CN102559763B

CN102559763B - 一种利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法

Info

Publication number: CN102559763B
Application number: CN201210008717.1A
Authority: CN
Inventors: 赵美花; 曾茁桐; 曾光明; 黄丹莲; 赖萃; 危臻; 黄超; 李宁杰; 许飘; 张辰
Original assignee: Hunan University
Current assignee: Hunan University
Priority date: 2012-01-12
Filing date: 2012-01-12
Publication date: 2014-03-19
Anticipated expiration: 2032-01-12
Also published as: CN102559763A

Abstract

本发明公开了一种利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法，包括以下步骤：（1）秸秆预处理：将稻草秸秆粉碎得到秸秆粉，过筛备用；（2）制备复合酶液：液态培养黄孢原毛平革菌，得到复合酶液；（3）催化降解：在所述秸秆粉中加入所述复合酶液，同时添加活性介体组合，保温保湿静置，完成催化降解。本发明的降解稻草秸秆的方法，提高稻草秸秆中木质素的酶解率，利于稻草秸秆的分解转化与资源化利用，且成本低廉、操作简单、运行费用低、清洁无污染。

Description

一种利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法

技术领域

本发明涉及生物降解技术领域，具体涉及一种利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法。

背景技术

稻草是丰富的可再生资源，是主要的农作物秸秆之一。但由于秸秆产量随季节变化，且产量大、价值低、体积大、不便运输，秸秆的自然降解过程又极其缓慢，导致大量的秸秆以堆积、荒烧等形式直接倾入环境，中国常年燃烧的秸秆量约为5×10⁷t～7×10⁷t，占秸秆产生总量的10%～15%，造成极大的环境污染和严重的物质资源浪费。

秸秆由有机物、少量矿物质及水分构成，其有机物主要是木质素、纤维素和半纤维素，营养价值低，其中，木质素难降解致使秸秆分解缓慢，因此，稻草秸秆降解的关键技术在于木质素的降解。目前，研究较多的主要是利用物理化学手段对稻草秸秆进行处理，包括微波辐射法和酸、碱处理法等，但是此类方法能耗高，酸碱用量大且回收低，易造成环境污染。另外是利用生物技术处理稻草秸秆，其关注点主要是利用木素降解酶（如木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP））来催化降解稻草秸秆中的木质纤维素，这类方法环境污染小且能耗较低，但是由于LiP和MnP之类的高分子物质难以进入完好的、未被破坏的稻草秸秆内，因此，单纯的利用木素降解酶催化稻草的降解率较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种能提高稻草秸秆中木质素的酶解率，利于稻草秸秆的分解转化与资源化利用，且成本低廉、操作简单、运行费用低、清洁无污染的利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法，包括以下步骤：

（1）秸秆预处理：将稻草秸秆粉碎得到秸秆粉，过筛备用；用于秸秆粉过筛的筛孔尺寸优选为60～100目；

（2）制备复合酶液：液态培养黄孢原毛平革菌，得到复合酶液；

（3）催化降解：在所述秸秆粉中加入所述复合酶液，同时添加活性介体组合，保温保湿静置，完成催化降解。

活性介体是指除酶之外的木质素降解过程中必须的一些低分子量的复合物，研究表明在木质素降解的初级阶段有各种可渗透性的活性介体物质参与，这些参与木质素降解的活性介体主要包括有羟基自由基、铁离子、草酸、锰离子、黎芦醇等。

作为对上述技术方案的优化，所述活性介体组合为藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液（例如硫酸锰溶液）和H₂O₂溶液。

作为对上述技术方案的优化，所述的藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液的浓度分别为80mM/L～100mM/L、600mM/L～800mM/L、1500mM/L～2000mM/L和500mM/L～600mM/L 。

作为对上述技术方案的优化，所述步骤（3）中，每克秸秆粉中，复合酶液、藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液的添加量分别为1200mL～3600mL、200mL～800mL、50mL～200mL、10mL～40mL和312.5mL～1250mL。

作为对上述技术方案的优化，所述步骤（2）中，液态培养黄孢原毛平革菌获得复合酶液时，每200 mL液体培养基中添加2mL～4mL孢子浓度为1.5×10⁶ 个/mL～2×10⁶个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液；所述液态培养时的温度、转速和培养时间分别为30℃～37℃、120r/min～150r/min和6～8天。其中，液体培养基（1 L）配方为：葡萄糖 10 g，酒石酸铵 0.2 g，MgSO₄0.71 g，吐温80 0.5 mL，KH₂PO₄ 2.56 g，VB₁ 0.01 g，酒石酸钠缓冲液4.616 g，微量元素液100 mL，苯甲醇0.516 mL，H₂O 899.484 mL，pH值调节为4.5。

作为对上述技术方案的优化，优选地，所述步骤（2）中，复合酶液中LiP和MnP的酶活分别为15U/L～20U/L和213 U/L～250U/L。

作为对上述技术方案的优化，优选地，所述步骤（3）中，保温的温度为28℃～30℃，静置时间为3～24天。

与现有技术相比，本发明的优点为：

本发明的催化降解稻草秸秆的方法，利用LiP和MnP复合酶处理稻草秸秆，同时加入活性介体组合与复合酶协同作用，活性介体组合可以促进复合酶的催化，使得复合酶加速对木质素的降解，进而提高稻草秸秆的腐化速度和木质素的酶解效率，同时本发明的方法成本低廉、操作简单、运行费用低、清洁无污染，可大量用于工业化生产。

附图说明

图1是实施例1中添加和未添加活性介体组合时稻草秸秆中木质素降解率与有机质含量随时间的变化情况示意图。

图2是实施例2中添加和未添加活性介体组合时稻草秸秆中木质素降解率与有机质含量随时间的变化情况示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明。

实施例1：

一种本发明的利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法，包括以下步骤：

（1）秸秆预处理：将稻草秸秆粉碎得到秸秆粉，过60目筛备用；

（2）制备复合酶液：在已灭菌的200mL液体培养基中添加2mL孢子浓度为1.5×10⁶个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液，30℃、120 r/min下振荡培养6天，通过沉淀、滤纸过滤、高速离心和0.45mm滤膜过滤得到复合酶液（15 U/L 的LiP和213 U/L的MnP）；液体培养基（1L）的配方为：葡萄糖 10 g，酒石酸铵 0.2 g，MgSO₄0.71 g，吐温80 0.5 mL，KH₂PO₄ 2.56 g，VB₁ 0.01 g，酒石酸钠缓冲液4.616 g，微量元素液100 mL，苯甲醇0.516 mL，H₂O 899.484 mL，pH值调节为4.5；

（3）催化降解：在5kg步骤（1）得到的稻草秸秆粉中加入步骤（2）得到的复合酶液，同时添加浓度为80mM/L的藜芦醇溶液、浓度为600mM/L的草酸溶液、浓度为1500mM/L 的Mn²⁺溶液和浓度为500mM/L 的H₂O₂溶液，每克秸秆粉中复合酶液、藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液的添加量分别为1200mL、200mL、50mL、10mL和312.5mL，再添加去离子水调节催化系统的含水量为85%，恒温（28℃）恒湿条件进行酶催化降解；分别在3、6、12、24天观察稻草秸秆的腐化破坏程度和测定木质素降解率和有机质含量变化，结果见表1和图1。

以未添加活性介体组合作为对比例，进行对比试验，对比试验中没有添加活性介体组合，其他步骤均与本实施例的工艺步骤操作相同，试验结果见表1和图1。

从表1可知，未添加活性介体组合的酶催化降解过程中，稻草秸秆的腐化破坏程较低，而添加活性介体组合的酶催化降解过程中稻草秸秆的腐化破坏程度随时间递增，表观上在24天达到最大值。

从图1可知，在添加活性介体组合的酶催化降解过程中，木质素降解率最高达到61.57%，是对比试验中木质素降解率的8.04倍；此过程中有机质含量从0.85g/g降低至0.65g/g，而对比试验中有机质含量仅降低至0.80g/g。

表1：稻草秸秆酶催化降解过程中的腐化破坏程度

时间	3	6	12	24
					未添加活性介体组合	-	-	-	+
添加活性介体组合	-	+	++	+++

注：表中，符号“- ”、“+”、“++”、“+++”分别表示稻草秸秆的腐化破坏程度，“- ”表示无腐化破坏，“+”越多表示腐化破坏程度越大。

实施例2：

（1）秸秆预处理：将稻草秸秆粉碎得到秸秆粉，过100目筛备用；

（2）制备复合酶液：在已灭菌的200mL液体培养基（液体培养基的配方同实施例1）中添加4mL孢子浓度为2×10⁶个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液，37℃、150r/min下振荡培养8天，通过沉淀、滤纸过滤、高速离心和0.45mm滤膜过滤得到复合酶液（20 U/L 的LiP和250 U/L的MnP）；

（3）催化降解：在5kg步骤（1）得到的秸秆粉中加入步骤（2）得到的复合酶液，同时添加浓度为100mM/L的藜芦醇溶液、浓度为800mM/L的草酸溶液、浓度为2000mM/L 的Mn²⁺溶液和浓度为600mM/L 的H₂O₂溶液，每克秸秆粉中复合酶液、藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液的添加量分别为3600mL、800mL、200mL、40mL和1000mL，再添加去离子水调节催化系统的含水量为85%，恒温（30℃）恒湿条件进行酶催化降解；分别在3、6、12、24天观察稻草秸秆的腐化破坏程度和测定木质素降解率和有机质含量变化，结果见表2和图2。

以未添加活性介体组合作为对比例，进行对比试验，对比试验中没有添加活性介体组合，其他情况均与本实施例的工艺步骤操作相同，结果见表2和图2。

从表2可知，添加活性介体组合的酶催化降解过程中稻草秸秆的腐化破坏程度较之其在未添加活性介体组合的酶催化过程中的腐化破坏程度要高，表观上在24天腐化破坏程度最大。

从图2可知，在添加活性介体组合的酶催化降解过程中，木质素降解率最高达到了65.78%，是对比试验中木质素降解率的8.20倍；此过程中有机质含量从0.85 g/g降低至0.64 g/g，而对比试验有机质含量仅降低至0.80 g/g。

表2：稻草秸秆酶催化降解过程中的腐化破坏程度

时间	3	6	12	24
					未添加活性介体组合	-	-	+	+
添加活性介体组合	+	++	++	+++

Claims

1.一种利用活性介体组合促进复合酶催化降解稻草秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）秸秆预处理：将稻草秸秆粉碎得到秸秆粉，过筛备用；

（2）制备复合酶液：液态培养黄孢原毛平革菌，再通过沉淀、滤纸过滤、高速离心和0.45mm滤膜过滤得到复合酶液；

（3）催化降解：在所述秸秆粉中加入所述复合酶液，同时添加活性介体组合，保温保湿静置，完成催化降解；

所述活性介体组合为藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液；

所述的藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液的浓度分别为80mM/L～100mM/L、600mM/L～800mM/L、1500mM/L～2000mM/L和500mM/L～600mM/L；

所述步骤（3）中，每克秸秆粉中，复合酶液、藜芦醇溶液、草酸溶液、Mn²⁺溶液和H₂O₂溶液的添加量分别为1200mL～3600mL、200mL～800mL、50mL～200mL、10mL～40mL和312.5mL～1250mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，用于秸秆粉过筛的筛孔尺寸为60～100目。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，液态培养黄孢原毛平革菌获得复合酶液时，每200mL液体培养基中添加2mL～4mL孢子浓度为1.5×10⁶ 个/mL～2×10⁶个/mL的黄孢原毛平革菌孢子悬液；所述液态培养时的温度、转速和培养时间分别为30～37℃、120r/min～150r/min和6～8天。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，复合酶液中木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的酶活分别为15U/L～20U/L和213 U/L～250U/L。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，保温的温度为28℃～30℃，静置时间为3～24天。