，并对这些制剂与WCE进行如下方面的比较：对用血清型6B的肺炎双球菌菌株进行的鼻内激发的加速清除；以及在体外对IL-17A应答的致敏。按照这两个标准，WCC、WCT和WCB都比WCE更加有效。具体而言，图1A显示出在每次免疫接种的剂量为10⁸和10⁷时WCE有保护性作用（即，显著地降低了由用6B菌株0603经鼻内激发的小鼠的鼻咽中回收的CFU的数量），但在10⁶时没有保护性作用，而WCC在10⁶时也有保护性作用（剂量被表示成灭活前的CFU数量，这一值对应于约1.7μg干重或1μg的蛋白）。如WCE一样，WCC在体外致敏了通过T细胞表达的IL-17A：在激发前1周，各WCC免疫接种小鼠的IL-17A表达与激发后回收的CFU呈反相关（图2A，Spearman检验p=-0.54，P=0.0007）。

在单独的实验中，在剂量比WCE低10-100倍时，WCT有显著的保护性作用。因此，WCC和WCT显示出比WCE有效约10倍。当经鼻内给予时，WCB同样有保护作用：它有抗定殖的保护作用（图1B）并且在IL-17A致敏中有活性；所述保护作用与IL-17A分析相关。在单独的实验中，WCB显示出具有类似于WCC的定量效力（图6A和图6B）。

在水性悬浮液中用上述任何试剂对肺炎双球菌RM200细胞进行灭活，使多种蛋白释放入可溶（水性的）相中。由于乙醇能与水混溶并且难以从水中除去，所以必须将乙醇灭活的细胞从水相中分离，以免有毒溶剂污染WCE疫苗。相比之下，不混溶的溶剂氯仿和三氯乙烯可容易地从水相中除去，并且β-丙内酯可被容易地分解成无害成分；所以在用这些试剂灭活后，可将水溶相与细胞一起保留在疫苗中。当从疫苗悬浮液中将细胞离心除去后，通过电泳对疫苗进行分析时，WCC、WCT和WCB的上清液部分明显地显示出所释放蛋白的多样性，WCE（从此前经相分离的WCE疫苗中获得）则不出所料地仅显示出痕量的这类蛋白。所释放的蛋白本身已经显示出具有实质性的保护活性，因此，相对于WCE，显然有助于本申请公开的疫苗制剂的更强的效力。

具体而言，使肺炎双球菌疫苗菌株RM200在大豆基培养基中生长至对数生长晚期，随后漂洗并在乳酸化林格氏溶液中浓缩至A₆₀₀为32。通过在4℃下与氯仿（C）（1/40[体积/体积]）搅拌2h、或与三氯乙烯（T）（1/40[体积/体积]）搅拌2h、或与β-丙内酯（B）（1/4,000[体积/体积]）搅拌24h进行灭活。细胞不用进一步漂洗：通过冻干将C和T除去，通过在冻干前于37℃孵育2h使B分解。所得到的疫苗抗原制剂分别被称为WCC、WCT和WCB。为了对从所述细胞中释放的物质进行检测，将冻干的WCE、WCC、WCT和WCB的样品以A₆₀₀为32的量悬浮于LR中，在25℃涡旋1min，然后在16,000×g离心5min。上清液的总蛋白含量大约是未离心悬浮液的总蛋白的15%。SDS-PAGE（图3A）显示出了WCC和WCT的上清液（以下标“su”表示）中的大量可溶蛋白，而WCE（此前已在灭活后被离心以除去所存在的大体积的70%乙醇）仅含有痕量的这类蛋白。然而，当对不经离心的处于70%乙醇中的细胞悬浮液进行检测时，同等的蛋白混合物（通常会在WCE的制剂中损失）显示出已被溶液化（未示出）。图3B显示出大量可溶蛋白同样存在于WCB中。我们示出了，如同未分离的疫苗WCC一样，氯仿灭活细胞经离心分离的水相（“WCCsu”）相对于定殖是高度保护性的。用WCB和WCBsu可证实类似的结果（未示出）。因此，在用允许保留所释放的组分的试剂对RM200细胞进行灭活后，当通过鼻内途径给予时，可溶相有助于保护作用。

考虑将肺炎双球菌疫苗（如WCV）用于粘膜给予有许多潜在的优点（Holmgren & Czerkinsky，Nat.Med.，1，S45（2005））。世界卫生组织对于肺炎双球菌疫苗的预先市场承诺的“目标产品概况”（WHO，肺炎双球菌缀合物疫苗的预先市场承诺（AMC）的目标产品概况（TPP）（2008）），优选皮下注射或肌内注射；因此，使用目前批准的铝佐剂对目前公开的可注射疫苗制剂进行试验是令人信服的。皮下注射使小鼠免于鼻内定殖，而鼻内定殖是肺炎双球菌疾病前的必经过程（Austrian，J.Antimicrob.Chemother.，18（A），35（1986））。吸附至Al(OH)₃上极大地增高了效力。

除了非致死的血清型6B定殖模型之外，还使用了致死的血清型3模型：用高度荚膜化的血清型3菌株对麻醉的小鼠进行鼻内激发产生了菌血症和死亡。这里，经皮下（s.c）途径的WCC或WCB同样有效：顺序注射三次少至1μg的蛋白、或顺序注射两次10μg的蛋白有显著的保护作用。在这一模型中，如同所示，对于将肺炎双球菌从鼻咽中清除并不必要的血清抗体应答（Malley等，PNAS，102，48（2005）），看起来参与了以下保护作用：不消除CD4抗体的保护作用；以及通过将血清从接种后的兔子转移至小鼠的“被动保护”。

具体而言，为通过免疫学分析进行评估和在定殖模型中进行保护，将未吸附和吸附在Al(OH)₃（0.21mg Al/剂）上的剂量递增的WCC（1μg、10μg和100μg）以顺序的三次注射进行测试。没有佐剂时，无可测的IL-17A应答（图5A）；而使用Al(OH)₃时，甚至对1μg的剂量都有明显的应答。

用作为包被抗原的WCC和缀合有HRP的抗小鼠IgG二抗，通过ELISA对血浆IgG抗体进行测定。吸附和未吸附时均存在剂量依赖的抗体应答，但是通过Al(OH)₃增强了约100倍（图5B）。抗体应答包括IgG1和IgG2c两者。

未吸附时，没有针对血清型6B菌株0603的实验性NP定殖的保护作用；但是，Al(OH)₃吸附时，两个较高的WCC剂量引起CFU的明显降低（图5C）。对于注射的WCB，观察到了铝佐剂类似的增强作用；以及在定殖模型中，吸附的WCB的保护作用与IL-17A的致敏相关（图2A）。对吸附的WCB和WCC在IL-17A致敏和在定殖模型中的保护作用进行定量比较：注射吸附在Al(OH)₃上的剂量为10μg或100μg的WCC和WCB。剂量依赖的IL-17A应答并没有不同（图6A）。对将血清型6B从鼻咽的清除也是不可区别的（图6B）。在WCC免疫接种的动物组中对这一模型中的CD4+途径依赖性进行评价，在临激发前对所述动物给予抗CD4+抗血清以使得这些细胞不能再作为保护作用效应因子；在这些小鼠中保护作用被消除（图6B第2列）。

为确定血清型3菌株WU-2的致死吸入性脓毒病模型（Lu等，2009；Malley等，Infect.Immun.，74，2187，2006）中的保护作用，用剂量为1μg、10μg和100μg的WCB-Al(OH)₃注射三次。在接受了单独的Al(OH)₃的对照中，7天的观察期结束后，7/10的小鼠死亡（图7A），三只存活者中的两只患有菌血症。存在着WCB的剂量依赖的保护作用：接受了1μgWCB的小鼠中的半数以及接受了10μg或100μg的小鼠中的全部在7天的观察期后存活；存活的经接种小鼠中无一患有菌血症。不出所料，在IL-17A应答和抗体应答中存在剂量依赖地增高，致死模型中的保护作用与各小鼠激发前的抗体滴度相关。当小鼠体内的血清抗肺炎双球菌IgG抗体滴度超过10,000任意单位时，均观察到了保护作用（图2B）。

还用仅两次注射对这一模型中的保护作用进行了测试。相隔2周给予10μg或100μg的剂量，一周后取血，取血2天后进行激发。10μg剂量部分地抵御了死亡或菌血症，而100μg剂量完全抵御了死亡或菌血症（图7B）；在2次注射实验安排中，血清IgG抗体应答起实质作用；在较高的剂量下，滴度增高至约7倍（图7C）。当通过肌内注射给予吸附的WCB时，在致死的激发模型中同样也观察到了保护作用。目前，这是将疫苗注射入人的常规途径。

通常地，在4℃下吸附18h到22h，然后立即对制剂进行测试。为测试吸附后的抗原的稳定性，将Al(OH)₃和100μg/剂的WCC在经上述实验进行测试之前于37℃下孵育1个月。IL-17A应答、抗体滴度和保护结果与相同剂量的新鲜制备的WCC-Al(OH)₃并没有不同（图5A、图5B和图5C，最后一列，通过Δ标示）。因此，作为液体悬浮液是稳定的（可注射疫苗的优点）。

尽管通过注射WCB来抵御致死的鼻内激发的保护作用与IL-17A分析和抗体应答相关，但是这一模型中的CD4+T细胞的缺乏（由此显著地削弱了IL-17A应答）并不会阻断该保护作用。因此，蕴涵了抗体的必要功能。如上文所指出的，各小鼠的保护作用与抗全细胞抗原的抗体的激发前滴度相关（图2B）。如将在下文示出的，通过用来自WCB接种后的兔子的经加热灭活血清进行被动保护，示出了抗体在这一模型中的功能性作用的迹象（图8B）。

因此，两种不同感染模型的使用显示出肺炎双球菌全细胞疫苗具有双管齐下的免疫（two-pronged immunity）潜能：依赖于IL-17A的抗非致死定殖的保护作用和主要依赖于抗体的抗致死侵袭的保护作用。通过含有细胞成分和可溶成分的疫苗促进了所述的双管齐下免疫力。在图4A-图4B中所示的实验中，对WCB的样品进行离心以产生细胞（“沉淀物”）部分和可溶（“sup”）部分。注射等量（按照蛋白含量为30μg）的上述部分。图4A显示出细胞部分在诱导致敏IL-17A应答方面更优越，图4B显示出对于抗体应答来说，可溶部分能力相当或更好。因此，利用选择性裂解细胞以释放保护性抗原、但不需要随后除去可溶相的试剂使疫苗失活，构成了生成提供了双管齐下的保护性应答的疫苗的简单步骤。

本发明的另一实施方式提供了通过超声溶液化的制剂的保护作用。延伸对可溶组分的保护作用的观察，将WCC的样品进行声波处理以裂解细胞，并将这一裂解物与相应剂量的完整WCC进行比较。图1D显示出该裂解物有同等的保护作用，图1E显示出通过血细胞检测的，该裂解物在体外同等地致敏了IL-17A的应答，所述IL-17A应答和定殖模型中的保护作用相关（Lu等，2008）。

作为通用方法，WCA的剂量可表示为μg蛋白，其中约85%为细胞部分，约15%为可溶部分（Lu等，2010）；1μg对应于大约1.7μg的总干重并对应于灭活前的10⁶的CFU。对于小鼠的主动免疫，相隔两周给予两次或三次顺序注射，在最后一次注射1周或2周后，取血用于体外致敏IL-17A表达分析和抗WCA的血清IgG抗体分析，在定殖模型或吸入性脓毒病模型中用肺炎双球菌对动物进行激发，将各小鼠的结果与体外分析的结果进行比较。

为证明血清型覆盖度的扩大，用此前未使用的肺炎双球菌血清型诱导小鼠吸入性脓毒病的激发：激发用的5型菌株DBL5在少至10⁵CFU/吸入时可致死。对用100μg剂量的WCB Al(OH)₃的2次注射顺序进行测试，发现其对10⁵CFU/吸入或10⁷CFU/吸入的激发具有高保护作用。

在兔子中对初步的毒物学评估和免疫原性进行了评价。用盐水、单独的Al(OH)₃（0.21mg Al）、剂量为50、500或5000的Al(OH)₃吸附的WCB或商购的DTwP疫苗（已知的毒性对照）在第1天、第15天、第29天和第43天对每组三只的各组中的雌性新西兰白兔进行肌内注射。在整个过程中未观察到试验制品相关的临床征象、皮肤刺激、食欲不振或温度变化。当尸检时，在这一研究的任何组中，均没有确定的与试验制品相关的肉眼表现（macroscopic findings）。

尽管并非明显地剂量依赖，在所有WCB组中，嗜中性白细胞和单核细胞显示出轻微至适度的增加（相对于铝佐剂为1.58-1.87倍）。在接受了中等剂量WCB和高剂量WCB的动物中，从第2天（相对于铝佐剂为1.16-1.94倍）到第45天（相对于铝佐剂为1.31-2.62倍），纤维蛋白原逐步地且剂量依赖性地增加。在接受了500μg和5,000μg的WCB的组中，球蛋白轻微地增加。这些临床病理学参数的变化与对疫苗的炎症应答一致。在肌内注射部位观察到许多镜下表现（microscopic findings），包括观察到在不同的对照组和WCB试验制品注射组之间不同的表现。这些表现通常对于注射部位4（第45天）最大，并显示出随时间而不断恢复（recovery）（注射部位1，第1天）。在皮下出血/炎症/坏死的表现中观察到了WCB免疫组之间的剂量依赖性的唯一微小的证据。

总的来说，与第2组对照相比，在所有WCB组中，肌肉和皮下炎症的表现有一定程度提高，所有注射部位没有表明这些表现的严重程度或发病率具有剂量依赖性的任何一致的证据。与DTwP对照相比，WCB组作为整体并没有一致地具有任何镜下表现的增高的发病率或严重程度。

总之，在50μg、500μg或5,000μg这三个剂量水平对WCB进行检测。基于局限在炎症的表现（纤维蛋白原和微观病理学），这一研究中，无可见不良作用水平（NOAEL）为50μg/动物的氢氧化铝吸附的WCB。

在WCB免疫接种的兔子中，在第1天、第15天、第29天和第43天注射前所取的样品中，血清IgG抗体滴度逐步并剂量依赖性地升高；在图8A中示出了第43天的滴度。利用来自经铝佐剂和WCB免疫接种的兔子的第45天的混合血清，对血清型3的小鼠吸入性脓毒病模型中的被动保护进行了测试：第45天的混合血清具有高度保护性（图8B）。在如前所述的表面灭活分析中，对来自兔子（已用500μg Al(OH)₃吸附的WCB或单独的铝佐剂进行了免疫）的经加热处理的濒死放血血清（terminal bleed sera）进行评价（Lu等，PLoS Pathog，9，e1000159（2008）；Weinberger等，PLoS Pathog.，5，e1000476（2009））。如图8C中所示，在所测试的三个稀释度中，与免疫前血清相比，来自兔子的免疫血清显著地增强了人嗜中性白细胞对血清型6B肺炎双球菌菌株的灭活，表明用吸附的WCB进行的免疫接种诱导了调理吞噬抗体。

本发明的另一实施方式提供了通过与无毒的肠毒素衍生物一起经鼻内给予的WC抗原的保护作用。CT和大肠杆菌不耐热毒素（LT）均不适合于经鼻内对人使用，这促使对无毒的突变型LT进行评价。将大肠杆菌不耐热毒素的单突变衍生物（mLT，R192G）与CT进行比较。图15显示出，与盐水相比，单独给予佐剂显示出加速肺炎双球菌清除的迹象（虽然并非统计上显著的），这是这一模型中的预期结果，在这一模型中通过相同途径进行接种和激发。然而，当与10⁸的WCE一起给予时，mLT提供了出色的保护作用。

此外，本发明提供了适合于通过颊途径和舌下途径给予的免疫原性制剂。最近的报道提高了对通过鼻内途径给予的大肠杆菌不耐热毒素（LT）、甚至是去毒的突变型LT的安全性的关注，并指出它们的使用可能与贝耳氏麻痹（Bell’s palsy）的发展相关（Lewis等，PLoS one，4，e6999（2009）；Mutsch等，2004）。在幼儿中进行鼻内接种的另一缺点是受试者有大量鼻腔粘液（在一些临床环境中常见），将削弱疫苗与粘膜的有效接触。因此，对可选的粘膜途径进行测试：施加至下臼齿旁的颊粘膜（常常用于儿童的活脊髓灰质炎接种）和舌下应用（最近在细胞学上详细分析的途径）（Cuburu等，J.Immunol.，183，7851（2009））。这两种途径均可进入韦氏环（Waldeyer’s ring）的免疫应答组织而较少进入中枢神经系统，并避开了鼻腔粘液问题。使用WCC并以双重突变的LT（dmLT，R192G/L211A）作为佐剂对颊途径和舌下途径进行探索。发现两种给药途径均具有剂量依赖的保护作用（图11A）。与所述保护作用一致，观察到了体外IL-17A应答的致敏（图10B）。

本发明还提供了通过透皮免疫（TCI）给予的含有超声产生的WCC片段的免疫原性组合物。通过将含有抗原和LT佐剂的纱布贴剂施加至背部皮肤而对透皮免疫途径进行测试，如同此前为了其它疫苗制剂所做的一样，对背部皮肤进行轻微摩擦以使角质层破损（Zhu等，Clin.VaccineImmunol.，15，359（2008））。其他体系的经验提倡降低粒径，所以对平均直径为100nm（WCC100）和20nm（WCC20）的片段进行测试。与单独施用LT或单独施用WCC100相比，当与LT一起施用时，WCC100和WCC20有同样的保护作用。与该保护作用一致，体外使IL-17A应答的致敏极大地超过了与经i.n.免疫的保护作用相关的水平（图12C）（同样参见Lu等，2008）。因此，透皮接种是鼻腔途径的另一替代途径。

针对幼儿中的全身性疾病，肺炎双球菌荚膜多糖-蛋白缀合物疫苗对于所包括的血清型已是有效的，并提供了某些群体免疫力（Hsu等，N.Engl.J.Med.，360，244（2009）；Lexau等，JAMA，294，2043（2005）；Whitney等，N.Engl.J.Med.，348，1737（2003））。制造的复杂性、相对高的生产成本和增加的血清型替代疾病（Hanage，2008）使得努力开发出血清型非依赖性的且更经济的疫苗。这些疫苗包括纯化的蛋白质抗原（Basset等，Infect.Immun.，75，5460（2007）；Briles等，Vaccine，18，1707（2000）；Giefing等，J.Med.Exp.，205，117（2008）；Glover等，Infect.Immun.，76，2767（2008））、载体化的蛋白质抗原（Arevalo等，FEMS Immunol.Med.Micro.，55，346（2009）；Kong等，PNAS，105，9361（2008）；Li等，PNAS，106，593（2009）；Nayak等，Infect.Immun.，66，3744（1998）；Xin等，Infect.Immun.，77，4518（2009））、以及本文所研究的无荚膜化的WCV（Lu等，2008；Malley等，2003；Malley等，Infect.Immun.，72，4290（2004）），上述任一疫苗均可与本实施方式的免疫原性组合物联合使用。

携带（Carriage）通常先于肺炎双球菌疾病（Austrian，1986），所以疫苗诱导的对携带的增强清除（Lu等，2008）可抵御肺炎和侵袭性疾病。本实施方式提供了降低持续时间和强度、但不一定消除携带的免疫原性组合物。例如，在小鼠中，WCV并不阻断定殖，但是却加速了从鼻咽中的清除（Bogaert等，Infect.Immun.，77，1613（2009）；Lu等，2008；Malley等，2001；Malley等，2004；Malley等，2005）。

尽管以微粒形式和可溶形式存在的灭活WC抗原（许多不同抗原的组合）在生产一致性和标准化方面具有潜在的挑战，但它的效力、低生产成本、作为亲液物（lyophile）的稳定性以及不需注射器的可能给药方式使得值得对它进行临床开发。

对于这么复杂的抗原，通过生化标准对其直接进行标准化和品质控制是不可行的。需要基于动物免疫接种的效力分析；但是将动物激发试验作为终点是不理想的，优选通过体外分析测定的相关物。用于在体外生成IL-17A的小鼠的致敏就是通过多种途径给予WCV所产生的保护作用的相关物（Lu等，2010），但是这一分析需要在许多发展中国家可能不容易得到的组织培养设备。如本文所示，当经s.c给予WCV时，通过ELISA测定的抗WCA的血清IgG抗体既是相关物、也是抵御侵袭性疾病的药剂。因此，WCV的经规划的初步临床评价是作为用于肌内注射的铝吸附抗原，初步效价标准将依据小鼠免疫接种和用于测定两次顺序注射后的IgG抗体的ELISA。可潜在地将IL-17A分析用作辅助标准。如同IgG ELISA，IL-17A分析可使用人血的小样品进行，所以二者均可在临床试验中用作有用的生物标记物。

7价肺炎双球菌缀合物疫苗（PCV）在美国抵御侵袭性疾病的成功和9价PCV在南非以及冈比亚的临床试验结果（Klugman等，N.Engl.J.Med.，349，1341（2003）；Cutts等，Lancet，365，1139（2005））理所当然地产生了如下结论：在发达国家和发展中国家，利用下一代缀合物疫苗提供足够的血清型覆盖度并降低成本，肺炎双球菌疾病如果没被根除也可被显著地控制。最近分别在欧洲和美国获批的所谓的“第二代”10价和13价肺炎双球菌疫苗代表了在这一领域中的进一步的重要进展。然而，并不包含于第一代的7价缀合物疫苗中的血清型的出现（Hanage，Future Microbio.，3，23（2008）），以及对这些菌株是疾病、发病和死亡的重要原因的证实（Singleton等，JAMA，297，784（2007）；Hsu等，N.Engl.J.Med.，369，244（2009））引起了关注。尽管现在发达国家和发展中国家对使用促进适当广谱的肺炎双球菌缀合物疫苗的努力仍在继续，针对肺炎双球菌接种的可选策略的需要仍然是优先级的。

在过去的十年中，多个科研小组将注意力集中在了开发能够进入临床试验的种特异性肺炎双球菌疫苗（Nabors等，Vaccine，18，1743（2000）；Briles等，J.Infect.Dis.，182，1694（2000）；Giefmg等，J.Exp.Med.，205，117（2008）；Oliveira等，Microbes Infect.，8，1016（2006）；Ogunniyi等，Infect.Immun.，68，3028（2000））。然而，令人清醒的是，迄今为止还没有已进入III期临床试验的此类疫苗。此外，很明显的是，开发种特异性肺炎双球菌疫苗面对着开发和获批中的多个重要障碍，所述障碍包括但不限于：研究种群、终点、效力确定的选择；与目前批准的缀合物肺炎双球菌疫苗的比较；给药途径和对优化粘膜免疫力刺激的佐剂的潜在需求。

在特定的实施方式中，使用菌株RM200生产WC抗原。在菌株Rx1E中，为了通过减少自溶来提高产率，利用标记有卡那霉素抗性基因rpsL的Janus表达盒取代整个lytA基因组编码区域（Sung等，Appl.Environ.Micro.，67，5190（2001）；Trzcinski等，Appl.Environ.Micro.，69，7364（2003））。展示有正确的lytA::Janus基因组背景、对脱氧胆酸盐溶胞作用具有抗性、并具有类似于野生型菌株的生长动力学的整合体被称为RM200。Rx1E表达肺炎链球菌溶血素的非溶血性衍生物PdT（Berry等，1995），所述PdT既是毒素也是保护性抗原。为确定PdT表达的滞留（retention），用羊的红细胞对RM200的溶血活性进行测试，用纯化的肺炎链球菌溶血素蛋白进行标准化，发现用多至5×10⁸的细胞时为非溶血性的，而少100倍的表达肺炎链球菌溶血素的全细胞诱导了红细胞的完全溶胞（分别为8×10⁶个表达肺炎链球菌溶血素的WCE细胞和5×10⁵个表达肺炎链球菌溶血素的WCC细胞）；该分析的肺炎链球菌溶血素检测下限为0.05ng/ml。用抗肺炎链球菌溶血素血清进行的Western印迹分析证实了PdT蛋白的表达。

可将本文给出的技术（使用选择性裂解并保留所释放的可溶部分来制备全细胞免疫原）用于在其他革兰氏阳性细菌中制备疫苗，例如链球菌（包括A组链球菌和B组链球菌）、肠球菌（Enterococci）（包括粪肠球菌（faecalis）和屎肠球菌（faecium））、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）或非金黃色葡萄球菌、肠道球菌（Enterococcus）、芽孢杆菌属（Bacillus）（包括炭疽杆菌（Bacillus antracis），引起炭疽病的因子）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、诺卡氏菌属（Nocardia）、分枝杆菌（包括结核分枝杆菌（M.tuberculosis）、非结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌（M.leprae））和李斯特菌属（Listeria）。

此外，其它细菌抗原成分可与本发明的免疫原性组合物相联合，所述其他细菌的抗原成分来自于如葡萄球菌的种、链球菌的种（包括A组和B组）、肠球菌的种；李斯特菌属、芽孢杆菌属（包括炭疽杆菌）、棒状杆菌属、奈瑟氏球菌属（Neisseria）（脑膜炎奈瑟氏球菌（meningitidis）和淋病奈瑟氏球菌（gonorrheae））、莫拉菌属（Moraxella）、嗜血杆菌属（Haemophilus）（分型嗜血杆菌和非分型嗜血杆菌）、假单胞菌属（Pseudomonas）（铜绿假单胞菌（aeruginosa）及其它）、沙门氏菌属（Salmonella）（伤寒沙门氏菌和非伤寒沙门氏菌）、志贺氏菌属（Shigella）、抗革兰氏阴性肠道菌（肠杆菌属（Enterobacter）、柠檬酸细菌属（Citrobacter）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、大肠杆菌等）、艰难梭状芽胞杆菌属（Clostridium difficile）及其它梭状芽胞杆菌、类杆菌属（Bacteroides）及其它厌氧菌、衣原体科（Chlamydiaceae）的种（沙眼衣原体（C.trachomatis）和肺炎衣原体（C.pneumoniae））、支原体（Mycoplasma）和军团菌属（Legionella）以及密螺旋体（Treponemes）（梅毒、钩端螺旋体）和疏螺旋体（Borrelia）。

本发明的免疫原性组合物还可与如WO 09/143413中所述的融合蛋白-多糖缀合物联合使用。

通过医药或兽医领域普通技术人员公知的技术并通过对如下这类因素加以考虑来确定本发明组合物中的免疫原和佐剂的量以及给予的剂量：具体的抗原；佐剂（如果存在）；具体患者的年龄、性别、体重、物种和病症；以及给药途径。

例如，根据本申请的公开，本领域技术人员可容易地确定用于合适宿主（希望在其中进行免疫应答）的具体的全细胞免疫原的剂量以及一般与之一起给予的任何佐剂的量。因此，本领域技术人员可容易地确定组合物中的抗原和任选的佐剂的量并以本发明的方法给予。一般地，通常以处于磷酸盐缓冲盐水中的0.001-50wt%的溶液使用佐剂，并且抗原以μg到mg的数量级存在，如约0.0001wt%-约5wt%。

然而，一般情况下，抗原以μg到mg的数量级存在，如1μg-100μg，包括端值；或约10μg；或约0.001wt%-约20wt%，包括端值。

对于待给予动物或人的组合物（包括其组分）以及任何具体的给药方法，优选如通过在合适的动物模型（例如啮齿动物（如小鼠））中测定致死量（LD）和LD₅₀来确定可能的毒性；还优选如通过用于抗体或抗原的血清滴定及其分析（例如通过ELISA和/或RFFIT分析）来确定诱发合适的免疫应答的组合物的剂量、组合物中组分的浓度和给予该组合物的时间。这类测定并不需要除本领域技术人员的知识、本申请的公开和本文所引用文献以外的过度试验。并且，不需要过度实验即可确定顺序给药的时间。

本发明免疫原性组合物的实例包括用于孔口给药（如口腔给药、鼻腔给药、肛门给药、阴道给药、口服给药、胃内给药、粘膜（例如经舌粘膜、牙槽粘膜、齿龈粘膜、嗅区粘膜或呼吸区粘膜）给药等）的液体制剂（如悬浮剂、糖浆剂或酏剂）；以及用于胃肠外给药、皮下给药、皮内给药、肌内给药或静脉内给药（例如可注射的给药）的制剂（如无菌悬浮剂或乳剂）。这类组合物可与合适的载体、稀释剂或赋形剂（如无菌水、生理盐水、葡萄糖）等混合。所述组合物还可被冻干。根据给药途径和期望的制剂，该组合物可含有辅剂物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、凝胶化或粘度增强添加剂、防腐剂、芳香剂、着色剂等。可查阅标准文本（如Remington，Science & Practice of Pharmacy（最新版）和美国专利公开No.2009/0098165）以制备合适的制剂，无需过度的实验。

本发明的组合物作为可被缓冲至所选定的pH的液体制剂（例如等渗水溶液剂、悬浮剂、乳剂或粘性组合物）而被方便地提供。如果期望鼻腔给予或呼吸区（粘膜）给予，组合物可为一定的剂型并可通过挤压喷雾分料器、泵分料器或气雾剂分料器分发。气雾剂通常借助于烃加压。泵分料器可优选分发计量的制剂或具有特定粒径的制剂。

本发明的组合物尤其是如果经口服给予时，可含有药学上可接受的芳香剂和/或着色剂以使它们变得更加有吸引力。粘性组合物可为凝胶剂、乳液剂（lotions）、软膏剂、霜剂等的形式，并且一般含有足够量的增稠剂以使粘度为2500-6500cps，然而也可使用更粘稠的组合物（粘度甚至高达10,000cps）。粘稠组合物优选具有2500-5000cps的粘度，因为高于该范围它们变得较难给予。

比起凝胶剂、其它粘性组合物和固体组合物，液体制剂通常更容易制备。此外，尤其是通过注射或口腔给药时，液体组合物在某种程度上也比较方便给予至动物、儿童，特别是较小的儿童。另一方面，粘性组合物可在适当的粘度范围内配制以提供与粘膜（如胃粘膜或鼻腔粘膜）更长的接触时间。

对合适载体和其他添加剂的选择将取决于确切的给药途径和具体剂型（如液体剂型（例如，组合物是否将被配制成溶液剂、悬浮剂、凝胶剂或其它液体剂型）、或固体剂型（例如，组合物是否将被配制成丸剂、片剂、胶囊剂、囊片、定时释放剂型或液体填充剂型））的性质。

除抗原、脂蛋白和任选的佐剂之外，溶液剂、悬浮剂和凝胶剂通常含有主要量的水（优选纯净水）。还可存在少量的其他成分，如pH调节剂（例如，碱，如NaOH）、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、胶凝剂（例如甲基纤维素）、着色剂和/或芳香剂。组合物可为等渗的，即，它可具有与血液和泪液相同的渗透压。

可使用氯化钠或其他药学上可接受的试剂（如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机溶质或有机溶质）来实现本发明组合物期望的等渗性。尤其是对于含有钠离子的缓冲液，优选氯化钠。

可使用药学上可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定的水平。由于甲基纤维素易于得到且经济并便于共同发挥作用，优选甲基纤维素。其它合适的增稠剂包括，例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度将取决于所选定的试剂。要点在于使用可实现选定粘度的量。通常通过这类增稠剂的加入而由溶液制备粘性组合物。

可使用药学上可接受的防腐剂以延长组合物的保质期。尽管可使用多种防腐剂，包括例如对羟苯甲酸酯、硫柳汞、氯代丁醇或苯扎氯铵，苯甲醇可能比较适合。尽管根据所选定的试剂可能有相当大的变化，防腐剂的合适浓度可为0.02%-2%（基于总重量）。

本领域技术人员将认识到相对于WCA和任选的佐剂，所选择的组合物组分必须为化学上非活性的。根据本申请公开和本文所引用的文献，这对化学原理和药学原理领域的技术人员来说是没有问题的，或者通过参考标准文本或通过简单的实验（不涉及过度实验）可容易地避开问题。

利用普遍接受的步骤混合各成分来制备本发明的免疫学上有效的组合物。例如可将所选择的成分简单地混入搅拌机、或其它标准设备中以生产浓缩的混合物，随后通过加入水或增稠剂可将该混合物调节至终浓度和粘度，以及可能通过加入缓冲剂以控制pH或加入额外的溶质以控制张度（tonicity）。通常pH可为约pH 3-pH 7.5。考虑到如下因素：具体患者或动物的年龄、性别、体重和病症；以及用于给予的组合物的形式，可以不同剂量并通过医药和兽医领域技术人员公知的技术给予所述组合物。尤其是由于可通过类似于已知疫苗的方式和剂量进行WCA给药，本领域技术人员根据本申请公开、本文所引用的文献和下文的实施例（例如本文所引用的申请中涉及小鼠和兔子的实施例），可确定用于人或其它哺乳动物的剂量而无需过度实验。

用于初次给药和加强剂量或用于顺序给药的适合方式也是可变的，可包括初步给药继之以后续给药；尽管如此，可由本领域技术人员根据本申请公开、本文所引用的文献（包括本文所引用的申请）和下文的实施例来进行确定。可单独给予该组合物、或者可与本发明的其它组合物或与其它预防性或治疗性组合物共同给予或顺序给予。

本发明的疫苗可被一次给予、或者以各次给药间隔2-6个月的方式给予两次或三次。或者，本发明的疫苗包括每当需要时就可向动物或者人给予。

本文所使用的“免疫原性组合物”是指用于对受试者的免疫系统进行刺激的组合物，以使该免疫系统的一种或多种功能被增强并针对该免疫原性组合物。抗原或者免疫原旨在表示含有可刺激宿主免疫系统产生对该抗原特异性的分泌的、体液免疫应答和/或细胞免疫应答的一个或多个表位的分子。可使用本技术领域已知的技术将免疫原性组合物用于生产抗体（包括分离的多克隆抗体和单克隆抗体）。免疫原性组合物包括疫苗。

本文所使用的“疫苗”是指用于对受试者的免疫系统进行刺激的试剂，以提供针对不被受试者的免疫系统视为自身抗原的抗原的防护作用。免疫接种是指在受试者体内诱导高水平的抗体和/或细胞免疫应答的方法，所述免疫应答针对暴露至生物体的病原体或抗原。本文所使用的疫苗和免疫原性试剂涉及受试者的免疫系统：受试者借之以产生针对侵入受试者细胞或细胞外液的抗原性物质的抗体和/或细胞免疫应答的解剖学特征和机理。就抗体生产而言，由此产生的抗体可属于任何免疫学种类，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。由于IgA是恒温动物体内分泌系统的主要免疫球蛋白，所以关注刺激免疫球蛋白A（IgA）生成的疫苗。除IgA形成外，疫苗很可能产生广谱的其它免疫应答，例如细胞和体液免疫力。对抗原的免疫应答已被很好地研究并被广泛地报道。参见例如，Elgert，IMMUNOL.（Wiley Liss,Inc.，1996）；Stites等，BASIC & CLIN.IMMUNOL.，（第7版，Appleton&Lange，1991）。

如本文所指出的，在免疫学中佐剂常常被用于通过对免疫系统进行刺激来修饰或增强疫苗的作用，从而使免疫系统更加有力地对疫苗进行应答，并因此提供了对具体疾病增强的免疫力。佐剂通过摹拟在进化上保守的分子（所谓的PAMPs）的特异性参数（sets）来完成这一任务，所述PAMPs包括脂质体、脂多糖（LPS）、用于抗原的分子笼、细菌细胞壁组分和内吞的核酸（如双链RNA（dsRNA）、单链DNA（ssDNA）和含未甲基化的CpG二核苷酸的DNA）。由于免疫系统已经进化以识别这些特异的抗原性部分，通过摹拟天然感染，和疫苗一起存在的佐剂通过加强树突状细胞（DCs）、淋巴细胞和巨噬细胞的活性，可极大地增强针对抗原的固有免疫应答。此外，由于佐剂的各种毒力功能均经过减毒，它们自身一般对宿主生物体几乎没有或没有威胁。

一般的无机佐剂（有时被称为“铝佐剂（alum）”）包括磷酸铝、氢氧化铝及其它磷酸盐。尽管铝盐被普遍地用于人疫苗，也使用有机化合物（如角鲨烯），这在动物疫苗中更加常用。油基佐剂常被用于某些兽医疫苗中。除本文所述的佐剂之外，类毒素（如破伤风类毒素）也被用作佐剂。其它可与本发明的全细胞免疫原性组合物一起使用的蛋白性佐剂包括鸭肝炎表面抗原（参见美国专利No.7,279,555）和细菌孔蛋白（参见美国专利No.6,153,406和No.6,013,267）。

本发明的特定实施方式提供了制备全细胞免疫原性组合物的方法，所述方法包括：（a）使肺炎双球菌在培养基（例如，无动物成分培养基，如大豆基培养基）中生长；（b）漂洗并富集该肺炎双球菌（例如，至A₆₀₀为32）；（c）通过在约4℃下与氯仿（约1/4到1/40[体积/体积]，包括端值）搅拌足够的一段时间（例如约2h）、或通过在约4℃下与三氯乙烯（约1/4到1/40[体积/体积]，包括端值）搅拌足够的一段时间（例如，约2h）、或通过在约4℃下与β-丙内酯（约1/4到1/4,000[体积/体积]，包括端值）搅拌足够的一段时间（例如，约24h）对细胞进行选择性裂解，使肺炎双球菌灭活；其中，灭活的细胞制剂未进一步漂洗；以及（d）对氯仿或三氯乙烯灭活的细胞进行冻干以除去氯仿或三氯乙烯；或将β-丙内酯灭活的细胞在37℃下孵育2h以分解β-丙内酯然后冻干该制剂。

借助于下述实施例对本发明进行进一步的描述，所述实施例被提供用于说明，而并不应被认为是对本发明的限制。

实施例

实施例1.抗原制剂

由James Paton（阿德莱德大学，澳大利亚）向我们提供菌株Rx1E，该菌株中的肺炎链球菌溶血素基因被去毒的突变型PdT所取代。使用前文所述策略，将整个lytA基因组编码区域用标记有卡那霉素抗性基因rpsL的Janus表达盒取代（Sung等，Appl.Environ.Microbio.139（2006）；van Ginkel等，J.Immunol.，165，4778（2000））。简短而言，产生了三种PCR扩增产物：（i）用引物LAD1（CAAGGTATCCATCATTCC）（SEQID NO:1）和LAD2（CGCGGATCCACAGTAGAGCCAGATGGC（SEQ IDNO:2）扩增得到的lytA基因组区域上游的1kb片段；下划线示出BamHI位点）；（ii）用引物LAD3（TTTGGGCCCGTTGCACGCCGACTTGAGG（SEQ ID NO:3）；下划线示出ApaI位点）和LAD4（CTTTGCTTCTCAGAATCTAGG）（SEQ ID NO:4）扩增得到的lytA下游的800bp片段；以及（iii）用引物DAM351（具有ApaI位点）和DAM406（具有BamHI位点）扩增得到的Janus表达盒（Sung等，2001）。使用相应的限制性内切酶在通过PCR引入的位点处对扩增产物进行消化，凝胶纯化，然后在4℃下过夜连接。然后，将连接混合物用作最终PCR的模板，使用外侧引物LAD5（CATAGCTTTATGACTGATACC）（SEQ ID NO:5）和LAD6（AAGGTCTTCGAATCGGCAGTCG）（SEQ ID NO:6），产生3.2kb的扩增产物：具有侧翼为lytA上游序列和下游序列的Janus表达盒的三元DNA分子（tripartite DNA molecule）。然后，通过选择卡那霉素抗性菌落（其中的野生型lytA基因被lytA::Janus中断片段（disruptionfragment）取代），将这一分子转化入卡那霉素敏感、链霉素抗性的菌株Rx1E（PdT）中。

与野生型亲代菌株相比，使用Janus特异性内侧引物和LAD5引物通过PCR在基因型上证实了该推定的整合体：lytA::Janus菌株产生了Janus特异性PCR产物，但是野生型菌株没有。在5%脱氧胆酸钠存在的情况下，通过对溶胞敏感性进行评价在表型上证实了lytA::Janus转化子：野生型菌株裂解，而lytA缺乏菌株抗溶胞。Rx1E PdT菌株的lytA::Janus转化子被命名为RM200。

本文使用了四种不同的灭活细胞制剂，其中用乙醇、氯仿、三氯乙烯或β-丙内酯实现失活（分别为WCE、WCC、WCT或WCB）。通常，使菌株RM200生长至A₆₀₀为1.0，此时活菌数（viable count）为约6×10⁸CFU/ml。在4℃下进行后续步骤。通过离心收集细胞并用乳酸化林格氏溶液（LR）（102mM NaCl、28mM NaC₃H₅O₃、1.5mM CaCl₂和4mM KCl）漂洗两次。对于WCE制剂，将细胞重悬至A₆₀₀为10，在15min内，逐步加入乙醇至70%（体积/体积）。将悬浮液搅拌55min，再次离心沉淀细胞，漂洗两次，在具有10%蔗糖的LR中重悬至A₆₀₀为32，培养至确定无菌，再以单次使用的等份冻干。对于WCC制剂和WCT制剂，将处于具有10%蔗糖的LR中的A₆₀₀为32的经漂洗的细胞与氯仿或三氯乙烯（1/40[体积/体积]）混合2h。对于WCB，将处于具有10%蔗糖的LR中的经漂洗的细胞与β-丙内酯（BPL）（1/4,000[体积/体积]）在4℃下混合24h，随后在37℃下孵育2h至使BPL失活。对于WCC和WCT，灭活的细胞不用漂洗，而是直接冻干（消除了残留的有机溶剂）；在使BPL失活后，同样地对WCB进行冻干。通过将悬浮液涡旋1min然后在16,000×g离心5min来制备上清液。使用总蛋白试剂盒，以牛血清白蛋白（Sigma）作为标准对蛋白浓度进行测定。用预制的4-12%Bis-Tris SDS凝胶（Invitrogen，Carlsbad，CA）进行SDS-PAGE。将WCC悬浮液用探头声波仪在最高强度声波处理至少2min以制备WCC裂解物。

在免疫接种前一天，将疫苗按如下制备：将冷冻的等份解冻或用无菌水使冻干粉剂复水，稀释至适当的浓度，并在所示浓度于15ml锥形管中与Al(OH)₃混合，然后在4℃下翻转过夜以使之吸附。

氢氧化铝（铝佐剂）（2%铝胶（Alhydrogel））来自于Brenntag NorthAmerica（Reading，PA）。β-丙内酯（BPL）来自于Fisher（Rockford，IL），盐水来自于B.Braun Medical Inc.（Bethlehem，PA）。所有其它试剂从Sigma处获得。霍乱毒素（CT）来自于List Biological Laboratories（Campbell，CA）。大肠杆菌不耐热毒素LT的突变衍生物（mLT（R192G）和dmLT（R192G/L211A））如此前所述得到（Dickenson & Clements，Infect.Immun.，63，1617（1995））。LT、纱布贴剂和用于透皮免疫的砂纸由Intercell USA，Gaithersburg，MD提供。

实施例2.小鼠的免疫接种和激发

将C57BL/6J小鼠（Jackson Laboratories，Bar Harbor，Maine）用于所有的实验中。在首次免疫接种时年龄为4-6周。通过将10μL盐水、单独的佐剂、或与特定的抗原混合的佐剂无损伤地滴注入未麻醉小鼠中，进行鼻内（i.n）免疫（该步骤不将免疫原放置入肺中）；在1周后进行二次免疫。分别通过将与1%NaHCO₃和30%蔗糖混合的30μL疫苗放置在口腔表面上、或者将处于相同稀释剂中的5μL疫苗放置在舌下，进行口腔或舌下免疫。口腔或舌下免疫每周进行一次，共进行三次，而经鼻内免疫仅给予两次。

将WCC用于透皮免疫（TCI）实验。将WCC在含有0.1%Zwittergent3-14（Calbiochem，Gibbstown，NJ）和1%精氨酸（Sigma）的水中再水化，然后声波处理至平均尺寸为100nm（WCA100）或20nm（WCA20）。将小鼠用2,2,2-三溴乙醇（Avertin；Sigma）麻醉，然后用推子剃除背部毛发。用湿纱布轻柔触碰，使剃过的皮肤含水，用干燥的无菌纱布轻抚来除去多余水。在用砂纸轻柔打磨后，用移液管将免疫溶液（体积为20μL）移至贴剂上，将该贴剂施加于剃过的区域并在该皮肤上保留18h。每两周免疫接种一次，共进行三次。对于除鼻内免疫情况外的所有免疫接种，在最后一次免疫接种2周后取血，对于鼻内免疫在3周后取血，并分析WCA刺激后的IL-17A生成。将未麻醉的小鼠轻轻地束缚，使之每隔两周在下背部接受一次、共接受两次或三次皮下注射（具有或不具有抗原的200μL佐剂）。在最后一次免疫接种1周或2周后取血，并分析WCA刺激后的抗体生成和IL-17A的体外生成。

鼻咽（NP）定殖模型：为测定对NP定殖的易感性，按此前所述的方法（Malley等，2001）用活的荚膜化肺炎双球菌进行经i.n.的激发：如此前所述，在最后一次免疫接种四周后（或对于通过TCI免疫的小鼠，2周后），用处于所施用的10μL PBS中的10⁷CFU的血清型6B菌株0603对小鼠进行激发。为测定NP定殖，通过滴注从横断气管逆流的无菌盐水、收集来自鼻孔的前6滴（约0.1ml）、并将未掺水的或稀释的样品置于含有2.5μg庆大霉素/ml的血琼脂平板上，进行上呼吸道培养。图中示出了各小鼠的每鼻腔洗涤物样品的CFU数；几何平均数（GM）作为水平条展示。为便于统计分析，无菌样品被规定为检测下限（1.6CFU/鼻腔洗涤物）的一半或0.8CFU/鼻腔洗涤物。

吸入性脓毒病激发模型：在最后一次免疫接种两周后，用异氟醚将小鼠缓和地麻醉，使之保持仰卧，并使用我们之前所述的模型（Lu等，Infect.Immun.，77，2076（2009）），给予100μL含有3型菌株WU-2或5型菌株DBLS（David Briles博士，Univ.Alabama，Birmingham，AL）的接种物的鼻内接种，但是进行了如下改变：在吸入性激发前2天，小鼠不再经鼻内暴露于肺炎双球菌。这一模型在未免疫小鼠中于3-4天内诱导了脓毒病和死亡。对小鼠每日监测两次，当表现出疾病的病征时，通过吸入CO₂处死并进行濒死放血，随后获得血培养物；如下所述，在所有小鼠中，经腹膜内注射如下物质：500μL盐水或者300μL盐水外加200μL加热失活的血清（56℃下30min），该血清来自于由用氢氧化铝（具有或不具有WCA）免疫接种的兔子。所有动物研究都经过了当地动物伦理委员会批准。

统计分析：使用PRISM（4.0a版本，GraphPad Software,Inc.）通过Mann-Whitney U检验对抗体和IL-17A的浓度以及NP定殖密度进行比较。同样使用PRISM由Kaplan-Meier检验分析存活率差异。对于毒物学研究，所有比较都是与接受单独的铝佐剂的组进行的。使用ANOVA或Welch’s检验，通过组两两比较法对体重、食物消耗量、体温、血液学（除白细胞计数之外）凝结参数、临床化学值以及器官重量进行比较，对于多重比较进行适当的调整。对于白细胞计数和尿分析，由于缺乏正态性（normality），分别将数据进行对数变换和秩变换，并将变换后的数据进行如上分析。通过Cochran Mantel Haenszel检验对红斑、焦痂和水肿形成进行分析。

实施例3.兔子免疫接种和毒物学研究

所有的兔子免疫接种均在MPI（Mattawan，MI）进行。在第1天、第15天、第29天和第43天，通过肌内注射向每组各三只的组中的雌性新西兰白兔给予0.5ml的如下注射液：盐水；单独的Al(OH)₃（含有0.6mg Al）；剂量为50、500或5000Ag的Al(OH)₃吸附的WCB或全细胞白喉-破伤风-百日咳全细胞（DTwP）疫苗（来自Institute Butantan的临床产品）。在各次免疫接种前和在第45天濒死放血时得到血清，并冷冻寄送至波士顿儿童医院（Children’s Hospital Boston）以对抗体进行测定。对于所有的动物，定期对发病率、死亡率、临床征象、体温以及食物和水的消耗量进行观察。在每次给药前对皮肤刺激得分（Dermal irritationscores）进行评价，在每次给药之后（除最后一次给药外）每日进行评价并连续评价三天。在基线时、第2天和终点时，进行临床病理学研究。在研究终点（最后一次给药两天后），进行肉眼检查，对器官重量进行记录，在显微镜下对注射部位进行检测。

实施例4.酶联免疫吸附分析（ELISA）

在包被有处于PBS中的WCA（100ps蛋白/ml）的Immulon 2HB 96微孔板（Thermo Scientific，Waltham，MA）中对抗WCA的鼠抗体进行分析。将平板用处于PBS中的1%BSA进行封闭。加入在PBS-T中稀释的抗体，并于室温下孵育2h。用PBS-T对平板进行漂洗，加入抗小鼠免疫球蛋白G、G1或G2的HRP缀合二抗（全部来自Sigma），并于室温下孵育1h。用SureBlue TMB微孔过氧化物酶底物（KPL，Gaithersburg，MD）对平板进行漂洗和显色。

实施例5.全血样品中IL-17A生成的分析

向含有10%的低内毒素限定胎牛血清（FBS）（Hyclone，Logan，UT）和10μg/ml环丙沙星（Cellgro，Manassas，VA）的450pd DMEM培养基（BioWhittaker，Walkersville，MD）中加入50μL肝素化血液。除了未刺激的对照外，将培养物与10⁷个细胞的肺炎双球菌WCA在37℃下孵育6天。在离心后收集上清液，并储存在-80℃下直至通过酶联免疫吸附分析（ELISA）对IL-17A的浓度进行分析（R&D Systems，Minneapolis，MN）。

实施例6.表面灭活分析

如此前所述的方法进行嗜中性白细胞表面灭活分析（Lu等，2008；Weinberger等，2009）。简短而言，6B型菌株0603（Malley等，2005）生长至对数生长中期，并在-80℃下于THY/10%甘油中进行冷冻。在实验当天，将细菌解冻并将其在补充有10%FBS的RPMI中稀释至100CFU/gL，用正常的兔血清或来自于已按照如上所述进行了三次WCV免疫接种的兔子血清在37℃下调理30min。在所有情况下，将兔子血清在52℃下加热30min以使补体失活。

根据制造商说明书，使用Histopaque梯度（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO）从人类志愿者的外周血中纯化出多形核白细胞（嗜中性白细胞）并立即使用。将被稀释至含有30cfu的、经调理的5μL细菌悬液以5个重复/平板的方式，在室温下点样于具有5%脱纤维蛋白的羊血的胰蛋白酶解酪蛋白大豆琼脂（TSA II）（BD）上，使流体吸附，这需要约15min。然后涂覆10μL嗜中性白细胞（3×10⁶细胞/mL；细菌：嗜中性白细胞的比值为约1∶60），进行吸附，并在37℃下、5%CO₂中孵育过夜。对照包括在没有嗜中性白细胞、或具有嗜中性白细胞但没有血清的情况下点样的细菌。

实施例7.WCB免疫接种动物中的脓毒病模型

用铝佐剂和相当于灭活前的0、10⁷CFU或10⁸CFU剂量的WCB每2周对动物经皮下（s.q）免疫接种一次，共进行两次。在第二次给药6天后，取血用于IL-17A和抗体测定。2天后（没有预先暴露）对小鼠进行WU-2吸入激发，并每天两次地对疾病和死亡进行监测，共监测7天。在第7天，从存活者处获得最终的血液（血培养物）。结果在图中示出。

使用不同剂量的WCB重复这一实验，结果在图2B、图9A和图9B中示出。在这一脓毒病激发中，用10⁷-3×10⁸CFU免疫接种的所有小鼠在激发后存活，在3×10⁶和10⁶免疫接种的组中有三例死亡。

实施例8.对用WCC进行的颊免疫/舌下免疫/皮下免疫的评价

在这一实施例中，“口腔”或“颊”给药途径使用了放置在清醒小鼠舌下的30L体积的WCA和佐剂。疫苗稀释剂由30%蔗糖、LR和碳酸氢钠组成。“舌下”给药途径使用了放置在舌下的5μL体积的WCA和佐剂，使用相同的稀释剂。“皮下”途径仅在LR中稀释。基于实验，口腔途径看起来有效。这一研究的目的是比较通过口腔给予、更加浓缩的舌下给予和皮下给予的WCA和dmLT的效力，并评价免疫原性和保护能力。将免疫原与dmLT一起制备：从90mg总重量中称取27mg，溶于50μL 3%碳酸氢钠/30%蔗糖LR缓冲液中，使得终浓度为10mg/ml。制备这一制剂仅用于单次免疫接种，第二次免疫接种时再新鲜配制。将WCC在LR中冻干，并在80μL 3%NaHCO₃和30%蔗糖中复水以得到5E10；或在400μL中复水以得到E10。在表1中示出了分组和途径。

表1.疫苗的途径和组成

表2.组和剂量

将所有的小鼠在第1天进行免疫接种，第1-16笼在第8天进行免疫接种，所有笼在第15天进行免疫接种。在第34天取血，在第42天激发，在第58天处死。第17笼和第18笼退出了实验。在图10A-图10B中示出免疫原性结果；在图11A-图11C中示出定殖结果。口腔免疫有效；舌下免疫与口腔免疫没有显著差别。细胞因子生成和CFU之间的相关性相当一致。如图中所示，皮下途径在抗体生成中有效。

实施例9.皮下接种评价

如实施例1中所讨论的，将WCC重悬于400μ1水中用于经s.q.免疫。将新鲜配制的制剂用于二次免疫。WCC E8（371m）为在4℃下与铝佐剂混合过夜、然后在37℃下保持1个月的WCC E8。将WCB重悬在1.3ml水中以使OD与WCC的OD相一致。将WCB批（lots）在冷藏室中留存5周然后冻干。重悬于400μL水中。每两周免疫接种一次，共进行三次。

表3.WCC和Al(OH)₃（铝佐剂）疫苗制剂

	口腔给药组	#M	稀释剂体积	疫苗	铝佐剂	总计
							1	铝佐剂	10	2250	0	250	2500
2	WCC E8+铝佐剂	10	2125	125	250	2500
							3	WCC E7+铝佐剂	10	2237.5	12.5	250	2500
4	WCC E6+铝佐剂	10	2249	1.25	250	2500
							5	WCC E8	10	2375	125	0	2500
6	WCC E7	10	2487.5	12.5	0	2500
							7	WCC E6	10	2499	1.25	0	2500
8	WCC E8(371m)+铝佐剂	10	2125	125	250	2500
							9	WCB-but E8+铝佐剂	10	2125	125	250	2500
10	WCB lot 4E8+铝佐剂	10	2125	125	250	2500

表4.免疫接种组

将小鼠在第1天、第16天和第30天进行免疫接种。在第30天和第50天进行眼睛取血。在第55天，用10⁷CFU的Pn菌株（0603）对小鼠进行激发。在第65天，通过CO₂使小鼠安乐死，并收集鼻腔洗涤物。在图中示出结果。

实施例10.透皮给药研究

对于透皮研究，按如下所述制备免疫原：将WCC重悬于400μL水中以用于免疫接种（二次免疫时新鲜配制）。将WCC重悬于800μL ZWR（0.1%Zwittergen 3-14和1%Arg）。将WCC悬浮液用探头声波仪在最高强度声波处理至少2min以制备WCC裂解物。例如，使用强度4对两管处于2ml锥形管中的WCC声波处理6次，每次5s，涡旋10s以生产“WCA100”。声波处理二十四次，每次5s，以生产WCA。“WCA/bust”为重悬于水中、并将两个2ml管合并的WCC。使用强度4，以10s的间隔声波处理6次，每次20s。

表5.途径和给药制剂

途径		组	#M	次数	稀释剂	稀释剂体积	疫苗	LT/铝佐剂	总计
										TCI	1	仅LT	10	3	ZWR	250	0	28	278
TCI	2	仅WCA 100	10	3	ZWR	28	250	0	250
										TCI	3	WCA 100+LT	10	3	ZWR	0	250	28	278
TCI	4	WCA 20+LT	10	3	ZWR	0	250	28	278
										鼻内	5	仅LT	10	2	盐水	220	0	2.5	222.5
鼻内	6	WCA+LT	10	2	盐水	110	110	2.5	222.5
										鼻内	7	WCA/bust+LT	10	2	LR	0	220	2.5	222.5

以等价于10⁸细胞的剂量、连同1μg LT佐剂（在示出的情况下）一起将平均直径为100nm或20nm的片段（20μL；处于纱布贴剂中）施用至被轻缓摩擦除去角质层的背部皮肤上。将贴剂在原位保留18h。每两周如此免疫接种一次，共进行三次。在第三次免疫接种10天后取血样用于IL-17A分析，在6天后进行肺炎双球菌激发。在图12A-图12D中给出了免疫原性和定殖数据。

实施例11.Al(OH)₃（铝佐剂）中的WCA

如下所示，用铝佐剂中的WCA对各动物组进行皮下免疫：

表6.WCA接种组

	组	#M	次数	稀释剂	稀释剂体积	疫苗	LT/铝佐剂	总计
									1	铝佐剂	10	3	盐水	2250	0	250	2500
2	E8+铝佐剂	10	3	盐水	2125	125	250	2500
									3	E9+铝佐剂	10	3	盐水	1000	1250	250	2500

实施例12.BPL灭活的疫苗

为对用于制备全细胞抗原（在本报道中称作WCB）的BPL（β-丙内酯）介导的肺炎链球菌的灭活进行评价，利用了制备WCB的BPL的灭活作用，并使用了各种浓度的BPL（0.025%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%）。后续研究使用了0.025%（1∶4000）的BPL浓度，并在4℃下孵育过夜，继之以在37℃下失活2h。在所有情况下，观察到了100%的灭活。

更具体地，所使用的疫苗制剂（WCB）为：

（A）由Butantan Institute，Brazil所提供的WCB（OD 38.6，处于LR+0.2%葡萄糖中，0.025%BPL，4℃O/N，在37℃下失活2h，冻干）；

（B）本文所制备的WCB（WCB疫苗，OD 32，处于LR+0.2%葡萄糖中，0.025%BPL，4℃O/N，在37℃下失活2h，冻干）；

（C）低温保藏3周的WCB（WCB，OD 32，处于LR+10%蔗糖中，0.025%BPL，4℃O/N，在37℃下失活2h，未冻干）；以及

（D）WCC（氯仿灭活；1∶40氯仿，冻干）。通过革兰氏染色对疫苗制剂进行比较。

使用脾细胞的细胞悬浮液对脾细胞的IL-17A分泌进行测定，通过将小鼠的脾脏穿过70mm细胞过滤器得到所述脾细胞。在漂洗并通过溶血作用去除红细胞后，将细胞以5×10⁶细胞/孔的浓度（处于500μL补充有10%胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇（Sigma）以及10μg/ml环丙沙星的具有L-谷氨酰胺的DMEM/F12中）放入24孔组织培养板。随后，用所有WCB（相当于10⁷cfu/ml）刺激90h（此前，细胞仅在72h后收集），离心后收集它们的上清液并通过ELISA分析IL-17A浓度（R&D Systems，Minneapolis，MN）。相对于标准物，对上清液进行分析和读数。

在分光光度计中对所有的OD进行测定。通过BCA方法对蛋白进行定量。简短而言，将100μL的各蛋白与1mL的BCA工作试剂混合并在60℃下孵育30min，相对标准物测定其值。对于SDS-PAGE，将来自各制剂的上清液在4-12%Bis-Tris凝胶上进行电泳以检查蛋白。对于上清液，将冻干疫苗在dH₂O中复水并在8,000RPM下离心10min，收集上清液。基于OD读数，将Butantan疫苗稀释至终OD32（1.3∶1的稀释度）。

来自暴露于肺炎双球菌的小鼠的脾细胞的刺激：在体外于脾细胞中对使IL-17A生成的致敏进行分析，该细胞与WCB孵育超过90h。用稀释的Butantan疫苗（1.3∶1的稀释度）进行IL-17A刺激，所测定的IL-17A表达结果在表9中示出：

表7.BPL制剂的比较（GN=革兰氏阴性；GP=革兰氏阳性）

离心后收集各制剂的上清液，对于冻干制剂，在400μL dH₂O中重悬后冻干；对于非冻干制剂，仅400μL疫苗制剂。将10μL的各等份在4%-12%BisTris凝胶（SDS-AGE凝胶）上进行电泳，这显露出，比起其它制剂，WCC上清液中的相应蛋白的浓度更高（这与如图3A-图3B中所示的与经乙醇灭活的细胞相比，该制剂的蛋白回收率更高的结果一致）。在图14中示出了IL-17A刺激数据，其中“sup”表示通过将WCB离心后收集的上清液进行的刺激。

Claims (18)

1.具有全细胞革兰氏阳性细菌的、诱导多重免疫力的部分的免疫原性组合物，通过以下述方式选择性裂解全细胞细菌制剂来制备所述免疫原性组合物：将主要诱导抗体应答的可溶部分和主要诱导抗体非依赖性应答的细胞部分保留在所述组合物中。

2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌无荚膜。

3.如权利要求1或2所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌为肺炎链球菌。

4.如权利要求1-3任一项所述的免疫原性组合物，其中，通过化学试剂完成所述选择性裂解。

5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述化学试剂为氯仿、三氯乙烯或β-丙内酯。

6.如权利要求1-3任一项所述的免疫原性组合物，其中，通过声波处理完成所述选择性裂解。

7.包含如权利要求1-6任一项所述的免疫原性组合物的疫苗。

8.如权利要求7所述的疫苗，其中，所述疫苗包含佐剂。

9.如权利要求7或8所述的疫苗，其中，所述疫苗被配制为用于鼻腔给药、颊给药、透皮给药、皮下给药或肌内给药。

10.在哺乳动物体内诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予如权利要求7-9任一项所述的疫苗。

11.制备灭活的、全细胞免疫原性组合物的方法，所述免疫原性组合物具有来自于革兰氏阳性细菌的、诱导抗体依赖性免疫力和抗体非依赖性免疫力的细菌的部分，所述方法包括以下述方式选择性裂解细菌：将可溶部分和裂解的细胞部分保留在所述全细胞免疫原性组合物中。

12.如权利要求11所述的方法，其中，所述细菌无荚膜。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中，所述细菌为肺炎链球菌。

14.如权利要求11所述的方法，其中，所述可溶部分诱导血清型非依赖性的抗体应答，所述细胞部分诱导增强的吞噬作用。

15.如权利要求11-14任一项所述的方法，其中，通过化学试剂完成所述细菌的裂解。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述化学试剂为β-丙内酯、氯仿或三氯乙烯。

17.如权利要求15或16所述的方法，所述方法进一步包括以保留所述可溶部分和所述细胞部分的方式去除所述化学试剂。

18.如权利要求11-13任一项所述的方法，其中，通过声波处理完成所述细菌的裂解。

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