CN102614494A - 一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，具体是将博来霉素用0.01M的无菌PBS溶液稀释为1mg/ml的浓度注射于大鼠口腔双侧颊黏膜，每次每侧注射100μl，每天一次，注射8周。该方法实施周期短，成本低，操作简单，能够构建出理想的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型。

Description

一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法

技术领域

本发明属于动物病理模型构建领域，具体涉及一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法。

背景技术

口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis，OSF)又称口腔黏膜下纤维化，是一种慢性、隐匿性、具有癌变倾向的口腔黏膜疾病，已经被世界卫生组织定义为癌前状态，国内报道其癌变率为1.19-2.04％，国外报道其癌变率高达7-13％。它主要的病理特征包括口腔黏膜上皮组织萎缩或增生，固有层及黏膜下层胶原纤维堆积、玻变，血管闭塞、减少。临床表现为局部或全口黏膜苍白、僵硬，触之呈皮革感，有时伴有腭部水疱、口干等症状。

根据流行病学资料，OSF与咀嚼槟榔关系密切，并且其患病风险与咀嚼槟榔的频率和时间呈正相关。在我国，OSF好发于有咀嚼槟榔习惯的湖南、海南和台湾三省。一项来自台湾的报道显示，上世纪90年代，台湾的咀嚼槟榔者约有200万。湖南省最新的流行病学调查结果显示，全省15岁以上的居民中，13.3％的人目前有咀嚼槟榔习惯，2.9％的人曾经有咀嚼槟榔习惯，一生的咀嚼槟榔率高达16.2％，并且呈现出年轻化的发展趋势；OSF的患病率约为1％。高义军等对湖南娄底市的中小学生进行调查后发现，男性咀嚼槟榔率为21.1％，女性为3.1％。由此估计，目前湖南省咀嚼槟榔者近千万，OSF患者近百万。不仅如此，咀嚼槟榔习惯在湖南周边省份也逐渐流行开来，湖南省外的OSF病例也时有报道。在我国OSF已经逐渐上升为一种公共健康问题。

目前OSF具体的发病机制尚不明确，虽然目前学者们普遍认同其主要是由于槟榔中槟榔碱等成分长期反复刺激口腔黏膜，致使局部胶原合成和降解失衡造成的。临床上已有多种方法用于OSF的治疗，如口服、局部注射中西药物、高压氧和外科手术等，但是仍然缺乏特效治疗手段。

缺乏动物模型是制约OSF发病机制及临床治疗研究的一个十分重要的因素。建立OSF动物模型一方面可以为OSF发病机制和临床治疗的研究提供一个模拟人体的平台，另一方面在厘清OSF与口腔癌关系研究中也具有重要的价值。

已有很多学者在OSF动物模型的制作方面进行了多种尝试。上世纪60年代Sirsa等先后采用辣椒素和槟榔碱在Wistar大鼠的腭部涂擦来制作OSF的动物模型，但均未能诱导出典型的OSF病变。1987年MacDonald等将槟榔碱涂擦在仓鼠颊囊部位诱导OSF，也未获得成功。1991年Khrime等连续6个月采用pan masala(印度流行的一种槟榔咀嚼物)糊剂隔天刺激albino大鼠口腔黏膜，发现口腔黏膜下胶原沉积增加，而其他病理改变则不够典型。直到2007年Perera等采用槟榔提取物在小鼠的口腔黏膜局部滴300-600天，成功诱导出类似人类OSF的病理改变，为人们提供了一种较成功的OSF造模方法。但是这种方法试验周期长，成本高，操作难度大。再加上小鼠寿命短，其口腔黏膜组织面积太小，也不利于在此基础上进行进一步的实验研究。因此目前OSF仍然缺乏较理想的造模方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，该方法实施周期短，成本低，操作简单，能够构建出理想的口腔黏膜下纤维性变动物模型。

一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法：将博来霉素注射到大鼠口腔双侧颊黏膜即可。

具体方法是将博来霉素用0.01M的无菌PBS溶液稀释为1mg/ml的浓度注射于大鼠口腔双侧颊黏膜，每次每侧注射100μl的博来霉素稀释液，每天一次，注射8周。

上述方法中注射时进针位置距大鼠口角2-3mm；博来霉素稀释液现用现配，注射采用5号针头的注射器；大鼠在异氟烷麻醉状态下进行注射。

本发明采用的博来霉素(Bleomycin，BLM)是一种抗肿瘤药物，其毒副作用低，不会引起白细胞减少，也不抑制机体的免疫功能。主要的副作用有肺纤维化、皮肤纤维化等。据此，BLM已经被广泛地用于建立肺纤维化和硬皮病的动物模型。利用BLM的这一特点，我们采用BLM大鼠颊黏膜局部注射的方法建立了一种周期短、容易复制、病变稳定的OSF动物模型，以供对OSF的研究。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中实验大鼠体重变化趋势图；

图2为本发明具体实施方式中实验大鼠张口度变化趋势图；**表示与对照组相比P＜0.01。

图3为本发明具体实施方式中实验组大鼠BLM颊黏膜局部注射8周后张口度的测量情况图；

图4为本发明具体实施方式中对照组大鼠PBS颊黏膜局部注射8周后张口度的测量情况图；

图5为本发明具体实施方式中实验8周时实验组与对照组大鼠颊黏膜情况图；A：对照组PBS局部注射8周，颊黏膜颜色质地变化不明显。B-H：实验组BLM局部注射8周，颊黏膜局部苍白、僵硬(图中黑色箭头所示)。

图6为本发明具体实施方式中实验大鼠颊黏膜羟脯氨酸含量变化趋势图；**表示与对照组相比P＜0.01。

图7为本发明具体实施方式中实验期间实验组和对照组大鼠颊黏膜组织HE染色情况图(×100)；A、C、E、G依次为实验组第2、4、6、8周HE染色情况。B、D、F、H依次为对照组第2、4、6、8周HE染色情况。实验第2周(B)固有层大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，伴少量的浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。对照组(A)有少量中性粒细胞浸润。实验第4周(D)上皮钉突变尖，变短。固有层炎症细胞浸润减少，固有层下肌纤维萎缩，细丝状胶原沉积。实验第6周(F)上皮钉突变平、消失，上皮明显萎缩变薄。固有层少量淋巴细胞、浆细胞浸润，钉突逐渐消失。固有层胶原沉积增加，固有层下肌纤维萎缩明显。实验第8周(H)大部分上皮钉突消失，上皮萎缩、变薄。固有层大量胶原沉积，局部玻璃样变。仍有少量淋巴细胞、浆细胞浸润。

图8为本发明具体实施方式中实验大鼠颊黏膜组织masson染色图(×100)；A为正常大鼠颊黏膜，B、C分别为BLM局部注射4周和8周的大鼠颊黏膜，胶原沉积量较正常组大鼠明显增加。

图9为本发明具体实施方式中实验组大鼠部分组织器官HE染色图(×100)；A为BLM颊黏膜局部注射BLM 8周的大鼠肺组织，肺泡间隔变宽，渗出增加，炎症细胞浸润。B-F依次为BLM颊黏膜局部注射BLM 8周的大鼠舌、肝、肾、卵巢及子宫组织，结构基本正常。

图10为本发明具体实施方式中两组大鼠上皮下血管数变化情况图；*表示P＜0.05，**表示P＜0.01。

图11为本发明具体实施方式中正常组和实验组大鼠颊黏膜α-SMA表达情况图；A、C、E、G、I依次为正常组、实验组2、4、6、8周大鼠颊黏膜α-SMA表达情况(×100)，B、D、F、H、J为高倍镜时(×400)的表达情况。

图12为本发明具体实施方式中I型胶原的蛋白表达免疫印迹图；

图13为本发明具体实施方式中I型胶原蛋白表达直方图；

*表示与正常组相比P＜0.05，**表示与正常组相比P＜0.01。

图14为本发明具体实施方式中III型胶原的蛋白表达免疫印迹图；

图15为本发明具体实施方式中III型胶原蛋白表达直方图；

*表示与正常组相比P＜0.05，**表示与正常组相比P＜0.01。

图16为本发明具体实施方式中TGF-β1的蛋白表达免疫印迹图；

图17为本发明具体实施方式中TGF-β1蛋白表达直方图；*表示与正常组相比P＜0.05，**表示与正常组相比P＜0.01。

图18为本发明具体实施方式中IFN-γ的蛋白表达免疫印迹图；

图19为本发明具体实施方式中IFN-γ蛋白表达直方图；**表示与正常组相比P＜0.01。

图20为本发明具体实施方式中实验大鼠颊黏膜上皮组织超微结构图；A(×5000)、B(×10000)示实验组大鼠BLM局部注射8周后，上皮细胞萎缩，细胞间连接松散，局部水肿明显。C(×5000)、D(×10000)示对照组大鼠PBS局部注射8周后，上皮细胞及连接基本正常。

图21为本发明具体实施方式中实验组大鼠颊黏膜固有层胶原沉积情况图；A(×5000)、B(×10000)、C(×20000)、D(×30000)均显示实验组大鼠BLM局部注射8周后，固有层大量胶原沉积。

图22为本发明具体实施方式中实验大鼠颊黏膜固有层血管情况图；A(×5000)表示对照组大鼠PBS局部注射8周，血管形态基本正常。B(×5000)、C(×10000)、D(×10000)示实验组大鼠BLM局部注射8周血管壁增厚明显，管腔狭窄。

图23为本发明具体实施方式中实验组大鼠颊黏膜固有层成纤维细胞及肥大细胞图；A(×5000)B(×5000)、C(×5000)示实验组大鼠BLM局部注射8周后，固有层可见较多成纤维细胞，新生、成熟、凋亡各阶段均可见。有时可见肥大细胞(红色箭头所示)。D(×5000)示成纤维细胞内质网扩张。

具体实施方式

下面结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实验动物

健康的8周龄Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)100只，SPF级，雌雄各半。由中南大学湘雅二医院动物实验室提供。

实验方法

1、动物分组及饲养条件

100只SD大鼠随机分为实验组50只、对照组40只和正常组10只。所有大鼠均在标准条件下饲养(标准温度、湿度、12h明暗周期、可自由摄食)。

2、给药方法

将博来霉素(Bleomycin，BLM)粉针用0.01M的无菌PBS溶液稀释为1mg/ml浓度的稀释液。实验组大鼠在异氟烷(Isoflurance，USP)麻醉状态下用5号针头的注射器分别于双侧颊黏膜注射100μl BLM稀释液，每天一次。进针位置约距大鼠口角约2-3mm，将药液注射在黏膜下，不宜过浅或过深。BLM稀释液现用现配。对照组用0.01M的无菌PBS溶液(磷酸盐缓冲液)代替BLM稀释液，给药方式相同。正常组大鼠不给予任何干预。

在进行干预前，测量所有参加实验大鼠的体重和张口度。在实验的第2周，4周，6周和8周分别随机选取实验组和对照组大鼠各10只，在最后一次给药24h后采用过量CHCl₃处死。另外10只实验组大鼠在用BLM口腔黏膜局部注射8周后，停止干预，继续相同环境饲养6周后使用过量CHCl₃处死。正常组10只大鼠在实验的第一天即采用相同的方法处死。

3、标本取材

电镜标本的取材：实验组和对照组干预8周后，每组随机抽取3只大鼠，水合氯醛麻醉状态下，采用双面刀片于大鼠颊黏膜上取1mm×1mm×5mm的长条组织块，立刻投入2.5％的戊二醛中固定。

其余实验标本的取材：过量CHCl₃处死大鼠后立即取其双侧颊黏膜组织，一侧置于10％的福尔马林中4℃固定20-24小时，石蜡包埋，以备HE染色、masson染色和免疫组化实验；另一侧用皮肤环状活检器取直径6mm的黏膜组织块后，同余下的黏膜组织一起立即置于-80℃冰箱保存，以备羟脯氨酸的测定和western blotting实验。另外，实验组干预8周的大鼠处死后，随机选取4只取其舌、肝、肺、肾、子宫及卵巢组织用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋，以备HE染色。

4、体重和张口度的测量

用10％的水合氯醛以3ml/kg的剂量对大鼠进行腹腔麻醉后，进行体重和张口度的测量。张口度是指将大鼠的上中切牙固定，用计力器给其下中切牙2N的张口力，将其口腔拉开，用游标卡尺测量得到的其上下前牙切缘之间的距离。张口度每只大鼠测量3次，取其平均值，结果精确至1mm。

5、碱水解法测定大鼠颊黏膜组织中羟脯氨酸的含量

羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其颜色的深浅可推算出其含量。具体实验步骤如下：

1).样本前处理：将直径6mm的黏膜组织块放入玻璃试管中，准确加水解液1ml，用保鲜膜将试管口封闭，并在保鲜膜上扎几个小孔，95℃水浴水解20分钟，其间混匀一次。

2).调pH值至6.0-6.8左右。

①各试管流水冷却后各加指示剂1滴，摇匀；

②各管准确加入调PH值甲液1ml，混匀；

③用200μl的移液器吸取调PH值乙液向各管内逐滴小心加入，每滴加入后均要混匀，直至液体中指示剂的颜色变成黄绿色；④加蒸馏水至10ml，混匀；

⑤取4ml稀释的水解液加适量的活性炭(约20mg，以上清液离心后澄清无色为准)，混匀。3500转/分离心10分钟，小心取上清1ml做检测。

3).操作步骤见下表：

羟脯氨酸含量测定操作表

冷却后，3500转/分离心10分钟，取上清在560nm波长处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

4).羟脯氨酸含量的计算

6、HE染色观察大鼠颊黏膜组织病理改变

将实验组和对照组大鼠黏膜组织石蜡块以4μm的厚度切片，按以下步骤依次进行操作：

1).将切好的切片依次置于无水乙醇中5分钟，80％乙醇5分钟，蒸馏水5分钟；

2).苏木精染色液染色5分钟，流水洗1-3秒；

3).1％盐酸乙醇1-3秒，水洗10-30秒，蒸馏水洗1-2秒；

4).0.5％伊红染色液染色2分钟，蒸馏水洗1-2秒；

5).80％乙醇1-2秒，95％乙醇(I)2-3秒，95％乙醇(II)3-5秒，无水乙醇5-10分钟脱水；

6).石炭酸二甲苯5-10分钟，二甲苯(I)2分钟，二甲苯(II)2分钟，二甲苯(III)2分钟透明；

7).中性树胶封片。

7、masson染色观察大鼠颊黏膜胶原沉积情况

将实验组和对照组大鼠黏膜组织石蜡块以4μm的厚度切片，按以下步骤依次进行操作：

1).脱蜡至水：组织切片依次二甲苯I 10分钟，二甲苯II 10分钟，100％酒精I 5分钟，100％酒精II 5分钟，95％酒精3分钟，90％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，蒸馏水1分钟；

2).masson染色：masson复合液染色5分钟，自来水洗2次，0.2％醋酸I 1分钟，0.2％醋酸II 1分钟，自来水洗1次，1％磷钨酸6分钟，自来水洗1次，0.2％苯胺蓝液复染，自来水洗2次，0.2％醋酸I 1分钟，0.2％醋酸II 1分钟，自来水洗1次；

3).脱水透明：70％酒精30秒，80％酒精30秒，90％酒精30秒，95％酒精30秒，100％酒精I 5分钟，100％酒精II 5分钟，二甲苯I 5分钟，二甲苯II 10分钟，中性树胶封片。

8、免疫组化SABC法检测上皮层下血管数量

上皮层下血管数量通过CD34免疫组化染色后在显微镜下进行计数得到。实验组和对照组大鼠黏膜组织石蜡块以4μm的厚度切片，载玻片采用赖氨酸预处理，之后按以下步骤依次操作：

1).石蜡切片脱蜡至水；

2).蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟；

3).3％过氧化氢室温孵育10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性；

4).高压抗原修复：将切片放入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)容器中，高压修复90秒，取出冷却至室温，PBS冲洗2分钟×3次；

5).滴加5％BSA封闭液，室温孵育20分钟；

6).甩去血清，滴加50ul一抗工作液(CD34：1∶100)，37℃孵育1小时，PBS冲洗2分钟×3次；

7).滴加50ul生物素化山羊抗兔IgG，37℃孵育20分钟，PBS冲洗2分钟×3次；

8).滴加50ul SABC，37℃孵育20分钟，PBS冲洗5分钟×4次；

9).滴加DAB显色剂，显微镜下显色；

10).蒸馏水充分冲洗，苏木素复染2分钟，0.1％盐酸分色2秒，碳酸锂蓝化15秒；

11).梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。

阳性对照采用正常SD大鼠颊黏膜组织，阴性对照采用PBS代替一抗。

结果判断及血管计数方法：CD34的阳性表达为切片上被染成棕黄色色的部分。在显微镜下，将每张切片随机选取5个高倍视野(400×)，将每个视野中的血管进行计数，取其平均值。

9、免疫组化SABC法检测肌成纤维细胞

肌成纤维细胞(myofibroblast，MFB)特征性地表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin，α-SMA)，通过检测α-SMA的表达，可以反映出组织中MFB的情况。具体的实验步骤同上述CD34免疫组化染色，α-SMA抗体的稀释比例为1∶100。

阳性对照采用正常SD大鼠颊黏膜组织，阴性对照采用PBS代替一抗。

结果判断：黏膜固有层中，除血管壁平滑肌细胞外，α-SMA染色阳性(棕黄色)的长梭形细胞被认为是MFB。

α-SMA的表达程度采用Punnya等^[17]介绍的方法进行分析：在OSF病变区域内，除血管壁平滑肌细胞外，α-SMA染色阳性的细胞占所有细胞的0％记为0分，1-25％记为1分，25-50％记为2分，50-100％记为3分；同时，除血管壁平滑肌细胞外，α-SMA染色阳性(棕黄色)在组织切片放大40倍时即可明显观察到记为3分，放大100倍可明显观察到记为2分，仅在放大400倍时可明显观察到时记为1分，无阳性染色则记为0分。以上两项分数的乘积为α-SMA的表达指数。该表达指数根据分值分为无表达(0)，低表达(1-2)，中表达(3-4)和高表达(6-9)四个等级。

10、western blotting检测I、III型胶原、TGF-β1和INF-γ蛋白的表达

1).剪取0.25g的大鼠颊黏膜组织，用冰预冷的PBS洗涤一次，吸尽PBS。将组织块放入玻璃匀浆器内，加入500ulRIPA裂解液，手动匀浆，然后转移至1.5ml的离心管中；

2).冰上，蛋白裂解30分钟；

3).4℃，12000rpm离心5分钟(提前开离心机预冷)；

4).将离心后的上清分装转移到0.5ml的离心管中，冻存于-20℃冰箱中。

1.2.4.10.2蛋白浓度检测

5).按照BCA蛋白定量试剂盒使用说明测定蛋白浓度。

6).根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50∶1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

7).完全溶解蛋白标准品，浓度为2mg/ml。

8).将标准品按0，1，2，3，4，5，6μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。

9).加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl。

10).各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。

11).在波长562nm处测定各样本的吸光度，根据标准曲线计算蛋白浓度。

1.2.4.10.3western blotting

(1)电泳

①配10％-12％分离胶，加入TEMED后摇匀，灌胶，用异丙醇封胶。

②当水和胶之间出现一条折射线时，再等3分钟使胶充分凝固倒去胶上层异丙醇并用吸水纸将其吸干。

③配4％的浓缩胶，加入TEMED后摇匀，灌胶，插入梳子。

④计算使每个样品总蛋白上50-100ug各个样品所需取样量，并与5×loading buffer混匀，沸水煮5分钟，放入冰盒中速冷。

⑤上样，开始电泳。浓缩胶电泳电压为80V，分离胶电泳电压为120V。待溴酚蓝电泳至胶底部时终止电泳。

(2)转膜

①准备6张与胶同样大小的滤纸和1张PVDF膜，PVDF膜先在甲醇中浸湿，然后与滤纸一起放入转膜缓冲液中，至完全浸透。

②按照3张滤纸，膜，胶，另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。

③盖上仪器，接通电源，转膜约2h。

④转膜完毕后，将膜取出放入TBS-T中洗1次，时间5分钟。

⑤用丽春红染膜，检测蛋白转膜的效率。用TBS-T将丽春红洗净。

(3)封闭

用TBST配制5％脱脂奶粉，将膜浸入后，室温放置1小时。

(4)一抗孵育

用封闭液将一抗按照不同的比例稀释，将膜与一抗稀释液一起孵育，4℃过夜。孵育结束，TBS-T洗3次，每次15分钟。

(5)二抗孵育

用封闭液稀释HRP标记的二抗，稀释比例1∶3000，将稀释后的二抗与膜共同孵育45-60分钟。孵育结束，TBS-T洗3次，每次15分钟。

(6)显色/曝光

使用ECL化学发光液与膜孵育3分钟，用吸水纸吸尽液体，在暗盒内与X胶片曝光数秒至数分钟，显影冲洗。

(7)数据分析

将曝光后的底片扫描，采用Image-Pro Plus 6.0软件对图像进行灰度分析。

11、超微结构观察

采用透射电镜观察实验组和对照组大鼠颊黏膜组织的超微结构变化，标本取材后依次按照下列实验步骤操作：

1).固定：2.5％的戊二醛固定24小时；

2).后固定：2％的锇酸固定2小时；

3).梯度脱水：50％、70％、90％、100％丙酮脱水，每级10分钟×3次；

4).浸泡：环氧树脂混合液∶纯丙酮＝1∶1，浸泡24小时；

5).包埋：Epon812(Epoxiaquivalentgewicht 145-160)、DDSA(DodecenylsuccinicAnhydride)、MNA(Methyl Nadic Anhydride)、DMP30(dimethylaminomethyl phenol)，60℃，24小时包埋成块。

6).修薄、定位：半薄切片，甲苯胺蓝染色观察，选取所需要的部位。

7).超薄切片：瑞典产LKB-III型超薄切片机切片，厚约500埃；

8).电子染色：醋酸铀、硝酸铅双重染色

9).日产H-7500型透射电镜观察、切片。

10).拍照，分析。

12、统计学方法

所有数据均采用均数±标准差(

)表示，统计分析采用SPSS 11.0统计软件处理。计量数据组间比较采用单因素方差分析，若差异有显著性，采用LSD检验继续组间两两比较。等级数据组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，若差异有显著性，采用Mann-Whitney检验继续组间两两比较。以P＜0.05认为差异具有显著性，P＜0.01认为差异有极显著性。

结果

1、实验大鼠体重及一般状况

所有参与实验的大鼠在实验期间均活泼好动，皮毛光泽发亮，未出现行动迟缓、死亡等情况。在整个实验过程中，实验组和对照组大鼠体重均逐渐增加(表1、图1)两组差异不明显。

表1实验大鼠体重变化情况

2、实验大鼠张口度及颊黏膜颜色、质地的变化

在实验过程中，随着时间的推移，实验组大鼠张口度逐渐减小，对照组大鼠张口度逐渐增加，从实验第4周开始，两组大鼠的张口度差异显著，见表2、图2及图3、4。

实验组大鼠口腔黏膜从实验第3周起开始逐渐出现发白、僵硬，至实验第8周所有大鼠颊黏膜均不同程度的出现上述变化。对照组口腔黏膜颜色质地变化不明显，具体见图5。

表2实验大鼠张口度变化情况

3、实验大鼠颊黏膜羟脯氨酸(Hyd)含量变化

实验结果显示，正常组大鼠颊黏膜组织中Hyd的含量为45.6±7.56μg/块。随着实验时间的延长，实验组大鼠颊黏膜组织中Hyd的含量逐渐上升，对照组变化不明显，实验组从第4周起与对照组差异显著，具体见表3、图6。

表3实验大鼠颊黏膜羟脯氨酸的含量

4、HE和masson染色

实验组

随着实验时间的延长，大多数实验组大鼠颊黏膜上皮钉突逐渐变平、消失，上皮层萎缩、变薄(图7B、D、F、H)；少数上皮钉突增生、肥大，上皮层变厚。同时上皮层下开始出现炎症细胞浸润、粉红色物质沉积、血管闭塞等情况，具体变化如下：

第2周大鼠颊黏膜固有层炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，伴少量的浆细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。肌纤维未见明显萎缩，血管变化不明显。

第4周大鼠颊黏膜固有层炎症细胞浸润减少，固有层下肌纤维萎缩，有粉红色细丝状物质沉积。部分血管管壁增厚、闭塞。

第6周大鼠颊黏膜固有层少量淋巴细胞、浆细胞浸润，固有层下粉红色沉积物变致密，肌纤维萎缩明显。部分血管管壁增厚、闭塞。

第8周大鼠颊黏膜固有层粉红色致密沉积物范围扩大，固有层下肌纤维进一步萎缩，粉红色致密物沉积处几乎没有炎症细胞浸润，局部出现玻璃样变。黏膜下层血管明显减少。

masson染色显示，固有层下粉红色沉积物为胶原组织(图8)。

对照组

对照组大鼠颊黏膜组织上皮层结构基本正常，部分钉突出现伸长、变粗、不规则等。固有层炎症细胞浸润，以中性粒细胞为主，固有层下肌纤维轻度萎缩，血管变化不明显(图7A、C、E、G)。

实验组BLM干预8周的大鼠肺组织切片出现了局部的肺泡间隔变宽，渗出增加及炎症细胞浸润(图9A)。其他组织器官，如舌、肝、肾、子宫及卵巢组织未出现明显异常(图9B-F)。

BLM干预8周，继续饲养6周后处死的大鼠黏膜上皮萎缩或增生，固有层胶原沉积等病理变化依然存在。

5、黏膜下血管计数结果

CD34免疫组化染色后，在显微镜高倍视野下对各组大鼠黏膜下血管进行计数后发现，正常组大鼠黏膜下血管数量平均为4.44士1.51支/高倍视野。随着实验的进行，实验组和对照组血管数量均逐渐降低，具体见表4。实验第8周，实验组与正常组和对照组相比差异具有统计学意义(图10)。

表4实验大鼠黏膜下血管数变化情况

6、α-SMA的表达

除血管壁平滑肌细胞外，正常大鼠颊黏膜组织未观察到α-SMA的表达。从第2周起，实验组大鼠黏膜下层开始出现α-SMA的表达，并在第4、6、8周其表达明显增强，与正常组相比具有统计学意义，具体见表5，图11。除血管壁平滑肌细胞外，对照组黏膜下层未发现α-SMA的表达。

表5实验大鼠颊黏膜α-SMA表达情况

7、I型胶原蛋白的表达

Western blotting检测实验组大鼠颊黏膜I型胶原的蛋白表达情况如表6和图12、图13。在整个实验过程中，随着实验时间的延长，其表达不断升高，从第4周起与正常组相比差异具有统计学意义。

表6I型胶原的蛋白表达灰度值

*表示与正常组相比P＜0.05，**表示P＜0.01。

8、III型胶原蛋白的表达

Western blotting检测实验组大鼠颊黏膜III型胶原的蛋白表达情况如表7和图14、图15。在整个实验过程中，随着实验时间的延长，其表达不断升高，从第2周起与正常组相比差异具有统计学意义。

表7III型胶原的蛋白表达灰度值

*表示与正常组相比P＜0.05，**表示与正常组相比P＜0.01。

9、TGF-β1蛋白的表达

实验组大鼠颊黏膜TGF-β1蛋白表达结果如表8和图16、图17。在整个实验过程中，随着实验时间的延长，其表达先升后降，从第2周起与正常组相比差异具有统计学意义，并在第6周达到最高值，第8周略有下降。

表8TGF-β1的蛋白表达灰度值

*表示与正常组相比P＜0.05，**表示与正常组相比P＜0.01。

10、IFN-γ蛋白的表达

实验组大鼠颊黏膜IFN-γ蛋白的表达结果如表9和图18、图19。在整个实验过程中，随着实验时间的延长，其表达逐渐降低，从第4周起与正常组相比差异具有统计学意义。

表9IFN-γ的蛋白表达灰度值

*表示与正常组相比P＜0.05，**表示与正常组相比P＜0.01。

11、超微结构变化

通过透射电镜对实验组和对照组大鼠颊黏膜组织进行观察后发现，实验组颊黏膜上皮细胞固缩，细胞间连接疏松，局部水肿(图20)；上皮下大量胶原沉积，呈束状排列，胶原横纹清晰可见(图21)。上皮下血管内膜增厚，管径狭窄、闭塞(图22)。固有层可见新生、成熟、凋亡各阶段成纤维细胞，伴有内质网扩张，有时可见肥大细胞(图23)。

由以上试验结果可以看出，按照本发明方法构建的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型符合口腔黏膜下纤维性变的临床和病理特征，是理想的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型。

Claims (6)

1.一种口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，其特征在于，将博来霉素注射到大鼠口腔双侧颊黏膜即可。

2.根据权利要求1所述的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，其特征在于，博来霉素用0.01M的无菌PBS溶液稀释为1mg/ml的浓度注射于大鼠口腔双侧颊黏膜，每次每侧注射100μl的博来霉素稀释液，每天一次，注射8周。

3.根据权利要求2所述的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，其特征在于，注射时进针位置距大鼠口角2-3mm。

4.根据权利要求2所述的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，其特征在于，博来霉素稀释液现用现配。

5.根据权利要求2所述的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，其特征在于，注射采用5号针头的注射器。

6.根据权利要求2所述的口腔黏膜下纤维性变大鼠模型构建方法，其特征在于，大鼠在异氟烷麻醉状态下进行注射。

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