CN102552411A

CN102552411A - 一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂

Info

Publication number: CN102552411A
Application number: CN2012100686163A
Authority: CN
Inventors: 刘红柏; 王荻; 卢彤岩; 李绍戊; 徐黎明
Original assignee: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Heilongjiang River Fisheries Research Institute of Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2012-07-11

Abstract

一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂，它涉及一种鱼种用中草药免疫增强剂。它解决了现有鲟科鱼类鱼种阶段病害频繁发生、免疫力低下及生长状况不良的问题。鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由甘草、金银花、紫草、葛根和桑叶混合制成。本发明鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂，能有效增强鱼体的免疫力、抗氧化能力，从而提高对疾病的抵抗力，降低发病率；能显著提高鱼的增重率，生长状况良好，缩短养成时间，提高养殖产量；在热应激条件下，可以调节机体对外界的抵抗力；长期添加投喂后鱼体没有出现毒副作用和不良反应；弥补了鲟鱼鱼种生产中缺乏此类免疫添加剂的空白；因而，鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂具有提高鲟鱼免疫抗病能力和促进鱼类健康生长的双重效果。

Description

一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂

技术领域

本发明涉及一种鱼种用中草药免疫增强剂。

背景技术

鲟鱼是一种经济鱼类，目前国外鲟渔业是世界上利润最高的产业之一。我国境内的鲟鱼主要分布于长江、黑龙江及其支流，目前共有2科4属11种。但由于人口增长，需求增加导致的捕捞过度，加上江河污染已使黑龙江的鲟鱼资源量大减少。1998年4月1日起，联合国华盛顿公约(CITIS)将全世界野生鲟鱼认定为濒临绝种的保护动物。野生的史氏鲟被列为我国二级保护动物。为了增加资源量，在保护的同时，我们国家也采用了增殖放流以及人工养殖的措施。鲟鱼生长速度快，广温、广盐，对环境的适应性强，具有很好的养殖特性。早在1957我国即成功地进行了史氏鲟的人工繁殖，并获得少量鱼苗。80年代末90年代初，有关单位还开展了池塘养殖、饵料生物学、以及鲟鳇杂交等方面的研究。

近年来史氏鲟的人工养殖发展迅速，已成为较为常见的商品鱼，随着养殖业的发展，其病害也逐渐增加，经常会发生某些疾病，包括病毒、细菌和寄生虫感染等疾病，其中有常见病，也有不明原因的暴发性疾病；尤其在鲟科鱼类的鱼种阶段，病害频繁发生，鱼种免疫力低下，出现生长状况不良等问题。但由于鲟鱼开始规模化养殖的时间短，相关的基础研究包括病害研究相对薄弱，因此疾病的诊断和治疗都较为困难，如何有效预防就成了关键。提高机体的非特异性免疫能力，可以有效抵抗疾病入侵，减少发病和死亡率，许多中草药就具有这样的功效。研究表明，中草药具有调节机体健康、增强机体免疫力的作用，作为一种天然的药物越来越受到人们的重视。中草药的品种众多，药性多样，价格低廉，资源丰富，采用中草药作为免疫添加剂不但有助于提高机体免疫力，而且由于它属于天然物质，污染少，所以、更符合绿色渔业的要求，有利于人们对食品安全的要求。

发明内容

本发明目的是为了解决现有鲟科鱼类鱼种阶段病害频繁发生、免疫力低下及生长状况不良的问题，而提供一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂。

鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由16～24g的甘草、12～18g的金银花、12～18g的紫草、8～12g的葛根和8～12g的桑叶混合制成。

本发明中甘草具有增强免疫力、保肝、抗病毒、抗菌、抗溃疡和解毒的功效，甘草及其有效成分在国内外均有研究，常单独或配方使用，预防和治疗疾病；金银花则清热解毒，也可抗菌抗病毒，增强免疫力，并且有对抗细菌内毒素保护机体的作用；紫草具有抗菌抗病毒、消炎、保肝的作用；葛根则能调节循环系统、改善肝脏功能并清热解毒；桑叶也可清热解毒、抗菌消炎，并且提高免疫力。

本发明根据实验室试验及应用推广单位的试验证明它具有如下特点：

(1)能有效增强鱼体的免疫力、抗氧化能力，从而提高对疾病的抵抗力，降低发病率；

(2)能显著提高鱼的增重率，生长状况良好，缩短养成时间，提高养殖产量；

(3)在热应激条件下，可以调节机体对外界的抵抗力；

(4)长期添加投喂后鱼体没有出现毒副作用和不良反应；

(5)弥补了鲟鱼鱼种生产中缺乏此类免疫添加剂的空白；

因而，鲟方具有提高鲟鱼鱼种免疫抗病能力和促进鱼类健康生长的双重效果，对减少我国鲟鱼养殖过程中爆发性疾病频繁发生的几率有一定促进作用。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由16～24g的甘草、12～18g的金银花、12～18g的紫草、8～12g的葛根和8～12g的桑叶混合制成。

本实施方式中鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂的制备：一、称取16～24g的甘草、12～18g的金银花、12～18g的紫草、8～12g的葛根和8～12g的桑叶，粉碎后放入砂锅中，加水浸泡30min，第一次熬45min，将药汁倒出，再加水熬30min，过滤，将两次药汁合并浓缩成1mL药液相当于1g鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂(干物质)的浓度的水煎剂，备用。

本实施方式中鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂的制备：称取16～24g的甘草、12～18g的金银花、12～18g的紫草、8～12g的葛根和8～12g的桑叶，混合后进行粉碎，粉碎目数为120目～160目，备用。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由17～23g的甘草、13～17g的金银花、13～17g的紫草、9～11g的葛根和9～11g的桑叶混合制成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由18g的甘草、14g的金银花、14g的紫草、10g的葛根和10g的桑叶混合制成。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由20g的甘草、15g的金银花、15g的紫草、11g的葛根和11g的桑叶混合制成。其它与具体实施方式一相同。

试验：在试验站水族箱中进行了口灌和混饲试验，并于口灌试验中设立了常温和高温刺激组，用以研究药物在热应激情况下(主要针对运输等特殊情况造成的高温刺激)对鱼机体的作用效果。后又在中国水产科学研究院鲟鱼繁育工程技术中心进行了应用推广试验。

1.口灌试验

鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂的制备：一、称取18g的甘草、15g的金银花、15g的紫草、10g的葛根和12g的桑叶，粉碎后放入砂锅中，加水浸泡30min，第一次熬45min，将药汁倒出，再加水熬30min，过滤，将两次药汁合并浓缩成70mL，其中1mL药液相当于1g鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂(干物质)的水煎剂，备用。

将药液按给药剂量稀释，以达到每100g鱼体重口灌0.3mL的药液浓度，按70g/50kg的剂量经口灌服鲟方药液，对照组按照体重等比例灌服蒸馏水。

选取健康非免疫状态下的1龄鲟鱼，于室内水族箱(0.90m×0.50m×0.45m)，在22℃下预饲2周，保持各水族箱养殖条件均一，每天按鱼体质量的2.0％投喂全价基础饲料。2周后对试验组鱼连续口灌给药7天，分别于试验第1和第7天给药前准确称量每尾鱼空腹体质量，记录数据。第8天，将试验组和对照组半数鱼放入30℃的控温水族箱中热刺激2h，然后与在正常水温22℃下的试验鱼一同取样，用3g/L肝素钠润洗过的注射器自试验鱼尾动(静)脉采血，4℃下3500r/min离心20min，取上清血浆及底部红细胞，中间层白细胞备用；解剖取鱼鳃、肝、幽门毛囊、胃、肠等各组织样品，立即于-80℃下保存，待测。

2.混饲试验

鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂的制备：称取20g的甘草、15g的金银花、15g的紫草、10g的葛根和10g的桑叶，混合后进行粉碎，粉碎目数为140目，备用；然后以4.5％的比例加入到基础饲料当中混匀，制成药饵。

随机选取健康费免疫状态下1龄施氏鲟于室内水族箱(0.90m×0.50m×0.45m)水温22℃下预饲两周，每组两个重复各15尾鱼，保持各水族箱养殖条件均一，每天按鱼体重的2.0％投喂全价基础饲料。预饲结束后，每天按照鱼体重2.5％投喂药饵，连续给药30天，停食一天后，自实验鱼尾动(静)脉采血，并解剖取鱼肝组织样品，立即于-80℃下保存，待测。

3.养殖试验

鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂的制备方法与口灌试验相同。按干药量含量为5.6％的比例加入到基础饲料当中混匀，制成药饵。

养殖终试采用混饲方法，取健康、非免疫状态下的鲟鱼，于室外圆形水泥池(直径2.5m)中，循环水养殖，试验期间水温15-19℃。试验设试验组及对照组，分别投喂加药饲料及基础饲料，每组300尾，设平行，每天按照体重的2.0％投喂。试验周期为30天。结束后，每组随机选取15尾试验鱼，于尾动/静脉处采集肝素抗凝血，4℃下以3500r/min离心20min，取血浆。解剖，取肝脏等组织的样品，将血清及组织样品立即置于-70℃下保存备用。

4.攻毒试验

选取健康非免疫状态下的1龄鲟鱼(60-80g之间)，于室内水族箱(0.90m×0.50m×0.45m)，在22℃下预饲2周，每箱15尾，保持各水族箱养殖条件均一，每天按鱼体质量的2.0％投喂全价基础饲料。采用黑龙江水产研究所鉴定保存的克里斯坦森耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)进行攻毒试验，先选取60尾鲟鱼，按照累积法亦称Reed-Mueuch氏法计算，半致死浓度LD50＝3.6*10⁷。试验组及对照组均按口灌试验的方法灌服鲟方水煎剂和蒸馏水，每组15尾，均设平行，一周后按半致死浓度进行攻毒。

相关指标测定

1.口灌试验

实验测定混饲鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂(简称：鲟方)的施氏鲟增长及各种生理生化，免疫相关指标如下：

1.1鲟方对施氏鲟生长的影响

表1-1灌服鲟方后不同时间下施氏鲟的增重情况

	初始平均体重	终末平均体重	增重率％
				对照	92.95	105.22	13.20

鲟方

95.07

109.93

15.63

由表1-1可见，口灌给药7天后，实验组增重率高于对照组。表明，鲟方对鲟鱼增长有一定的促进作用。

1.2鲟方对施氏鲟生理生化指标的影响

表1-2灌服鲟方对后施氏鲟血清中碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量及谷丙谷草比值的影响

注：表中同一列相同字母表示无显著差异(P＞0.05)，相邻字母表示差异显著(P＜0.05)，相间字母表示差异极显著(P＞0.01)，下同。

由表1-2可见，鲟方对鲟鱼谷丙转氨酶，谷草转氨酶，碱性磷酸酶和乳酸脱氢酶均无显著影响，但温度对碱性磷酸酶有一定影响，其高温试验组和高温对照均显著高于其对应的常温组。碱性磷酸酶是机体生长代谢、保持内环境稳定所必须的酶，实验表明鲟方对机体生长代谢和内环境稳定无重大影响。

表1-3灌服鲟方对施氏鲟血清中总胆红素、甘油三脂、总胆固醇、尿素氮、肌酐含量及尿素氮与肌酐含量比值的影响

由表1-3可见，鲟方对鲟鱼血液内总胆红素、甘油三脂、总胆固醇、尿素氮均无显著影响。

1.3鲟方对施氏鲟非特异性免疫功能的影响

表1-4灌服鲟方后施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量及白蛋白与球蛋白含量比值的变化

组别	总蛋白(g/L)	白蛋白(g/L)	球蛋白(g/L)	白/球比例
					对照-常温	21.65±3.04^a	8.03±0.67^a	13.63±2.52^a	0.60±0.08^a
对照-高温	24.98±1.98^ab	9.43±0.67^ab	15.55±1.6^ab	0.61±0.06a
					鲟方-常温	25.38±0.90^ab	7.73±0.34^a	17.65±0.97^b	0.44±0.04^b
鲟方-高温	28.15±3.73^b	10.55±1.45^b	17.60±2.28^b	0.6±0.01^a

由表1-4可见，鲟方组总蛋白和球蛋白含量均明显高于对照组，且高温鲟方组显著高于常温对照组。血浆中总蛋白及白蛋白等的含量能较好的反应机体营养和代谢状态，而球蛋白中含有γ-球蛋白，对机体免疫具有促进作用，因此，鲟方在适温养殖过程中对施氏鲟在免疫促进方面有一定的的增强作用，且在热刺激后效果更加明显。

表1-5投喂鲟方后施氏鲟白细胞吞噬作用的变化

组别	吞噬率	吞噬细菌	吞噬指数
				对照-常温	19.07±2.97^a	50.44±19.62	2.59±0.61^a
对照-高温	21.00±2.96^ab	45.67±4.71	2.19±0.09^ab
				鲟方-常温	19.98±3.95^ab	62.11±13.35	3.11±0.23^ab
鲟方-高温	25.11±1.02^b	97.22±19.28	3.91±0.95^b

由表1-5可见，鲟方组白细胞吞噬率和吞噬指数均高于对照组，且鲟方高温组显著高于对照常温组。这样的结果表明，鲟方的使用对白细胞吞噬功能有较好的促进作用，对提高鱼体非特异性免疫有较好效果，且在高温应激情况下，能促进鱼体做出快速免疫应答。

表1-6鲟方对施氏鲟不同组织中溶菌酶活性的影响

由表1-6可见，作为机体免疫力高低的重要指标之一的溶菌酶活性，在鲟鱼血清、肝脏、鳃中溶菌酶活性均较低，且鲟方组与对照组均无显著差异，而幽门盲囊、胃及肠道组织中溶菌酶活性鲟方组均显著高于对照组，且鲟方常温组略高于鲟方高温组。这样的结果表明，鲟方能催化提高施氏鲟体内溶菌酶活性，且在高温刺激下虽有小幅度降低，但是并无明显减弱迹象。

1.4鲟方对施氏鲟抗氧化功能的影响

表1-7灌服鲟方后施氏鲟血清、肝脏及红细胞中SOD活性的变化

由表1-7可见，施氏鲟体内红细胞中SOD活性最高，而肝脏和血清中较少。在肝脏和血清中，SOD活性最高值均出现在鲟方高温组。而红细胞中，鲟方组均高于相应的对照组，且最大值出现在鲟方常温组。机体中，红细胞SOD活性是相对较重要的指标，这样的结果表明，鲟方对施氏鲟抗氧化活性有较好的促进作用，在高温刺激下也有体现。

表1-8灌服鲟方后施氏鲟MDA的变化

由表1-8可见，施氏鲟血清中MDA含量显著高于肝脏中，且肝脏中鲟方组与对照组无显著差异。而血清中常温和高温鲟方组MDA含量均显著低于相应对照组。表明鲟方可以降低氧自由基引起的脂质过氧化损伤。

表1-9灌服鲟方后施氏鲟NO及NOS的变化

由表1-9可见，鲟鱼血清中还是肝脏中的NO含量，鲟方组及对照组均无显著差异；而血清中和肝脏中NOS活性，鲟方组均高于对照组，且鲟方高温组显著高于对照常温及高温组。

2.混饲试验

混饲实验结果简要整理如下，

表2-1混饲鲟方后施氏鲟血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白含量及白蛋白与球蛋白含量比值的变化

组别	总蛋白(g/L)	白蛋白(g/L)	球蛋白(g/L)	白球比例
					对照	23.43±3.4^a	8.9±0.82^a	14.53±2.59^a	0.62±0.05^a
鲟方	29±1.59^b	10.78±0.36^b	18.23±1.38^b	0.59±0.04^a

表2-2混饲鲟方对施氏鲟血清中碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量及谷丙谷草比值的影响

表2-3混饲鲟方对施氏鲟血清中总胆红素、甘油三脂、总胆固醇、尿素氮、肌酐含量及尿素氮与肌酐含量比值的影响

表2-4混饲中草药复方添加剂对施氏鲟血清中钙、磷、血糖、血清铁含量的变影响

由以上结果可见，混饲试验测得鲟鱼体内各种离子含量，活性物质含量及酶活性反应出与口灌试验一致的结果。混饲试验鱼体内免疫相关指标有较好提升，如体内球蛋白含量升高；而碱性磷酸酶略有上升，但乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶均大幅降低；鲟方对血液中钙磷离子影响较小，血糖和血清铁均有一定有升高；总胆红素也有一定升高，尿素氮则稍有降低，但无显著差异。提示饲料中添加该鲟方对鲟鱼免疫相关的蛋白含量有显著影响，尤其是球蛋白，而对机体的多数生理生化指标无显著性改变，不会影响机体的正常代谢。

3.养殖试验养殖试验结果简要整理如下：

表3-1 鲟方对施氏鲟血清中补体3和补体4含量的影响

组别	补体3	补体4
			对照	0.028±0.005^a	0.016±0.004^a
鲟方	0.047±0.005^a	0.033±0.016^a

表3-2 鲟方对施氏鲟各组织中溶菌酶活性的影响

组别	胃	脾	幽门盲囊	肝	血清
						对照	6.45±2.78^a	26.57±6.46^a	1.58±0.35^a	4.13±1.2^a	17.05±4.87^a
鲟方	4.37±0.73^a	28.73±3.89^a	11.46±1.84^c	6.72±1.38^a	87.85±36.55^b

表3-3 鲟方对施氏鲟各组织中NO含量的影响

组别	血清	肝	脾
				对照	229.86±29.86^a	2.48±0.51^a	10.36±1.45^a
鲟方	415.53±55.05^b	3.12±0.25^a	8.45±1.10^a

由测得各项指标可见，大批量混饲养殖后随即抽取测定所得结果，与试验用口灌和混饲结果基本一致。免疫相关指标如补体3和补体4含量，溶菌酶活性均明显高于对照组。

表3-8鲟方饲喂体重增长情况

分组	平均初始体重(g)	平均终末体重(g)	增重率(％)
				对照	69.75	107.59	54.25
鲟方	70.17	113.29	61.43

体重测试结果显示，此方剂对鲟鱼的体重增长具有较好的促进作用。

4.攻毒试验

试验结果显示，攻毒48hr后试验组存活率为63.33％，对照组为46.67％，提示灌服该鲟方对鲟鱼鱼种对抗细菌感染有一定作用。

综上所述，鲟方对试验中鲟鱼鱼种的抗氧化和免疫相关大部分指标有一定的促进作用，而对机体生理生化指标的影响并不显著，说明此方剂对鲟鱼鱼种有免疫促进作用和一定的生长促进作用的同时，对机体其它的功能基本无显著影响，是较为温和的免疫增强剂。

Claims

1.一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂，其特征在于鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由16～24g的甘草、12～18g的金银花、12～18g的紫草、8～12g的葛根和8～12g的桑叶混合制成。

2.根据权利要求1所述的一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂，其特征在于鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由17～23g的甘草、13～17g的金银花、13～17g的紫草、9～11g的葛根和9～11g的桑叶混合制成。

3.根据权利要求1所述的一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂，其特征在于鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由18g的甘草、14g的金银花、14g的紫草、10g的葛根和10g的桑叶混合制成。

4.根据权利要求1所述的一种鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂，其特征在于鲟鱼鱼种用中草药免疫增强剂由20g的甘草、15g的金银花、15g的紫草、11g的葛根和11g的桑叶混合制成。