CN102603575A

CN102603575A - 大精酸共晶物、其制备方法、纯化方法及其在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用

Info

Publication number: CN102603575A
Application number: CN2012100005839A
Authority: CN
Inventors: 丛晓东; 戴德哉; 戴茵; 迟宗良
Original assignee: Individual
Current assignee: Cong Xiaodong; Nanjing Due To Large Health Science And Technology Co ltd
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2012-01-04
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2032-01-04
Also published as: CN102603575B

Abstract

大精酸共晶物、其制备方法、纯化方法及其在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。大精酸共晶化合物为大黄酸和L-精氨酸形成的共晶物，大黄酸活性药物成分与L-精氨酸物质的量比为1∶1，共晶粉末X射线衍射图具有9.22°，10.34°，12.28°，26.05°，26.58°及27.57°2θ的特征峰。治疗糖尿病并发症药物指治疗糖尿病心肌病的药物、治疗糖尿病大血管病变的药物、治疗糖尿病肾病的药物、治疗糖尿病性睾丸病的药物、治疗糖尿病并发的男性性功能低下的药物或糖尿病性阳痿的药物。本发明能增加药物的溶解度和溶出度、提高大精酸的纯度与稳定性、减少杂质含量与引湿性、提高生物利用度、改善释放特性。

Description

大精酸共晶物、其制备方法、纯化方法及其在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种大黄酸精氨酸的复合物，该复合物利用超分子化学共晶技术，将其制备共晶物-大精酸(Argirein)，即活性药物成分大黄酸(rhein)和共晶形成物L-精氨酸(L-arginine)形成的共晶物(复合物的一种)，本发明还涉及这种大精酸共晶化合物的制备方法、这种大精酸共晶化合物与大黄酸的纯化方法，以及这种大精酸共晶在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

背景技术

糖尿病及其并发症属于常见病、多发病。糖尿病的发病率居高不下，呈高发病率的态势。中国的发病率较高。糖尿病主要是II型，侵袭中老年人群，具有高度致病性，成为高病死率的病因。II型糖尿病由于多种致病因素的作用下，形成对胰岛素抵抗，而后发展成高血糖症，损害重要器官的细胞，导致并发症的出现。主要是微血管并发症和大血管并发症，涉及糖尿病心肌病，糖尿病大血管并发症，糖尿病肾病，糖尿病男性性功能低下症(睾丸病，阳痿)，糖尿病视网膜病，以及糖尿病神经病变，等。糖尿病并发症的发生率高，血管并发症构成糖尿病致死病因的大多数，约占80％以上。

目前，对糖尿病的药物治疗，不仅考虑降低高血糖症，单用降糖药治疗并不能达到满意的治疗效果，有些并发症仍会发展。由于糖尿病的高血糖症激活体内的细胞因子等。虽用降糖药控制血糖基本正常，细胞病变有记忆机制，还可能发展，使病理过程不断进行。如糖尿病肾病，虽血糖控制在正常范围内，多年后仍会发展成终末性肾病，尿毒症。另方面，单用降糖药并不能使糖尿病患者寿命延长。因此，对糖尿病患者，使用保护细胞的药物，阻断细胞因子等致病因子，治疗和防治糖尿病并发症，显得十分重要。

糖尿病并发症主要是大血管和微血管并发症。高血糖生成糖基化终末产物(AGEs)，损害血管内皮细胞，以及心肌细胞，肾系膜细胞，视网膜，睾丸等。AGEs有氧自由基特性，损害细胞，生成ROS(反应氧自由基)及ET(内皮素)等多种细胞因子。TGFβ1上调等也参与糖尿病的细胞损害。血管内皮细胞功能损害。使NO(一氧化氮)降低，同时使ET上调。增强缩血管功能，降低舒血管功能，使血管呈痉挛状态。微血管损害，导致糖尿病肾病，视网膜病，及睾丸病。细胞因子增多成为糖尿病并发症的主要病因。

本发明所涉及的糖尿病，主要是II型糖尿病和并发症，包括以下疾病：

糖尿病心肌病；

糖尿病心肌病的发病率很高，致病性严重。表现心肌损害，心功能减弱，易于出现心力衰竭，病死率高。

糖尿病大血管病变；

糖尿病大血管并发症，如动脉粥样硬化等。累及颈总动脉，冠状动脉，四肢动脉，等。糖尿病血管壁中NO减少，细胞因子如内皮素增多，内膜增厚，血管壁趋于硬化。不仅使血管舒张功能降低。血管功能明显异常，呈轻度痉挛状态。而且，内膜损害易引起动脉血栓，闭塞血管。

糖尿病肾病；

糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症，常在血糖控制到正常范围后，潜在地不断发展，会发展到尿毒症，后果极为严重。已公认是造成肾功能衰竭的重要病因。

糖尿病男性性功能低下症-睾丸病；

男性性功能低下已构成现代社会的一个重要问题。糖尿病，高血压和高血脂，肥胖等代谢综合症发病较多。男性性功能低下在美国，占45岁以上男性医院就诊1/3。构成全球性的医药问题。

申请人首次发现：睾丸病中ET(内皮素)表达，可分为过度和低下表达二类：ET系统上调型，多见于糖尿病性和应激性睾丸病(见后)，ET系统下调型，见于腺嘌呤性睾丸病。这差异可能对药物的治疗反应有所不同。糖尿病睾丸病与睾丸中旁分泌(paracrine)性的ET，与反应氧类(ROS)自由基的生成较多，十分相关。

糖尿病性男性性功能低下症，常并发阳痿：由于雄激素降低和阴茎海绵体病变。

男性性功能低下伴有阴茎海绵体的异常。海绵体由大量血管组成。勃起障害与NO有关。西地那非抑制5-脂氧酶使海绵体NO增高，明显增强舒血管功能，改善勃起功能。但是，糖尿病性勃起障害。阴茎海绵体血管反应性降低，出现纤维化等，西地那非的治疗效应差。因此，要寻求其他有效地药物。海绵体勃起功能减退，由多种病因，与ET系统和ROS上调等相关，以及，海绵体病变中细胞外基质增多，MMPs(基质金属蛋白酶系)和TIMPs(组织内源性金属蛋白酶抑制物)间失调等，构成致病性。

糖尿病并发症还包括：糖尿病视网膜病和糖尿病神经病变等。糖尿病和它的诸多并发症，均由于慢性炎症，发生内质网应激是本质。也与细胞因子，等增多有关。本发明提供的大黄酸精氨酸(大精酸)可抑制内质网应激，故而对众多糖尿病并发症均有治疗作用。糖尿病病变中的多个分子靶点，发明人已有系统研究及系列论文中均有论述。

中国第200610106502.8号发明专利申请：“大黄酸或大黄酸类化合物的复合物、其制备方法及其在制备治疗骨关节炎药物中的应用”、中国第200610106515.5号发明专利申请：“大黄酸或大黄酸类化合物的复合物、其制备方法及其在制备预防肠粘连药物中的应用”，及中国第200610106516.X号发明专利申请：“大黄酸或大黄酸类化合物的复合物、其制备方法及其在制备治疗糖尿病肾病药物中的应用”，公开了一种大黄酸或大黄酸类化合物与精氨酸的复合物。该复合物的结构如通式(I)：

通式(I)中的左侧部分为大黄酸或大黄酸类化合物单体成分，或含大黄酸的植物提取物；

通式(I)中的M，表示含氮有机碱或碱性氨基酸，所述的大黄酸或大黄酸类化合物，与含氮有机碱或碱性氨基酸，以分子间作用力结合形成复合物。

以上发明尚未涉及到使用大黄酸或大黄酸类化合物的复合物治疗糖尿病并发症，包括尚未涉及对糖尿病心肌病；糖尿病大血管病变；男性性功能低下的治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种大精酸共晶物，这种大精酸共晶物是一种缓释，长效，低毒的大黄酸衍生物，可以用来治疗糖尿病肾病。与传统大黄酸类物质、大黄酸衍生物及大精酸复合物a、b相比，能够增加药物的溶解度和溶出度、提高稳定性、减少引湿性、提高生物利用度、改善释放特性，在药品质量方面，提高了药物的纯度，减少了相关物质(杂质)。本发明还将提供该大精酸共晶物的制备方法、该大精酸共晶化合物与大黄酸纯化方法，以及该大精酸共晶在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

完成上述第一个发明任务的技术方案是：

一种大精酸共晶物，为活性药物成分(API)大黄酸(rhein)和共晶形成物(CCF)L-精氨酸(L-arginine)形成的共晶物，其特征在于，该大精酸共晶物中，大黄酸与L-精氨酸的物质的量比(摩尔比)比为1∶1，该共晶的粉末的X射线衍射图(图4)，具有9.22°，10.34°，12.28°，26.05°，26.58°及27.57°2θ处的特征峰。

更优化地说：在差式扫描量热分析(DSC)中，本发明的大精酸共晶化合物具有246.27℃的特征峰。

在傅里叶红外光谱扫描(FT-IR)图2中，本发明的大精酸共晶化合物具有1660、1694、3343(cm-1)的特征峰。

在质谱测定(MS)中，本发明的大精酸共晶物具有457.1357、282.9484、238.9696、210.9806、182.9948、154.0001m/z的特征峰。

本申请所述的大精酸与一般意义的“大黄酸盐”完全不同，该化合物生成过程不是简单的酸碱反应，这反应过程中没有脱掉一分子水形成离子键，本专利所述的反应：在两个分子之间以弱共价键或氢键作用力相结合，生成共晶物，而非离子键结合。大精酸结晶型化合物，它的元素分析结果，证明分子式：C₁₅H₈O₆·C₆H₁₄N₄O₂。¹³C-NMR谱测定数据，与大黄酸文献报道的数据比较，2位碳[δ：147.37(rhein 138.18)]及2位上的羧基碳[δ：172.02(rhein 165.06)]的化学位移，分别向低场移动约9个单位和7个单位，而精氨酸部分，由于其结构中含有中等强度的碱性基团胍基。因此推断：大黄酸的2位羧基与精氨酸的胍基形成氢键，生成大精酸共晶物-新共晶物，结构式见下。

大黄中有主要的5种蒽醌成分：大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚。其中，大黄酸安全性最高。为了规避除大黄酸以外的4种蒽醌类相关物质的超标，本发明中所用的大黄酸，从芦荟中或大黄中提取。结果相关4种蒽醌类物质含量均小于1.0％。

以下测定数据及图7(左)，图(7右)，图27-29中的数据证明：本发明大精酸共晶物与已经公开的粉末状(非晶型)大精酸在纯度、相关物质及引湿性等药学性质方面的不同。

共晶测定数据(表1-5)：

表1X射线衍射特征峰(最大峰)

表2大精酸、大黄酸和精氨酸FT-IR特征峰

表3大精酸复合物a、b和大精酸I型结晶FT-IR特征峰

表4大精酸复合物a、b与I型结晶比较

表5大精酸I型结晶的晶格

大精酸I型结晶为黄色结晶状固体，显微镜下为针状结晶。区别于大精酸复合物a、b。有着独特的红外特征及X射线衍射特征；大精酸I型结晶的熔点为276℃，有着明显的熔化过程，区别于大精酸复合物a、b(两者分别于206℃和202℃下炭化)；大精酸I型结晶引湿性很低，10天时的吸湿增重为0.56％，小于大精酸复合物a、b。

完成本申请第2个发明任务的技术方案是：一种上述大精酸共晶物(式3)的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1).取大黄酸，加入物质比(摩尔比)1∶1的精氨酸，溶于水中，加热，回流；(2).趁热过滤；

(3).向滤液中加入惰性溶剂，至含惰性溶剂为40-70％，搅拌；(4).过滤，减压回收惰性溶剂；

(5).冷却至室温20℃、0-4℃放置、析出晶体；(6).过滤、干燥即得产品。

以上制备方法更优化和更具体的操作方法是：

1、所述步骤(1)至步骤(3)，是将活性物质大黄酸(式1)与共晶形成物精氨酸(式2)置于水中，在20-100℃条件下(优选40-90℃条件下)，搅拌反应0.5-2h后，加入惰性溶剂；

2、步骤(3)所述的合适惰性溶剂是低级醇、酮类或者乙腈，如乙醇、2，2，2-三氟乙醇、2-丙醇、丙酮、乙腈。优选乙醇或者丙酮。

3、步骤(4)所述的减压回收惰性溶剂，是选择在30-70℃减压蒸发；

4、步骤(4)至步骤(5)的操作是：选择在30-70℃减压蒸发溶剂到1/2体积，加入晶种大精酸I型结晶，冷却到15-30℃，保温4h，在0-10℃下静置，放置析晶。

上述制备方法也可以完成对大精酸与大黄酸的纯化，所以，

完成本申请第3个发明任务的技术方案是：

上述大精酸共晶物与大黄酸的纯化方法，其特征在于，步骤如下：(1).取大精酸适量，加入40-70％乙醇，加热，回流1-2h；(2).趁热过滤；(3).于60-80℃水浴下减压回收溶剂，至体积减半；(4).过滤，滤液冷却至室温；(5).0℃以下放置、析出晶体；(6).过滤、干燥即得纯化大精酸共晶物产品；(7).取步骤(6)得到的大精酸共晶物产品适量，加水，加热使溶解，加入稀盐酸调节pH至2，收集沉淀，用水洗沉淀至中性，干燥即得纯化大黄酸产品。

以下测定数据及图2、图7(左)、图7(右)、图27-29的数据证明：本发明大精酸共晶物与已经公开的粉末状(非晶型)大精酸在纯度与其相关物质及引湿性等药学性质方面的不同。

1、仪器与试药：

高效液相色谱仪型号：戴安U3000；

供试品①：江苏联创医药技术有限公司，批号：20100706，起始原料为芦荟，简称：[Rhein]^南；

供试品②：自制，批号：20111213，简称：[Argirein]^复合物a；

供试品③：自制，批号：20111215，简称：[Argirein]^共晶a；

供试品④：自制，批号：20110831，简称：[Argirein]^共晶b；

供试品⑤：淮安巍伟值化研究所，批号：20060821，起始原料大黄，简称：[Rhein]^淮；

供试品⑥：江苏联创医药技术有限公司自制，批号：20050920，简称：[Argirein]^复合物b；

供试品⑦：自制，批号：20111215，简称：[Argirein]^共晶c；

供试品⑧：自制，批号：20060316，简称：[Argirein]^共晶d；

精氨酸：上海味之素氨基酸有限公司，批号：10abb002，简称：[Arg]^上。

2、方法：

2.1使用HPLC的主成分自身对照(外标两点法)测定纯度

HPLC条件：

固定相：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；流动相：甲醇-0.1％磷酸溶液(75∶25)；检测波长：254nm；柱温：25℃；流速：1ml/min。

供试品溶液的制备：用流动相将供试品①～④，⑦～⑧配制成1mg/ml的溶液。超声至完全溶解，放冷后用流动相补足刻度。分别得供试品溶液①，供试品溶液②，供试品溶液③，供试品溶液④，供试品溶液⑦，供试品溶液⑧。(见式1～6)。

对照品溶液的制备：将上述6种供试品溶液分别用流动相稀释100倍、1000倍配制成为对照品溶液。分别得对照品溶液①，对照品溶液②，对照品溶液③，对照品溶液④，对照品溶液⑦，对照品溶液⑧。(见表8，式1～6)。

HPLC测定：将以上获得的供试品溶液和对照品溶液分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应至少为主成分色谱峰保留时间的2倍。测定供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积的总和，按自身对照外标两点法，即与1/100和1/1000的对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质相对量。测定结果请见表6，10。(色谱图，略)。

表6供试品有关物质检查结果(自身对照法)

2.2HPLC外标法测定供试品⑤，⑥含量：

因反应式4-5中粗品大黄酸、复合物中大黄酸含量低，不易测其纯度，故用外表两点法测大黄酸含量。

供试品溶液的制备：精密称定约0.03g供试品⑤和供试品⑥，分别置500ml容量瓶中，用流动相溶解至刻度，超声到完全溶解，放冷后用流动相补足刻度。得供试品溶液⑤，供试品溶液⑥。

测定：将上供试品溶液和标准品溶液分别进样，通过峰面积之比计算含量。测定结果请见表7。

表7含量测定结果

3、结果：

(1)表6，8，按式1～6制备的样品结果表明纯度降序排列依次为：

供试品④＞供试品⑧＞供试品③＞供试品⑦＞供试品②＞供试品①，该结果表明：本专利制备方法，以大黄酸为原料制备共晶，所得的共晶纯度最高，杂质量最少。

(2)有关物质(杂质)的鉴别：

分别取芦荟大黄素、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚对照品，用流动相溶解，得杂质对照液。分别注入液相色谱仪，并记录保留时间。与供试液①～⑧色谱图中的杂质峰比较，进行杂质鉴别。结果见表9。

表8复合物、共晶制备方法，及比较结果

表9杂质的定义与鉴别

(3)由上表8，式1-2结果显示：由专利200610106516.X中的实施例法6制备大黄酸和精氨酸复合物，再通过本专利实施例13的精制，其中大黄酸(起始原料芦荟)，纯度从97.7％上升到98.5％，提高了0.8％。

(4)由上表8，式3结果显示：本专利实施例2制备大黄酸和精氨酸复合物的(大精酸)共晶的纯度为99.6％，其中原料大黄酸(起始原料芦荟)的纯度为97.0％，相比之下，制备共晶后提高了2.6％。

(5)由上表8，式4-5结果显示：由专利200610106516.X中的法4制备大黄酸和精氨酸复合物，其中起始粗品大黄酸(来自大黄)含量44.7％，杂质为55％；制得大黄酸和精氨酸复合物中大黄酸含量提高到47.4％。对该复合物再按本发明方法(实施例14)进行精制，结果表明大精酸共晶物中大黄酸含量大幅提升，纯度达98.2％，杂质数量减少至1.8％。

(6)由上表8，式6结果显示：由本发明专利实验施例6制备大精酸共晶，结果表明起始粗品大黄酸(来自大黄)含量为44.7％，制得成品大精酸共晶中大黄酸含量显著提升，纯度达99.8％，杂质数量减少至0.2％。

4、结论：通过形成大精酸共晶，可以提高大黄酸的纯度，降低有关物质的数量和含量，可满足用药的安全性和质量可控性要求。

大精酸复合物与其共晶相比，本发明方法可以进一步提高大黄酸的纯度，减少有关物质的数量和含量，尤其共晶在用药安全性和质量可控性方面优于复合物。

完成本申请第4个发明任务的技术方案是：

上述大精酸共晶化合物在制备治疗糖尿病并发症药物中的应用。

具体地说，本发明所述的上述大精酸共晶物在治疗糖尿病多种并发症药物中应用的实例。药物治疗使用口服途径，剂量：50～200mg/kg，大鼠。在糖尿病各种并发症的治疗中相同。

本发明所述的糖尿病并发症包括以下疾病：

糖尿病心肌病、糖尿病大血管病变、糖尿病肾病、糖尿病性男性性功能低下(睾丸病和阳痿)、糖尿病视网膜病，和/或糖尿病神经病变，等等。

换言之，本发明的第3个方案包括：上述大精酸共晶物在制备治疗糖尿病心肌病药物中应用；上述大精酸共晶物在制备治疗糖尿病大血管病变药物中应用；上述大精酸共晶物在制备治疗糖尿病肾病药物中应用；上述大精酸共晶物在制备治疗糖尿病并发的男性性功能低下(睾丸病和阳痿)药物中应用；上述大精酸共晶物在制备治疗糖尿病视网膜病药物中应用。

本发明提供的是一个优良的、安全性的新药，优于传统治疗糖尿病药物；并将开启中药超分子技术，在改造中药有效成分的范例，扩大超分子技术在中药创新药物的研究和应用。该新药用于治疗糖尿病并发症，包括：糖尿病心肌病，糖尿病大血管病变，糖尿病肾病，糖尿病性男性性功能低下(睾丸病和阳痿)，糖尿病视网膜病，糖尿病神经病变的治疗，具有优良治疗效果。

更详细地说，本发明的技术方案是：使用超分子化学的共晶技术，制备成大精酸(Argirien)结晶性新化合物是难溶性大黄酸(rhein)活性药物成分(API)和L-精氨酸(L-arginine)形成的共晶化合物(CCF)，该化合物的溶解度和溶出度提高，进入体内缓释大黄酸和L-精氨酸2个活性分子。L-精氨酸是NO前体药，在体内转化为NO。糖尿病的血管内皮细胞的病变，都表现出NO的不足，L-精氨酸能够提高血管内皮细胞的NO，从而可减轻糖尿病并发症，改善和减轻糖尿病肾病的恶化；Rhein能有效阻止糖尿病肾病发生，其主要作用机制是：抑制线粒体中NADPH氧化酶(NADPH oxidase，Nox)活性，减少ROS(reactive oxygen species，反应氧基，即自由基)对血管的损伤；下调p66Shc基因，抑制内质网应激(ER stress)与ETA受体上调。在我们的前期研究中，Argirien阻断AGEs(非糖基化产物)的作用与氨基胍相仿。显示Argirien具有优良的开发前景。

通常的共晶工程的步骤是分析活性药物成分(API)的结构以及选择合适的共晶形成物(CCF)。通过形成共晶，可能大大改善API的性质，如增加溶解度和溶出度、提高稳定性、减少引湿性、提高生物利用度、改善释放特性等等；共晶也能在延长市场周期的同时明显减少研发成本。

本发明选择与API活性有协同作用的CCF在改善大黄酸的理化性质的同时，改善其药效学和药物代谢动力学参数，以制备一种缓释、长效、低毒的大黄酸衍生物。这一设计思路已在药效试验中得到了验证。

本发明的另一创新点是：首次选择中药天然化合物作为API及CCF。在之前的研究中，研究者们都选择化学合成药物作为API，选择糖精、烟酰胺等等非天然化合物作为CCF。但是由于化学合成药物和非天然化合物具有的毒副作用，使共晶研究受到了一定程度的限制。此外，化学合成药的开发时间短，尚不能确定其长期毒性。与此相比，传统中药的使用在中国等国家已有2000多年的历史，其用药安全性经受了长期的考验，从而能有效规避研发潜在的风险。因此，这一思路在开发药物共晶过程中是非常重要的；同时，这一思路的运用能很好地促进传统中药的研究。此外，众所周知，近几年药学领域的投入直线上升，然而得到的成果却与预期相去甚远。如果这一设计能得到很好的应用，这个矛盾将会迎刃而解。

本发明的目的是开发一种缓释，长效，低毒的大黄酸衍生物来治疗糖尿病肾病。最新的研究显示，糖尿病是一种炎症性疾病，糖尿病肾病等血管并发症由于血管内皮细胞损伤。由于以上原因，大黄酸被选作API。如引言中所说，考虑的主要因素有化学结构和药效学。我们分析了大黄酸的结构来选择可能的CCF。通过分析，大黄酸3-羧基的羟基氢易与精氨酸7-胍基形成氢键。此外，L-精氨酸是NO前体，在体内经eNOS(内皮细胞一氧化氮合酶)生成NO。糖尿病的血管内皮细胞的病变，都表现出NO的不足，L-精氨酸能够提高血管内皮细胞的NO，从而可减轻糖尿病并发症，改善和减轻糖尿病肾病的恶化。综合以上原因，我们选择大黄酸作为API，精氨酸作为CCF。

1、大精酸结构表征及其性质测定如下。

(1).元素分析：对大精酸样品进行C、H、N、S四种元素的元素分析。实验采用LECO-CHNS932元素分析仪(LECO公司)对样品进行分析。

(2).差式扫描量热分析(DSC)：样品的热分析试用版DSC1(Perkin Elmer)组件，该组件使用铟及蓝宝石对温度及电导常数校准。样品(3-5mg)放在不密闭的铝埚中，以10℃/min的升温速率在30-300℃的范围内并在持续通干燥氮气(流速50ml/min)的条件下进行扫描。仪器配有冷冻制冷系统。DSC图谱见图1。

(3).傅里叶红外光谱扫描(FT-IR)：Perkin Elmer Spectrum 100FT-IR分光光度计使用KBr投射模式(样品浓度为1mg加入100mgKBr)来收集样品的红外光谱数据。仪器配有DTGS检测器。样品在4000-400cm^-1范围内一共扫描16次。数据使用Spectrum software(version 6.0)软件进行分析。红外图谱见图2。

(4).质谱测定(MS)：本实验使用Xevo G2 QTof(waters公司)，测定条件为：注射器直接进样，ESI+，毛细管电压：2000v，一级锥孔电压：20v，二级锥孔电压：0.4v，源温度：110度，雾化气温度：170度，雾化气流速：200L/Hour，反吹气：50L/Hour。测定结果见图3。

(5).粉末X射线衍射：粉末X衍射分析使用带有Cu-Kαradiation

的Bruker D8Advance powder diffractometer(Karlsruhe，Germany)。样品于铝容器中压实在40KV及40mA条件下从3-60°2θ开始，以2°/min的扫描速率及0.02°的步长扫描。衍射图使用Materials Studio(version 4.0)软件及OriginPro 7.0(OriginLab Corporation，Northampton，MA，USA)软件进行分析。衍射图谱见图4。

(6).溶解曲线测定：大黄酸与大精酸使用美国实验材料学会(ASTM)标准目筛(149mm筛)来提供相似大小颗粒的粉末。实验使用ZRS-8G溶出检测仪(TDTF technology Co.，Ltd，Tianjin，China)。实验采用AUSP32-NF27搅拌桨法条件为37℃、50rev/min。称取适量样品，加入500mL水。分别于5、10、15、20、30、45、60及90min取样，经0.22-mm微孔滤膜过后使用HPLC分析。每种样品测验12次来计算溶解率，溶出曲线见图26。

(7).高湿实验：供试品置恒湿设备中，于25℃、RH92.5％±5％条件下放置10天，在0、5、10天取样测定。采用2010版中国药典二部附录VIIIM水分测定法第一法A容量滴定法测定吸湿增重。

2、结果：

(1).元素分析：从实验结果中可看出，大精酸中C、H、N、S的元素分析测定值与理论值偏差均小于0.5％，说明合成的样品同理论分子式C₁₅H₈O₆·C₆H₁₄N₄O₂一致，可证明大精酸中大黄酸同精氨酸的化学计量比为1∶1；同时证明该反应过程中没有发生脱水反应。

(2).DSC分析：大精酸、大黄酸、L-精氨酸的DSC热分析数据见图1。大黄酸没有出现吸热峰。但可看出，吸热曲线呈上升趋势。通过查阅相关资料，大黄酸的熔点为324℃。L-精氨酸呈现出一个尖锐的吸热变化，原因是在246.27℃时熔化，这与报道的热行为相符。大精酸的DSC温度曲线显示出一个单独的吸热峰，原因是在276.6℃时熔化。

大精酸以及单独组分的T_max测试值在熔点检测中与测试的熔点范围相符。共晶的热行为是不同的，有着独特的与任何组分都不同的熔化位移；由此可推测性成了新的物相：大精酸共晶。大精酸单独的吸热峰证明了没有任何的未结合的或吸收的溶剂或水。

(3).红外光谱分析：大黄酸、精氨酸和大精酸的红外图谱见图2。大黄酸的红外光谱在3061和1721cm^-1出现峰，分别与羧酸O-H和C＝O的伸缩振动一致。这证明大黄酸在结晶过程中是起始材料。纯态精氨酸的光谱在3359和1679cm^-1有与胍基N-H及C＝N伸缩振动相一致的峰。

大黄酸羧基O-H伸缩振动频率和L-精氨酸胍基N-H伸缩振动频率在3166和3343cm^-1被观察到。这意味着两个分子都形成了新的物相。大黄酸O-H伸缩振动频率从3061增加到3166cm^-1及精氨酸中N-H伸缩振动频率从3359降低到3343cm^-1组成了强氢键。

(4).MS分析：由大精酸质谱图3，大精酸的分子离子峰为m/z＝457.1357，符合大黄酸与L-精氨酸的分子量按1∶1相加的结果。图3中b，c，d 3种碎片被指认见下，其中a为大黄酸的分子离子。

(5).粉末X射线衍射和共晶结构：共晶的粉末X射线衍射图4在9.22°，10.34°，12.28°，26.05°，26.58°及27.57°2θ处出峰。大精酸表现出独特粉末X射线衍射图形使它区别于大黄酸和精氨酸，推断形成了共晶。化学计量比为1∶1。拟合结构见图5。

根据以上结果表征大精酸结构见图6。据图显示，大黄酸的羧基与精氨酸的胍基以O-H...N氢键相连。

(6).大黄酸与大精酸技术指标对比：结果见下表10。

表10大黄酸与大精酸(3批中试样品)的技术指标

大精酸共晶物和大黄酸的药动学和药效学的比较。

1、大精酸共晶物和大黄酸的药动学比较

(1).药动学参数：大黄酸和大精酸经口给药100mg/kg后，大精酸进入机体后，释出大黄酸和L-精氨酸。大精酸共晶分子中含大黄酸为62％；药动学相差很大，比较如下：给药后，大黄酸的血药浓度上升很快，T_max短，C_max高，半衰期较短；大精酸的血药浓度上升较慢，T_max出现延迟，C_max明显缩短。大鼠灌胃100mg/kg后，血药浓度-时间曲线，和参数的比较。大精酸在体内释放出大黄酸和L-精氨酸。用HPLC测定血中大黄酸血中血浓，与未作处理的大黄酸制剂等剂量，作比较。

见图8：灌胃大黄酸，和大精酸100mg/kg，血浓-时间曲线比较：纵坐标：血药浓度(μg/ml)；横坐标：时间(小时)。每点6只大鼠，均数±SD.图中：●大精酸，◆大黄酸。

(2).药动学参数比较(见表11)：与大黄酸相比较：大精酸的Tmax延迟，Cmax明显降低；T1/2延长；吸收有所减少，MRT延长。

表11大精酸和大黄酸的药动学参数比较

(3).有效血药浓度：血药浓度对抗急性炎症的最低血药浓度为5μg/ml。大精酸100mg/kg灌胃后，血药浓度达到5μg/ml以上，在24小时内基本保持不低于5μg/ml；大黄酸血药浓度上升极快，在8小时前明显高于大精酸。大黄酸过高血药浓度，未能提高抗炎活性。它对抗急性炎症的最低有效血浓约为50-60μg/ml。

(4).大精酸药动学的特点---缓释型，长效药物；大精酸服药后，迅速达到有效浓度，并长时间地保持较低但有效的血药浓度，又能有效地防止过高的血药浓度。这种差别存在于给药8小时内，由于大精酸释出大黄酸较慢，血中缓慢上升。给药8小时后，大精酸和大黄酸的血药曲线重合，药物消除的曲线一致。

(5).大精酸共晶分子的药动学特点：主要对它在体内释放/吸收大黄酸的过程缓慢，而对消除未见明显影响。故而，大精酸共晶分子具有缓释，半衰期长，为特点的新型药物分子。

2、大精酸共晶物和大黄酸的药效学比较：

(1).对炎症抑制作用，有增效功能；在炎症组织中，血管的病变，构成炎症损害的组成部分。大精酸共晶分子中的L-精氨酸，有助于改善血管内皮细胞中的NO生物利用度。大精酸，大黄酸，L-精氨酸，各100mg/kg，po.，大精酸中含大黄酸相当于62mg/kg。观察对大鼠由角叉菜胶注入引起的炎症的抑制作用。灌胃给药后，大黄酸吸收虽很快，血药浓度上升高，但是，抑制炎症的药理作用，未见迅速起效；相反，大精酸的血药浓度上升较低，但在给药1小时，大精酸对炎症已有明显抑制作用，而大黄酸无作用，L-精氨酸单独使用，无抗炎作用。在6小时，大黄酸和大精酸抗炎活性基本相同。在给药24小时，对炎症组织中的炎症相对的生物靶点，而者均有明显的抑制作用，药效相同。见图9、图10和图11：比较对抗角叉菜胶引起大鼠足拓炎症的抗炎作用，以消炎痛(indomathacin，IND)作对照。大精酸共晶物(AR)，大黄酸(R)，L-精氨酸(A)。角叉菜胶的未治疗组(Car)。

对炎症的抑制作用：有NADPH氧化酶，它的催化亚单元NOX2(qp91phox)，和调节亚单元(p22phox)；基质金属蛋白酶(MMP-2)，内质网应激伴随分子ATF-6，和调控组织中氧化应激的基因p66Shc的蛋白表达。它们在炎症中均上升。大精酸，大黄酸均使抑制；单独用L-精氨酸未见药效。见图12-图16：大精酸和大黄酸使用同等剂量，但是，大精酸共晶分子中能释放的大黄酸，为大黄酸制剂的62％。而药效与100％的大黄酸制剂相等。

L-精氨酸在大精酸共晶分子中，起着增效作用。使较小剂量大精酸，和大黄酸等效；这点，在治疗其他指标，也相同。

(2).急性毒性的比较；小鼠一次灌胃的急毒，大黄酸LD50为3.2g/kg，在7天内死亡一半。大精酸3000mg.kg，灌胃7天，无一死亡。大精酸3.O/kg，po为最大耐受量。急毒低于大黄酸。另外，大精酸的血药浓度明显低于大黄酸，而药效基本相当。从而降低血中大黄酸的过高浓度，可降低潜在的毒性作用。大精酸共晶分子具有减毒的作用。

3、小结：大黄酸组成大精酸共晶分子后，获得明显优点，与大黄酸比较，具有明显优势：有缓释，长效，增效，减毒的特性。

本发明的大精酸共晶物治疗糖尿病的并发症，具有以下明显效果。大精酸治疗高脂高糖和小剂量STZ诱发的II型糖尿病和并发症：

II型糖尿病大鼠实验84只SD大鼠，(雄性)随机分7组：N(正常组，11只)，DM(II型糖尿病，14只)；II型糖尿病+药物灌胃治疗4周：Val(缬沙坦12mg/Kg，12只)，ARL，ARM，ARH(大精50mg/Kg，100mg/Kg，200mg/Kg，各12只)，N+AR(正常组，给大精酸200mg/Kg，11只)。

实验安排：1-4周：N、N+AR组大鼠每天给予基础饲料15g/只；DM以及个治疗组，大鼠每天均给予高脂高糖饲料22g/只，自由饮水；第5周：一次性腹腔给药STZ(streptozotocin，35mg/Kg，ip)；第9-12周，给予大精酸治疗：药物以0.5％CMC-Na为溶剂，研磨，混悬，灌胃；N，DM组以等体积0.5％CMC-Na灌胃。13周开始时，进行药理实验和解剖。

(1)，对血清中生化指标的改善作用：大鼠出现高糖血症，并有高胰岛素血症。参照图17、图18，提示有II型糖尿病特征。经大精酸4周治疗，均有明显改善。

胰岛素抵抗：以HOMA-IR公式计算胰岛素抵抗，见下表12：大精酸明显降低胰岛素抵抗。

表12

(2)，治疗糖尿病心肌病，改善血流动力学(表13)；高脂高糖II型糖尿病大鼠明显心功能降低，心脏收缩功能(LVSP。LV+dp/dt max)，和舒张功能(LVEDP，LV-dp/dtmax)，均显示障害，心功能明显降低。虽然高脂高糖饮食仍继续，大精酸治疗使明显恢复。

表13对血流动力学指标的改善

n＝9-11，**P＜0.01vs.control，#P＜0.05，##P＜0.01vs.DM.

(3)，治疗2型糖尿病并发肾病：并发糖尿病肾病，大精酸治疗明显改善肾功能。给大精酸(ARL，ARM，ARH：50，100，200mg/kg，po)及缬沙坦(Val，12mg/kg，po)，4周后，对血和24h尿的肌酐，尿素氮，以及微量蛋白尿的改善作用。参照图19-图23：大精酸治疗4周，降低血中的肌酐，尿素氮；提高尿中肌酐和尿素氮和降低24h微量蛋白尿。提示：大精酸明显改善2型糖尿病肾病。

(4)，治疗II型糖尿病并发睾丸病：II型糖尿病大鼠的睾丸，出现病变；血睾酮降低，LH(促黄体生成素)也降低，显示糖尿病睾丸病的低促性腺激素特征。大精酸使降低的血中睾酮及LH恢复到正常；缬沙坦未见明显药效。参照图24、图25。

糖尿病引起大血管和微血管并发症，与血管舒张功能减退相关，均由于细胞的内质网应激。这是一种慢性炎症。大精酸有效对抗病变细胞中内质网应激，抑制内皮素，ROS，和其它细胞因子和炎性物质。本申请仅列出大精酸治疗几种糖尿病并发症的主要药效学一些指标。

各类糖尿病的并发症，制作基本方法：雄性大鼠，由链脲霉素65mg/kg，一次腹腔注射，诱发糖尿病。血糖高达25mM，维持8周。给链脲霉素4周后，糖尿病持久升高，已经引起各类并发症(早期)。在未治疗组中，各种并发症很明显。大精酸(3个剂量组：50，100，200mg/kg)治疗在第5周后实施，连续灌胃给药共4周。阳性药氨基胍100mg/kg作参比。糖尿病未治疗组虽未给药，大鼠均给予饮食控制的治疗方法，使未用药物治疗的大鼠，也获得适当治疗。另组大鼠，以高脂高糖饮食和小剂量STZ，建立II型糖尿病的大鼠模型，以缬沙坦作为阳性药治疗，大精酸3个剂量，共12周，在最后4周大精酸治疗。

(1).大精酸对糖尿病心肌病的实施和疗效；糖尿病心肌病的心肌损害，心功能减弱，出现心力衰竭。糖尿病心肌病心功能障害明显，出现抑制心肌细胞凋亡，心肌纤维化，异常基质金属蛋白酶2，9MMP2，9)，内皮素受体和NADPH氧化酶和内质网应激的激活：Bip(Ig重链结合蛋白)，和PERK(与内质网应激相关蛋白)上调，等。大精酸使上述各项指标均恢复到正常范围，并呈剂量依从性。

(2).大精酸治疗糖尿病大血管病变的实施和疗效；糖尿病大血管并发症：在本专利的实施例中：大鼠糖尿病8周后，血管功能明显异常：血管收缩增强，血管舒张降低，NO生物利用度降低，呈轻度痉挛状态。经4周大精酸和氨基胍治疗，使血管舒张功能和NO生物利用度恢复。在实施中也观察到：血管壁中分子生物学靶点异常，基本恢复到正常范围内。如：血管紧张素受体1(AT1)，内皮素A受体，NADPH氧化酶表达，PPARα和PPARγ异常表达等。

(3).大精酸治疗糖尿病肾病的实施和疗效；糖尿病患者常有发生糖尿病肾病并发症的明显倾向。糖尿病肾病大鼠8周后，24h尿中微量蛋白明显增加，血中肌酐和非蛋白氮增多，提示：糖尿病肾病已很明显。同时，分子生物学指标异常：肾脏PPARα，NADPH氧化酶，Cx43表达异常，大精酸使明显改善。

(4).大精酸治疗大鼠糖尿病性雄性性功能低下症的实施和疗效；糖尿病患者常呈现男性性功能低下症，血中睾酮降低。在大精酸治疗的实施：糖尿病雄性大鼠8周后，明显出现血中睾酮降低，提示：糖尿病睾丸病明显，血中LH(黄体生成素)，FSH(卵泡刺激素)明显降低，提示：这是低促性腺激素性雄性性功能低下症，与糖尿病睾丸病变临床表现一致。已观察到：睾丸中的睾酮生物合成的相关基因表达均下调。睾丸中NADPH氧化酶，p66Shc蛋白表达，内质网应激的PERK蛋白，均上调。大精酸的治疗作用明显，使恢复到正常范围。

大精酸治疗大鼠应激性雄性性功能低下症实施和疗效。由于男性性功能低下，也可由工作紧张，持久应激所致。故建立应激性雄性性功能低下症。

雄性大鼠皮下注射异丙肾上腺素1.0mg/kg，10天，形成雄性性功能低下症。血中睾酮降低，而FSH，LH上升，为高促性腺激素性的雄性性功能低下症。第6～10天用大精酸治疗大鼠(30mg/kg，皮下注射)，阳性药为丙酸睾酮0.5mg/kg，皮下注射。大精酸明显改善睾丸病变，提高血中睾酮含量。抑制上升的FSH和LH。并改善睾丸内其他分子生物学指标。阳性药丙酸睾酮，只能提高血中睾酮，但不降低FSH和LH。也不改善睾丸内多个分子生物学靶点mRNA或蛋白表达改变指标。另外，实施大精酸离体治疗研究：大鼠睾丸匀浆与高糖，或异丙肾上腺素温孵，损害睾丸组织，大精酸使多个分子生物学靶点异常表达转为正常。

(5).大精酸治疗糖尿病性阳痿(男性性功能低下的一部分)的实施和疗效：糖尿病患者常出现勃起障害，呈现阳痿。大精酸治疗实施：糖尿病雄性大鼠8周，作离体阴茎海绵体制备，观察对乙酰胆碱的舒张反应，作为勃起能力指标。糖尿病大鼠海绵体舒张功能明显减弱(显示阳痿)，与正常组差别很大。大精酸3个剂量治疗组，使海绵体舒张功能明显恢复。同时，明显使海绵体中分子靶点表达恢复。参见图22：显示大精酸明显改善海绵体的舒张功能。其它未列出。纵坐标：舒张反应；STZ-链脲霉素制作的糖尿病大鼠海绵体，Nor-正常组，AMG-氨基胍组，high，Middle，low-大精酸的高、中、低的3个剂量组。

大精酸的药效基础：大黄酸与L-精氨酸以氢键结合成超分子化合物，生成大精酸共晶，改善了大精酸的理化特性，保留了大黄酸的对抗炎症因子和细胞因子等活性。另方面，糖尿病的血管并发症，从机制上分析，大多由于NO的缺乏，而致血管舒张功能减弱。大精酸在体内释放出L-精氨酸，它是NO的前体药物，可生成NO。大黄酸与精氨酸形成的新化合物，具有双重作用：不仅具有大黄酸对抗炎症因子，和对抗内皮素受体的作用；并且，作为NO前体，提供NO，直接保护血管舒张功能，二者具有协同作用，加强药效。大精酸本身并无降血糖的作用，但能够明显地减轻内质网应激，供应额外的NO，有利于对抗大血管和微血管并发症发生，使转变到正常。大精酸进入体内释放出大黄酸和精氨酸。发挥大黄酸抑制多种抗炎性因子：NFκB，TNFα，ROS，EGF等，能对内皮素系统调控，改善内皮细胞的功能。

本发明的积极效果有：

作为大黄酸与精氨酸复合物的大精酸，是创新药，对抗炎性因子和提供NO的双重功能的药物分子。改善大黄酸的溶解度，和吸收。具有复合型药效，将显示有优良的治疗睾丸病的药理作用。

附图说明

图1为DSC热分析图，其中，a大精酸、b大黄酸、c精氨酸；

图2为的红外光谱，其中，a大黄酸、b为L-精氨酸、c大精酸；

图3为大精酸质谱质谱图；

图4为粉末X射线衍射，其中，a大黄酸、b为L-精氨酸、c物理混合、d大精酸；

图5为大精酸共晶物粉末X射线衍射拟合图；

图6为大精酸结构图；

图7-左：(从下到上)为大精酸、大黄酸和精氨酸FT-IR图；图7-右：(从下到上)为大精酸I型结晶、大黄酸和精氨酸红外二阶导数图；

图8为本发明的大精酸共晶物和大黄酸的血药浓度的比较图；图中的纵坐标：C-血药浓度(μg/ml)；横坐标：t-时间(小时)；

图9、图10与图11分别为大精酸，大黄酸，L-精氨酸抗炎作用的比较图；图中的纵坐标-paw swelling-足拓肿胀；横坐标：Nor-正常组；Car-角叉菜胶的未治疗组，IND-消炎痛，AR-大精酸，R-大黄酸，A-L-精氨酸；其中，图9为1小时；图10为6小时；

图12-图14：同等剂量大精酸共晶物与大黄酸药效比较图；图中：qp91phox和p22phox-分别为NADPH氧化酶的催化和调控亚基；MMP-2-基质金属蛋白酶-2；ATF-6-激活转录因子-6；p66Shc-促氧化应激基因；β-actin-β-肌动蛋白(内标)；

图11图12-图14：同等剂量大精酸共晶物与大黄酸药效比较图；图中：qp91phox和p22phox-分别为NADPH氧化酶的催化和调控亚基；MMP-2-基质金属蛋白酶-2；ATF-6-激活转录因子-6；p66Shc-促氧化应激基因；β-actin-β-肌动蛋白(内标)；

图15、图16本发明的大精酸共晶物对大鼠血糖与血胰岛素抵抗的治疗作用；纵坐标：glucose(mmol/L)葡萄糖；胰岛素；横坐标：N(normal)-正常组；DM-II型糖尿病组；Val(DM-val)-缬沙坦组；AR-L(DM-ARL)-大精酸小剂量组；AR-M(DM-ARM)-大精酸中剂量组；AR-H(DM-ARH)-大精酸大剂量组；N+(N+ARH)-正常组给大精酸大剂量；

图17-图19：本发明的大精酸共晶物治疗2型糖尿病肾病：降低血中肌酐，尿素氮；和降低24h微量蛋白尿的数据图；图中，横坐标：N-正常组；DM-II型糖尿病组；Val-缬沙坦组；AR-L-大精酸小剂量组；AR-M-大精酸中剂量组；AR-H-大精酸大剂量组；N+H-正常组给大精酸大剂量；其中，图18为血尿素氮；图19为24h尿蛋白；

图20、图21：本发明的大精酸共晶物治疗II型糖尿病并发睾丸病，明显提高血中睾酮及LH数据；而缬沙坦无效；图中：纵坐标：testosterone-睾酮；LH-黄体生成素；横坐标：Normal-正常组；DM-II型糖尿病组；DM+Val-缬沙坦组；DM+ARL-大精酸小剂量组；DM+ARM-大精酸中剂量组；DM+ARH-大精酸大剂量组；N+ARH-正常组给大精酸大剂量；

图22为大精酸与大黄酸溶出曲线；

图23为大精酸复合物a显微照片(10*40)；

图24为大精酸复合物b显微照片(10*40)；

图25为大精酸I型结晶显微照片(10*40)。

具体实施方式

实施例1，取大黄酸2.0g和精氨酸1.23g，混合，加入水200mL，加热至90℃，保温1h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为80％，于60℃水浴下，减压回收溶剂，至体积减半，降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例2，取大黄酸2.0g和精氨酸1.23g，混合，加入水200mL，加热至80℃，保温1.5h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为60％，于50℃水浴下减压回收乙醇溶剂，至体积减半，降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例3，取大黄酸2.0g和精氨酸1.23g，混合，加入水250mL，加热至75℃，保温2h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为40％，于65℃水浴下减压回收溶剂，至体积减半，降温至静置到20～30℃，保温4h，之后降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。取大精酸I型结晶产品适量，加水，加热使溶解，加入稀盐酸调节pH至2，收集沉淀，用水洗沉淀至中性，干燥即得纯化大黄酸产品。

实施例4，取大黄酸1.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水150mL，加热至90℃，保温0.5h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为30％，于55℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，加水，加热使溶解，加入稀盐酸调节pH至2，收集沉淀，用水洗沉淀至中性，干燥即得纯化大黄酸产品。

实施例5，取大黄酸1.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水150mL，加热至90℃，保温0.5h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为20％，于60℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，降温至静置到20～30℃，保温4h，之后降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例6，取大黄酸(粗品，含量约50％)2.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水150mL，加热至100℃，保温1h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为70％，于60℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至150mL，降温至静置到10～18℃，保温4h，之后降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例7，取大黄酸2.0g和精氨酸1.23g，混合，加入水200mL，加热至85℃，保温1h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为50％，于60℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，降温至静置到20～30℃，保温4h，之后降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例8，取大黄酸2.0g和精氨酸1.23g，混合，加入水150mL，加热至85℃，保温1h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为65％，于70℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至150mL，降温至静置到10～18℃，保温4h，之后降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例9，取大黄酸1.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水150mL，加热至80℃，保温1.5h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为80％，于65℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，加入晶种大精酸I型结晶，降温至静置到20～30℃，保温4h，之后降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例10，取大黄酸1.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水100mL，加热至75℃，保温2h，趁热过滤。向滤液中加乙醇，使含醇量为70％，于60℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，加入晶种大精酸I型结晶，降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例11，取大黄酸1.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水100mL，加热至75℃，保温2h，趁热过滤。向滤液中加丙酮，使丙酮含量为70％，于60℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，加入晶种大精酸I型结晶，降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例12，取大黄酸1.0g和精氨酸0.62g，混合，加入水100mL，加热至75℃，保温2h，趁热过滤。向滤液中加2，2，2-三氟乙醇，含醇量为70％，于60℃水浴下减压回收溶剂，至体积减至200mL，加入晶种大精酸I型结晶，降温至4～10℃，静置、析晶，过滤，干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例13，取大精酸复合物a(见上)2.0g，加150mL水，加热，搅拌溶解，过滤。滤液加乙醇至含醇量70％，过滤。滤液回收溶剂至体积减半，放置至室温，置冰箱中(4-10℃)，静置，析晶。过滤。取结晶，减压干燥，即得大精酸I型结晶。

实施例14，取大精酸复合物b(见上)1.1g，加水80mL，加热、搅拌、溶解，加入0.1MolHCl，调节pH至2，沉淀完全，过滤，收集沉淀，用蒸馏水洗至中性，取沉淀，加入精氨酸0.36g，按照实施例2中方法制备，即得大精酸I型结晶。

实施例15，大黄酸与精氨酸的复合物(大精酸)治疗糖尿病心肌病。大鼠由链脲霉素65mg/kg，一次腹腔注射，诱发的糖尿病。血糖高达25mM，维持8周。经4周后，糖尿病并发症已经出现。未治疗组，继续发展。治疗组在后4周中给药治疗(mg/kg，灌胃)：阳性药氨基胍100，大精酸3个剂量组：50mg/kg，100mg/kg，200mg/kg。糖尿病的未治疗组虽未给药，但控制了食量，给予饮食控制的治疗方法，使获得适当治疗。

药效观察：由宏观的主要药效学指标，病变细胞中重要生物活性分子的表达(mRNA，和蛋白)等多种指标。大精酸使上述各项指标均恢复到正常的范围内，并呈剂量依从性。

实施例16，大精酸治疗糖尿病大血管病变。与实施例1基本相同。制作糖尿病大鼠的方法及药物治疗，同前。经后4周大精酸和氨基胍的治疗，使血管舒张功能和NO生物利用度，血管壁中异常表达的分子生物学靶点，恢复正常。如：血管紧张素受体1(AT1)，内皮素A受体，NADPH氧化酶，PPARα，和PPARγ的异常等。

实施例17，大精酸治疗糖尿病肾病。制作糖尿病大鼠的方法，及药物治疗，同前。糖尿病肾病大鼠的24h尿中微量蛋白明显增加，血中肌酐和非蛋白氮增多，提示：糖尿病肾病。同时，分子生物学指标：肾脏PPARα的基因及蛋白表达，NADPH氧化酶和内皮素系统表达均上调，肾皮质的Cx43表达下调。这些靶点的异常，进一步提示糖尿病肾病充分建立。大精酸明显改善糖尿病肾病，药效与氨基胍相仿。下列图显示对微量蛋白尿，肌酐和非蛋白氮的治疗作用。

实施例18，大精酸治疗糖尿病性睾丸病(男性性功能低下症)。制作糖尿病大鼠的方法，及药物治疗，同前。8周糖尿病大鼠，血中睾酮明显降低，血中LH(黄体生成素)，FSH(卵泡刺激素)也明显降低，提示：低促性腺激素性雄性性功能低下症，与临床糖尿病睾丸病变一致。同时，睾丸中睾酮生物合成的相关基因表达均下调。睾丸中内皮素A受体和NADPH氧化酶，p66Shc蛋白，以及内质网应激的PERK蛋白，均上调。与阳性药氨基胍对比，大精酸有很明显的治疗作用。使恢复到正常范围。

实施例19，大精酸治疗应激性睾丸病(男性性功能低下症)；大鼠皮下注射异丙肾上腺素1.0mg/kg，10天，形成雄性性功能低下症。特征为高促性腺激素性的雄性性功能低下症：血中睾酮降低，而FSH，LH上升。在最后5天(第6～10天)用大精酸治疗大鼠(30mg/kg，皮下注射)，阳性药为丙酸睾酮0.5mg/kg，皮下注射。大精酸明显改善睾丸病变，提高血中睾酮含量。抑制上升的FSH。并改善睾丸内其他分子生物学指标。阳性药丙酸睾酮，只能提高血中睾酮，但不降低FSH，和LH；已不能改善睾丸内多个分子生物学靶点mRNA或蛋白表达改变指标。离体研究：大精酸对睾丸匀浆体外与高糖，或异丙肾上腺素温孵，使损害的分子生物学靶点mRNA或蛋白表达，均能改善。

实施例20，大精酸治疗糖尿病性阳痿(男性性功能低下症的一种表现)。制作糖尿病大鼠的方法，及药物治疗，同前。糖尿病雄性大鼠8周，海绵体的舒张功能明显减弱，与正常组的差别很大。大精酸3个剂量组均使海绵体舒张功能明显恢复，大剂量组与氨基胍组，均使接近正常。同时，观察到海绵体中的分子生物学靶点的mRNA或蛋白表达改变：eNOS表达下调，iNOS上调。p66Shc和Bip上调，分别反映氧化应激和内质网应激；大精酸和氨基胍均使逆转，趋于正常。

实施例21，大精酸治疗糖尿病视网膜病。制作糖尿病大鼠的方法，及药物治疗，同前。与实施例1～6基本相同，已证实大精酸明显纠正糖尿病视网膜病的内质网应激的指标PERK及Bip上调。

实施例22，大精酸治疗糖尿病神经病变。制作糖尿病大鼠的方法，及药物治疗，同前。证实大精酸对糖尿病脑内病变明显改善。

实施例23，大黄酸类化合物与精氨酸的复合物治疗糖尿病并发症。6孔细胞培养板中培养心肌细胞，高糖组加入高糖溶液(25mmol/L)1μl，治疗组分别加入高糖溶液1μl，再分别加入供试药物下表中#1-39溶液1μl(10^-6mol/L)，待细胞完全贴壁。

分别取#1-39蛋白液适量，按聚丙烯酰胺凝胶电泳法操作。将展开的胶转膜到硝酸纤维素滤膜上，孵一抗PERK(或Bip)37℃1h；孵二抗37℃1h或4℃过夜；比较高糖组与治疗组PERK(Bip)条带。结果：化合物#1-39使PERK及Bip指标下调，有抗糖尿病并发症活性。

上述大黄酸类化合物与精氨酸的复合物中的大黄酸类化合物见下表15。

表15所述大黄酸类化合物结构式中包括的替换官能团

实施例24-27，与以上各实施例基本相同，但惰性溶剂分别改用丙酮、乙腈、2，2，2-三氟乙醇或2-丙醇。

Claims

1.一种大精酸共晶物，为活性药物成分大黄酸和共晶形成物L-精氨酸形成的共晶物，其特征在于，该大精酸共晶物中，大黄酸与L-精氨酸的物质的量比为1∶1，该共晶的粉末的X射线衍射图，具有9.22°，10.34°，12.28°，26.05°，26.58°及27.57°2θ处的特征峰；在差式扫描量热分析中，所述的大精酸共晶化合物具有246.27℃的特征峰。

2.根据权利要求1所述的大精酸共晶物，其特征在于，在傅里叶红外光谱扫描图中，所述的大精酸共晶化合物具有1660、1694、3343cm^-1的特征峰；在质谱测定中，所述的大精酸共晶物具有457.1357、282.9484、238.9696、210.9806、182.9948、154.0001m/z的特征峰。

3.根据权利要求1或2所述的大精酸共晶物，其特征在于，所述的大精酸共晶物是指，按照以下步骤制备得到的药物：

(1).取大黄酸，加入物质比1∶1的精氨酸，溶于水中，加热，回流；

(2).趁热过滤；(3).向滤液中加入惰性溶剂，至含惰性溶剂，为70％，搅拌；

(4).过滤，减压回收惰性溶剂；(5).冷却至室温20℃、0-4℃放置、析出晶体；

(6).过滤、干燥即得产品。

4.一种权利要求1所述大精酸共晶物的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(6).过滤、干燥即得产品。

5.根据权利要求4所述的大精酸共晶物的制备方法，其特征在于，

所述步骤(1)至步骤(3)，是将式1的活性物质大黄酸与式2的共晶形成物精氨酸置于水中，在20-100℃条件下，搅拌反应0.5-2h后，加入惰性溶剂；

步骤(3)所述的合适惰性溶剂是低级醇、酮类或者乙腈；

步骤(4)所述的减压回收惰性溶剂，是选择在30-70℃减压蒸发；

步骤(4)至步骤(5)的操作是：选择在30-70℃减压蒸发溶剂到1/2体积，加入晶种大精酸I型结晶，冷却到15-30℃，保温4h，在0-10℃下静置，放置析晶。

6.根据权利要求5所述的大精酸共晶物的制备方法，其特征在于，

所述步骤(1)至步骤(3)的搅拌反应是在40-90℃条件下；

步骤(3)所述的低级醇或者酮类选自：乙醇、2，2，2-三氟乙醇、2-丙醇、丙酮、乙腈。

7.一种权利要求1所述大精酸共晶物与大黄酸的纯化方法，其特征在于，步骤如下：

(1).取大精酸适量，加入40-70％乙醇，加热，回流1-2h；(2).趁热过滤；

(3).于60-80℃水浴下减压回收溶剂，至体积减半；(4).过滤，滤液冷却至室温；

(5).0℃以下放置、析出晶体；(6).过滤、干燥即得纯化大精酸共晶物产品。

(7).取上述步骤(6)得到的大精酸共晶物产品适量，加水，加热使溶解，加入稀盐酸调节pH至2，收集沉淀，用水洗沉淀至中性，干燥即得纯化大黄酸产品。

8.权利要求1所述的大精酸共晶化合物在制备治疗糖尿病并发症药物中应用。

9.根据权利要求8所述的大精酸共晶化合物在制备治疗糖尿病并发症药物中应用，其特征在于，所述的治疗糖尿病并发症药物是指：治疗糖尿病心肌病的药物、治疗糖尿病大血管病变的药物、治疗糖尿病肾病的药物、治疗糖尿病性睾丸病的药物、治疗糖尿病睾丸病的药物、治疗糖尿病性阳痿的药物或治疗糖尿病视网膜病和糖尿病神经病变的药物。

10.根据权利要求8或9所述的大精酸共晶化合物在制备治疗糖尿病并发症药物中应用，其特征在于，所述的给以方式是：经口给药；所述的给药剂量是：50～200mg/kg。