CN102586330B

CN102586330B - 神经酰胺产生促进剂的制造方法

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Publication number: CN102586330B
Application number: CN201110023670.1A
Authority: CN
Inventors: 孔凡旗
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2011-01-14
Filing date: 2011-01-14
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2031-01-14
Also published as: CN102586330A

Abstract

本发明提供一种神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。根据本发明的制造方法，能够利用容易获得的物质作为培养基并利用特定的微生物，来廉价而高效地获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

Description

神经酰胺产生促进剂的制造方法

技术领域

本发明涉及能够促进皮肤产生神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法。

背景技术

皮肤具有产生神经酰胺(ceramide)和葡萄糖神经酰胺(glucosylceramide)的能力。在皮肤中、特别是表皮角质层中聚集着由表皮细胞合成分泌得到的神经酰胺，它是细胞间脂质的主要成分。而由表皮细胞合成得到的神经酰胺暂时以葡萄糖神经酰胺或者神经鞘磷脂(sphingomyelin)的形式被储存起来；之后被排出至细胞外，在葡糖脑苷酯酶(glucocerebrosidase)和神经磷脂酶(sphingomyelinase)的作用下，再次形成神经酰胺，从而发挥作为细胞间脂质的功能。皮肤中的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺具有提高皮肤的保湿功能和皮肤的屏障功能等的生理作用。

但是，近来由于环境、气候等的影响，皮肤容易变得干燥，因此由皮肤自身产生神经酰胺等来改善皮肤的保湿功能就显得不足够。

因而人们尝试了从外部向皮肤补充神经酰胺的方法。例如，在专利文献1中记载了培养假丝酵母(Candida)属的微生物来制造葡萄糖神经酰胺的方法，通过将该葡萄糖神经酰胺涂布在人体的干燥性皮肤上能够改善皮肤的保湿功能。该方法是直接从培养后的菌体中获取大量存在的葡萄糖神经酰胺，因此所合成的葡萄糖神经酰胺的神经酰胺骨架与人体中存在的神经酰胺类的神经酰胺骨架不同，其在两处具有碳碳双键且具有支链。因此，将这种从微生物中直接提取得到的葡萄糖神经酰胺涂布在人体皮肤上的话，有可能不能与人体皮肤相适应而产生使用安全性方面的问题。

另外，专利文献6中报道了从芽孢杆菌属的醋酸菌中获得醋酸菌型神经酰胺的方法。但这种方法所获得的神经酰胺也存在上述的不能与人体皮肤相适应的问题。并且这样的方法需要从菌体中进行提取来获得神经酰胺等的操作，工序复杂且成本高。

另外，从外部向皮肤补充神经酰胺的方法与以往使用的保湿剂等同样有保湿效果的持续性不够的问题，而且有些状态的皮肤对从外界补给的神经酰胺等的吸收不充分，从而导致不能充分发挥保湿效果。

而另一方面，如果能够增强或促进皮肤本身的神经酰胺或葡萄糖神经酰胺的产生能力，则无需从外部补充神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，而能够通过促进皮肤自身产生神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺来提高皮肤的屏障功能和保湿功能。这样，由于是由皮肤自身产生神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，所合成的是皮肤所具有的常规结构的神经酰胺等，因而其不存在与皮肤的适应性不好等的安全性问题。

因此最近关于在皮肤角质层中产生促进表皮神经酰胺等的生成的物质的研究相当热门。其中，作为能够促进神经酰胺生成的物质，已报道的有以灵芝、蜂花粉(Bee Pollen)、川芎等的提取物为有效成分的神经酰胺产生促进剂(专利文献2～4)。然而，由于这些神经酰胺产生促进剂全都是从植物原料提取得到，其提取操作耗费时间长，且在天然资源的可利用性方面有限制，因而其制造成本高。

另外，在专利文献5中，公开了一种能够活化皮肤表层内部的表皮细胞自身的神经酰胺合成的神经酰胺合成促进剂，其以含有烟酸和/或烟酰胺的菌培养物为有效成分，该菌培养物可以是乳酸菌培养物、双歧杆菌培养物、香菇菌体培养物或者酵母菌培养物。但是，该促进剂的制备过程中使用的培养基实质上以烟酸和/或烟酰胺作为有效成分，因此这种神经酰胺合成促进剂的制备成本较高。

另外，芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物普遍地存在于水中以及泥土中。其中也有很多菌种甚至适应高pH、低温、高盐浓度、高压等的各种各样的极限环境。芽孢杆菌属(Bacillus)中包括以枯草芽孢杆菌为代表的多种非常有用的菌种，它们可被用于生产各种酶(食品用酶、洗涤剂用酶以及其它多种多样的工业用酶)等用途。

但是，目前还没有利用芽孢杆菌属细菌来制备神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的报道。

专利文献1：日本特开2010-22217号公报

专利文献2：日本特开2005-194240号公报

专利文献3：日本特开2010-70499号公报

专利文献4：日本特开2010-150237号公报

专利文献5：日本特开平9-194383号公报

专利文献6：日本特开2006-345796号公报

发明内容

本发明就是为了解决上述现有技术中存在的技术问题而做出的，目的在于提供一种低成本且高效地制造神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的方法。

本发明人为了解决上述技术问题进行了专心研究，结果发现：在含有豆渣和糖类的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，能够高效地获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂；从而完成了本发明。

本发明提供一种神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，在含有豆渣和糖类的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

根据本发明的制造方法，能够使用特定的微生物并利用豆渣这样的容易获得的物质作为培养基的主要原料，从而能够廉价且高效地获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，该促进剂能够有效提高皮肤所具有的产生神经酰胺/葡萄糖神经酰胺的能力，从而有效提高皮肤的保湿能力。

具体实施方式

本发明的制造方法是在含有豆渣和糖类的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，并从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

作为在本发明中使用的芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，可以列举出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、酸居芽孢杆菌(Bacillusacidicola)、吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、扩散芽孢杆菌(Bacillus diffusus)、球芽孢杆菌(Bacillus globigii)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、蕈状芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、胶冻样芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)等。

其中，从所获得的产品具有更高的神经酰胺产生促进效果和/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，优选枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酸居芽孢杆菌(Bacillus acidicola)、吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

本发明所涉及的芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物都可以从中国普通微生物保藏管理中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)、中国高校工业微生物资源和信息中心(CICIM：Culture&Information Center of Industrial Microorganism of China Universities)等商业渠道购买得到。

在本发明的制造方法中，可以单独使用1种上述微生物，也可以组合2种以上的上述微生物进行使用。

本发明中使用的培养基是含有豆渣和糖类的培养基。豆渣和糖类都是容易获得的物质，因而，本发明的培养基具有成本低的优点。并且，除此之外，也可以适当添加例如1％的蛋白胨、0.5％的酵母粉等。

其中，豆渣是指，将大豆浸泡在水中使其充分吸收水分后粉碎、再经过滤、除水、沥干而得到的物质。也可以使用食品产业中压榨豆浆等的豆制品制造工序中残留的大豆残渣。

糖类可以是葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等，它们可以任意单独使用或混合使用。而从提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，其中优选葡萄糖。

从提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，本发明的培养基优选由豆渣、葡萄糖和水构成，进一步优选培养基中豆渣的含量为5～20w/v％、更优选8～12w/v％，葡萄糖的含量为0.2～2w/v％、更优选0.8～1.2w/v％。

从芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的生理特性、以及提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，优选在27～35℃下进行上述培养。

从芽孢杆菌属(Bacillus)微生物的生理特性、以及提高神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果的观点考虑，上述培养时间优选为1～7天，更优选为48～96小时，更优选为68～76小时。

从得到更纯的产品的观点出发，优选将通过所述培养获得的培养物进一步进行精制从而得到上清液。作为精制的方法，可以根据需要适当组合使用过滤、离心分离、离子交换或吸附色谱、溶剂提取、结晶化等的常用的操作来进行。优选通过离心分离获得上清液，该离心分离的速度优选为2000～4000rpm、更优选为2500～3500rpm，离心时间优选为0～20分钟，更优选为5～15分钟。

可以在离心后获得的上述上清液中加入乙醇，用来进行灭菌，并将加入了乙醇的上清液作为神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

也可以通过离心分离从培养液中除去菌体，再超声波处理，离心分离，回收上清液。接着，再将回收后的上清液过滤除去杂质等，真空下干燥处理后作为本发明的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

通过培养本发明的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物并从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提取物，能够起到在正常人体的角化细胞中使神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的量增加的作用。

因此，通过培养本发明的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物而从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提取物，可以用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生的治疗目的或非治疗目的的使用，也可以作为治疗目的或非治疗目的的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。非治疗目的的使用是以美容为目的的使用，或为维持健康状态的使用等。并且，所述治疗目的的使用和非治疗目的的使用是可以完全区分地进行的。

通过培养本发明的芽孢杆菌属(Bacillus)微生物而从培养上清液中得到的大豆残渣发酵提取物，也可以用于制造神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂可以作为使角质层中的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺增加并恢复和提高皮肤的屏障功能和保湿功能的医药品、准医药品、化妆品等使用。另外，本发明的神经酰胺产生促进剂或葡萄糖神经酰胺产生促进剂也可以作为以神经酰胺产生促进或葡萄糖神经酰胺产生促进为概念的、并根据需要标明该概念的准医药品、化妆品使用。

作为本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的使用形态，可以是用于向培养细胞中添加的添加剂，也可以是配合到皮肤洗净剂、化妆品等皮肤外用剂中使用。例如，可以列举化妆水、乳液、凝胶、霜、软膏等各种形态。而作为外用剂的基剂，只要是公知的外用基剂即可，没有特别限制。在配制各种皮肤外用剂时，可以单独地使用本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，或与在皮肤洗净剂和化妆品等皮肤外用剂中通常配合的油性成分、保湿剂、粉体、色素、乳化剂、增溶剂、紫外线吸收剂、增稠剂、药效成分、香料、防菌防霉剂、植物提取物、醇类等适当组合来使用。

将本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂添加到培养的表皮细胞中来促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的情况下，作为该促进剂的干燥物的添加量优选为0.0001～10w/v％，更优选为0.001～5w/v％。当添加量为0.0001w/v％以上时，能得到充分的促进效果；而当添加量为10w/v％以下时，对表皮细胞的刺激性更小。

将本发明的神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂配合在皮肤外用剂使用时，从有效促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生、从而有效提高皮肤的保湿能力、而且不易显示出培养物的颜色和气味的观点出发，其配合量优选为皮肤外用剂总量的0.01～20w/v％，更优选为0.1～10w/v％。

实施例

下面，基于实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。

实施例1

<神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备>

首先，按照以下方法制备培养基：将大豆放入水中浸泡12小时，使大豆充分吸收水分，然后将吸收了水分的大豆研磨破碎，将其过滤并除去液体成分，剩余残渣沥干，得到豆渣。将该豆渣与葡萄糖以及水相混合，并使豆渣和葡萄糖在混合物中的浓度分别达到10w/v％和1w/v％，将该混合物作为培养基。

然后，将100ml的上述培养基加至三角烧瓶中，接种一定量的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1677)，在30℃下培养3天。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品A、B，将样品A、B分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

<神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的评价>

(细胞培养)

首先，取正常人的活化角质化细胞(Cascade Co.，Ltd)作为原代细胞，于75cm²培养瓶中(含有生长因子的培养基2ml)，37℃、CO₂浓度为5％的条件下培养细胞至80～90％浓度。进行传代，传代细胞至175cm²方瓶中继续培养细胞至80～90％浓度。然后将传代后的人体表皮细胞接种到12孔板中，每孔容积为2ml，细胞浓度为1×10⁵个细胞/ml，继续培养细胞至80～90％浓度。

然后，在上述12孔板中更换不含有生长因子的培养基，将样品A、B和对照品(浓度为50v/v％的乙醇水溶液)分别加入上述12孔板中(n＝2)，相同培养条件下培养3天。

3天培养后，弃去上清培养液，以2ml PBS(磷酸盐缓冲液)对细胞进行2次清洗，再加入1ml的PBS至板孔中，以细胞收集器(细胞铲)收集细胞至试管中，以备后续神经酰胺/葡萄糖神经酰胺和蛋白质分析。

(神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果的确认)

在回收得到的含有细胞的PBS溶液中加入甲醇∶氯仿＝2.5ml∶1.25ml的溶剂，进行振动20分钟，进行离心(3000rpm，5分钟)分离，从而得到上清液a和沉淀b。将上清液a用于神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量的分析，将沉淀b用于蛋白质含量的分析。

(1)神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量的分析

在由此得到的上清液a中加入PBS∶氯仿＝1.25ml∶1.25ml的溶剂，进行振动20分钟，进行离心(3000rpm，5分钟)分离，得到上下两相。回收下相，并在30℃、氮气保护下进行干燥40分钟。在得到的干燥品中加入100μl的氯仿∶甲醇＝2ml∶1ml的溶剂进行溶解，并用下述薄板层析(TLC)法对其进行神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量(分别记为Cer和GlyCer，单位为μg/ml)的解析。

将神经酰胺(或葡萄糖神经酰胺)标准品与样品溶液点至干燥TLC板上，以CHCl3∶CH3OH∶CH3COOH(190∶9∶1v/v/v)为展层剂进行薄板层析，待展层剂行至薄板顶端，以吹风机吹干展层剂；重复以上步骤一次。然后以CHCl3∶CH3OH∶C3H6O(76∶20∶4v/v/v)为展层剂进行薄板层析，待展层剂行至距薄板底端2.5cm处，停止展层，以吹风机吹干。喷以硫酸铜磷酸溶液，吹干，将层析板放置于180℃烘烤板上烘烤7分钟显色。扫描显色TLC板并进行神经酰胺(或葡萄糖神经酰胺)分析。

(2)蛋白质含量的分析

为了表征细胞中的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量，进行蛋白质含量分析。在上述沉淀b中加入90μl的SDS(十二烷基磺酸钠)溶液并进行混合，在60℃下加热2小时使蛋白质变性降解，冷却后在其中添加100μl的2N的HCl溶液，按照BCAKit(蛋白质定量分析试剂盒)法测定其中蛋白质的量(记为Pro，单位为μg/ml)。

(3)分析结果

对于本发明品和对照品的样品，分别测定Cer/Pro和GlyCer/Pro(见下式)。以对照品的Cer/Pro和GlyCer/Pro为1，在表1中表示本发明品的Cer/Pro和GlyCer/Pro的相对值。另外，以对照品每孔中的蛋白质的量为100，求出本发明品的每孔中的蛋白质的量的相对值(Pro.(％))，并据此求出每孔的神经酰胺和葡萄糖神经酰胺的量(相对于对照品的相对量)，即，Cer/Well＝Cer/Pro×Pro.(％)，GlyCer/Well＝GlyCer/Pro×Pro.(％)。一并表示在表1中。

如果Cer/Pro(或Cer/Well)大于1(对照品的值)，则表明该样品具有神经酰胺产生促进效果；如果GlyCer/Pro(或GlyCer/Well)大于1(对照品的值)，则表明该样品具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

如表1所示，确认了实施例1的样品A、B具有神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

实施例2

在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，作为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，使用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1923)，除此以外，与实施例1同样进行培养。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品C、D，将样品C、D分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

按照与实施例1同样的方法评价样品C、D的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表示在表1中。

如表1所示，确认了实施例2的样品C、D具有神经酰胺产生促进效果和葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

实施例3

在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，作为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，使用酸居芽孢杆菌(Bacillusacidicola)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1297)，除此以外，与实施例1同样进行培养。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，取1ml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品E，存于4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。

对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品F、G，将样品F、G分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

按照与实施例1同样的方法评价样品E、F、G的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表示在表1中。

如表1所示，确认了实施例3的样品E、G具有神经酰胺产生促进效果。

实施例4

在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，作为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，使用吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1171)，除此以外，与实施例1同样进行培养。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，取1ml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品H，存于4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。

对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品I、J，将样品I、J分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

按照与实施例1同样的方法评价样品H、I、J的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表示在表1中。

如表1所示，确认了实施例4的样品H、I、J具有神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

实施例5

在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，作为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，使用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1294)，除此以外，与实施例1同样进行培养。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，取1ml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品K，存于4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。

对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品L、M，将样品L、M分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

按照与实施例1同样的方法评价样品K、L、M的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表示在表1中。

如表1所示，确认了实施例5的样品K、L、M具有神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

实施例6

在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，作为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，使用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1282)，除此以外，与实施例1同样进行培养。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，取1ml混合液作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品N，存于4℃冰箱中以备用作细胞培养用添加物。

对上述无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品O、P，将样品O、P分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

按照与实施例1同样的方法评价样品N、O、P的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表示在表1中。

如表1所示，确认了实施例6的样品N、O、P具有神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

实施例7

在实施例1的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制备过程中，作为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，使用地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)(保藏于中国高校工业微生物资源和信息中心CICIM，编号CICIM B1298)，除此以外，与实施例1同样进行培养。

然后将所得到的培养物离心分离(3000rpm，10分钟)。剩余上清液加入2.5倍的无水乙醇稀释，对该无水乙醇稀释后的混合液进行超声处理10分钟，离心(3000rpm)30分钟，收集上清液(约70ml)，上清液以滤纸过滤得滤液，滤液于真空干燥机中干燥至恒重，将此干燥品作为本发明的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进剂的样品Q、R，将样品Q、R分别以50％乙醇溶解而配制成1％、0.1％浓度的溶液，存于4℃冰箱中作为细胞培养用添加物。

按照与实施例1同样的方法评价样品Q、R的神经酰胺/葡萄糖神经酰胺产生促进效果，结果一并表示在表1中。

如表1所示，确认了实施例7的样品Q、R具有葡萄糖神经酰胺产生促进效果。

表1

另外，对于样品A～R，不将其加入到上述含角质化细胞的12孔板中(即，不进行上述细胞培养)而直接进行神经酰胺/葡萄糖神经酰胺量的分析，除此以外的操作与上述实施例1同样进行。结果确认了样品A～R本身中没有神经酰胺或葡萄糖神经酰胺存在。

由此表明，虽然本发明品本身中不存在神经酰胺或葡萄糖神经酰胺，但本发明品具有促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生的效果，可以作为神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂使用。

Claims

1.一种神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

在含有豆渣和糖类的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，从其上清液中获得神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂，

所述芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酸居芽孢杆菌(Bacillus acidicola)、吉氏芽孢杆菌(Bacillusgibsonii)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。

2.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

所述糖类是葡萄糖。

3.如权利要求2所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

所述培养基由豆渣、葡萄糖和水构成。

4.如权利要求3所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

所述培养基中所述豆渣的含量为8～12w/v％，所述糖类的含量为0.8～1.2w/v％。

5.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

在27～35℃下进行所述培养。

6.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

所述培养时间为1～7天。

7.如权利要求1所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

将通过所述培养获得的培养物进行离心，从而得到所述上清液。

8.如权利要求7所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，其中，

在离心后获得的所述上清液中加入乙醇后，将其作为神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

9.如权利要求8所述的神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的制造方法，

其中，进一步对所述加入了乙醇后得到的物质通过超声波处理、离心分离、过滤、真空干燥处理进行精制后，得到神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂。

10.豆渣的发酵提取物用于促进神经酰胺和/或葡萄糖神经酰胺的产生的非治疗目的的用途，

所述豆渣的发酵提取物是在含有豆渣和糖类的培养基中培养芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物并从培养上清液中得到的，

11.豆渣的发酵提取物作为神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂的非治疗目的的用途，

12.豆渣的发酵提取物在制造神经酰胺产生促进剂和/或葡萄糖神经酰胺产生促进剂中的用途，