CN102631340A - 含异硫氰酸盐的抗肿瘤药物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含异硫氰酸盐的抗肿瘤药物及其用途，所述的抗肿瘤药物是异硫氰酸盐，所述的异硫氰酸盐为β-苯乙基异硫氰酸酯。本发明的抗肿瘤药物以高效逆转铂类化疗药物耐药而达到杀伤肿瘤细胞的作用。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及含异硫氰酸盐的抗肿瘤药物和异硫氰酸盐在制备抗肿瘤药物中的用途。
背景技术
癌症已取代心血管疾病成为导致死亡人数最多的疾病，据世界卫生组织统计在2004年的癌症死亡人数达740万，预计未来全世界因癌症死亡人数将继续增加。化学药物治疗是癌症的主要治疗手段之一，在近三十年来，以铂类化合物为基础的抗肿瘤药物在实体肿瘤中的应用非常广泛，有效地延长了患者的生存期或提高了患者的生存质量。但含铂方案的药物的治疗效果依然不尽人意，肿瘤细胞耐药性是其主要原因之一。近年来，大量研究发现细胞内铂聚集的减少是铂类化疗药物耐药的重要机制。耐药的肿瘤细胞胞膜上高表达多药耐药蛋白和多药耐药相关蛋白，能主动消耗ATP将与谷胱甘肽结合的铂泵出至胞外，这种谷胱甘肽依赖的铂外排是导致细胞内铂聚集减少的主要机制。多药耐药蛋白和多药耐药相关蛋白的表达增高已在乳腺癌，肺癌，卵巢癌等多种肿瘤耐药细胞中得到证实。传统化疗药物不能有效针对肿瘤细胞膜上的耐药泵，是导致继发性耐药和多药耐药的原因之一。因此，如何克服肿瘤细胞内铂聚集的减少是攻克铂类化疗药物耐药的重要手段。
肿瘤耐药细胞与敏感细胞在能量代谢上有着显著的差别，耐药的肿瘤细胞具有较高的ROS水平和增强的谷胱甘肽抗氧化系统。一方面，适当的ROS水平增高有利于肿瘤细胞生长；另一方面，ROS水平的进一步增高将导致细胞死亡。这些生化特性为研发逆转铂类化疗耐药的有效药物提供了生物学基础。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术不足而提供一种能够有效逆转顺铂，奥沙利铂等铂类化合物耐药的药物。
一种抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物含有异硫氰酸盐，所述的异硫氰酸盐为β-苯乙基异硫氰酸酯，如下列化学式所示
作为本发明抗肿瘤药物的优选实施方式，所述的抗肿瘤药物还含有顺铂(DDP)和奥沙利铂(L-OHP)。
本发明的异硫氰酸盐β-苯乙基异硫氰酸酯可与顺铂(DDP)以及β-苯乙基异硫氰酸酯与奥沙利铂(L-OHP)作特定药物组合以杀灭肿瘤细胞，克服以铂类化合物为基础的化疗耐药。
发明人的研究表明肿瘤铂类化疗药耐药细胞与敏感细胞相比，具有独特的能量代谢特征，表现为细胞内活性氧ROS水平增高和增强的谷胱甘肽抗氧化系统，如下表所示。
发明人的研究表明肿瘤顺铂耐药细胞与敏感细胞相比，细胞内的铂浓度以及DNA结合的铂浓度减少，如下表所示。
生化分析表明人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP和人肠腺癌耐奥沙利铂细胞株THC8307/L-OHP较其相应敏感株显示较高的细胞内ROS水平和增强的谷胱甘肽抗氧化系统。相同浓度的顺铂(40μM)作用于A549/CDDP细胞12小时和24小时后细胞内总的铂含量和DNA结合的铂含量明显少于A549细胞。基于铂类耐药细胞株的上述特点，提出以下假设：铂类化合物耐药细胞较其敏感细胞相比，已经处于较高的细胞内ROS状态，需要相应增强的GSH抗氧化系统来维持细胞内氧化还原状态平衡，而GSH的增高是导致顺铂耐药的重要原因。因此，ROS的进一步的增高或者GSH的剥夺将对耐药细胞株产生杀伤作用。为了寻找增加细胞内ROS水平和剥夺GSH的有效途径以杀灭铂类化合物耐药细胞，发明人发现了异硫氰酸盐β-苯乙基异硫氰酸酯能高效选择性杀伤铂类化合物耐药的肿瘤细胞。
体外药理实验表明，异硫氰酸盐β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)对多种肿瘤细胞，包括人肺腺癌A549细胞、人肠腺癌THC8307细胞等具有一定的生长抑制活性，特别是能有效地杀伤顺铂耐药细胞。联合运用异硫氰酸盐和化疗药物，具有协同作用，可明显杀伤对多种化疗药物耐药的细胞。体内药理实验表明，移植人肺腺癌耐顺铂细胞A549/CDDP的裸鼠模型中，在单独应用β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)和顺铂(DDP)对肿瘤生长无明显抑制作用的情况下，两者联合应用能明显抑制肿瘤的生长。因此，上述化合物可作为逆转铂类化合物耐药的抗肿瘤药物。
本发明还提供异硫氰酸盐与化疗药物联合运用作为根除铂类化疗药耐药细胞的用途，所述的异硫氰酸盐为β-苯乙基异硫氰酸酯，如下列化学式所示
附图说明
图1为本发明实施例1中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)具有高效选择性抑制人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)生长能力的结果图；
图2为本发明实施例1中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)能高效诱导人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)凋亡的结果图；
图3a为本发明实施例2中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP联合运用具有明显诱导顺铂耐药细胞(A549/CDDP)凋亡的结果图；
图3b为本发明实施例2中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与L-OHP联合运用具有明显诱导奥沙利铂耐药细胞(THC8307/L-OHP)凋亡的结果图；
图4为本发明实施例2中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP以及β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与L-OHP联合运用具有明显抑制顺铂耐药细胞(A549/CDDP)和奥沙利铂耐药细胞(THC8307/L-OHP)克隆形成能力的结果图；
图5为本发明实施例3中在人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)中，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)单独运用或与DDP联合运用能明显升高细胞内ROS水平的结果图；
图6为本发明实施例4中在人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)中，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)单独运用或与DDP联合运用能明显降低细胞内GSH水平的结果图；
图7a为本发明实施例5中在人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)中，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP联合运用后细胞内总铂含量明显增高的结果图；
图7b为本发明实施例5中在人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)中，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP联合运用后DNA结合的铂含量明显增高的结果图；
图8为本发明实施例6中在人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)中，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP联合运用后DNA损伤明显增强的结果图；
图9a-b为本发明实施例7中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP单独或联合运用对人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)在裸鼠体内的肿瘤生长的抑制作用的结果图；
图9c为本发明实施例7中β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP单独或联合运用后裸鼠体重变化的结果图。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
β-苯乙基异硫氰酸酯(β-phenylethyl isothiocyanate，简称PEITC)。
实施例1
β-苯乙基异硫氰酸酯在体外选择性杀伤顺铂耐药的肿瘤细胞。
所选细胞株为人非小细胞肺腺癌顺铂敏感株A549和顺铂耐药株A549/CDDP。取A549和A549/CDDP制成一定浓度的细胞悬液接种于96孔板中，每孔加入一定浓度的β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 0.94μM、1.88μM、3.75μM、7.5μM、15μM和30μM)作为待测药物，对照孔不加药物，每个浓度设3个平行孔。培养72小时后，每孔加入5mg/ml的MTT 20μl，继续培养4小时后，弃去上清，每孔加入200μl DMSO，微量振荡器振荡10min，于酶标仪570nm和630nm波长处读出吸光值，最终吸光值为570nm波长吸光值减去630nm波长吸光值。细胞生长抑制曲线见图1。另外，在体外培养试验中，取一定浓度的A549和A549/CDDP细胞接种于6孔板，加入β-苯乙基异硫氰酸酯(10μM)，每种细胞设3个复孔，培养24小时后，收集细胞离心后，用Annexin-v与PI染色，用流式细胞仪进行检测，结果见图2。实验结果表明PEITC能有效杀伤耐顺铂的A549/CDDP细胞，且A549/CDDP细胞较顺铂敏感的A549细胞对PEITC更加敏感。
实施例2
β-苯乙基异硫氰酸酯与DDP联合用药以及β-苯乙基异硫氰酸酯与L-OHP联合用药在体外明显杀伤顺铂耐药细胞和奥沙利铂耐药细胞。
所选细胞株为人肺非小细胞肺腺癌耐顺铂A549/CDDP细胞株和人大肠腺癌耐奥沙利铂THC8307/L-OHP细胞株。将上述2种耐药细胞制成一定浓度的细胞悬液接种于6孔板中，每孔加入一定浓度的β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 5μM、10μM)、DDP(40μM)、L-OHP(40μM)或两者联合(PEITC 5μM+DDP 40μM、PEITC 10μM+L-OHP 40μM)待测药物，对照孔不加药物，每个浓度设3个平行孔。培养24和48小时，收集细胞离心后，用Annexin-v与PI染色，用流式细胞仪进行检测，结果见图3a、图3b；实验结果表明5μM PEITC与40μMDDP联合运用以及10μM PEITC与40μM L-OHP联合运用具有很强的协同作用；而相同浓度的PEITC、DDP和L-OHP单独作用于耐药细胞没有明显毒性作用。另外，在体外培养试验中，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 4μM)和DDP(5μM)联合运用以及β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 4μM)和L-OHP(2.5μM)联合运用具有明显抑制A549/CDDP和THC8307/L-OHP克隆形成的能力，结果见图4。
实施例3
β-苯乙基异硫氰酸酯对顺铂耐药细胞内ROS水平的影响
实验所用细胞株：人非小细胞肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP。细胞中加入5μM的β-苯乙基异硫氰酸酯，40μM DDP，或两药联合培养6小时或12小时后，用CM-H2DCF-DA染色，流式细胞仪检测细胞内ROS水平。结果见图5。β-苯乙基异硫氰酸酯具有明显升高A549/CDDP细胞内ROS的作用，如于DDP联合运用，效果更加显著。
实施例4
β-苯乙基异硫氰酸酯对顺铂耐药细胞内谷胱甘肽抗氧化系统的影响。
实验所用细胞株：人非小细胞肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP。细胞中加入5μM的β-苯乙基异硫氰酸酯，40μM DDP，或两药联合培养6小时或12小时后，使用Cayman Chemical公司的GSH检测试剂盒检测细胞内总谷胱甘肽水平，结果见图6。单独运用DDP，细胞内GSH水平代偿性增高；β-苯乙基异硫氰酸酯单独运用或与DDP联合运用能明显剥夺A549/CDDP细胞内GSH水平。
实施例5
β-苯乙基异硫氰酸酯与DDP联合运用有效增加顺铂耐药细胞内总铂含量和DNA结合铂含量。
实验所用细胞株为人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP和顺铂敏感细胞株A549。实验分为对照组，DDP单药组和β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)联合运用DDP组。顺铂敏感细胞株A549作为实验对照，予以DDP(40μM)处理12小时和24小时；DDP单药组使用A549/CDDP细胞，予以DDP(40μM)处理12小时和24小时；联合用药组使用A549/CDDP细胞，予以β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 5μM)和DDP(40μM)共同处理12小时和24小时后，收集细胞并离心，用浓硝酸溶解沉淀，Agilent 7500ce ICP-MS原子吸收光谱仪测定铂浓度。DNA结合铂浓度的测定使用上述药物处理后，收集细胞并离心，用2×lysing buffer(2％SDS，20mM EDTA，200mM NaCl，20mM Tris，pH 8.0)重悬细胞沉淀后，加入3倍以上体积的无水乙醇，充分混匀后于-20℃冰箱过夜制备DNA-蛋白质复合物，离心并用75％乙醇洗涤后加入浓硝酸溶解沉淀，用Agilent7500ce ICP-MS原子吸收光谱仪测定DNA结合铂浓度。结果见图7。DDP(40μM)处理细胞12小时和24小时后，顺铂敏感细胞株A549中的总铂含量和DNA结合铂含量约为顺铂耐药细胞株A549/CDDP的3倍。DDP(40μM)联合运用β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 5μM)后，A549/CDDP细胞内总铂含量和DNA结合铂含量较单用DDP相比明显增加。
实施例6
β-苯乙基异硫氰酸酯与顺铂联合运用有效增强顺铂耐药细胞的DNA损伤。
实验所用细胞株为人非小细胞肺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP。分为阴性对照组，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)单药组，DDP单药组和β-苯乙基异硫氰酸酯联合运用DDP组。单药组分别予以β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 5μM或7.5μM)和DDP(40μM)处理12小时和24小时。联合用药组予以β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 5μM)和DDP(40μM)或β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC 7.5μM)和DDP(40μM)共同处理12小时和24小时。收集细胞用Western Blotting方法检测DNA损伤指标γ-H2AX的表达，结果见图8。与单独运用顺铂相比，联合运用β-苯乙基异硫氰酸酯能明显增加A549/CDDP细胞的DNA损伤。
实施例7
β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)与DDP单独或联合运用对人肺腺癌耐顺铂细胞(A549/CDDP)在裸鼠体内肿瘤生长的抑制。
实验所用细胞株为人非小细胞肺腺癌耐顺铂细胞株A549/CDDP。将A549/CDDP细胞(1×107个)接种于裸鼠胁腹部，待肿瘤长至体积约为30mm3时，将裸鼠随机分为4组，每组8只，分别为溶剂对照组，β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)单药组，DDP单药组和β-苯乙基异硫氰酸酯(PEITC)联合运用DDP组。溶剂对照组裸鼠予以腹腔注射200μl溶剂(蓖麻油∶无水乙醇∶PBS＝1∶1∶8)，每周一次。β-苯乙基异硫氰酸酯单药组予以腹腔注射25mg/kg PEITC，早晚各一次，每周一次；DDP单药组予以腹腔注射2.5mg/kg DDP，每周一次；联合用药组在腹腔注2.5mg/kg DDP前后5小时各给予腹腔注射25mg/kgPEITC，每周一次。从给药开始时测量肿瘤体积生长情况和裸鼠体重变化情况，每周测量2次。肿瘤体积＝(肿瘤长径×肿瘤短径2)/2。待溶剂对照组肿瘤体积约为1200mm3时，用颈椎脱臼法处死裸鼠，测量肿瘤净重。结果见图9，β-苯乙基异硫氰酸酯联合运用DDP能明显抑制A549/CDDP裸鼠皮下移植瘤的生长。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物含有异硫氰酸盐，所述的异硫氰酸盐为β-苯乙基异硫氰酸酯，如下列化学式所示
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述的抗肿瘤药物还含有顺铂和奥沙利铂。
3.如权利要求1所述的抗肿瘤药物作为制备逆转铂类化疗药物耐药的药物的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的化疗药物为顺铂和奥沙利铂。
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| CN103262850A (zh) * | 2013-01-16 | 2013-08-28 | 长沙理工大学 | 一种石蒜生长促进剂及其使用方法 |
| CN104072395A (zh) * | 2013-03-25 | 2014-10-01 | 黄蓬 | 一种异硫氰酸酯及其制备方法与抗癌应用 |
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