CN102585004B - 具有高亲和力的aeg-1/1e3单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，AEG-1/1E3mAb轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。该抗体可变区基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；AEG-1/1E单克隆抗体与AEG-1的亲和力高，能够特异性识别AEG-1并进行免疫反应；其腹水效价为1×10^-7。为研制和开发抗AEG-1基因工程抗体及诊断试剂提供支持。

Description

具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体，特别涉及具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。

背景技术

伴随人类基因组测序完成，我们更清醒地意识到，针对人类基因组中的三万多个功能基因，我们仅仅了解了极少数基因的基本功能和作用，而更多的、未知的新基因及其所编码蛋白所发挥的生理、病理作用仍有待人们深入发掘和探索，尤其是与恶性肿瘤发生、发展密切相关的各种新基因及其功能逐步被认识和阐明。星形胶质细胞上调基因1(AEG-1)，是一个新发现的、调控多种肿瘤细胞生物学表型的重要癌基因。自2002年发现并克隆此基因以来，该基因在恶性肿瘤发生、发展中的多重功能作用已经成为恶性肿瘤研究领域备受关注的热点之一。它通过调控NF-KB、PI3k/Akt、P44/42-ERK、P38-MAPK及Wnt等多种信号转导通路在肿瘤的发生、发展、转移、预后、耐药等各方面发挥重要的作用。Khuda等人报道，人的单核前体细胞受到LPS刺激并诱导AEG-1的上调是由NF-kB活性上调造成。但另一方面，AEG-1本身又可激活NF-kB表达，而且抑制AEG-1可以阻断LPS诱导的炎性细胞因子的产生，如TNF-a，PGE2等。这些发现提示AEG-1在细菌感染后发挥的免疫学作用可能与肿瘤炎性作用中的某些关键环节有关。此外，AEG-1目前研究的热点之一是关于其不同定位与功能之间的关系。研究报道，在乳腺癌、肝癌和黑色素瘤中AEG-1核转位预示预后不良，而在前列腺癌中，核染色的消失同时胞浆染色增强则提示疾病的进展。

AEG-1可变区抗体在上述问题的研究中是必不可少的工具，然而，目前国内外未见抗AEG-1可变区抗体制备的研究报道，这给AEG-1的深入研究带来诸多不便。此外，早期诊断、抗体治疗在疾病尤其是肿瘤性疾病中的应用也越来越受到研究者的关注。

Porter等对血清抗体的研究证明，免疫球蛋白分子的基本结构是由四条肽链组成，即由二条相同的分子量较小的肽链称轻链(L链)和二条相同的分子量较大的肽链称为重链(H链)组成的。轻链与重链以二硫键相连接而形成一个四肽链分子称为免疫球蛋白分子单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。免疫球蛋白单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端(N端)和羧基端(C端)，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FWR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区和轻链可变区折叠成相对独立的结构域，由一条亲水性的连接肽相连，从而形成和天然抗体中抗原结合位点相似的结构。重链可变区和轻链可变区的可变性是相对于轻链和重链的恒定区而言的，它们的氨基酸变化频率在不同的抗体中比较大，但就轻链或重链的可变区本身而言，它们的氨基酸变化率在不同的位置有明显的不同。对可变区的序列比较后发现，有的区域比较保守，在不同的抗体中大致相似，称它们为框架区。轻链和重链中都有四个框架区：FWR1，FWR2，FWR3和FWR4。另外一些区域，它们的变化率在不同的抗体中比较大，称它们为超变区，又因为它们与抗体的特异性有关，即与抗原相匹配，因而人们称它们为互补决定区(Complementary Determined Region，CDR)。轻链和重链都有三个超变区：CDR1，CDR2，CDR3。免疫球蛋白单体中恒定区(C区)可引发抗原抗体识别后的反应，抗体根据FWR/C区不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反应，这些免疫反应可引起宿主对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。

AEG-1在肿瘤的治疗、诊断以及预后判断中，均具有较为广阔的应用前景，为了更好地研究AEG-1在恶性肿瘤中的信号转导通路，以及为恶性肿瘤的诊断、生物治疗奠定物质基础，我们首先必须获得具有良好特异性、亲和力和中和活性的鼠源性亲本抗体。

发明内容

本发明解决的问题在于提供具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，包括其氨基酸和核苷酸序列，为构建高亲和力、具有中和活性的抗AEG-1嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

本发明是通过以下技术方案来实现：

具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，包括轻链和重链可变区，所述轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为：

CDR1：Ser Gln Ser Ile Val His Thr Asn Gly Asn Thr；

CDR2：Tyr Lys Val；

CDR3：Cys Phe Gln Gly Ser His Val；

所述重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为：

CDR1：Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp；

CDR2：Ile Phe Pro Gly Arg Gly Ser Thr；

CDR3：Thr Arg。

所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。

所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体用于构建针对AEG-1的基因工程抗体或诊断试剂的制备的应用。

所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体用于抗肿瘤药物的制备的应用。

所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体应用于抗宫颈癌或抗肺癌的药物的制备。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、目前国内外未见抗AEG-1可变区单克隆抗体制备的研究报道，本发明提供的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，是首次以AEG-1作为免疫原，获得针对该抗原的具有高亲和力的单克隆抗体AEG-1/1E3，该单克隆抗体与AEG-1的亲和力高，能够特异性识别AEG-1并进行免疫反应；其腹水效价为1×10^-7。

本发明所制备的单克隆抗体AEG-1/1E3能够特异性的识别肿瘤细胞(如宫颈癌HeLa细胞和肺癌A549细胞)所表达的AEG-1：Western Blot方法检测出AEG-1/1E3能够与肿瘤细胞裂解后的AEG-1识别并进行免疫结合；免疫组织化学法检测AEG-1/1E3单抗能够与A549细胞中所表达的AEG-1识别并进行免疫结合；这表明单克隆抗体AEG-1/1E3对AEG-1的特异性识别可以应用于抗肿瘤药物的制备。

2、本发明克隆抗AEG-1单克隆抗体AEG-1/1E3的轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。

3、分析获得轻链、重链可变区的CDR区，在此基础上为构建高亲和力、具有中和活性的抗AEG-1基因工程抗体提供支持。

附图说明

图1为利用western blot法检测杂交瘤细胞所分泌的单抗与肿瘤细胞裂解物的反应结果图；

图2为利用免疫组织化学法检测杂交瘤细胞所分泌的单抗与肺癌细胞A549中表达的AEG-1蛋白的结合结果图；

图3是AEG-1/1E3mAb轻链可变区基因同源性序列检测结果；

图4是AEG-1/1E3mAb重链可变区基因同源性序列检测结果；

图5是AEG-1/1E3mAb轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果；

图6是AEG-1/1E3mAb重链可变区氨基酸同源性序列检测结果。

具体实施方式

本发明用天然AEG-1免疫BALB/c小鼠，制备了一组分泌小鼠抗人AEG-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从中筛选出能稳定分泌高亲和力抗AEG-1的AEG-1/1E3mAb杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力抗AEG-1单克隆抗体；以该杂交瘤细胞提取细胞总RNA，反转录后以简并引物扩增该抗体轻、重链可变区基因，并确认该基因序列和相应氨基酸序列的惟一性及其CDR序列；为抗AEG-1嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。下面结合具体单克隆抗体的制备方法、抗体活性检测，以及序列的检测和唯一性的确定对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。本发明具体按以下步骤实施：

1、小鼠抗人AEG-1高亲和力抗体AEG-1/1E3的制备

1.1单克隆抗体的制备、纯化

按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P₉-P₁₇页)，用天然AEG-1免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)，初次免疫，使用25μg纯化AEG-1蛋白与等体积的福氏完全佐剂，背部皮下多点注射，四周后第二次免疫，使用福氏不完全佐剂加25μg纯化的AEG-1蛋白，20天后通过间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价。间隔2～3周后，经腹腔注射50μg纯化的AEG-1蛋白加强免疫，3天后处死动物取脾进行细胞融合。

取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫鼠的脾细胞悬液。按常规方法用50％PEG使脾细胞与SP2/0细胞进行融合。融合后的细胞加入含有滋养细胞(6周龄BALB/c鼠胸腺细胞)的96孔板内，以含1％HAT、20％小牛血清的RPMI-1640筛选培养。当克隆长至1/3板底时，收集培养上清。以纯化的AEG-1抗原包被ELISA板，间接ELISA法检测培养上清中抗AEG-1抗体，筛选分泌抗人AEG-1抗体的克隆，进一步利用有限稀释法进行单克隆化获得一株可稳定分泌高亲和活性的抗AEG-1单克隆抗体的细胞株，标记为1E3，并对其分泌的抗体进行免疫球蛋白类型及亚类测定(结果为IgG₁亚类，κ型轻链)。

在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，常规方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P₉-P₁₇页)制备包含单克隆抗体的小鼠腹水。腹水经45％饱和硫酸铵沉淀后，采用GE公司的rprotein A/G Gravitrap抗体纯化柱纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的AEG-1/1E3纯度达到95％以上。

1.2抗AEG-1单克隆抗体AEG-1/1E3的效价测定

用间接ELISA方法测定纯化前腹水以及纯化后mAb的相对亲和力。其中包被抗原为天然AEG-1，待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后mAb，检测抗体为山羊抗小鼠-HRP酶标记抗体，底物使用OPD。所筛选出的高亲和力AEG-1/1E3，腹水效价为1×10^-7，而一般采用间接ELISA检测腹水效价达1×10^-5以上的抗体即可使用。

以宫颈癌HeLa细胞和肺癌A549细胞的全细胞裂解蛋白(25ug)为抗原，Western Blot方法检测AEG-1/1E3单抗与肿瘤细胞中的AEG-1蛋白的结合，结果如图1所示，可以看到在A549、Hela细胞中均有80kd的目的条带出现，说明AEG-1/1E3单抗能够识别肿瘤细胞中的AEG-1抗原分子，并发生了免疫结合。

肺癌细胞A549制备细胞爬片，以AEG-1/1E3单抗作为检测抗体，山羊抗小鼠IgG-HRP为第二抗体，免疫组织化学法检测AEG-1/1E3单抗与肿瘤细胞表达的AEG-1的结合，结果如图2所示，在A549细胞中(主要在胞膜和胞浆)，可见明显的棕色阳性反应产物，结果表明：AEG-1/1E3单抗与AEG-1分子识别并生了免疫结合。

2、抗AEG-1的AEG-1/1E3mAb轻链和重链可变区基因的克隆

2.1AEG-1/1E3mAb杂交瘤细胞的培养

能稳定分泌AEG-1/1E3mAb的杂交瘤细胞，用含20％小牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5％CO₂孵箱中培养至对数生长期。

2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成

采用Invitrogen公司的TRIZOL Reagent提取细胞总RNA，TaKaRa cDNA反转录试剂盒进行反转录，合成cDNA。

2.3PCR扩增AEG-1/1E3mAb的VL和VH基因

利用小鼠抗体基因简并引物，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR反应；反应体积50μl，反应条件为：94℃5min；35次循环(95℃90s，50℃90s，72℃2min)；72℃10min；引物序列为：

VL-F：ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTG    30bp；

VL-R：ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA                21bp；

VH-F：ATGAAATGCAGCTGGGTCAT STTCTTC               27bp；

VH-R：CCA GGG RCC ARK GGA TAR ACI GRT GG         26bp；

(IUB标准兼并碱基代码：S：C/G；K：G/T；R：A/G；I：inosine)

2.4PCR扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程有限会司)回收PCR扩增片段，插入pMD-18T载体(购自TakaRa公司)中，连接产物转化E.coli JM109大肠杆菌，涂布LB/X-gal/IPTG/Amp⁺琼脂培养板，37℃培养过夜。

挑取LB琼脂培养平皿中白色阳性克隆，在Amp⁺的LB培养基中37℃摇菌过夜，OMEGA公司质粒小量提取试剂盒提取质粒DNA，送北京奥科生物技术有限公司进行基因序列测定，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3 AEG-1/1E3mAb轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析

3.1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。

AEG-1/1E3mAb轻链可变区基因与编号为ref|NT_039353.7的小鼠Igκv1-117基因同源性最高，达308/311(99％)，如图3所示。

AEG-1/1E3mAb重链可变区基因与编号为GeneID：640979的小鼠Igheavy V region基因同源性最高，为302/308(98％)，如图4所示。

同源性分析表明，编码AEG-1/1E3mAb的轻、重链可变区的核苷酸序列，尽管与其它基因序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的基因序列，表明本发明在基因序列上具有惟一性。

3.2可变区基因翻译后氨基酸序列及分析

AEG-1/1E3mAb轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。

分析结果表明，AEG-1/1E3mAb轻链氨基酸序列与编号emb|CAD68984.1的小鼠Immunoglobulin light chain kappa同源性最高，达141/146(97％)，如图5所示。

AEG-1/1E3mAb重链氨基酸序列与编号为dbj|BAB87184.1的小鼠anti-dsRNA antibody同源性最高，为120/150(80％)，如图6所示。

同源性分析表明，AEG-1/1E3mAb轻、重链可变区的氨基酸序列，尽管与其它蛋白氨基酸序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列，表明本发明在氨基酸序列上也具有惟一性。

3.3利用IMGT System分析可变区结构，确定CDR区。

将测序所得AEG-1/1E3mAb轻链和重链可变区序列，在IgBLAST/IMGT中(网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)进行分析，得出其CDR区。

轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列，如SEQ ID NO.1划线部分所示，具体为：

CDR1：Ser Gln Ser Ile Val His Thr Asn Gly Asn Thr；

CDR2：Tyr Lys Val；

CDR3：Cys Phe Gln Gly Ser His Val；

所述重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列，如SEQ ID NO.2划线部分所示，具体为：

CDR1：Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp；

CDR2：Ile Phe Pro Gly Arg Gly Ser Thr；

CDR3：Thr Arg。

4.基因工程抗体设计

基于抗AEG-1mAb AEG-1/1E3的表达、纯化以及序列分析，设计构建以下生物制品

1)单链抗体的构建：可将本发明的AEG-1/1E3mAb轻、重链可变区基因通过linker连接，插入原核或真核表达载体，转化宿主菌或转染真核细胞，用于恶性肿瘤细胞内信号转导特性研究；并应用于恶性肿瘤的细胞内抗体治疗；同时可制备针对AEG-1的具有治疗作用的单链抗体，该单链抗体分子标记不同的同位素后，可用于恶性肿瘤影像学示踪诊断及恶性肿瘤靶向放射治疗中。

2)人-鼠抗AEG-1嵌合抗体的构建：可将本发明的AEG-1/1E3mAb轻、重链可变区基因插入通用型嵌合抗体表达载体中，获得含嵌合基因的载体转染真核细胞，用于制备针对AEG-1的有治疗作用的嵌合抗体。

3)可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对AEG-1功能表位的其它生物制品。

Claims (4)

1.具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，包括轻链和重链可变区，其特征在于，所述轻链可变区的3个互补决定区（CDR）序列分别为：

CDR1：Ser Gln Ser Ile Val His Thr Asn Gly Asn Thr；

CDR2：Tyr Lys Val；

CDR3：Cys Phe Gln Gly Ser His Val；

所述重链可变区的3个互补决定区（CDR）序列分别为：

CDR1：Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp；

CDR2：Ile Phe Pro Gly Arg Gly Ser Thr；

CDR3：Thr Arg。

2.如权利要求1所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，其特征在于，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

3.如权利要求1所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体，其特征在于，编码轻链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.3所示，编码重链可变区的基因序列如SEQ.ID.NO.4所示。

4.权利要求1所述的具有高亲和力的AEG-1/1E3单克隆抗体在针对AEG-1的基因工程抗体或诊断试剂的制备中的应用。

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