CN102595914A - 增加分子转移穿过生物膜以加速乳品发酵的电学的用途 - Google Patents

Abstract

用于制备乳品发酵产品的方法，其包括将乳酸细菌接种入乳品基质组合物和起始发酵。将电极放置直接与接种的乳品基质组合物接触，产生电脉冲，从而在乳酸细菌中形成孔以便乳品基质组合物中的分子获得进入乳酸细菌。

Description

增加分子转移穿过生物膜以加速乳品发酵的电学的用途

发明领域

本发明涉及用于制备食品的方法。更具体地，本发明涉及利用乳品基质(dairy base)的带电化（electrification）制备发酵乳制品（fermented dairy product）的方法。本发明在酸乳制品(yogurt product)的制备中是特别有用的。

发明背景

发酵乳制品，例如酸乳，通常是指通过将一种或多种乳制品成分(有时也称为乳品基质)与包含产乳酸细菌例如德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus)和/或嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)的细菌培养物培养(发酵)产生的组合物。此类产品可以以多种形式和制剂利用。

酸乳消费者对于发酵乳制品正不断产生特别精细的味道。这已导致发酵乳制品提供物的显著多样化。产生不同味道和质感(texture)的至关重要的因素之一是乳品发酵菌株的专门独特的混合的应用。这对生产设施产生了压力，从而影响工厂效率。

除了为生产厂家引入一组新的乳品发酵菌株以进行管理的方面外，还存在加速酸乳的发酵的另一个需要。在一些发酵乳制品中，此类新型制品的最终属性通常取决于从具有天然冗长发酵时间的菌株产生的香料（flavors）的独特香味。为了使所述工艺商业可行，高度期望加速发酵。

加速乳品发酵的领域中的现有技术集中于以代谢限制浓度向乳品基质、补充营养物或提取物中添加发酵增强剂。本发明通过另一个途径，绕开细胞运输机制并且为这些营养物进入细胞代谢提供直接途径解决了所述问题。

发明概述

本发明描述了直接的电场（direct electrical field）用于乳品发酵的应用。在该方法中，将乳品发酵菌株接种入乳品基质。提供电极与接种的乳品基质直接接触。使用与电极连接的外部电源以产生通过接种的乳品基质的电脉冲。施加的电场影响乳品发酵菌株的细胞膜的内侧和外侧上的电荷。已发现，如果电极与乳品基质绝缘或分离则该方法不起作用。以足够高以在乳酸细菌中形成孔(以允许乳品基质组合物中的分子进入乳酸细菌)或足够低以便乳酸细菌保持活力以进行发酵的电场强度使用电极给接种的乳品基质施加至少一个电脉冲。

乳品发酵菌株的细胞膜包含以在乳品基质与细胞内细胞溶胶之间产生半渗透屏障的方式排列的脂质。在脉冲的持续过程中，电荷在细胞膜两侧都增加。然而不受理论束缚，认为一旦两侧上的电荷大到足以克服膜的电容，脂质分子快速重排以形成电荷通过的孔，从而平衡电荷。一旦这些孔形成，其它分子就可自由地利用这些孔来进入细胞溶胶。常规地，各种物质进入细胞溶胶的通过通常借助于跨膜转运蛋白（transporter）。转运蛋白运转的速率受到多个因素的限制，所述因素可包括细胞可获得提供给该过程的能量。通过产生通过膜的孔，生长支持组分或其它物质能够绕开限速转运蛋白并进入细胞溶胶。孔不是永久性的，因此生长支持物以比正常浓度更高的浓度被捕获在细胞溶胶中，并且可用于细胞代谢而消耗。

在本发明的实施方案中，待引入乳品发酵的细菌的分子包括但不限于氨基酸、蛋白质片段、自由离子、有机酸、维生素和有益于细菌培养物生长的其它营养物（nutrients）。在本发明的另一个实施方案中，待引入乳品发酵的细菌的分子包括有益于人健康的营养制品（nutraceuticals），例如有助于不耐受乳糖的那些人的乳糖酶，孕妇所需的叶酸和骨健康所需的三肽。

在特别优选实施方案中，本发明增强酸乳发酵的共生关系(symbiotic relationship)。常规酸乳发酵依赖于两种菌株：德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌。研究已发现每一种菌株产生另一种菌株需要的营养物(即，对于嗜热乳链球菌(S. thermophilus)：缬氨酸和其它氨基酸，以及对于乳酸杆菌(L. bacillus)：甲酸)。已发现电穿孔的使用通过允许这些至关重要的营养物以比常规吸收更快的速率流动，加速两种菌株的生长。在迟缓期期间节省的时间对工厂生产安排可具有很大帮助，因为生产厂家可使用具有更长的发酵时间和更温和的条件的培养系统来产生更多设计的制品。其还可解决当使用 DVS(直投式发酵剂(Direct Vat Set))培养系统时发生的更长的迟缓期。例如，在本发明的实施方案中，接种的乳品基质组合物的发酵时间比未暴露于电脉冲的相同组合物缩短至少10%，优选至少20%。

在本发明的实施方案中，提供了通过直接施加电场加速培养的乳制品的发酵的方法。在一些方面，本发明包括在乳制品培养物的细胞膜中产生孔以允许生长支持物快速进入细胞代谢。在特别优选实施方案中，乳品发酵培养物包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的混合物。

发明详述

下文中描述的本发明的实施方案无意为穷举的或将本发明限定于下列详细描述中公开的确切形式。相反，这样选择和描述实施方案以便其他本领域技术人员可了解和理解本发明的原理和实施。

通常，本发明涉及通过直接施加电场加速乳品发酵培养物的生长的方法。可在本发明的实施中发酵多种不同的乳品基质。

为了有助于本发明的讨论，将阐述本发明提供用于酸乳制品的用途。选择酸乳制品，因为可明确地呈现本发明概念的有利方面。然而，应理解，公开的组合物和方法适用于任何发酵乳制品，例如硬酸乳(firm yogurt)、可饮用酸乳(drinkable yogurt)、酸奶(kefir)、软奶油乳酪( soft cream cheese)、软干乳(包括清爽干酪(fromage frais)和quark、发酵奶、基于酸乳的奶制甜点或发酵奶制甜点(yogurt-based or fermented milk dessert)、奶昔、脱脂酸牛奶（skyr）等。此外，本文中公开的本发明组合物和方法适用于任何酸乳组合物例如本文中提及的各种形式，以及不同脂肪水平(包括低脂、脱脂和标准酸乳)。酸乳形式的实例包括设置型( set style)、搅拌型( stirred style)、瑞士型(Swiss style)、充气型(aerated style)等。

如本文中所使用的，术语“酸乳”（“yogurt”）包括但不限于所有满足美国食品药物管理局联邦法规(CFR) 第21篇第131.200、131.203和131.206节中所述的定义的那些食品。

一般地，发酵乳制品例如酸乳可从可发酵乳品基质和细菌培养物制备而来。此外，发酵乳制品可包括凝胶形成的水胶体组分（gel-forming hydrocolloid component）和任选地一种或多种添加剂。

用于制备酸乳的乳品基质是公知的并且描述于美国专利号4,971,810(Hoyda等); 5,820,903(Fleury等); 6,235,320(Daravingas等); 6,399,122(Vandeweghe等); 6,740,344(Murphy等)和美国公开号2005/0255192(Chaudhry等)中。一般地，乳品基质包括至少一种可发酵乳制品成分。可发酵乳制品成分可包括原料乳(raw milk)或全脂乳（whole milk）、脱脂乳（skim milk）、炼乳、奶粉（dry milk）(例如脱脂奶粉固体，或MSNF)的组合。然而，如果需要，其它奶可用作牛奶的部分或完全替代物，例如骆驼、山羊、绵羊或马奶。可发酵乳制品成分还可包含A级乳清、奶油（cream）和/或这类其它奶级分成分如酪乳(buttermilk)、乳清、乳糖、乳清蛋白、乳球蛋白或通过部分或完全除去乳糖和/或矿物质而改良的乳清，和/或其它乳制品成分以增加脱脂固体含量，将所述成分混合以提供期望的脂肪和固体含量。如果需要，乳品基质可包括换脂乳成分（filled milk component），例如具有由非乳成分(例如，油或豆浆)提供的一部分的乳成分。优选地，可发酵乳制品成分包括牛奶。

优选地，可发酵乳制品成分由牛奶组成。

一般而言，众所周知通常配制具有期望的乳固体含量和期望的脂肪含量的乳品基质。在示例性实施方案中，乳品基质具有范围在基于乳品基质的总重量的 1至50重量百分比，优选4至25重量百分比，更优选约9重量百分比的范围内的乳固体含量。

此外，本发明的乳品基质可包括甜味剂、香料成分（一种或多种）、加工粘度改性剂(process viscosity modifier)（一种或多种）、维生素（一种或多种）、营养物（一种或多种）、这类物质的组合等。可包括的其它成分为凝胶形成添加剂、稳定剂、多价螯合剂等。

适合的甜味剂的实例包括一种或多种营养碳水化合物增甜剂。示例性营养增甜剂包括但不限于蔗糖、液体蔗糖、高果糖玉米糖浆、葡萄糖、液体葡萄糖、各种DE玉米糖浆、玉米糖浆固体、甜菜糖或蔗糖、转化糖(以糊剂或糖浆形式存在)、红糖、精制糖浆(refiner’s syrup)、糖蜜、果糖、果糖糖浆、麦芽糖、麦芽糖浆、干麦芽糖浆、麦芽提取物、干麦芽提取物、麦芽糖浆、干麦芽糖浆、蜂蜜、槭糖及其混合物。在一些实施方案中，特别地在低脂和/或低卡路里变型中，乳品基质可包含高潜能非营养碳水化合物增甜剂。示例性高潜能增甜剂包括、阿司帕坦、蔗糖素(sucralose)、乙酰氨基磺酸钾（acesulfame potassium）、糖精、环己氨磺酸、索马汀、塔格糖、甜菊双糖苷(rebaudioside)、蜜叶糖及其混合物。

在示例性实施方案中，甜味剂通常以基于乳品基质组合物的总重量的0至20重量百分比，优选12至17重量百分比的量存在。

在示例性实施方案中，加工粘度改性剂可以以基于乳品基质组合物总重量的0.5至3重量百分比，优选1至2重量百分比的量存在。示例性加工粘度改性剂可以商品名THERMTEX®从National Starch(Bridgewater, NJ)购得。

适合用于本发明的实施的凝胶形成添加剂包括“凝胶形成水胶体成分”，在本发明的上下文中，其是指在水中充分分散的成分，但因其相对大的分子尺寸，其在水中不容易溶解，从而在水中所得的物理形态为胶体。此外，凝胶形成水胶体成分当其以给定的凝胶形成量存在并且将食物组合物经历成胶条件时，在一定程度上引起食物组合物形成凝胶。常用胶凝条件包括使根据本发明的乳品组合物经历35至70℉(约2至约21℃)，优选35至55℉(约2至约13℃)，以及甚至更优选35至45℉(约2至约7℃)的范围内的温度，进行0至12小时的时期。大多数凝胶可在12小时内发生，但最大凝胶设置可在48小时后发生。

与凝胶形成水胶体成分相反，一些水胶体成分可在乳品组合物例如酸乳的加工中用作流变学改性剂(rheology modifier)，但这类水胶体成分当暴露于胶凝条件时可能不会使这样的组合物形成凝胶。

一般地，凝胶形成水胶体是公知的。凝胶形成水胶体成分通常为多糖或蛋白质。优选凝胶形成成分包括非乳品凝胶形成水胶体成分。

如本文中所使用的，非乳品凝胶形成水胶体成分为可与乳品凝胶形成水胶体区别的凝胶形成水胶体成分。如本文中所使用的，乳品凝胶形成水胶体成分是指在乳中天然发现的一些物质，所述物质可引起乳品组合物在适当的条件下形成凝胶。例如，乳可包括酪蛋白和/或乳清蛋白。此类蛋白质当暴露于适当的条件例如pH、离子浓度、温度、这些条件的组合等时促成乳品组合物的轻微凝胶形成。例如，发酵过程中产生的酸可引起酪蛋白胶束离解和聚集。在加热过程中，可使乳清蛋白变性，变成不溶性的并且倾向于引起胶凝化。热变性的乳清蛋白还可与酪蛋白相互作用以进一步在一些乳制品中胶凝化。此类乳蛋白质可被分类为乳品凝胶形成水胶体。

用于本发明的示例性非乳品凝胶形成水胶体成分可包括明胶、琼脂、藻酸盐、角叉菜胶、果胶、淀粉、黄原胶(xanthan)/刺槐豆胶混合物(locust bean gum blend)、结冷胶(gellan gum)、魔芋胶(konjac gum)、这类胶的组合等。应指出，一些凝胶形成水胶体成分(例如，淀粉)可具有可影响其它水胶体的凝胶形成能力的结构修饰。

有用的稳定剂和增稠剂的实例为例如淀粉、明交、果胶、琼脂、角叉菜胶、结冷胶、黄原胶、羧甲基纤维素(CMC)、海藻酸钠、羟丙基甲基纤维素及其混合物。在一些实施方案中，乳品基质可包含牛、猪或鱼类明胶。可使用在约200至约250凝胶强度（bloom strength）的范围内的牛明胶；而且，在约220至约230凝胶强度范围内的B型牛明胶也是合适的。

当被包括时，可以以足以给乳品基质提供期望的粘度的量包括稳定剂或增稠剂，以便可在本发明的组合物的配制过程中通过设备加工(例如，抽吸)乳品基质。当在20℃(68℉)下测量时，包含稳定剂和/或增稠剂的乳品基质具有基于乳品基质的总重量在约1至约1000 厘泊(cP)的范围内，优选在约10至约1000 cP的范围内的粘度。

乳品基质还可包括以足以减少乳品基质中蛋白质内容物的过早沉淀(premature precipitation)的发生的量包含钙多价螯合剂。过早蛋白质沉淀意指在加热(例如，巴氏消毒)或冷却步骤过程中任何蛋白质的凝固作用。期望乳制品的增稠在热处理后例如在发酵步骤过程中发生。

示例性可溶性钙多价螯合剂包括但不限于柠檬酸钠或柠檬酸钾(例如，柠檬酸三钠)、磷酸钠或磷酸钾、醋酸钠或醋酸钾、酒石酸钠或酒石酸钾、苹果酸钠或苹果酸钾、延胡索酸钠或延胡索酸钾、己二酸钠或己二酸钾、抗坏血酸钠或抗坏血酸钾及其混合。当存在约0.025%至约0.15%的多价螯合剂时，获得良好结果。

可将在制备用于消费的发酵乳制品中有用的任何细菌培养物与乳品基质组合物一起使用。此类细菌培养物是活的和具有活性的并且是公知的。示例性细菌培养物可包括适合用于乳酸发酵的任何微生物例如乳杆菌属物种(Lactobacillus sp)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、这类细菌的组合等。更具体地，细菌培养物可包括德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus)、嗜热链球菌、唾液乳杆菌嗜热亚种(Streptococcus salivarius ssp thermophilus)、乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、乳酸双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、双歧双歧杆菌(Bifodobacterium bifidus)、乳脂链球菌(Lactococcus cremoris)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌二乙酰亚种(Lactococcus lactis ss diacetylactis)、这些细菌的组合等。

对于术语“细菌培养物”存在多个同义词。这些同义词包括例如活的培养物、活性培养物、活的且活性培养物(live and active culture)、起子培养物等。

在代表性实施方案中，本发明的方法包括短暂施加跨越用乳品发酵培养物接种的乳品基质的相对强的电场。一般地，电脉冲各个具有约0.01微秒至约100毫秒，优选约1微秒至约10毫秒的持续时间，强度为约10 V/m至约100,000,000 V/m，优选强度为约1,000 V/m至约10,000,000 V/m。在一个实施方案中，使用该相对强的电场对乳品基质脉冲约3至12次，优选约4至10次。

在另一个实施方案中，本发明包括以相对更弱的电场以方波、正弦波或指数式衰减波形施加更长的脉冲。在本实施方案中，电场具有约0.001 V/m至约1 V/m，优选约0.01 V/m至约0.2 V/m的强度，频率为约0.1个循环/秒至约1000个循环/秒，优选约30个循环/秒至100个循环/秒。每一个脉冲的持续时间可在长度上短至1秒至长至发酵的长度。如果应用短持续时间的脉冲，则可以以脉冲之间持续至少1秒至10小时的有规律的或无规律的间隔使用它们。此外，可使用多个脉冲和间隔。优选实施方案是使用5个有规律地间隔1小时以上持续3分钟的脉冲。

在本发明的任何实施方案中，以这样的量和强度提供跨越乳品基质的电场的施加，以便形成用于乳品基质组合物中的分子获得进入乳酸细菌的孔。

在其优选实施方案中，在发酵期间施加数个脉冲。在另一个实施方案中，在活性发酵期间的前半段进行脉冲。在理想优选实施方案中，可在接种后立即施加脉冲。在本发明的实施方案中，在接种的1小时、30分钟或10分钟以内进行脉冲。这些早期施加为进一步的生长加速提供了希望，并且因为通常已知细胞生长为指数性的，因此电场的早期施加为所述努力提供了最大益处。将近发酵结束时的电脉冲的应用已显示减小的作用，但在一种乳品发酵培养物仍然可利用刺激的情况下可以仍然有用。在一个实施方案中，进行脉冲直至接种的乳品基质组合物达到约4.5的pH。

在起始时，所述方法使用诱导期。在诱导期的一个实施方案中，将初始预定量的乳品基质和细菌培养物的初始供给加入搅拌式发酵容器。优选尽可能快地将乳品基质的初始供给加入发酵容器。然后混合乳品基质和细菌培养物直至乳品发酵培养物已被均匀地分配在整个乳品基质中。达到该点的时间可因产品而变化并且将取决于这些情况如乳品基质的配制、添加的乳品发酵培养物的量、发酵容器的操作重量、搅拌器和/或叶轮的设计、中断流动的挡板或其它内部结构的存在以及终产物中期望的发酵程度。常见停留时间可从30分钟至2小时变化。如合适地，可使用更短或更长的的初始停留时间。

在实施方案中，所述方法是连续的方法。在另一个实施方案中，通过在任何给定的时间上暴露于电脉冲只对一部分接种的乳品基质组合物进行处理。任选地，接种的乳品基质组合物在发酵容器中，并且其一部分被抽吸通过电极结构用于暴露于电脉冲，然后再返回发酵容器。

在另一个实施方案中，该应用利用两种最流行的乳品发酵培养物德氏乳杆菌保加利亚亚种与嗜热链球菌之间的已知相互作用。已良好地记录在乳品基质中同时具有两个物种一起增强了两种培养物的生长。本领域技术人员熟悉的其它实验已证明该关系。已显示德氏乳杆菌保加利亚亚种通过释放蛋白水解酶刺激嗜热链球菌的生长，所述蛋白水解酶在乳品基质中产生可用氨基酸，最值得注意地(但不限于)缬氨酸和组氨酸。该关系得到嗜热链球菌互给（reciprocated），所述嗜热链球菌产生简单有机分子，最值得注意地(但不限于)甲酸和二氧化碳，已显示所述有机分子刺激德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长。

还已证明这些氨基酸被嗜热链球菌的吸收受到可获得的代谢能量限制。因此，本发明提供了绕开能量限制转运蛋白并且允许这些氨基酸直接进入细胞溶胶的方法。

在本发明的优选实施方案中，细胞培养物的初始接种为仅将细菌培养物引入发酵容器。有利地，在本实施方案中，加速乳品发酵培养物的生长，从而避免添加额外乳品发酵培养物的需要。任选地，可在发酵过程中可因各种原因添加额外的乳品发酵培养物。

在发酵过程中，原位监控进展。在优选实施方案中，通过使用在线仪器进行测量。测量可以是连续的、周期性的或间歇性的。然而，因为电场的应用可中断操作即“fry”在线仪器，因此用户在进行电场脉冲期间具有移走在线仪器的选择。可选择地，可在进行电场脉冲期间使用离线仪器监控发酵的进展。

搅拌和未搅拌的发酵也可通过使用两阶段方法来进行，所述方法在每一个步骤中使用不同的发酵温度。当将菌株的混合物用于包含乳品发酵培养物时，这是特别有用的。已发现通过使用该多温度法，可定制所述方法以使用最适合于每一种使用的微生物的温度。这使发酵法的效率最大化。

通常，该方法使用其中第一步骤优选使用更低或最低发酵温育并且每一个相继步骤使用更高的发酵温度的序贯方法（sequential approach）。可选择地，多温度法可包括在每一个不同温度下同时发酵一部分乳品基质，然后在单个容器中混合发酵的乳品基质。

取决于温度、固体含量、成分例如甜味剂、防腐剂、稳定剂等以及添加的培养物的量，诱导期可花费约30至90分钟。优选地，诱导期花费40至60分钟。最终发酵通常花费约3至约14个小时。在一些实施方案中，在约37℃至约 49℃(约100℉至约120℉)的范围内的温度下进行发酵，持续约5小时。

具体的靶和最终发酵终点可适当地变化。通常，靶粘度在约5至10,000厘泊(cP)，优选约10至1,000 cP的范围内，如在25 ℃使用具有5号轴的Brookfield粘度计以10 rpm进行25秒测量的。在该范围内的产物的pH通常分别在6.8与5.0之间，或更具体地通常在5.9与5.5之间。发酵乳品基质的终点或最终粘度范围通常为约5,000至70,000 cP，优选约10,000至30,000 cP，如上所述测量的。通常发现这些粘度与约5.5至约4.3，或具体地约5.2至约4.5的终点pH范围相关。最终或终点粘度通常比靶粘度更大。如此制备的终发酵乳品基质可展示通常大于约1x10⁶个菌落形成单位/克(cfu/克) 至约1x10¹⁰ cfu/克的培养物计数。

上述给定的靶和最终粘度仅代表有用的粘度。本领域技术人员将理解，确切的粘度可基于这类因素如培养物选择、噬菌体、制剂、制剂的总固体含量、形式等而随产品的不同而变化。

为了减少总发酵时间，期望在所述方法的发酵阶段的晚期以至少10:1的比例分别维持嗜热链球菌浓度(以CFU/gm测量的)与德氏乳杆菌保加利亚亚种浓度。优选使嗜热链球菌相比较德氏乳杆菌保加利亚亚种浓度以100:1至10,000:1的比例存在。然而，取决于发酵的持续时间、处理的条件、起始物质的性质的微小差异和起子培养物的健康和状况的变化，细菌菌株可共生地努力达到1:1的比例。为了增强使用的电场的功效，可能必需的是： a)通过直接增加它们的浓度引入更多嗜热链球菌；b)以有效地增强嗜热链球菌的生长的量添加缬氨酸、亮氨酸、组氨酸、谷氨酸、色氨酸、包含前述氨基酸的肽和/或其它补充剂的组合；c)使发酵容器的温度降至有效地增加嗜热链球菌的生长速率和/或降低德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长速率的水平；和/或 d)以有效地减少德氏乳杆菌保加利亚亚种的生长速率的量降低可溶性甲酸盐、丙酮酸盐、嘌呤、尿嘧啶、腺苷、鸟嘌呤、腺嘌呤、含有前述氨基酸的肽和/或二氧化碳的浓度。e)利用氧化还原电位改变溶解的气体如二氧化碳、氧化氮和/或分子氧的浓度，期望改变德氏乳杆菌保加利亚亚种和/或嗜热链球菌的代谢以获得期望的比例。f)在酸乳品基质中诱导缺氧或微好氧条件，所述条件激活可选择的代谢网络或改变德氏乳杆菌保加利亚亚种和/或嗜热链球菌的生长速率以获得期望的比例。g)引入攻击德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌株特异性噬菌体或其它病毒。h)包括限制生长速率或减少稳定亚群（stable subpopulations）(自主地或诱导的（automatically or induces）)的改良菌株。i)包括加速生长速率或改善高等亚群（higher subpopulations）(自主地或诱导的)的嗜热链球菌的改良菌株。

在将乳品基质发酵成期望的终点后，通过例如将发酵乳制品抽吸通过冷式热交换器(cooling heat exchanger)停止发酵过程。在该阶段，将发酵乳品基质充分冷却至细胞培养物不活跃地发酵乳品基质并从而不显著改变粘度时所处的温度。通常，可将发酵乳制品冷却至约10℃或约20℃或更低的温度。在某些实施方案中，可将发酵乳制品冷却至约4℃或更低(约40℉或更低)的温度。使发酵停止的温度可取决于选择的具体细菌培养物，并且可由本领域技术人员使用标准技术来容易地确定。

因此制备的发酵乳品基质可具有如下特征：约5,000 至约7,000 cP，或约10,000 cP至约30,000 cP(于4.4℃)的粘度。发酵乳品基质的特征还可在于具有一个或多个下列特征：约4.65至约4.75范围内的pH；约20,000 cP至约30,000 cP的范围内粘度；约5%至约40%，或约10%至约20%的范围内的固体含量；约0.3%至约6%，或约0.5%至约5%的范围内的乳脂%；和约0.01%至约50%的范围内的总乳固体含量。

任选地，通过本发明的方法制备的组合物还可包括多种佐剂材料来改良组合物的营养、感官性能、风味、颜色或其它性质。例如，发酵乳制品可额外地包含合成和/或天然调味料，和/或可将着色剂用于本发明的组合物。可按照本发明的教导使用可包含在发酵乳制品中的任何香料。同样地，还可按需要将香味材料和颗粒例如果类和果类提取物、坚果、小片(chip)等添加至发酵乳制品。可以以约0.01至约3%的范围内的量使用调味剂。可以以约0.01至0.2%的范围内的量使用着色剂(所有百分比基于发酵乳制品的总重量)。

任选地，可向乳品基质中加入营养物例如维生素。可包括通常包括在发酵乳制品中的任何维生素，例如维生素A、维生素D、维生素E、维生素C、叶酸、硫胺、核黄素、尼克酸、pyrixodine、氰钴维生素、生物素、泛酸、钙、磷、碘、铁、镁、锌、锰及其混合物。维生素至形式组合物的添加可使维生素(例如维生素A和维生素C)的热降解降至最低并且使可因巴氏消毒过程中维生素的丢失而引起的异杂味(off-flavors)减轻至最低。

当被包含时，果类（fruit）和果类提取物(例如，沙司（sauces）或果泥（purees）)可包含约1% 至约40%，优选约5%至约15%的发酵乳制品。可在添加第一和/或第二发酵乳品基质之前将果类组分与乳化剂混合，或按需要以分开的组分添加。

在瑞士型酸乳的制造中，可在发酵完成后但在包装之前将果类调味料（fruit flavoring）与发酵乳制品充分均匀混合。可使用静态混合器以最小剪力将果类组分混合入发酵乳制品。

在“sundae”型酸乳的制造中，可将果类调味料沉积在容器的底部，然后用发酵乳制品(例如，酸乳混合物)充满容器。为了利用搅拌型酸乳制备sundae型酸乳制品，利用添加的增稠剂和/或稳定剂制备乳品基质以在静止时提供模拟设置型酸乳的酸乳口感。在该变型中，在充满酸乳之前，将果类直接添加至容器，通常至底部。

果类调味料可以以沙司或果泥提供，并且可以是发酵乳制品中常用的多种常规果类调味料的任何一种。常见调味料包括草莓、木莓(raspberry)、蓝莓、草莓-香蕉、波森莓、樱桃-香草、桃子、菠萝、柠檬、柑橘和苹果。通常，果类调味料包括果脯(fruit preserves)和果类或果泥(fruit puree)，具有甜味剂、淀粉、稳定剂、天然和/或人造香料、着色剂、防腐剂、水和柠檬酸或控制pH的其它适当的酸的任何组合。可向果类中添加少量钙以控制通常由可溶性钙材料例如氯化钙提供的果类制剂的期望的质感（texture）。常用的少量可以少于50 mg钙/226 g一份。

如果向形式组合物（the style composition）中加入阿司帕坦（aspartame），可将所有或部分阿司帕坦与果类调味料预混合。

充气

任选地，当期望的制品为充气酸乳制品或发酵奶油冻（mousse）时，可将发酵乳制品与气体混合。在一个这样的实施方案中，将发酵乳制品与氮气混合。可按照任何常规方法将气体充入发酵乳制品。例如，可在发酵乳制品流过管或容器进入混合室时，使气体加压通过小孔进入发酵乳制品，在混合室中发生均匀分布。可使用任何常规无毒性、无臭无味气体例如空气、氮气、氧化亚氮、二氧化碳及其混合物。

根据本发明的一些实施方案，可给发酵乳制品充气或搅动（whipped）发酵乳制品，同时维持在期望的温度范围内。通常，可以以约1.1 g/cc的天然密度至约0.56 g/cc-约0.9 g/cc的范围内，或约0.7 g/cc-约0.8 g/cc的范围内的密度给发酵乳制品充气。本领域技术人员可选择商购可得的充气器/混合器用于本文中的用途。根据本发明概念的一个适当的充气器是可从荷兰Tanis Food Tec获得的Tanis Rotoplus 250充气器。Tanis Rotoplus充气器由通过正排量泵(positive displacement pump)和空气流动系统进料的混合室组成。产品流由泵束调节器控制，气流由流量计调节器控制。定子和转子上的相互啮合的齿轮的不锈钢同心排列（concentric rows）产生混合物的均匀性和一致性。可在围绕混合室的夹套中使用冷却剂例如乙二醇以在充气期间将优选恒定温育维持在约4℃至约30℃，或约4℃至约15℃的范围内，或约4℃至约7℃的范围内。

可在混合器中维持约15 psi至约30 psi的范围内的压力以帮助形成气室。可将充气的发酵乳制品逐渐从这些压力转移至大气压；压力的逐渐变化减少了气室坍塌（collapse）。

发酵乳制品对气体的比例可在约3:1至约1:1的范围内，或在约 2:1的范围内。

在充气过程中，重要地控制温度以允许大而可见的气室更容易地形成。将温度维持在上文中确定的范围内对于控制产品的终密度是重要的，产品的终密度反过来对于大而可见的气室的快速形成和在延长贮存时使气室坍塌减少至最低程度可以是重要的。应理解，期望的大而可见的气室在24至48小时形成，其中搅动和充填温度在上述温度范围内。

需要时，可随后将充气发酵乳制品(包括任何添加的调味料组分)转移至储存箱（holding tank），并且保持期望量的时间。在一些实施方案中，例如，可期望在储存箱中保留充气的发酵乳制品，持续约5至约15分钟的范围内的时间段。

随后可以以用于处理和贮存目的的方式包装充气的发酵乳制品。将充气的发酵乳制品装入用于酸乳制品的常规容器，例如压膜纸或塑料杯或由柔性薄膜包装原料制造的管。装填后，给填充的容器加盖或其它密闭或密封工具，装入盒子，并进入冷冻贮存以待分配和销售。在一些实施方案中，酸乳制品中的气室可在装填后约24至48小时内达到可见尺寸，这样的尺寸在约 130至约3,000 μm的范围内。装封后约24至48小时，充气的乳制品混合物可达到约52,000 cP至约55,000 cP的粘度。

在一些实施方案中，在用于乳品基质之前，除了标准匀化和/或巴氏消毒外，可发酵乳制品成分不需要任何处理(例如，本发明概念不需要预处理可发酵的乳品成分以除去这类材料如矿物质、蛋白质或任何其它类似物质)。

任选地，本发明的方法可包括从第一乳品基质除去水以允许在组分例如甜味剂的发酵后添加中向发酵乳品基质中添加水。

通常通过加热进行有效地形成巴氏消毒的或热处理的乳品基质的时间和温度来对乳品基质进行巴氏消毒。众所周知，可将乳品基质加热至较低温度进行延长的时间(例如，190℉/88℃，进行30分钟)或可选择地加热至更高的温度进行更短的时间(例如，203℉/95℃，进行约38秒)。还可利用进行中间时间的中间温度，如本领域已知的。如果有效且经济，可实施其它巴氏消毒技术或甚至灭菌(例如光脉冲、超高温、超高压等)。

通常在常规匀化器中匀化巴氏消毒的乳品基质以均匀分散添加的材料和由不同成分提供的脂肪组分。需要时，可在匀化前温热被巴氏消毒的乳品基质，从约40℉(约5℃)的常见乳贮存温度至150℉至约170℉(约65℃至约75℃)，优选约163℉(约73℃)的温度。在一些实施方案中，在两阶段匀化器(two-stage homogenizer)中进行匀化，在第一阶段使用约1000 psi(约6900kPa)的靶压力，在第二阶段使用约500 psi(约3450kPa)的靶压力。在某些商业实践中，可颠倒匀化与巴氏消毒步骤的顺序。

随后将巴氏消毒的和匀化的乳品基质达到温育温度，通常在约104ºF至约115ºF(约40℃至约46℃)的范围内。当使用加热巴氏消毒时，在巴氏消毒后可使用其中将匀化且巴氏消毒的乳品基质混合物冷却至期望的温育温度的冷却步骤。冷却的巴氏消毒且匀化的乳品基质可被表征为具有在约5至约40,000 cP，优选约10至约5000 cP的范围内的粘度。

本发明的另一个方面是将活细菌用作封装装置，以用作可被发酵乳品基质中的试剂降解的补充剂或营养制品的载体。一些可能的降解机制(但不限下列列表)为：低pH、光化学显影反应、光衍生氧化和可获得的螯合剂。通常几个因素可有助于降解化合物。在另一个方面，期望避免与补充剂或营养制品相关的令人不快的感官察觉的（organoleptic）事件。本发明通过将补充剂或营养制品引入在细菌内部来防止这类降解和/或令人不快的感官察觉的事件。然而不希望受理论束缚，认为将这些添加剂置于细菌内部保护了添加剂免受与其它成分的不利相互作用或对消费者的感官察觉感受器(organoleptic receptor)的过早暴露。

此外，本发明的方面可用于包括补充剂或营养制品，所述补充剂或营养制品在于发酵乳品基质内产生的条件下具有低可溶性或无可溶性。敏感性补充剂和营养制品的实例包括但不限于维生素A、类葫萝卜素、维生素D、植物甾醇（phytosterol）(植物固醇（plant sterols）)、维生素E(生育酚家族)、叶绿醌(包括维生素K₁)、甲萘醌(包括维生素K₂)、抗坏血酸、硫胺、核黄素(包括维生素B₂)、泛醇、泛酸钙、辅酶A、尼克酸（niacin）、烟酸、维生素B₁₂、维生素B₆、叶酸化物（folates）(包括叶酸)、辅酶Q₁₀、合成寡肽、天然生物活性肽、血管紧张素转化酶(angiotensisin converting enzyme)、保钾利尿剂、保钙利尿剂、渗透性利尿剂(osmotic based diuretics)、袢利尿剂（loop diuretics）、一般性抗高血压药、

吨、噻嗪、酪激肽、lactokinins、硫酸亚铁、莫尔盐、缀合的亚油酸、二十二碳六烯酸、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、亚油酸、多不饱和脂肪酸、钙盐、阿司帕坦、蔗糖素（sucralose）、糖精、乙酰氨基磺酸钾、阿力甜、纽甜、甜味蛋白（brazzein）、curclin、赤藓醇、甘油、异麦芽酮糖醇（isomalt）、菊粉、甘露醇、改味糖蛋白（miraculin）、莫尼糖蛋白（monellin）、山梨醇、蜜叶糖、塔盖糖、索马汀、木糖醇及其混合物。

本发明概念的方面现将参考下列非限定性实施例来进行描述。

实施例 #1

按照表中的重量百分比混合包含水、脱脂干乳粉、结晶糖、奶油、淀粉和明胶的常见酸乳基质(yogurt base)。

表1 实施例#1中常见酸乳基质的配方

匀化和巴氏消毒

在于500psi，然后于400psi下的两个阶段中匀化混合物。随后，以17.8lbs/分钟的速率将酸乳基质在93.3℃下巴氏消毒20秒。如果需要，可包括将乳品基质在85℃保持25分钟的额外步骤以降解乳蛋白质。在巴氏消毒后，将酸乳基质冷却至110℉，将2L转移入玻璃发酵容器(Omniculture台式发酵罐, The VirTis Company, Gardiner, NY, USA)。

发酵条件

通过夹套内水浴将发酵容器维持在110℉。为了开始发酵，向容器中加入按重量计0.02%的冷冻干燥的以1:1的比例包含嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种的酸乳起子培养物(Danisco A/S, Copenhagen, Denmark)。用内部叶轮以120 rpm搅拌酸乳基质5分钟以分散冷冻干燥的培养物。利用Metrohm 691 pH计和PT1001B12探针(Metrohm, Herisau, Switzerland)离线测量pH。酸乳基质的初始pH为6.5。

电通透作用（Electropermeabilization）变型1

发酵容器配备有从发酵罐的顶板(head plate)延伸至接种的乳品基质内的两个电极。将电极的头与Agilent脉冲发生器8111A(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)连接。对发酵乳品基质施加5个约10 ms的脉冲，场强为200,000 V/m，60个循环/秒。脉冲之间的时间长度为1分钟。将不具有电极但包含来自相同批次的乳品基质和来自相同批次的起子培养物的备用容器（spare vessel）用作对照。

发酵的跟踪和结论

使用以有规律的15分钟间隔从pH探针获取的离线pH测量来跟踪发酵的进展。在这些条件下在实验重复中发现电通透的培养物达到4.5的靶pH比对照快约15-20% 。在发酵结束时，从发酵容器取出样品，快速冷冻至 40℉。对细胞进行计数，比较终产品之间的细胞计数。电通透处理导致当与对照相比较时嗜热链球菌略微更高的细胞计数。德氏乳杆菌保加利亚亚种计数与对照菌株无显著差别。

电通透作用变型2

使用与变型1中的设备相同的设备。对发酵乳品基质施加脉冲1分钟，场强为200,000 V/m，60个循环/秒。脉冲之间的长度为15分钟。该过程持续发酵的持续时间。将不具有电极但包含来自相同批次的乳品基质和来自相同批次的起子培养物的备用容器用作对照。

发酵的跟踪和结论

使用以有规律的15分钟间隔从pH探针获取的离线pH测量来跟踪发酵的进展。在这些条件下在实验重复中发现电通透的培养物达到4.5的靶pH比对照快约15% 。在发酵结束时，从发酵容器取出样品，快速冷冻至 40℉。对细胞进行计数，比较终产品之间的细胞计数。电通透处理导致当与对照相比较时嗜热链球菌略微更高的细胞计数。德氏乳杆菌保加利亚亚种计数与对照菌株无显著差异。

本文中引用的所有专利、专利申请(包括临时申请)和公布通过引用并入，就如同为了所有目的单个地并入一样。除非另外指出，否则所有部分和百分比均按重量计算并且所有分子量为重均分子量。上述详细描述仅为了清晰地理解而给出。从其没有理解出不必要的限制。本发明不限于显示和描述的确切内容，因为对于本领域技术人员来说是显然的变化将包括在权利要求定义的本发明内。

Claims (24)

1.用于制备乳品发酵产品的方法，包括：

a) 提供乳品基质组合物;

b) 将乳酸细菌接种入乳品基质组合物并且起始发酵;

c) 提供电极直接与接种的乳品基质组合物接触;

d) 以足够高以在乳酸细菌中形成孔以允许乳品基质组合物中的分子获得进入乳酸细菌和足够低以使乳酸细菌保持活力以进行发酵的电场强度使用电极产生至少一个电脉冲。

2.权利要求1的方法，其中所述电脉冲各个具有约0.01微秒至约100毫秒的持续时间，强度为约10 V/m至约100,000,000 V/m，并且所述接种的乳品基质被脉冲约3至约12次。

3.权利要求1的方法，其中所述电脉冲各个具有约1微秒至约10毫秒的持续时间，强度为约1,000 V/m至约10,000,000 V/m，并且所述接种的乳品基质被脉冲约4至约10次。

4.权利要求1的方法，其中所述电脉冲各个具有约0.001 V/m至约1 V/m的强度，并且频率为约0.1个循环/秒至约1000个循环/秒。

5.权利要求1的方法，其中所述电脉冲各个具有约0.01 V/m至约0.2 V/m的强度，并且频率为约30个循环/秒至100个循环/秒。

6.权利要求1的方法，其中所述乳酸细菌为乳杆菌属物种、链球菌属物种及其组合的混合物。

7.权利要求1的方法，其中乳酸细菌选自德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌、唾液乳杆菌嗜热亚种、乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸双歧杆菌、双歧双歧杆菌、乳脂链球菌、乳酸乳球菌、乳酸乳球菌二乙酰亚种及其组合。

8.权利要求1的方法，其中乳酸细菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种和嗜热链球菌。

9.权利要求8的方法，其中在发酵过程完成时嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种的浓度比为至少10:1。

10.权利要求8的方法，其中在发酵过程完成时嗜热链球菌与德氏乳杆菌保加利亚亚种的浓度比为约100:1至约10,000:1。

11.权利要求1的方法，其中细菌培养物的初始接种为仅将乳酸细菌引入乳品基质组合物。

12.权利要求1的方法，其中在活性发酵期间进行脉冲。

13.权利要求1的方法，其中在活性发酵期间的前半段进行脉冲。

14.权利要求1的方法，其中在接种的30分钟内进行脉冲。

15.权利要求1的方法，其中在接种的10分钟内进行脉冲。

16.权利要求1的方法，其中进行脉冲持续约1至约15分钟的时间段。

17.权利要求1的方法，其中进行脉冲直至接种的乳品基质组合物达到约4.5的pH。

18.权利要求1的方法，其中所述方法是连续的方法。

19.权利要求1的方法，其中仅一部分接种的乳品基质组合物通过在任何给定的时间暴露于电脉冲来处理。

20.权利要求19的方法，其中所述接种的乳品基质组合物在发酵容器中，并且其一部分被抽吸通过电极结构用于暴露于电脉冲，然后再返回发酵容器。

21.权利要求1的方法，其中所述乳品发酵产品为酸乳。

22.权利要求1的方法，其中获得进入乳酸细菌的分子为营养物。

23.权利要求22的方法，其中接种的乳品基质组合物的发酵时间比未暴露于电脉冲的同样组合物缩短至少10%。

24.权利要求1的方法，其中获得进入乳酸细菌的分子为营养制品。