CN102604944B - 筛选乳腺炎抗性奶牛的hstn基因snp位点、方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点及检测方法，所述SNP位点为奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位碱基。通过提取奶牛的基因组DNA，测定奶牛HSTN基因单倍型组合，预测奶牛的乳腺炎抗性：HSTN基因单倍型组合为H2H2(AATTGG)时，奶牛的乳腺炎抗性最强；HSTN基因单倍型组合为H3H7(TTCCTG)时，奶牛的乳腺炎抗性最差。本发明的优点是：首次阐明了HSTN基因3个多态性位点组合与奶牛乳腺炎抗性的相关性，提供了一种预测奶牛乳腺炎抗性的方法，还提供了用于该方法的试剂盒，为奶牛的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。

Description

筛选乳腺炎抗性奶牛的HSTN基因SNP位点、方法及试剂盒

技术领域

本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及筛选乳腺炎抗性奶牛的HSTN基因SNP位点、应用方法及试剂盒。

背景技术

奶牛乳腺炎(Mastitis)是指奶牛乳腺受到物理、化学刺激，尤其是微生物的侵袭而发生的一种炎性变化，它不仅影响乳汁品质，而且降低产奶量，给奶业发展造成了严重的危害。据报道，乳腺炎在我国牛群中的阳性率可高达40％-80％，奶牛乳腺炎已成为目前困扰我国奶牛养殖业的头号难题，因此控制其发病率，降低治疗乳腺炎的费用，对于提高奶牛生产者的经济效益非常重要。

奶牛乳腺炎分为临床型乳腺炎(Clinical mastitis)和隐性乳腺炎(Hidden mastitis)(也称亚临床型乳腺炎，Subclinical mastitis)两种类型。临床型乳腺炎可产生明显的临床症状，比较容易作出诊断，而对于隐性乳腺炎要作出准确的诊断，须借助一些实验室的诊断方法。体细胞数(SCS)和乳腺炎之间的遗传相关从0.30到0.98，平均值为0.70，SCS与乳腺炎之间的高遗传相关使得SCS成为乳腺炎一个可行的遗传标记。如加拿大将SCS包括在总经济价值指数(TEV)中，而瑞典利用SCS制定了乳腺炎抗性指数。通过直接显微镜细胞记数法测定乳中SCS来评价奶牛各乳区和奶牛健康状况是目前比较公认的作法。人们通过功能基因多态性与SCS进行关联分析就可得到显著影响奶牛乳腺炎抗性的分子标记。

Histatherin(HSTN)由牛富组蛋白(Histatin，HTN)基因和富酪蛋白(Statherin，STATH)基因重组形成的HSTN基因编码，是富组蛋白和富酪蛋白的组合体，是最近发现的一种抗菌肽。Molenaar等(2008)人工合成了HSTN并进行了体外抗菌实验，发现在磷酸盐缓冲液中，3.1μg/mL浓度的HSTN能杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，6.25μg/mL浓度时能杀死念珠菌，表明HSTN的抗菌杀菌活性非常显著。据此推测HSTN在牛体内与免疫应答有关，具体的作用及其调控机制尚不清楚。HSTN基因是影响牛乳腺炎性状的一个重要基因，其单核苷酸多态性(SNP)是导致不同牛个体间抗乳腺炎性状差异的遗传学基础，但利用其SNP及单倍型组合与奶牛抗乳腺炎的关系检测奶牛抗性性状的试剂盒未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的提出一种用于HSTN基因单倍型组合筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，并通过此单倍型组合与乳腺炎抗性性状的关系，进而提供一种新的筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，为奶牛的标记辅助选择提供新的分子标记，可进行奶牛的早期筛选。

为实现这一目的，本发明提出的一个新的奶牛HSTN基因的单倍型组合H2H2(AATTGG)，是检测奶牛自GenBank Accession No NC_007304.5(88288094-88302412)中第635位脱氧核糖核苷酸是A还是T，第1607位脱氧核糖核苷酸是T还是C，第12624位脱氧核糖核苷酸是T还是G，确定所述奶牛在这三个位点的单倍型组合，然后通过单倍型组合确定乳腺炎抗性性状。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点，所述SNP位点为奶牛HSTN基因第635位、第1607位和第12624位碱基，奶牛HSTN基因第635位为A/T、第1607位为T/C和第12624位为T/G。

所述筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点可以应用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛试剂盒。

一种筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，为：提取奶牛基因组DNA，测定奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位碱基多态性，根据奶牛第635位、1607位和12624位的单倍型组合预测奶牛的乳腺炎抗性：当奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位基因单倍型组合为H2H2(ATG/ATG)基因型时，奶牛乳腺炎抗性最强；当奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位基因单倍型组合为H3H7(TTCCTG)时，奶牛的乳腺炎抗性最差。

所述单倍型组合按照如下方法确定：如果自GenBank Accession No.NC_007304.5(88288094-88302412)中第635位脱氧核糖核苷酸是A，其纯合体的基因型为AA；如果第635位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT；它们的杂合体基因型为AT。如第1607位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT；如第1607位脱氧核糖核苷酸是C，其纯合体的基因型为CC；它们的杂合体基因型为TC。如第12624位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT；如第12624位脱氧核糖核苷酸是G，其纯合体的基因型为GG；它们的杂合体基因型为TG。三位点组合后其单倍型组合有27种情况，即H5H5(AACCGG)、H5H6(AACCTG)、H6H6(AACCTT)、H2H5(AATCGG)、H4H5(AATCTG)、H4H6(AATCTT)、H2H2(AATTGG)、H2H4(AATTTG)、H4H4(AATTTT)、H5H7(ATCCGG)、H3H5(ATCCTG)、H3H6(ATCCTT)、H2H7(ATTCGG)、H4H7(ATTCTG)、H3H4(ATTCTT)、H2H8(ATTTGG)、H4H8(ATTTTG)、H1H4(ATTTTT)、H7H7(TTCCGG)、H3H7(TTCCTG)、H3H3(TTCCTT)、H7H8(TTTCGG)、H1H7(TTTCTG)、H1H3(TTTCTT)、H8H8(TTTTGG)、H1H8(TTTTTG)、H1H1(TTTTTT)。

一种筛选乳腺炎抗性奶牛的引物，具有序列表SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的碱基序列；所述引物可以特异性扩增出含HSTN基因的SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

一种筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，所述试剂盒为100头牛检测剂量，试剂盒的保存温度为-20℃，试剂盒的组成如下：

100μmol/L的上游引物20μL；

100μmol/L的下游引物20μL；

2×Taq PCR MasterMix 1mL；

ddH₂O 1.2mL；

所述上游引物和下游引物具有序列表SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的碱基序列。

所述试剂盒中还包括识别HSTN基因中第635位、1607位和12624位突变的限制性内切酶。

所述的突变选择以下单核苷酸多态性：

635位A→T；1607位T→C；12624位T→G；

其中，核苷酸位置编号基于NC_007304.5(88288094-88302412)。

本发明提出了HSTN基因第635位、1607位和12624位SNP碱基位点用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒的新应用，在实际应用中，本发明确定的乳腺炎抗性性状可作为奶牛育种的辅助选择标记。H2H2(AATTGG)单倍型组合个体的乳腺炎抗性高于其他单倍型组合个体。

本发明还提供了一种奶牛乳腺炎抗性基因HSTN单倍型组合筛选方法，包括如下步骤：

(1)采集奶牛颈静脉血液，ACD抗凝，利用常规的苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成50ng/μL备用。

(2)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性：

635位A→T；1607位T→C；12624位T→G；

其中，核苷酸位置编号基于GenBank索引号：NC_007304.5(448053-453004)。

(3)针对635位点EcoRI单核苷酸多态位点A/T，设计奶牛HSTN基因特异性引物，进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID NO：1所示)的扩增产物1；所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO：4和序列表SEQ ID NO：5所示的序列，所述的扩增产物1长度为933bp。

(4)针对1607位点HindⅢ单核苷酸多态位点T/C，设计奶牛HSTN基因特异性引物，进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID NO：2所示)的扩增产物2；所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO：6和序列表SEQ ID NO：7所示的序列，所述的扩增产物2长度为278bp。

(5)针对12624位点TaqI单核苷酸多态位点T/G，设计奶牛HSTN基因特异性引物，进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID NO：3所示)的扩增产物1；所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO：8和序列表SEQ ID NO：9所示的序列，所述的扩增产物1长度为849bp。

(6)检测扩增产物1的EcoRI单核苷酸多态位点A/T、扩增产物2的HindⅢ单核苷酸多态位点T/C的多态性和扩增产物3的TaqI单核苷酸多态位点T/G的多态性：限制性内切核酸酶EcoRI酶切所述扩增产物，若得到933bp片段，其基因型为AA纯合体；若得到933bp、532bp和401bp三个酶切片段时，其基因型为AT杂合体；若得到532bp和401bp片段，其基因型为TT纯合体。限制性内切核酸酶HindⅢ酶切所述扩增产物，若得到278bp片段时，其基因型为TT纯合体；若得到278bp、261bp和17bp片段，其基因型为TC杂合体；若得到261bp、和17bp片段时，其基因型为CC纯合体。限制性内切核酸酶TaqI酶切所述扩增产物，若得到849bp片段时，其基因型为TT纯合体；若得到849bp、541bp和308bp片段，其基因型为TG杂合体；若得到541bp和308bp片段时，其基因型为GG纯合体。

(7)构建单倍型，针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出27种单倍型组合：H5H5(AACCGG)、H5H6(AACCTG)、H6H6(AACCTT)、H2H5(AATCGG)、H4H5(AATCTG)、H4H6(AATCTT)、H2H2(AATTGG)、H2H4(AATTTG)、H4H4(AATTTT)、H5H7(ATCCGG)、H3H5(ATCCTG)、H3H6(ATCCTT)、H2H7(ATTCGG)、H4H7(ATTCTG)、H3H4(ATTCTT)、H2H8(ATTTGG)、H4H8(ATTTTG)、H1H4(ATTTTT)、H7H7(TTCCGG)、H3H7(TTCCTG)、H3H3(TTCCTT)、H7H8(TTTCGG)、H1H7(TTTCTG)、H1H3(TTTCTT)、H8H8(TTTTGG)、H1H8(TTTTTG)、H1H1(TTTTTT)。对于本领域普通技术人员来说，单倍型的构建方法可以根据需要而改变，只要适合检测本发明的单倍型即可。

本发明的积极效果为：

(1)在奶牛HSTN基因635位、1607位和12624位鉴定出3个突变位点，并分离鉴定出一个单倍型组合H2H2，经国际基因组数据库和文献专利检索，证明为新的SNP和单倍型组合。

(2)经将上述的单倍型组合与奶牛群736头中国荷斯坦牛个体的乳腺炎抗性性状进行相关性分析，新分离鉴定出的一个单倍型组合H2H2(ATG/ATG)与奶牛乳腺炎抗性性状显著相关，可以用于奶牛的早期筛选，从而减低饲养成本，增加产品的附加值。

(3)所发明的试剂盒可用于早期检测以提高检测效率，降低检测成本。

附图说明

图1：奶牛HSTN基因635位突变扩增产物经EcoRI酶切结果。

图2：奶牛HSTN基因1607位突变扩增产物经HindⅢ酶切结果。

图3：奶牛HSTN基因12624位突变扩增产物经TaqI酶切结果。

具体实施方式

本发明针对中国荷斯坦牛HSTN基因进行了深入的研究，发现3个新的SNPs位点，针对这3个SNPs位点组成的单倍型进行分析，其中统计分析结果显示，奶牛HSTN基因的单倍型组合H2H2(ATG/ATG)与奶牛乳腺炎抗性性状显著相关。因此这个单倍型组合可作为检测奶牛乳腺炎抗性性状的特异性单倍型组合，用于奶牛的标记辅助选种和选配。在此基础上完成了本发明。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等人，分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 单倍型组合及突变位点的确定

本发明采用PCR测序和PCR-RFLP技术对奶牛HSTN基因突变进行筛查，通过酶切电泳条带及测序结果比对，确定了635位、1607位和12624位3个突变位点。利用Shesis软件构建单倍型。

1.1 采集奶牛颈静脉血液(本发明所使用的荷斯坦牛颈静脉血液取自山东省规模化牛场，包括济南佳宝、青岛一牧等，即本发明所用血样的直接来源和原始来源)，ACD抗凝，利用常规的苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成50ng/μL备用。实验牛共500头，来自山东省内的规模化奶牛场。

1.2 引物设计

根据Genbank登陆号为NC_007304.5(88288094-88302412)的HSTN的基因序列(14319bp)，用Primer Premier5.0软件设计引物，所设计引物的序列、扩增产物的片段长度见表1。

表1 PCR扩增所用的引物

1.3 PCR扩增

25μL的反应体系：模板(50ng/μL)1μL，10μmol/L上下游引物各1μL，2×TaqPCRMasterMix 12.5μL，ddH₂O 4.5μL。

PCR反应条件：95℃变性5min，94℃变性30s，51(P1)℃或55(P2)或59(P3)℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

1.4 SNP的检测和分型

PCR产物经纯化后，用ABI 3730DNA测序仪进行序列的判读和SNP确认。635位点的A/T突变产生EcoRI单核苷酸多态、1607位点的T/C突变产生HindⅢ单核苷酸多态和12624位点的T/G突变产生TaqI单核苷酸多态。酶切反应体系为：10U/μL限制性内切酶EcoRI、HindⅢ或TaqI 1μL；dd H₂O 4μL；Buffer 1μL；PCR产物4μL。635位点的EcoRI单核苷酸多态发现3种基因型，分别为AA(933bp)型、AT(933bp+532bp+401bp)型和TT(532bp+401bp)型；1607位点的HindⅢ单核苷酸多态发现3种基因型，分别为TT(278bp)型、TC(278bp+261bp+17bp)型和CC(261bp+17b)型；12624位点的TaqI单核苷酸多态也发现3种基因型，分别为TT(849bp)型、TG(849bp+541bp+308bp)型和GG(541bp+308bp)型。

采用10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行检测，于凝胶成像系统白光下检测，如图1、图2、图3所示。

1.5 HSTN基因SNP位点单倍型构建

运用Shesis软件计算统计SNPs位点间各种单倍型。在HSTN基因共发现8种单倍型，分别是H1(ACG)、H2(ACT)、H3(ATG)、H4(ATT)、H5(TCG)、H6(TCT)、H7(TTG)和H8(TTT)，单倍型频率分别为0.080、0.072、0.198、0.137、0.069、0.166、0.069和0.208，如表2所示。单倍型频率小于0.03时，数据将会被自动删除。对3个SNPs进行单倍型组合分析，发现27种单倍型组合：H5H5(AACCGG)、H5H6(AACCTG)、H6H6(AACCTT)、H2H5(AATCGG)、H4H5(AATCTG)、H4H6(AATCTT)、H2H2(AATTGG)、H2H4(AATTTG)、H4H4(AATTTT)、H5H7(ATCCGG)、H3H5(ATCCTG)、H3H6(ATCCTT)、H2H7(ATTCGG)、H4H7(ATTCTG)、H3H4(ATTCTT)、H2H8(ATTTGG)、H4H8(ATTTTG)、H1H4(ATTTTT)、H7H7(TTCCGG)、H3H7(TTCCTG)、H3H3(TTCCTT)、H7H8(TTTCGG)、H1H7(TTTCTG)、H1H3(TTTCTT)、H8H8(TTTTGG)、H1H8(TTTTTG)、H1H1(TTTTTT)(见表2)。

本领域普通技术人员已知，上述单倍型的构建方法可以根据需要而改变只要适合检测本发明的单倍型即可。

表2 HSTN基因单倍型组合频率

实施例2 HSTN基因单倍型组合与奶牛乳腺炎抗性的相关

体细胞评分的测定：采集牛奶样40mL，加入重铬酸钾0.03g，轻轻混匀，然后送山东省农科院奶牛中心DHI实验室用Foss 6000乳成分及体细胞联机分析系统(FossMilkScan FT 6000，Fossmatic 5000)测定体细胞数。根据公式SCS＝log2(SCC/100)+3(其中SCS-体细胞评分；SCC-体细胞数，单位千/mL)，计算个体的体细胞评分。

最小二乘方差分析采用SAS 9.0(Statistical Analysis System)软件的ANOVA-LinearModels程序，建立下列模型，对体细胞评分与单倍型进行最小二乘分析和显著性检验，其模型为：

Y_ijkl＝μ+G_i+E_j+S_k+P_l+e_ijkl

公式中Y_ijkl为第i个个体表型的记录值，μ为群体平均值，G_i为第i个个体的基因效应值，E_j为环境效应值，S_k为季节的固定效应，P_l为胎次的固定效应，e_ijkl为随机位差。

在进行单倍型组合与体细胞评分的相关性分析中剔除掉样本数小于15的单倍型组合，结果显示，中国荷斯坦奶牛HSTN基因不同单倍型组合与体细胞评分间存在相关性，其中H2H2(AATTGG)单倍型组合体细胞评分极显著低于其他单倍型组合(P＜0.05)(见表3)，H2H2(AATTGG)为乳腺炎抗性组合。

表3 HSTN基因单倍型组合的体细胞评分的最小二乘均值及标准误

注：不同小写字母的平均值间差异极显著(P＜0.05)

由表3可知，具有HSTN基因H2H2单倍型组合的奶牛个体乳腺炎抗性显著高于具有其他单倍型组合的个体(P＜0.05)。这在奶牛选育和品种改良上具有潜在的应用价值。通过对奶牛HSTN基因3个位点进行基因定型，若发现某个个体携带H2H2单倍型组合，则该个体与携带其他单倍型的个体相比期望有更优的乳腺炎抗性性状。据此，育种工作者可以指导牛的早期筛选，从而降低饲养成本，增加产品的附加值。可见，奶牛HSTN基因单倍型组合在奶牛的标记辅助选种和选配中有重要的应用前景。

实施例3 检测试剂盒

基于HSTN基因单倍型组合标记筛选奶牛的试剂盒，如实施例1所述，NC_007304.5中的635位A→T突变、1607位T→C和12624位T→G突变构建的单倍型组合与奶牛的乳腺炎抗性性状密切相关。因此，可基于这3个SNP位点设计HSTN基因特异性引物进行扩增和检测。

制备检测奶牛乳腺炎抗性性状的试剂盒(100次)，组成如表4所示：

表4

采集牛血液，提取总DNA，按实施例1所述方法进行反应。将试剂盒中的PCR引物稀释到10μmol/L，以所提取的DNA为模板用上述试剂盒进行PCR反应。PCR反应条件：95℃变性5min，94℃变性30s，51(P1)℃或55(P2)或59(P3)℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。按实施例1所述方法对P1扩增产物、P2扩增产物和P3扩增产物单倍型组合进行确认。

根据本发明提供的标记方法，如果直接测序也可以检测出NC_007304.5中第635位A→T突变、1607位T→C突变和12624位T→G突变。

本发明具有实用性的例证：

1)本发明的HSTN基因多态性的检测方法可用于分析牛6号染色体的HSTN基因上的3个SNPs位点，应用于牛乳腺炎抗性的早期诊断，以利于培育乳腺炎抗性牛品种。

2)本发明建立的检测HSTN基因多态性的核苷酸序列和乳腺炎抗性相关位点，可高灵敏度、特异性地应用于牛乳腺炎抗性基因诊断的试剂盒。

如上所述，得出结论，HSTN基因在第635位、1607位和12624位碱基的多态性与牛乳腺炎抗性具显著相关性。因此，根据本发明，测定此多态性可用于进行基因诊断。

本发明叙述了HSTN基因乳腺炎抗性相关的新突变位点，并提供了一种测定HSTN基因多态性的方法。而且，根据本发明，只需要少量DNA样品就足以测定HSTN基因多态性。结果，本发明提供了一种测定牛乳腺炎抗性相关单倍型组合的基因诊断方法。

Claims (4)

1.一种筛选乳腺炎抗性奶牛的引物组合物，其特征在于：所述引物的序列为序列表SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的引物组合物用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛试剂盒的应用。

3.一种筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为100头牛检测剂量，试剂盒的保存温度为-20℃，试剂盒包括：

上游引物20μL，其中，三条上游引物的浓度各为100μmol/L；

下游引物20μL，其中，三条下游引物的浓度各为100μmol/L；

2×Taq PCR Master Mix1mL；

ddH₂O1.2mL；

所述三条上游引物的序列分别为序列表SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；

所述三条下游引物的序列分别为序列表SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括识别HSTN基因中第635位、1607位和12624位突变的限制性内切酶。

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