CN102600506B - Ngf壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开的一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统，该缓释系统为圆柱形胶原-壳聚糖神经支架，支架内部均匀负载有包埋神经生长因子的壳聚糖微球。该支架的制备方法是：首先，采用乳化交联法制备出包埋神经生长因子的壳聚糖微球；其次，制备具有相互平行的轴向微管样结构的胶原-壳聚糖神经支架；最后，通过后复合技术将壳聚糖微球复合于胶原-壳聚糖神经支架，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统。这种支架结构与正常神经基底膜结构类似，在最大程度上发挥了支架对再生神经的物理引导作用；该支架能缓释具有生物活性的神经生长因子达12周，可使神经生长因子长期有效释放到神经损伤部位，以达到更好、更快的促进长节段神经缺损修复的目的。

Description

NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统及其制备方法

技术领域

本发明属于神经组织工程支架技术领域，涉及一种神经组织工程支架，具体涉及一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统，本发明还涉及上述缓释系统的制备方法。

背景技术

周围神经损伤后的神经再生和功能恢复是临床治疗的一个难题。自体神经移植是目前临床上首选的神经重建方法(“金标准”)，但供区感觉功能障碍、供体来源受限、供受神经尺寸和类型不匹配、手术时间延长等原因大大限制了其应用；同种异体神经再生管道是指清除了雪旺细胞和其他生物大分子的神经内膜管，为神经再生创造一个良好的环境，这种管道具有易获得、可得到任何长度和口径的神经段、对患者的不良影响较小以及易保存等优点，但会引起患者自身的免疫排斥反应，需对其进行长期的免疫耐受治疗。另外，非神经组织制成的再生管道主要有静脉和肌膜管等，其基底膜与雪旺细胞的基底膜相似，这种相似的结构不仅可为再生神经纤维提供定向的低阻力通道，而且基底膜成分的层粘连蛋白和纤维粘连蛋白还能对再生的轴突起到接触性引导作用，从而更好的引导轴突再生，然而非神经组织管道也存在易粘连、易坍塌和易降解等缺点。

为了进一步提高修复长节段周围神经缺损的治疗效果，人们从神经细胞学、分子生物学方面对周围神经再生进行了深入的研究和大量的实验。近年来，利用组织工程学的方法构建的组织工程神经支架成为最有希望替代自体神经的发展方向。目前已开发了具有不同超微结构的神经支架并取得了一定的修复效果，人工合成神经支架大体分为两类：第一类是非降解的人工合成神经支架，主要由硅胶管和聚四氟乙烯等材料制备而成，这种支架价格便宜，可根据需要调整支架的内径大小，但是这种支架不能被生物降解，需通过二次手术取出，若长期存留于体内会产生感染和结缔组织反应；另一类是可降解的人工合成神经支架，主要由聚乳酸、聚羟基乙酸以及聚合物等材料制备而成，这类支架的生物兼容性好，可被生物降解吸收，无需二次手术取出，不会压迫神经，具有明显的优势，但是，这些支架的超微结构与正常神经基底膜结构相差较大，不能更好的引导神经再生。

神经的再生过程不仅需要有良好的物理引导作用以促进再生轴突向特定靶组织生长，更重要的是还需要长期有效的神经营养支持。神经生长因子是神经营养因子家族中最重要成员之一，神经生长因子不仅可以促进感觉神经元的生长与分化，还可以促进周围神经再生。为了进一步提高神经支架修复长节段神经损伤的治疗效果，一些学者将神经营养因子NGF直接复合于神经支架，取得了一定的修复效果。然而在神经支架中释放的神经营养因子只能在最初的阶段促进神经再生，这种作用往往不超过一个月，这可能是营养因子快速降解、从支架中漏出或者被稀释的缘故。因此提供一种具有缓释功能的神经组织工程支架是非常必要的，不仅可以保护营养因子的生物活性，还可以使其长期、有效的释放到神经损伤部位。

发明内容

本发明的目的是提供一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统，解决了现有神经组织工程支架系统内部超微结构与正常神经基底膜结构相差较大，难以更好的引导神经再生，以及无法长期有效缓释神经生长因子以更好、更快的促进神经再生的问题。

本发明的另一个目的是提供上述NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法。

本发明所采用的技术方案是，

一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统，包括有横截面直径为2mm，长度为1.5cm～2.5cm的圆柱形胶原-壳聚糖神经支架，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部具有相互平行的轴向微管样结构，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部均匀复合有包埋神经生长因子的壳聚糖微球，包埋神经生长因子的壳聚糖微球的粒径为3μm～60μm。

本发明所采用的另一技术方案是，一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，制备出的具有缓释功能的神经组织工程支架，包括有横截面直径为2mm，长度为1.5cm～2.5cm的圆柱形胶原-壳聚糖神经支架，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部具有相互平行的轴向微管样结构，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部均匀复合有包埋神经生长因子的壳聚糖微球，包埋神经生长因子的壳聚糖微球的粒径为3μm～60μm；

具体按照以下步骤实施：

步骤1：制备出水相和油相；

步骤2：制备包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

步骤3：干燥、冷藏包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

步骤4：制备胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；

步骤5：注模冷琳，制备胶原-壳聚糖支架凝胶；

步骤6：真空干燥，形成胶原-壳聚糖神经支架；

步骤7：对胶原-壳聚糖神经支架进行交联和消毒；

步骤8：制备NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统。

本发明的特点还在于，

其中的步骤1具体按照以下步骤实施：

在低温2～6℃的条件下，按质量比为1∶20～30分别称取神经生长因子和牛血清白蛋白，将神经生长因子溶解于pH为7.2～7.6的PBS溶液中，配制成质量-体积浓度为4～8μg/ml的溶液，再将牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制备出神经生长因子溶液；在室温条件下，将壳聚糖粉末完全溶解于质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中，制备出质量-体积浓度为10～20mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；将配置好的神经生长因子溶液与壳聚糖醋酸溶液按体积比为1∶5～15充分混合，制备出水相；

将液体石蜡油与表面活性剂Span80按体积比为70～80∶1量取好后，依次注入三口烧瓶中，采用机械搅拌3min～7min，搅拌速度为300r/min～700r/min，使液体石蜡油与表面活性剂Span80混合均匀，制备出油相；

其中的步骤2具体按照以下步骤实施：

1)在低温2～6℃的条件下，按体积比为1∶5～15将步骤1制得的水相逐滴加入制得的油相中，采用机械搅拌0.5h～1.5h，搅拌速度为800r/min～1200r/min，制备出水/油乳浊液；

2)配置质量百分浓度为3％的三聚磷酸钠溶液，三聚磷酸钠溶液与步骤1中使用的液体石蜡油体积比为1∶7～8；

3)将质量百分浓度为3％的三聚磷酸钠溶液逐滴加入步骤1)得到的水/油乳浊液中，采用机械搅拌0.5h～1.5h，搅拌速度为800r/min～1200r/min，形成乳浊液；

4)依次用石油醚、异丙醇反复清洗步骤3)得到的乳浊液3次，即得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

其中的步骤3具体按照以下步骤实施：

将步骤2得到的包埋神经生长因子的壳聚糖微球放入冷冻干燥机内于-80～-40℃条件下冷冻干燥4h～8h，冰冻干燥后，将冻干的包埋神经生长因子的壳聚糖微球储存于2～6℃冰箱内；

其中的步骤4具体按照以下步骤实施：

1)按质量比为2～6∶1分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖；

2)将称取的I型胶原蛋白放入质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中溶解22～26小时，配置成质量-体积浓度为24mg/ml～30mg/ml的I型胶原蛋白醋酸悬浊液；

3)再将称取的壳聚糖加入质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中搅拌至完全溶解，配置成质量-体积浓度为12mg/ml～16mg/ml的壳聚糖醋酸悬浊液；

4)将两种悬浊液按体积比为1～3∶1混合并保持2～6℃恒温，再以10000r/min～14000r/min搅拌速度搅拌70min～110min，充分混合后，制成胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；

其中的步骤5具体按照以下步骤实施：

1)取硅胶管模具，将步骤4制得的胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入硅胶管模具内，以铅丝封闭硅胶管模具两端；

2)将注入胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液的硅胶管模具沿纵轴方向在电子微型调速仪的控制下，以2×10^-2cm/s～6×10^-2cm/s的速度缓慢浸入冷淋剂液氮，开始时硅胶管模具底端距冷淋液表面的距离为15cm～25cm，直至硅胶管模具全部进入冷淋剂内；

3)将硅胶管模具从冷淋剂内取出，把硅胶管模具内冰冻好的胶原-壳聚糖支架凝胶取出后剪成短节段，每节长度为1.5cm～2.5cm；

其中的步骤6具体按照以下步骤实施：

1)将步骤5制得的胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段置于0℃的铝制容器内，将铝制容器置于冷冻干燥机中，于-80～-40℃条件下冷冻干燥22h～26h后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段取出；

2)将冷冻干燥机的温度升至0℃，再把胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段放入冷冻干燥机内冷冻干燥6h～10h后取出；

3)再将冷冻干燥机的温度升至20～24℃，继续把胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段放入冷冻干燥机内，保持30min～60min即制得干燥成形的胶原-壳聚糖神经支架；

其中的步骤7具体按照以下步骤实施：

1)将步骤6制得的胶原-壳聚糖神经支架置于0.5％～1.5％京尼平水溶液中交联22h～26h；

2)将交联后的胶原-壳聚糖神经支架用去离子水和无水乙醇交替清洗4h～8h，去除多余的交联剂；

3)将清洗后的胶原-壳聚糖神经支架置于冷冻干燥机内于-20℃下冷冻干燥6h～10h；

4)将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架经Co⁶⁰照射消毒；

其中的步骤8具体按照以下步骤实施：

1)将步骤3制成的包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶于蒸馏水中，配置成浓度为300mg/ml～700mg/ml的溶液，将配置好的溶液分为等量的两份；

2)将其中一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的一端；再将另一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的另一端，这个过程重复2～5次，直到包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液浸透直到包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液浸透胶原-壳聚糖神经支架，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统；

3)将制备出的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统放入冷冻干燥机内，于-80～-40℃条件下冷冻干燥4h～8h，冰冻干燥后将NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统储存于2～6℃冰箱内。

本发明的有益效果是，本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统其内部为平行排列的微管样结构，高度仿真于正常神经基底膜结构，能有效的引导再生轴突的定向生长。支架上负载的包埋神经生长因子的壳聚糖微球具有良好的缓释作用，能为神经的再生长期、有效的提供神经营养支持，不仅可以很好的保护神经营养因子的生物活性，还可以使神经营养因子长期、有效的释放到神经损伤部位，大量的实验结果证实本发明具有缓释功能的神经组织工程支架能更快更好的促进再生神经组织和功能学的恢复，可应用于治疗周围神经缺损的患者，修复长节段神经损伤。此外，本发明所使用的材料在人体内可吸收降解，无毒无害，无需二次手术，可以很大程度上提高修复神经缺损的治疗效果，本发明具有广泛的应用前景。

附图说明

图1包埋神经生长因子的壳聚糖微球的扫描电镜图片；

图2是本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的横截面扫描电镜图片；

图3是本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的纵截面扫描电镜图片；

图4是本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的缓释效果曲线图；

图5是使用本发明缓释系统后大鼠的神经传导速度随时间变化的统计图；

图6是使用本发明缓释系统后大鼠的肌肉动作电位最大峰值随时间变化的统计图；

图7是采用本发明缓释系统治疗大鼠后，大鼠坐骨神经功能指数随时间变化的统计图。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明进行详细说明。

一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统，包括有横截面直径为2mm，长度为1.5cm～2.5cm的圆柱形胶原-壳聚糖神经支架，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部具有相互平行的轴向微管样结构，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部均匀复合有包埋神经生长因子的壳聚糖微球，包埋神经生长因子的壳聚糖微球的粒径为3μm～60μm。

一种NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，具体按照以下

步骤实施：

步骤1，制备水相和油相

在低温2～6℃的条件下，按质量比为1∶20～30分别称取神经生长因子和牛血清白蛋白，将神经生长因子溶解于pH为7.2～7.6的PBS溶液中，配制成质量-体积浓度为4～8μg/ml的溶液，再将牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制备出神经生长因子溶液；在室温条件下，将壳聚糖粉末完全溶解于质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中，制备出质量-体积浓度为10～20mg/ml的壳聚糖醋酸溶液；将配置好的神经生长因子溶液与壳聚糖醋酸溶液按体积比为1∶5～15充分混合，制备出水相；

将液体石蜡油与表面活性剂Span80按体积比为70～80∶1量取好后，依次注入三口烧瓶中，采用机械搅拌3min～7min，搅拌速度为300r/min～700r/min，使液体石蜡油与表面活性剂Span80混合均匀，制备出油相；

步骤2，制备包埋神经生长因子的壳聚糖微球

1)在低温2～6℃的条件下，按体积比为1∶5～15将步骤1制得的水相逐滴加入制得的油相中，采用机械搅拌0.5h～1.5h，搅拌速度为800r/min～1200r/min，制备出水/油乳浊液；

2)配置质量百分浓度为3％的三聚磷酸钠溶液，三聚磷酸钠溶液与步骤1中使用的液体石蜡油体积比为1∶7～8；

3)将质量百分浓度为3％的三聚磷酸钠溶液逐滴加入步骤1)得到的水/油乳浊液中，采用机械搅拌0.5h～1.5h，搅拌速度为800r/min～1200r/min，形成乳浊液；

4)依次用石油醚、异丙醇反复清洗步骤3)得到的乳浊液3次，即得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

步骤3，干燥、冷藏步骤2得到的包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

将步骤2得到的包埋神经生长因子的壳聚糖微球放入冷冻干燥机内于-80～-40℃条件下冷冻干燥4h～8h，冰冻干燥后，将冻干的包埋神经生长因子的壳聚糖微球储存于2～6℃冰箱内；

步骤4，制备胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液

1)按质量比为2～6∶1分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖；

2)将称取的I型胶原蛋白放入质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中溶解22～26小时，配置成质量-体积浓度为24mg/ml～30mg/ml的I型胶原蛋白醋酸悬浊液；

3)再将称取的壳聚糖加入质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中搅拌至完全溶解，配置成质量-体积浓度为12mg/ml～16mg/ml的壳聚糖醋酸悬浊液；

4)将两种悬浊液按体积比为1～3∶1混合并保持2～6℃恒温，再以10000r/min～14000r/min搅拌速度搅拌70min～110min，充分混合后，制成胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；

步骤5，注模冷琳，制备胶原-壳聚糖支架凝胶

1)取硅胶管模具，将步骤4制得的胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入硅胶管模具内，以铅丝封闭硅胶管模具两端；

2)将注入胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液的硅胶管模具沿纵轴方向在电子微型调速仪的控制下，以2×10^-2cm/s～6×10^-2cm/s的速度缓慢浸入冷淋剂液氮，开始时硅胶管模具底端距冷淋液表面的距离为15cm～25cm，直至硅胶管模具全部进入冷淋剂内；

3)将硅胶管模具从冷淋剂内取出，把硅胶管模具内冰冻好的胶原-壳聚糖支架凝胶取出后剪成短节段，每节长度为1.5cm～2.5cm；

步骤6，真空干燥，形成胶原-壳聚糖神经支架

1)将步骤5制得的胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段置于0℃的铝制容器内，将铝制容器置于冷冻干燥机中，于-80～-40℃条件下冷冻干燥22h～26h后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段取出；

2)将冷冻干燥机的温度升至0℃，再把胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段放入冷冻干燥机内冷冻干燥6h～10h后取出；

3)再将冷冻干燥机的温度升至20～24℃，继续把胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段放入冷冻干燥机内，保持30min～60min即制得干燥成形的胶原-壳聚糖神经支架；

步骤7，对胶原-壳聚糖神经支架进行交联消毒

1)将步骤6制得的胶原-壳聚糖神经支架置于0.5％～1.5％京尼平水溶液中交联22h～26h；

2)将交联后的胶原-壳聚糖神经支架用去离子水和无水乙醇交替清洗4h～8h，去除多余的交联剂；

3)将清洗后的胶原-壳聚糖神经支架置于冷冻干燥机内于-20℃下冷冻干燥6h～10h；

4)将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架经Co⁶⁰照射消毒；

步骤8制备NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统支架

1)将步骤3制成的包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶于蒸馏水中，配置成浓度为300mg/ml～700mg/ml的溶液，将配置好的溶液分为等量的两份；

2)将其中一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的一端；再将另一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的另一端，这个过程重复2～5次，直到包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液浸透胶原-壳聚糖神经支架，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统；

3)将制备出的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统放入冷冻干燥机内，于-80～-40℃条件下冷冻干燥4h～8h，冰冻干燥后将NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统储存于2～6℃冰箱内。

二、结果分析

1.扫描电子显微镜观察结果分析

壳聚糖与三聚磷酸钠发生静电相互吸引后，会形成包埋神经生长因子的壳聚糖微球。通过扫描电镜对制得的包埋神经生长因子的壳聚糖微球粒径进行观察和分析，如图1所示，经分析可知：包埋神经生长因子的壳聚糖微球平均粒径为22μm，微球的粒径范围在3μm～60μm。

本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的扫描电镜图，如图2所示，支架的横切面为蜂巢样结构，呈规则排列；如图3所示，纵切面可见平行排列的微管样结构，微管内径均一，微管直径为97.6μm～107μm，管径范围为85.7μm～114.9μm，此结构与正常神经基底膜结构类似。

2.包埋神经生长因子的壳聚糖微球缓释效果分析

量取2ml pH为7.4的磷酸盐缓冲液(即PBS溶液)倒入烧瓶中，再将本发明的支架放置于烧瓶内，在37℃的条件下，将烧瓶放置于摇床上，缓慢摇动12周；在特定时间内(1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周)，每次用吸管吸取上层的缓释液后再补充2mlpH值为7.4的磷酸盐缓冲液；将每次回收的缓释液置于温度为-20℃的冰箱内冷藏；对缓释液中的神经生长因子做定量分析(神经生长因子ELISAKit)，测量随时间的增长，回收的缓释液中神经生长因子含量的变化情况，如图4所示，本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的缓释时间能达12周左右，能达到持续缓释神经生长因子的目的。

3.MTT比色法细胞活力检测

将本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统与大鼠的嗜络细胞瘤共培养，分别在特定的时间1、3、14、28天做MTT比色法细胞活力检测。

先将大鼠的嗜络细胞瘤培养于添加有15％马血清(Gibco，USA)，2.5％胎牛血清(Gibco，USA)，1％青霉素/链霉素(Gibco，USA)的RPMI1640(Gibco，USA)培养液中，在37℃条件下在细胞培养箱培养内3～5天；再将神经组织支架沿纵截面切成几个部分后放置于24孔细胞培养板内进行消毒处理，24孔细胞培养板内盛放有浓度为70％的酒精；随后用PBS溶液清洗神经组织支架，接着在37℃的条件下将神经组织支架放置于2ml的RPMI1640培养液中过夜；第二天，用吸管吸取支架内的培养液，将20μl大鼠的嗜络细胞瘤悬液以1×10⁴细胞/孔，均匀接种于神经组织支架上；培养2小时后，将700μl的RPMI1640培养液缓慢的注入神经组织支架内，再将神经组织支架放置于细胞培养箱内；经过1、7、14和28天的共培养后，用PBS溶液分别清洗支架3次；随后在含有20μl MTT和700μl RPMI1640培养液的混合液中培养4小时；4小时后移除培养液，用二甲亚砜溶解反应产物；将反应产物放置于24孔细胞培养板内，并把24孔细胞培养板放置于摇床摇动20分钟。用全自动定量绘图酶标仪在570nm的波长下读取24孔细胞培养板内OD值，测试后发现随时间的增长OD值不断增大，这是由于活细胞中的脱氢酶能将MTT还原成不溶于水的蓝紫色产物甲臜，并沉淀在细胞中，二甲亚砜能溶解沉积甲臜，使溶液的色泽不断变浅，但死细胞没有这种功能，由图5说明，本发明的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统具有良好的生物活性，能持续缓释具有生物活性的神经生长因子。

三、动物手术实例，再生神经功能性评估

1.电生理评估

利用本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统来修复大鼠16mm坐骨神经缺损，通过治疗效果来评定大鼠外周神经长节段缺损16mm的修复效果。

1)将15只雄性SD大鼠(200-220g)采用腹腔内注射戊巴比妥钠(100mg/ml)麻醉；

2)麻醉大鼠后，固定大鼠左腿并备皮消毒，切开皮肤和皮下筋膜，钝性分离肌肉组织，显露坐骨神经；

3)用显微剪剪去7～8mm长的坐骨神经，神经断端回缩后留下16mm长的神经缺损；

4)在显微镜下，采用10/0尼龙缝线通过神经外膜缝合技术将支架组缝合在神经断端；

5)最后，使用6/0尼龙缝线缝合肌肉，皮肤。

将手术后的大鼠放入铺满木屑的笼子里，常规喂水进食后观察12周。分别在第4、8、12周，对大鼠腹腔内注射戊巴比妥钠进行麻醉，随后钝性分离大鼠左腿的肌肉组织，用绝缘的橡皮圈将显露神经修复部位与周围组织隔离。测试移植本发明神经组织工程支架后，大鼠肌肉动作电位最大峰值和神经传导速度，肌肉动作电位主要反映运动神经的传导性、肌纤维受神经支配的状态，神经传导速度用来评价周围神经传导功能，如图6所示，大鼠的神经传导速度随时间的变化有明显的提升，由第5周的10m/s到第12周的23m/s，如图6所示，肌肉动作电位最大峰值由第4周的7毫伏到第12周的16毫伏。可知采用本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统修复大鼠16mm坐骨神经缺损后，大鼠的神经传导功能、肌纤维受神经支配的状态都具有明显的提升。

2.对大鼠进行步径试验，分析再生神经对大鼠肌肉功能支配情况

分别在第4、8、12周，对上述三组大鼠进行步径试验分析，给每只大鼠的左后足蘸上黑色的墨水，训练大鼠通过一条铺满白纸(50cm×7cm)的小路，使大鼠最终到达一个暗箱内。大鼠会在白纸上留下一连串的脚印，对足迹分析评估坐骨神经功能指数SFI，用SFI来评价再生神经对大鼠肌肉的功能支配情况，以SFI指为0表示正常，-100为神经完全离断为指标，如图7所示，随时间的增长，坐骨神经功能指数SFI在第4周为-75，到第12周恢复为-55，表示移植本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统后，再生神经对大鼠肌肉的功能支配情况逐渐恢复。

SFI计算公式如下：

$\mathrm{SFI}=-38.3\left[\frac{\mathrm{EPL}-\mathrm{NPL}}{\mathrm{NPL}}\right]+109.5\left[\frac{\mathrm{ETS}-\mathrm{NTS}}{\mathrm{NTS}}\right]+13.3\left[\frac{\mathrm{EIT}-\mathrm{NIT}}{\mathrm{NIT}}\right]-8.8---\left(1\right)$

EPL：代表手术后的大鼠从足跟到第三足趾前端的长度；

ETS：代表手术后的大鼠从第一足趾到第五足趾的距离；

EIT：代表手术后的大鼠从第二足趾到第四足趾的距离；

NPL：代表从未手术的大鼠从足跟到第三足趾前端的长度；

NTS：代表从未手术的大鼠从第一足趾到第五足趾的距离；

NIT：代表从未手术的大鼠从第二足趾到第四足趾的距离。

3.评价神经再生的指标

通常评价神经再生的指标有：再生轴突总面积(A_tot)，髓鞘的厚度，有髓轴突的直径，有髓轴突的数量，分别在4、8、12周，对大鼠治疗后的这些指标进行分析；

1)再生轴突总面积：第4周大鼠的再生轴突总面积为1.15mm²，8周后大鼠的再生轴突总面积为1.35mm²，12周后大鼠的再生轴突总面积为1.6mm²，经过治疗后的大鼠再生轴突总面积不断的增长；

2)髓鞘的厚度：髓鞘是一层脂肪组织，包裹在某些神经元的轴突外，具有绝缘作用并提高神经冲动的传导速度，并有保护轴突的作用。4周时大鼠髓鞘的厚度为0.5μm，8周后大鼠髓鞘的厚度为0.95μm，12周后大鼠髓鞘的厚度为1.15μm；

3)有髓轴突的直径：治疗4周后大鼠有髓轴突的直径为2μm，8周后大鼠有髓轴突的直径为2.2μm，12周后大鼠有髓轴突的直径为3μm；

4)有髓轴突的数量：治疗4周后大鼠有髓轴突的数量为0.9×10³，8周后大鼠有髓轴突的数量为1.3×10³，12周后大鼠有髓轴突的数量为1.7×10³；

实施例1

在低温2℃的条件下，先将40μg神经生长因子溶解于10mlpH为7.2的PBS溶液中，再将800μg牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制备出神经生长因子溶液；在室温条件下将700mg壳聚糖粉末完全溶解于70ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中；取7ml神经生长因子溶液与35ml的壳聚糖醋酸溶液充分混合，制备出水相；将140ml液体石蜡油与2ml表面活性剂Span80量取好后，依次注入三口烧瓶中，采用机械搅拌3min，搅拌速度为300r/min，使液体石蜡油与表面活性剂Span80混合均匀，制备出油相；在低温2℃的条件下，将20ml的水相溶液逐滴加入100ml的油相中，采用机械搅拌0.5h，搅拌速度为800r/min，制备水/油乳浊液；将20ml，质量百分浓度为3％的三聚磷酸钠溶液逐滴加入水/油乳浊液中并机械搅拌0.5h，搅拌速度为800r/min，形成乳浊液；依次用石油醚、异丙醇反复清洗乳浊液3次，得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球；将得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球放入冷冻干燥机内于-80℃条件下冷冻干燥4h，冰冻干燥后将干燥的包埋神经生长因子的壳聚糖微球储存于2℃冰箱内；将480mgI型胶原蛋白放入20ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸溶液中溶解22小时；再将240mg壳聚糖加入20ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸溶液中至完全溶解，将20ml的I型胶原蛋白悬浊液和20ml壳聚糖悬浊液混合并保持2℃恒温，再以10000r/min搅拌速度搅拌70min，充分混合制成胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；取硅胶管模具，将胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入硅胶管模具内，以铅丝封闭硅胶管模具两端；将注入胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液的模具沿纵轴方向在电子微型调速仪的控制下，以2×10^-2cm/s的速度缓慢浸入冷淋剂液氮，硅胶管模具底端距冷淋液表面的距离为15cm，直至硅胶管模具全部进入冷淋剂内；将硅胶管模具从冷淋剂内取出，把冰冻的胶原-壳聚糖凝胶剪成短节段，每节长度为1.5cm；将剪好的胶原-壳聚糖神经支架凝胶置于0℃的铝制容器，再将铝制容器置于冷冻干燥机中，于-80℃条件下真空干燥22h，将胶原-壳聚糖神经支架出；将温度升至0℃后，将胶原-壳聚糖神经支架放入冷冻干燥机内继续干燥6h，再将温度升至20℃，保持30min，即制得干燥成形的胶原-壳聚糖神经支架；将胶原-壳聚糖神经支架置于0.5％京尼平水溶液中交联22h，将交联后的胶原-壳聚糖神经支架用去离子水和无水乙醇交替清洗4h，将清洗后的胶原-壳聚糖神经支架置于冷冻干燥机内于-20℃下冷冻干燥6h；将干燥后的胶原-壳聚糖神经支架经Co⁶⁰照射消毒；将包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶于蒸馏水中，配置成浓度为300mg/ml的溶液，将配置好的溶液分为等量的两份；其中一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的一端；再将另一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的另一端，这个过程重复2次，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统；把制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统放入冷冻干燥机于-80℃条件下冷冻干燥4h，冰冻干燥后，将NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统储存于2℃冰箱内。

实施例2

在低温4℃的条件下，先将60μg神经生长因子溶解于10mlpH为7.4的PBS溶液中，再将1500μg牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制备出神经生长因子溶液；在室温条件下将1500mg壳聚糖粉末完全溶解于100ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中；将10ml神经生长因子溶液与100ml的壳聚糖醋酸水溶液充分混合，制备出水相；将300ml液体石蜡油与4ml表面活性剂Span80量取好后，依次注入三口烧瓶中，采用机械搅拌5min，搅拌速度为500r/min，使液体石蜡油与表面活性剂Span80混合均匀，制备出油相；在低温4℃的条件下，将30ml的水相溶液逐滴加入300ml的油相中，采用机械搅拌1h，搅拌速度为1000r/min，制备水/油乳浊液；将40ml，质量百分浓度为3％三聚磷酸钠溶液逐滴加入水/油乳浊液中并机械搅拌1h，搅拌速度为1000r/min，形成乳浊液；依次用石油醚、异丙醇反复清洗乳浊液3次，得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球；将得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球放入冷冻干燥机内于-80℃条件下冷冻干燥6h，冰冻干燥后将干燥的包埋神经生长因子的壳聚糖微球储存于4℃冰箱内；将840mg I型胶原蛋白放入30ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中溶解24小时；再将210mg壳聚糖加入15ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸溶液中至完全溶解，将30ml的I型胶原蛋白悬浊液和15ml壳聚糖悬浊液混合并保持4℃恒温，再以12000r/min搅拌速度搅拌90min，充分混合制成胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；取硅胶管模具，将胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入硅胶管模具内，以铅丝封闭硅胶管模具两端；将注入胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液的模具沿纵轴方向在电子微型调速仪的控制下，以4×10^-2cm/s的速度缓慢浸入冷淋剂液氮，硅胶管模具底端距冷淋液表面的距离为20cm，直至硅胶管模具全部进入冷淋剂内；将硅胶管模具从冷淋剂内取出，把冰冻的胶原-壳聚糖凝胶剪成短节段，每节长度为2cm；将剪好的胶原-壳聚糖神经支架凝胶置于0℃的铝制容器，再将铝制容器置于冷冻干燥机中，于-80℃条件下真空干燥24h，将胶原-壳聚糖神经支架出；将温度升至0℃后，将胶原-壳聚糖神经支架放入冷冻干燥机内继续干燥8h，再将温度升至20℃，保持50min，即制得干燥成形的胶原-壳聚糖神经支架；将胶原-壳聚糖神经支架置于1％京尼平水溶液中交联24h，将交联后的胶原-壳聚糖神经支架用去离子水和无水乙醇交替清洗6h，将清洗后的胶原-壳聚糖神经支架置于冷冻干燥机内于-20℃下冷冻干燥8h；将干燥后的胶原-壳聚糖神经支架经Co⁶⁰照射消毒；将包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶于蒸馏水中，配置成浓度为500mg/ml的溶液，将配置好的溶液分为等量的两份；其中一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的一端；再将另一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的另一端，这个过程重复4次，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统；把制备出的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统放入冷冻干燥机于-60℃条件下冷冻干燥6h，冰冻干燥后，将NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统储存于4℃冰箱内。

实施例3

在低温6℃的条件下，将160μg神经生长因子溶解于20mlpH为7.6的PBS溶液中，再将4800μg牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制备出神经生长因子溶液；在室温条件下将的4000mg壳聚糖粉末完全溶解于200ml乙酸溶液中；将10ml的神经生长因子溶液与150ml的壳聚糖溶液充分混合，制备出水相；将240ml液体石蜡油与3ml表面活性剂Span80量取好后，依次注入三口烧瓶中，采用机械搅拌7min，搅拌速度为700r/min，使液体石蜡油与表面活性剂Span80混合均匀，制备出油相；在低温6℃的条件下，将30ml的神经生长因子溶液与240ml的壳聚糖混合溶液逐滴加入油相中，采用机械搅拌1.5h，搅拌速度为1200r/min，制备水/油乳浊液；将30ml，质量百分浓度为3％三聚磷酸钠溶液逐滴加入水/油乳浊液中并机械搅拌1.5h，搅拌速度为1200r/min，形成乳浊液；依次用石油醚、异丙醇反复清洗乳浊液3次，得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球；将得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球放入冷冻干燥机内于-40℃条件下冷冻干燥8h，冷冻干燥后将干燥的包埋神经生长因子的壳聚糖微球储存于6℃冰箱内冷藏。称取600mgI型胶原蛋白和100mg壳聚糖；将I型胶原蛋白放入20ml质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中溶解26小时；再将壳聚糖加入8ml，质量-体积浓度为3mg/ml醋酸水溶液中充分溶解，将18ml的I型胶原蛋白悬浊液和6ml壳聚糖悬浊液混合并保持6℃恒温，再以14000r/min搅拌速度搅拌110min，充分混合制成胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；取硅胶管模具，将胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入硅胶管模具内，以铅丝封闭硅胶管模具两端；将注入胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液的模具沿纵轴方向在电子微型调速仪的控制下，以6×10^-2cm/s的速度缓慢浸入冷淋剂液氮，硅胶管模具底端距冷淋液表面的距离为25cm，直至硅胶管模具全部进入冷淋剂内；将硅胶管模具从冷淋剂内取出，把冰冻的胶原-壳聚糖凝胶剪成短节段，每节长度为2.5cm；将剪好的胶原-壳聚糖神经支架凝胶置于0℃的铝制容器，再将铝制容器置于冷冻干燥机中于-40℃条件下干燥26h，将胶原-壳聚糖神经支架出；将温度升至0℃后，将胶原-壳聚糖神经支架放入冷冻干燥机内继续干燥10h，再将温度升至24℃，保持60min，即制得干燥成形的胶原-壳聚糖神经支架；将胶原-壳聚糖神经支架与1.5％京尼平溶液交联26h，用去离子水和无水乙醇反复清洗8小时，将清洗后的胶原-壳聚糖神经支架置于冷冻干燥机内于-20℃下干燥10h；将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架经Co⁶⁰照射消毒；将包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶于蒸馏水中，配置成浓度为700mg/ml的溶液，将配置好的溶液分为等量的两份；其中一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的一端；再将另一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的另一端，这个过程重复5次，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统；将制备出的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统放入冷冻干燥机于-40℃条件下冻干8h，冷冻干燥后，将NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统储存于6℃冰箱。

本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统结构高度仿真，横截面为蜂巢状结构，呈规则排列；纵截面可见平行排列的微管样结构，微管直径为97.6μm～107μm，管径范围为85.7μm～114.9μm，此结构与正常神经基底膜结构类似，最大程度上发挥壳聚糖-胶原神经组织工程支架对神经的物理引导作用，可较好的引导神经再生；采用三聚磷酸钠交联壳聚糖微球，可更好的控制药物释放的时间以及速度，三聚磷酸钠和壳聚糖都具有良好的生物兼容性，壳聚糖微球可以被生物水解酶所降解，通过调整三聚磷酸钠交联的时间和交联浓度可控制壳聚糖微球的降解率；本发明NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的缓释时间能达12周左右，使神经生长因子长期有效释放到神经损伤部位，达到修复长节段神经的目的。

Claims (9)

1.NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，制备出的具有缓释功能的神经组织工程支架，包括有横截面直径为2mm，长度为1.5cm～2.5cm的圆柱形胶原-壳聚糖神经支架，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部具有相互平行的轴向微管样结构，圆柱形胶原-壳聚糖神经支架内部均匀复合有包埋神经生长因子的壳聚糖微球，包埋神经生长因子的壳聚糖微球的粒径为3μm～60μm；

具体按照以下步骤实施：

步骤1：制备出水相和油相；

步骤2：制备包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

步骤3：干燥、冷藏包埋神经生长因子的壳聚糖微球；

步骤4：制备胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液；

步骤5：注模冷淋，制备得到胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段；

步骤6：真空干燥，形成胶原-壳聚糖神经支架；

步骤7：对胶原-壳聚糖神经支架进行交联和消毒；

步骤8：制备NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统。

2.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤1具体按照以下步骤实施：

在低温2～6℃的条件下，按质量比为1:20～30分别称取神经生长因子和牛血清白蛋白，将神经生长因子溶解于pH为7.2～7.6的PBS溶液中，配制成质量-体积浓度为4～8μg/mL的溶液，再将牛血清白蛋白倒入溶液中完全溶解后制备出神经生长因子溶液；在室温条件下，将壳聚糖粉末完全溶解于质量-体积浓度为3mg/mL醋酸水溶液中，制备出质量-体积浓度为10～20mg/mL的壳聚糖醋酸溶液；将配置好的神经生长因子溶液与壳聚糖醋酸溶液按体积比为1:5～15充分混合，制备出水相；

将液体石蜡油与表面活性剂Span80按体积比为70～80:1量取好后，依次注入三口烧瓶中，采用机械搅拌3min～7min，搅拌速度为300r/min～700r/min，使液体石蜡油与表面活性剂Span80混合均匀，制备出油相。

3.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤2具体按照以下步骤实施：

1）在低温2～6℃的条件下，按体积比为1:5～15将步骤1制得的水相逐滴加入制得的油相中，采用机械搅拌0.5h～1.5h，搅拌速度为800r/min～1200r/min，制备出水/油乳浊液；

2）配置质量百分浓度为3%的三聚磷酸钠溶液，按照制备油相中采用的液体石蜡油的量取配置好的三聚磷酸钠溶液，三聚磷酸钠溶液与液体石蜡油的体积比为1：7～8；

3）将质量百分浓度为3%的三聚磷酸钠溶液逐滴加入步骤1）得到的水/油乳浊液中，采用机械搅拌0.5h～1.5h，搅拌速度为800r/min～1200r/min，形成乳浊液；

4）依次用石油醚、异丙醇反复清洗步骤3）得到的乳浊液3次，即得到包埋神经生长因子的壳聚糖微球。

4.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤3具体按照以下步骤实施：

将步骤2得到的包埋神经生长因子的壳聚糖微球放入冷冻干燥机内于-80～-40℃条件下冷冻干燥4h～8h，冰冻干燥后,将冻干的包埋神经生长因子的壳聚糖微球储存于2～6℃冰箱内。

5.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤4具体按照以下步骤实施：

1）按质量比为2～6:1分别称取I型胶原蛋白和壳聚糖；

2）将称取的I型胶原蛋白放入质量-体积浓度为3mg/mL醋酸水溶液中溶解22～26小时，配置成质量-体积浓度为24mg/mL～30mg/mL的I型胶原蛋白醋酸悬浊液；

3）再将称取的壳聚糖加入质量-体积浓度为3mg/mL醋酸水溶液中搅拌至完全溶解，配置成质量-体积浓度为12mg/mL～16mg/mL的壳聚糖醋酸悬浊液；

4）将两种悬浊液按体积比为1～3:1混合并保持2～6℃恒温，再以10000r/min～14000r/min搅拌速度搅拌70min～110min，充分混合后，制成胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液。

6.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤5具体按照以下步骤实施：

1）取硅胶管模具，将步骤4制得的胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液注入硅胶管模具内，以铅丝封闭硅胶管模具两端；

2）将注入胶原-壳聚糖凝胶状悬浊液的硅胶管模具沿纵轴方向在电子微型调速仪的控制下，以2×10^-2cm/s～6×10^-2cm/s的速度缓慢浸入冷淋剂液氮，开始时硅胶管模具底端距冷淋液表面的距离为15cm～25cm，直至硅胶管模具全部进入冷淋剂内；

3）将硅胶管模具从冷淋剂内取出，把硅胶管模具内冰冻好的胶原-壳聚糖支架凝胶取出后剪成短节段，每节长度为1.5cm～2.5cm，得到胶原-壳聚糖支架凝胶短节段。

7.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤6具体按照以下步骤实施：

1）将步骤5制得的胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段置于0℃的铝制容器内，将铝制容器置于冷冻干燥机中，于-80～-40℃条件下冷冻干燥22h～26h后将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段取出；

2）将冷冻干燥机的温度升至0℃，再把胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段放入冷冻干燥机内冷冻干燥6h～10h后取出；

3）再将冷冻干燥机的温度升至20～24℃，继续把胶原-壳聚糖神经支架凝胶短节段放入冷冻干燥机内，保持30min～60min即制得干燥成形的胶原-壳聚糖神经支架。

8.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤7具体按照以下步骤实施：

1）将步骤6制得的胶原-壳聚糖神经支架置于0.5%～1.5%京尼平水溶液中交联22h～26h；

2）将交联后的胶原-壳聚糖神经支架用去离子水和无水乙醇交替清洗4h～8h，去除多余的交联剂；

3）将清洗后的胶原-壳聚糖神经支架置于冷冻干燥机内于-20℃下冷冻干燥6h～10h；

4）将冷冻干燥后的胶原-壳聚糖神经支架经Co⁶⁰照射消毒。

9.根据权利要求1所述的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统的制备方法，其特征在于，所述的步骤8具体按照以下步骤实施：

1）将步骤3制成的包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶于蒸馏水中，配置成浓度为300mg/mL～700mg/mL的溶液，将配置好的溶液分为等量的两份；

2）将其中一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的一端；再将另一份包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液通过针管注入胶原-壳聚糖神经支架的另一端，这个过程重复2～5次，直到包埋神经生长因子的壳聚糖微球溶液浸透胶原-壳聚糖神经支架，制备出NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统；

3）将制备出的NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统放入冷冻干燥机内，于-80～-40℃条件下冷冻干燥4h～8h，冰冻干燥后将NGF壳聚糖微球-高仿生支架缓释系统储存于2～6℃冰箱内。

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