CN102565384A - 用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法。莱克多巴胺为瘦肉精“培林”类的一种，较常规瘦肉精而言，毒性较低，世界卫生组织与联合国粮食及农业组织及部分国家(美国、新西兰、日本等)允许使用，但国家之间允许的肉品残留量不同。我国目前禁用任何类型的瘦肉精。目前，临床检测莱克多巴胺主要通过高效液相色谱方法及ELISA方法，操作方法繁琐、耗时较长，并且需要昂贵的检测仪器设备及专门的检测操作人员。免疫胶体金技术近年来发展迅速，得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。本发明采用胶体金免疫层析法，建立快速检测莱克多巴胺的方法。并且能够通过两种T线以初步定量肉品中的莱克多巴胺的含量，满足市场需求。

Description

用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法

技术领域

本发明涉及一种生物工程技术领域的检测方法，具体是一种用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法。

背景技术

瘦肉精是一类动物用药的统称，任何能够促进动物瘦肉生长、抑制动物脂肪生长的化学药物均可叫做“瘦肉精”，主要包括盐酸克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林等。将瘦肉精添加于饲料中，可以增加动物的瘦肉量，减少饲料使用量，促进肉品提早上市，降低成本。但因为考虑对人体会产生副作用，各国的开放使用标准不一。国内由于双汇瘦肉精事件，使得人们开始关注瘦肉精对于人体的危害。

莱克多巴胺为一种医药原料，主要用于治疗充血性心力衰竭症的强心药，亦可用于治疗肌肉萎缩症，增长肌肉，减少脂肪蓄积。莱克多巴胺为瘦肉精的一种，其瘦肉提高的效率非常高，动物实验和小规模的人体试验发现每公斤体重的摄入量在67微克之下时对于人体没有明显损害，属于“培林”类瘦肉精之一。美国药监局允许使用“培林类”瘦肉精加入猪饲料中，培林残留量为50ppb；日本及新西兰规定国内严禁使用培林类瘦肉精，而进口肉类的培林残留量为10ppb；加拿大及世界卫生组织规定培林类残留量为40ppb；联合国粮食及农业组织规定肉类培林残留量为10ppb；中国禁止使用任何培林类瘦肉精。

莱克多巴胺主要的检测手段为液相色谱方法及ELISA方法。高效液相色谱方法(HPLC)为我国检测盐酸克伦特罗的半确证性方法，坐地检测限范围为1-15ng/g，优点为专属性好、选择性强、检测精确度较高，假阳性率低，但缺点是样本处理时间较长，检测过程繁琐、难于操作，需要贵重的仪器——高效液相色谱仪，需要有专门的仪器操作及结果分析人员，在实际应用中受到很大的经费限制。采用间接竞争ELISA方法可用于检测样本中的莱克多巴胺，通过莱克多巴胺与偶联抗原竞争抗莱克多巴胺抗体，加入酶标记物后，底物显色，运用酶标仪检测样本的吸光度，与标准曲线比较即可得到样本中的莱克多巴胺的残留量。ELISA方法相较于高效液相色谱方法而言，其设备较为便宜、操作简单。但对于肉联厂等基层使用者而言，耗时较长(大约3h)，且需要酶标仪、37℃培养箱等设备。

免疫胶体金技术是20世纪70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断制剂的制造等领域。目前金标记技术常与膜载体配合，形成特定的免疫检测方式，如免疫渗滤试验和免疫层析试验等。免疫层析试纸条就是此技术用于体外快速诊断的一个重要发展方向，是在现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的新型检测技术。近年来该技术发展迅速，已经在临床诊断特别是床边检测(POCT)中得到了广泛应用，如传染病、早孕、癌症等的检测。免疫胶体金技术与ELISA技术同属于免疫学诊断方法，均是依赖于抗原与抗体的特异性反应，但不需要专门的仪器设备，更适于现场及床旁快速检测。

利用竞争法免疫层析胶体金技术测定肉品中的莱克多巴胺的诊断试剂在市场上尚未有商品化的试剂盒，但已开发，但其仅为定性产品。针对于莱克多巴胺的用途及使用安全性，本研究采用双指示线半定量检测方式指示检测结果，以方便大众对其肉品进行分别对待，因此，半定量胶体金试纸也是十分必要的。目前国内外均无相关的试纸条出售。

发明内容

本发明的目的：开发简单、快速的莱克多巴胺检测方法具有十分重要的经济价值和社会价值。本实验采用胶体金免疫层析法，建立快速检测莱克多巴胺的方法。并且能够半定量检测1ng/mL～2ng/mL这一莱克多巴胺灰区范围。

本发明是通过以下技术方案实现的：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗莱克多巴胺抗体并均匀涂布于胶金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的莱克多巴胺-BSA偶联物固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

本发明方法包括如下步骤：

一、胶体金溶液配制

1.配制1％氯金酸溶液；

2.配制2％柠檬酸三钠溶液；

3.将0.02％的氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入2％的柠檬酸三钠2mL；

4.溶液由浅蓝色，深蓝，再加热出现酒红色，继续煮沸10min；

停止加热，继续搅拌至室温。

二、胶体金标记物的制备

1.取两个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金溶液；

2.加入适量硼砂缓冲液把pH调整为7.5；

3.加入10μg/mL莱克多巴胺抗体，使其达到最小蛋白浓度，混匀，振荡30min；

4.加入20μL的10％BSA，混匀，振荡30min；

5.12000rpm离心5min，轻轻吸除上清；

6.用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；

7.重复5.步操作；

8.重复6.步操作；

9.重复5.步操作；

10.用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5～1.0的胶体金免疫复合物；

11.玻璃纤维素膜点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。

三、在硝酸纤维素膜上划线

1.T1线用浓度为0.5mg/mL的莱克多巴胺-BSA偶联物划线，用于检出1ng/mL的莱克多巴胺；

2.T2线用浓度为0.9mg/mL的莱克多巴胺-BSA偶联物划线，用于检出2ng/mL的莱克多巴胺；

3.C线用2.0mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划线；

4.将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

四、胶体金试纸条的组装

1.将样品垫、胶金垫、NC膜和吸收垫4部分按顺序组装(见附图1)；

2.将其组装好后用剪刀剪成4mm/条后进行检测。

五、检测

试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与T1线、T2线均出现红色指示线表明样本中莱克多巴胺水平小于1ng/mL(见附图2)，C线与T1线出现红色指示线，T2线不显色表明样本中的莱克多巴胺水平在1-2ng/mL之间(见附图3)。C线出现红色指示线，T1、T2线均不显色表明样本中的莱克多巴胺大于2ng/mL(见附图4)。

本发明有益效果是：提供一种用双指示线免疫层析半定量检测莱克多巴胺的新型试纸。检测速度快，所需时间短，只需5min；能半定量检测样本中的莱克多巴胺含量，给出样本更多的信息，灵敏度更高。不需经培训的专业人员就可使用本发明方法来检测动物组织样本、尿液中莱克多巴胺(瘦肉精)的残留量，并且便于基层推广和运用。

附图说明

图1为本发明实施例试纸条的图示

图2为本发明实施例试纸条的阳性结果(莱克多巴胺水平小于1ng/mL)

图3为本发明实施例试纸条的阳性结果(莱克多巴胺水平为1-2ng/mL)

图4为本发明实施例试纸条的阴性结果(莱克多巴胺水平大于2ng/mL)

具体实施方式

下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

本实例先用2％的柠檬酸三钠溶液制备20nm的金水，并标记莱克多巴胺抗体喷金标垫，莱克多巴胺-BSA偶联物、羊抗鼠多克隆抗体分别包被至检测线(T线)、质控线(C线)，然后组装成试纸条，置37℃烘箱烘干并裁成4mm/条，室温干燥保存备用。

实施例

1.准备莱克多巴胺抗体和莱克多巴胺-BSA偶联物。并清洗实验所需的玻璃器皿。

2.胶体金的制备

先将0.02％氯金酸溶液溶液加热煮沸，迅速加入2％的柠檬酸三钠2mL；

溶液颜色由浅蓝色变为深蓝，继续加热出现酒红色，继续煮沸10min；出现透明的酒红色，停止加热，继续搅拌至室温。这样就制备了20nm的胶体金溶液。然后用电镜镜检，确保制备的金颗粒尽量使其大小一致、均匀，颗粒直径在20nm左右，否则重新制作。

3.胶体金标记物的制备

取两个1.5mL试管，分别加入1mL胶体金溶液；向其中加入适量硼砂缓冲液把pH调整为7.5；加入10μg/mL莱克多巴胺抗体，使其达到最小蛋白浓度，混匀，于振荡仪上快速振荡30min；加入20μL的10％BSA，混匀，振荡30min；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用1mL wash buffer溶液重悬浮松散的胶体金沉淀；于离心机中12000rpm，离心5min，轻轻吸除上清；用fix buffer配制在540nm处OD(光密度)值为0.5～1.0的胶体金免疫复合物；在玻璃纤维素膜上点样，形成胶金垫，真空冻干3小时。

4.胶体金试纸条的组装

分别将0.5mg/mL和0.9mg/mL的莱克多巴胺-BSA偶联物划在硝酸纤维素膜的检测线(T线)上，将2.0mg/mL羊抗鼠多克隆抗体划在质控线(C线)上。然后将硝酸纤维素膜置于烘箱中40℃干燥3天。然后将各个部分按附图1组装成试纸条。

5.胶体金试纸条的使用及结果判读

检测前，先提取被检者的血清样本。

然后把试纸条试纸平放，将样品加到检测条的样本垫上，由于毛细效应，液体的层析方向向前，与固定在T线、C线上的物质发生结合被截留而显色。5min后，根据T线、C线的显色情况判定阴阳性结果。C线与T1线、T2线均出现红色指示线表明样本中莱克多巴胺水平小于1ng/mL(见附图2)，C线与T1线出现红色指示线，T2线不显色表明样本中的莱克多巴胺水平在1-2ng/mL之间(见附图3)。C线出现红色指示线，T1、T2线均不显色表明样本中的莱克多巴胺大于2ng/mL(见附图4)。

实施例可直接检测样品中的莱克多巴胺，使用方法不需要专业培训，操作方便、快速，5min即可获得结果，可达到快速、简便、及时地检测莱克多巴胺的目的。

Claims (3)

1.一种用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法，其特征在于，采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗莱克多巴胺抗体并均匀涂布于胶体金垫上，作为示踪标记物。在硝酸纤维素膜上，两个不同浓度的莱克多巴胺-BSA偶联物固定于两个检测线(即T线)，羊抗鼠二抗固定于质控线(即C线)。依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装，剪成胶体金试纸并装入检测卡中。金标抗体与相应的抗原、抗体发生特异性结合被截留而显色，根据T线、C线显色与否来判断阴阳性结果。

2.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量诊断莱克多巴胺的方法，其特征在于，抗体划线浓度为：

T1线用浓度为0.5mg/mL的莱克多巴胺-BSA偶联物划线，用于检出1ng/mL的莱克多巴胺；

T2线用浓度为0.9mg/mL的莱克多巴胺-BSA偶联物划线，用于检出2ng/mL的莱克多巴胺；

C线用2.0mg/mL羊抗鼠多克隆载体划线；

将硝酸纤维素膜置于40℃烘箱干燥3天。

3.根据权利要求1所述的一种用双指示线免疫层析半定量莱克多巴胺的方法，其特征在于，运用不同浓度的抗体溶液在相同的基质上划线，以胶体金方法检测多个不同浓度水平物质的方法。

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