CN102552160A - 兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂及其制备方法与应用。制剂中有效药物成分甲磺酸达氟沙星含量为11.45～21.01％，载体海藻酸钠多糖交联物含量为78.99～88.55％。该制剂采用乳化化学交联法制备，先将甲磺酸达氟沙星、海藻酸钠、抗氧化剂配成水相溶液，在乳化的条件下滴加交联剂，固化形成微球，然后通过洗涤、离心、过滤、干燥，得到平均粒径在8～9μm的甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂。该制剂的制备工艺简单易行，所用原料具有很好的生物相容性、生物降解性和稳定性，制备的甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂具有安全无毒、载药量高(11.45％～21.01％)、包封率高(59.54～88.20％)和长效缓释等特点，对猪肌内注射该制剂后可维持有效浓度数天，适用于治疗由敏感菌引起的畜禽呼吸道、消化道感染。

Description

兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及兽药新剂型制备技术领域，具体涉及一种兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂及其制备方法与应用。

背景技术

甲磺酸达氟沙星(Danofloxacin mesylate)是一种动物专用的氟喹诺酮类药物，于1988年由美国辉瑞公司研制成功并上市，已在世界范围内广泛使用。甲磺酸达氟沙星的抗菌谱广、杀菌活性强、毒性低、水溶性好、体内分布广泛、与其他抗菌药无交叉耐药性，可多种途径给药，吸收迅速，生物利用度高。该药对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、细胞内病原菌、支原体及某些耐药菌株都表现出很强的抗菌活性，常用于治疗由溶血性巴氏杆菌、出血败血性巴氏杆菌、嗜血杆菌、化脓放线杆菌和支原体引起的猪、牛呼吸道感染；鼠伤寒沙门氏菌引起的猪、牛胃肠道感染；敏感菌引起的山羊泌尿道感染；大肠杆菌、鸡败血支原体和出血败血性巴氏杆菌引起的家禽胃肠道感染、禽霍乱、慢性呼吸道疾病等。

目前，国内外生产、销售和使用的甲磺酸达氟沙星制剂主要有注射剂、内服用的粉剂和溶液等3种剂型，如美国辉瑞公司生产的Advocin 180、Advocin Injectable Solution和A180

Sterile Antimicrobial InjectableSolution三种甲磺酸达氟沙星制剂，均为注射剂，主要用于治疗由敏感菌引起的猪、牛和禽的呼吸道、消化道感染和乳房炎。有资料显示(Lindecrona R.H.，et al.Pharmacokinetics and penetration of danogloxacin intothe gastrointestinal tract in healthy and in Salmonella typhimurium infected pigs.Research in Veterinary Science，2000，68：211-216)上述制剂在动物体内消除较快(猪t_1/2β为6.7h左右)，在使用过程中需连续多次给药才能达到治疗效果，给临床应用造成极大的不便。

微球制剂是将药物与适宜的载体通过微囊化技术制得微球，具有缓释长效、减少给药次数、提高动物的顺应性、平稳血药浓度、疗效持久、安全等优点。这类制剂的开发与应用研究，可以提升我国新型兽药制剂研发水平，为我国畜牧业养殖健康发展提供技术支撑与产品保障。关于甲磺酸达氟沙星微球制剂国内外仅有一篇报道。申请号为200810197943.2的中国专利申请采用乳化冷凝法制备得到甲磺酸达氟沙星微球制剂。该专利申请制得的甲磺酸达氟沙星微球平均粒径为10～11μm，能满足肌内注射的要求，但载药量(2.0～6.3wt％)和包封率(8.1％～16.5％)低，而且在制备过程中使用了大量的有机试剂如异丙醇、乙醚、石油醚、液体石蜡、甲醛、戊二醛等，这些试剂对人和动物均有一定的毒副作用，乙醚、石油醚等试剂易燃、易爆、易挥发，使用时存在安全隐患，并污染环境。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂及其制备方法与应用。本发明采用乳化化学交联法，以海藻酸钠、注射用大豆油、氯化钙、醋酸锌、无水乙醇等为材料制备了一种载药量高、包封率高的注射用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂，并解决了兽用临床使用需多次给药带来的不便。本发明的制剂使用简便，药效持久，生物利用度高等特点。

实现本发明的技术方案如下所示：

一种甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂，制剂中有效成分磺酸达氟沙星占微球制剂的质量百分比为11.45～21.01％，海藻酸钠多糖交联物占微球制剂的质量百分比为78.99％～88.55％，所述的甲磺酸达氟沙星被包裹或包埋在所述海藻酸钠多糖交联物中，所述微球的平均粒径为8～9μm。

一种甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的制备方法，是先将海藻酸钠和甲磺酸达氟沙星混溶于去离子水中，以注射用大豆油作为油相，高速搅拌下乳化成稳定乳液，然后滴加交联剂使乳滴固化形成微球，通过洗涤、离心、过滤、干燥，即得甲磺酸达氟沙星缓释微球。其制备方法包括以下步骤：

(1)将海藻酸钠溶解于去离子水中，45℃水浴搅拌至完全溶解，再加入0.2％抗氧化剂亚硫酸氢钠，搅拌溶解，配成海藻酸钠溶液。溶液中海藻酸钠的浓度为1％～10％(w/v)，优选为2.0％(w/v)。

(2)将甲磺酸达氟沙星用4～5mL去离子水溶解，在磁力搅拌的条件下，将甲磺酸达氟沙星溶液加至步骤(1)的海藻酸钠溶液中，40℃水浴搅拌至两者混合均匀，得到水相溶液。甲磺酸达氟沙星与海藻酸钠的质量比为0.5∶1～2∶1(w/w)，优选为1∶1(w/w)。

(3)量取注射用大豆油，加入乳化剂Span-80，搅拌均匀，得到油相溶液。乳化剂的浓度为1％～15％(w/v)，优选为5％(w/v)。

(4)称取适量的氯化钙和醋酸锌，用去离子水溶解，混合均匀，得到交联剂。交联剂中氯化钙浓度为4％～10％(w/v)，优选为6％(w/v)，醋酸锌浓度为3％～8％(w/v)，优选为4％(w/v)。

(5)水浴50～55℃中，高速搅拌的条件下，将步骤(3)的油相溶液加至步骤(2)的水相溶液中，制备成W/O型乳液。搅拌速度为800～2000r/min，优选1500r/min。乳化时间为0.5～3h，优选50min。油相溶液与水相溶液的体积比为1∶1～10∶1(v/v)，优选为1∶1(v/v)。

(6)持续高速搅拌的条件下，往步骤(5)的乳液中缓慢滴加步骤(4)所得交联剂，使乳滴固化形成微球。搅拌速度为800～2000r/min，优选为1500r/min。交联固化时间为1～5h，优选为2h。交联剂与水相溶液的体积比为1∶5～2∶1(v/v)，优选为1∶3(v/v)。

(7)在步骤(6)所得溶液中加入无水乙醇，搅拌脱水30min，离心，弃除上层液体，将沉淀用无水乙醇反复洗涤2～3次，最后将含微球的溶液用0.45μm滤膜过滤，然后40℃、0.1MPa真空干燥，得到兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。离心转速为3000～7000r/min，优选为6000r/min。

(8)利用高效液相色谱法测定步骤(7)所得制剂的含量，高效液相色谱法测定条件为：色谱柱为ZorbaxSB-Aq柱，流动相为磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)∶乙腈＝78∶22(v/v)，流速1mL/min，检测波长282nm，柱温30℃，进样量20μL。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

(1)原料天然易得：本发明所使用的缓释微球载体为海藻酸钠，是一种具有良好生物相容性和生物降解性的天然多糖，对动物体无毒、无害、无副作用。其他材料如注射用大豆油、氯化钙、醋酸锌均可以被动物吸收、利用，无任何毒副作用，且价格便宜，容易得到。

(2)本发明所涉及的微囊化技术为利用海藻酸钠能与二价阳离子发生交联反应为基础，在含有海藻酸钠-甲磺酸达氟沙星混合的稳定乳液体系中加入钙、锌离子混合溶液，促使交联反应的发生从而制备成固化的微球。

(3)反应设备、操作条件易控制。

(4)无毒无污染：本发明所需的有机试剂只有无水乙醇，对环境污染少。

(5)所得微球包封率和载药量高。

(6)所得微球制剂具有长效缓释的特点，药物释放缓慢平稳，避免多次给药引起血药浓度波动大而导致动物对药物的顺应性差等问题。该微球制剂经猪肌内注射后，在猪体内生物利用度高，消除缓慢，有效浓度维持时间长。见表1。

表1 本发明与现有技术的对比的积极效果

注：包封率＝微球中药物的量/药物投药量×100％；载药量＝微球中药物的量/微球载体量×100％

附图说明

图1：是甲磺酸达氟沙星缓释微球在光学显微镜下的图像。

图2：是甲磺酸达氟沙星缓释微球在扫描电镜下的图像。

图3：是甲磺酸达氟沙星原料药紫外光谱图。

图4：是甲磺酸达氟沙星缓释微球紫外光谱图。

图5：是空白微球紫外光谱图。

图6：是甲磺酸达氟沙星原料药红外光谱图。

图7：是空白微球红外光谱图。

图8：是甲磺酸达氟沙星缓释微球红外光谱图。

图9：是甲磺酸达氟沙星缓释微球体外释放曲线。

图10：是甲磺酸达氟沙星原料药体外释放曲线。

图11：是两种甲磺酸达氟沙星制剂在猪体内的药时曲线图。

图12：是甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂在猪可食性组织中的消除曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不以任何形式限制本发明要求保护的范围。

实施例1

本实施例甲磺酸达氟沙星缓释微球的制备方法如下：

(1)准确称取醋酸锌1.56g，氯化钙2.1g，用去离子水35mL溶解，得到含6％氯化钙和4％醋酸锌的交联剂。

(2)准确称取海藻酸钠(Sigma-Aldrich，下同)2.0g，加去离子水100mL，搅拌至完全溶解，再加入亚硫酸氢钠0.2g，在50℃水浴条件下磁力搅拌至完全溶解，得到2.0％海藻酸钠溶液。

(3)准确称取甲磺酸达氟沙星原料药(纯度100.5％，购自浙江新昌国邦兽药厂产品，下同)2.0g，用4～5mL去离子水溶解后，加入步骤(2)所得海藻酸钠溶液中，50℃水浴条件下磁力搅拌，使之混合均匀，得到水相溶液。

(4)量取注射液大豆油150mL，加入span-80(国药集团化学试剂有限公司，下同)7.5g，搅拌均匀，得到含5％ Span-80的油相溶液。

(5)在50℃水浴条件下将油相溶液步骤(4)加至水相溶液(3)中，1500r/min磁力搅拌，乳化50min。

(6)继续搅拌，向步骤(5)中缓慢滴步骤(1)加交联剂，继续搅拌2h，使海藻酸钠充分交联。

(7)停止搅拌，静置后弃上清液，用无水乙醇洗涤2～3次，用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。

(8)用仪器表征所得的制剂：

高效液相色谱法测定条件为：色谱柱为Zorbax SB-Aq柱，流动相为磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液(pH＝3.0)∶乙腈＝78∶22(v/v)，流速1mL/min，检测波长282nm，柱温30℃，进样量20μL。

本发明制得的微球为淡黄色，理化性质稳定，重复性好，平均载药量为11.45％，包封率为59.54％。

实施例2

本实施例甲磺酸达氟沙星缓释微球的制备方法如下：

(1)准确称取醋酸锌1.56g，氯化钙2.8g，用去离子水35mL溶解，得到含8％氯化钙和4％醋酸锌的交联剂。

(2)准确称取海藻酸钠2.0g，加去离子水100mL，搅拌至完全溶解，再加入亚硫酸氢钠0.2g，在50℃水浴条件下磁力搅拌至完全溶解，得到2.0％海藻酸钠溶液。

(3)准确称取甲磺酸达氟沙星原料药，纯度100.5％(来源厂商同实施例1)2.0g，用4～5mL去离子水溶解后，加入(2)所得海藻酸钠溶液中，50℃水浴条件下磁力搅拌，使之混合均匀，得到水相溶液。

(4)量取注射液大豆油150mL，加入span-80(国药集团化学试剂有限公司)7.5g，搅拌均匀，得到含5％ Span-80的油相溶液。

(5)在50℃水浴条件下将油相溶液(4)加至水相溶液(3)中，1500r/min磁力搅拌，乳化50min。

(6)继续搅拌，向(5)中缓慢滴加交联剂(1)，继续搅拌2h，使海藻酸钠充分交联。

(7)停止搅拌，静置后弃上清液，用无水乙醇洗涤2～3次，用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。

(8)按照实施例1的方法表征本例的制剂成分。

本发明制得的微球为淡黄色，理化性质稳定，重复性好，载药量为13.78％，包封率为70.28％。

实施例3

本实施例甲磺酸达氟沙星缓释微球的制备方法如下：

(1)准确称取醋酸锌1.56g，氯化钙2.8g，用去离子水35mL溶解，得到含8％氯化钙和4％醋酸锌的交联剂。

(2)准确称取海藻酸钠2.0g，加去离子水100mL，搅拌至完全溶解，再加入亚硫酸氢钠0.2g，在50℃水浴条件下磁力搅拌至完全溶解，得到2.0％海藻酸钠溶液。

(3)准确称取甲磺酸达氟沙星原料药2.0g，用4～5mL去离子水溶解后，加入(2)所得海藻酸钠溶液中，50℃水浴条件下磁力搅拌，使之混合均匀，得到水相溶液。

(4)量取注射液大豆油100mL，加入span-805.0g，搅拌均匀，得到含5％ Span-80的油相溶液。

(5)在50℃水浴条件下将油相溶液(4)加至水相溶液(3)中，1500r/min磁力搅拌，乳化50min。

(6)继续搅拌，向(5)中缓慢滴加交联剂(1)，继续搅拌2h，使海藻酸钠充分交联。

(7)停止搅拌，静置后弃上清液，用无水乙醇洗涤2～3次，用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。

(8)按照实施例1的方法表征本例的制剂成分。

本发明制得的微球为淡黄色，理化性质稳定，重复性好，载药量为15.86％，包封率为65.50％。

实施例4

本实施例的甲磺酸达氟沙星缓释微球的制备方法如下：

(1)准确称取醋酸锌1.56g，氯化钙2.1g，用去离子水35mL溶解，得到含8％氯化钙和4％醋酸锌的交联剂。

(2)准确称取海藻酸钠2.0g，加去离子水100mL，搅拌至完全溶解，再加入亚硫酸氢钠0.2g，在50℃水浴条件下磁力搅拌至完全溶解，得到2.0％海藻酸钠溶液。

(3)准确称取甲磺酸达氟沙星原料药2.0g，用4～5mL去离子水溶解后，加入(2)所得海藻酸钠溶液中，50℃水浴条件下磁力搅拌，使之混合均匀，得到水相溶液。

(4)量取注射液大豆油100mL，加入span-805.0g，搅拌均匀，得到含5％ Span-80的油相溶液。

(5)在50℃水浴条件下将油相溶液(4)加至水相溶液(3)中，1500r/min磁力搅拌，乳化50min。

(6)继续搅拌，向(5)中缓慢滴加交联剂(1)，继续搅拌2h，使海藻酸钠充分交联。

(7)停止搅拌，静置后弃上清液，用无水乙醇洗涤2～3次，用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。

(8)按照实施例1的方法表征本例的制剂成分。

本发明制得的微球为淡黄色，理化性质稳定，重复性好，载药量为19.60％，包封率为88.20％。

实施例5

本实施例甲磺酸达氟沙星微球的制备方法如下：

(1)准确称取醋酸锌1.56g，氯化钙2.8g，用去离子水35mL溶解，得到含8％氯化钙和4％醋酸锌的交联剂。

(2)准确称取海藻酸钠2.0g，加去离子水100mL，搅拌至完全溶解，再加入亚硫酸氢钠0.2g，在50℃水浴条件下磁力搅拌至完全溶解，得到2.0％海藻酸钠溶液。

(3)准确称取甲磺酸达氟沙星原料药1.6g，用4～5mL去离子水溶解后，加入(2)所得海藻酸钠溶液中，50℃水浴条件下磁力搅拌，使之混合均匀，得到水相溶液。

(4)量取注射液大豆油100mL，加入span-805.0g，搅拌均匀，得到含5％ Span-80的油相溶液。

(5)在50℃水浴条件下将油相溶液(4)加至水相溶液(3)中，1500r/min磁力搅拌，乳化50min。

(6)继续搅拌，向(5)中缓慢滴加交联剂(1)，继续搅拌2h，使海藻酸钠充分交联。

(7)停止搅拌，静置后弃上清液，用无水乙醇洗涤2～3次，用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。

(8)按照实施例1的方法表征本例的制剂成分。

本发明制得的微球为淡黄色，理化性质稳定，重复性好，载药量为11.95％，包封率为63.34％。

实施例6

本发明甲磺酸达氟沙星微球的制备方法如下：

(1)准确称取醋酸锌1.56g，氯化钙2.1g，用去离子水35mL溶解，得到含6％氯化钙和4％醋酸锌的交联剂。

(2)准确称取海藻酸钠2.0g，加去离子水100mL，搅拌至完全溶解，再加入亚硫酸氢钠0.2g，在50℃水浴条件下磁力搅拌至完全溶解，得到2.0％海藻酸钠溶液。

(3)准确称取甲磺酸达氟沙星原料药2.0g，用4～5mL去离子水溶解后，加入(2)所得海藻酸钠溶液中，50℃水浴条件下磁力搅拌，使之混合均匀，得到水相溶液。

(4)量取注射液大豆油100mL，加入span-805.0g，搅拌均匀，得到含5％ Span-80的油相溶液。

(5)在50℃水浴条件下将油相溶液(4)加至水相溶液(3)中，1500r/min磁力搅拌，乳化50min。

(6)继续搅拌，向(5)中缓慢滴加交联剂(1)，继续搅拌2h，使海藻酸钠充分交联。

(7)停止搅拌，静置后弃上清液，用无水乙醇洗涤2～3次，用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球粉末。

(8)按照实施例1的方法表征本例的制剂成分。

本发明制得的微球为淡黄色，理化性质稳定，重复性好，载药量为12.87％，包封率为70.79％。

实施例7 应用实施例(实施例4所得甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的质量研究)

制剂中的微球的外观观察：取少量干燥的甲磺酸达氟沙星缓释微球于载玻片上，用1％吐温-80溶液分散涂布均匀，分别置于电子显微镜下观察外观形态。取少量干燥的微球样品于载物台上，喷金镀膜后用扫描电镜观察微球立体结构。结果：从显微镜图(图1)和电镜图(图2)可见，微球几近呈圆球状，显微镜下分散均匀，电镜下微球表面圆整，偶见表面吸附的药物颗粒。

制剂鉴别：对甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂采用紫外分光光度计、红外光谱仪进行鉴定。

紫外光谱图：取甲磺酸达氟沙星对原料药、甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂和空白微球适量，原料药用10mmol/L磷酸盐缓冲液(PBS)配成1mg/mL的溶液，用磷酸盐缓冲液稀释若干倍后用紫外分光光度计检测，以PBS作空白对照；取空白微球和甲磺酸达氟沙星缓释微球适量于离心管中，加入PBS-EDTA溶液6mL，超声30min，振荡4h，静置过夜，待微球完全溶解，4000r/min离心15min后取上清液用PBS稀释若干倍后用紫外分光光度计检测。从图3～5可见，甲磺酸达氟沙星缓释微球和甲磺酸达氟沙星原料药的紫外光谱图基本一致，其最大吸收波长均为282nm，与《兽药质量标准(2003年版)》(中华人民共和国农业部公告第307号，2003)中甲磺酸达氟沙星的紫外鉴别结果一致，说明药物成功被吸附或包裹在微球载体内。空白微球在282nm处没有吸收峰，说明辅料不影响甲磺酸达氟沙星的检测。

红外光谱图：取空白微球、甲磺酸达氟沙星的原料药及其缓释微球适量，分别用KBr压片，用红外光谱仪检测，结果见图6～8。

图6为甲磺酸达氟沙星原料药红外光谱图。从图6可见，3427cm-1处是-COOH羧基与-OH羟基的伸缩振动；1708cm-1处是苯环上-C＝O-羰基的伸缩振动；1628cm-1处是羧基上-C＝O-羰基的伸缩振动；1545cm-1、1512cm-1、1471cm-1处是苯环伸缩振动；1337cm-1处是哌嗪环与苯环连接的C-N键的伸缩振动；1035cm-1处及1173cm-1处是苯环中C-N键的伸缩振动，原料药红外图谱中的特征吸收峰与《2003版兽药质量标准》中的甲磺酸达氟沙星的红外图谱一致。

图7为空白微球的红外光谱图。从图7可见，空白微球在3445cm-1处是-COOH羧基与-OH羟基的伸缩振动；1633cm-1处是羧基上-C＝O-羰基的伸缩振动；1384cm-1处是苯环外连接的甲氧基Ph-OMe的伸缩振动。空白微球的红外图谱中的特征吸收峰与海藻酸钠结构相符合。

图8为甲磺酸达氟沙星缓释微球光谱图。从图8可见，3445cm-1处是-COOH羧基与-OH羟基的伸缩振动；1641cm-1处是-C＝O-羰基的伸缩振动；1384cm-1处是甲氧基Ph-OMe的伸缩振动；1526cm-1处、1550cm-1处、1484cm-1处是苯环伸缩振动；1180cm-1处、1298cm-1处是C-N键的伸缩振动，甲磺酸达氟沙星缓释微球的红外图谱特征吸收峰与空白和原料药的吸收峰基本相符，其官能团主要包括辅料与甲磺酸达氟沙星原料药的主要官能团。

微球粒径：取少量干燥甲磺酸达氟沙星缓释微球于载玻片中央，滴加一滴1％吐温-80溶液，轻轻把微球涂布分散均匀，小心压上盖玻片，不留气泡，将其置于电子显微镜下观察其形态特征，进行显微拍照，在不同的视野里共观测500个微球，测量其粒子直径，并计算粒径分布。本发明制备的甲磺酸达氟沙星缓释微球粒径在15μm以内的占93.6％，以5～10μm范围内的居多，基本没有观测到粒径大于20μm的微球。微球的粒径符合用于肌肉注射的要求。见表2所示。

表2 本发明制备的制剂中的微球的平均粒径及其分布

本发明制备的制剂含量测定：准确称取甲磺酸达氟沙星缓释微球12mg于离心管中，加入提取液6mL，超声30min后，振荡4h，静置过夜，待微球完全溶解，离心后取上清液过0.45μm的滤膜，用流动相稀释100倍，用HPLC检测。

色谱条件：色谱柱为Zorbax SB-Aq(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液(pH3.0)∶乙腈＝78∶22(v∶v)；流速：1.0mL/min；紫外检测器波长：282nm；进样量：20μL；柱温：30℃。

标准曲线：准确称取甲磺酸达氟沙星对照品10mg，用磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液溶解于10mL容量瓶中并定容，配制成1mg/mL的标准储备液，-20℃保存备用。从1mg/mL的标准储备液中分别吸取适量，用磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液稀释成62.5μg/mL、12.5μg/mL、2.5μg/mL、0.5μg/mL及0.1μg/mL的标准液，用HPLC检测，每个浓度样品测定5次，不同时间内重复上述操作5次，将所得峰面积与对应添加浓度进行拟合，绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程和相关系数。在0.1μg/mL～62.5μg/mL浓度范围内，甲磺酸达氟沙星的浓度与其对应的峰面积线性关系良好，线性回归方程为y＝134520x+10313，相关系数r＝0.9999。

检测限与定量限：取空白微球加入适当浓度的标准溶液，配制一系列浓度较低的样品，按所述方法时行样品处理，用HPLC检测，每个浓度重复5次，在不同时间重复操作5次，取25次测定结果均值S和N，以达到S/N＝3时样品的最低浓度为方法的检测限，回收率和变异系数均达到定量分析要求时样品的最低浓度确定为方法的定量限。该方法的检测限为0.01μg/mL，定量限为0.02μg/mL。

准确度与精密度：准确称取空白微球12mg置于离心管中，分别添加0.1mL一定浓度的甲磺酸达氟沙星对照品溶液，使其含药物浓度分别为0.1μg/mL、2.5μg/mL和62.5μg/mL，加入PBS-EDTA溶液6mL，超声30min后，振荡4h，静置过夜，待微球完全溶解，离心后取上清液过膜，并用磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液适当稀释后，用HPLC检测。每个浓度样品测定5次，重复5天，分别计算回收率、日内和日间相对标准偏差(RSD)。在0.1～62.5μg/mL添加浓度范围内，该方法的回收率为80％～110％，日内、日间RSD＜16％，符合定量分析方法要求。见表3

表3 本方法对微球中甲磺酸达氟沙星检测的准确度与精密度

载药量和包封率测定：根据实施例4生产十批微球，测定微球中药物的包封率和载药量。其平均载药量为21.01％±1.38％，平均包封率为81.74％±2.71％，见表4。

表4 十批微球的载药量及包封率结果

实施例8 应用实施例(实施例4所得甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的稳定性研究)

影响因素试验：将甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂供试品置于玻璃培养皿中，分别进行高温、光照、高湿试验。

高温试验：将甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂供试品置于玻璃培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，于恒温恒温培养箱中60℃下放置10天，于放置后0天、第5天和第10天取样，考察高温对微球的性状、粒度、含量和有关物质的影响。

光照试验：将甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂供试品置于玻璃培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，于恒温光照培养箱中，于25℃、照度4500lx±500lx条件下放置10天，于放置后0天、第5天及第10天取样，考察强光照射对微球的性状、粒度、含量和有关物质的影响。

高湿试验：将甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂供试品置于玻璃培养皿中，摊成≤5mm厚的薄层，放置于25℃恒温恒湿培养箱中，相对湿度90％±5％条件下放置10天，于放置后0天、第5天及第10天取样，考察高湿对微球的性状、粒度、吸湿潮解性、含量和有关物质的影响。

本发明制备的缓释微球制剂分别在高温(60℃)、高湿(相对湿度90％±5％)、光照(照度4500lx±500lx)条件下放置10天，微球的药物含量明显降低，有关物质明显增加。结果表明，微球对高温、高湿及光照敏感，应该低温避光存放在干燥的地方。试验结果见表5。

表5 甲磺酸达氟沙星缓释微球影响因素试验结果(n＝3)

加速试验：将三批缓释微球制剂(批号：20080808，20080809，20080812)用棕色西林瓶进行无菌封装后，置于恒温恒湿培养箱中进行加速试验。加速试验的条件：温度为25℃±2℃，相对湿度为60％±10％，试验时间为6个月。分别于0、1、2、3、6月末取样，检测缓释微球的性状、粒度、含量和有关物质。结果表明，在温度25℃±2℃、相对湿度60％±10％的条件下，甲磺酸达氟沙星缓释微球的稳定性良好。见表6。

表6 三批微球在25℃±2℃，相对湿度60％±10％条件下加速试验结果(n＝3)

实施例9 应用实施例(实施例4所得甲磺酸达氟沙星缓释微球的体外释放研究)

将甲磺酸达氟沙星和上述实施例制备的甲磺酸达氟沙星微球制剂进行体外释放曲线的测定，采用转篮法测定：准确称取载药微球(或甲磺酸达氟沙星原料药)300mg至于预处理过的透析袋中，加入pH7.4的PBS溶液3mL，扎紧透析袋两端。然后把透析袋放入转篮中，以pH7.4的PBS溶液900mL为释放介质，在温度为38.5℃±0.5℃、转速为100rpm条件下微球的体外释放度测定。定时用注射器吸取释放介质2mL并及时补充相同体积PBS溶液。吸取的样品及时用0.45μm滤膜过滤，适当稀释后用HPLC检测甲磺酸达氟沙星含量。

实施例所制备的达氟沙星缓释微球制剂和甲磺酸达氟沙星原料药的体外累积释放曲线见图9～10。甲磺酸达氟沙星原料药在体外释放很快，1h内释放达到50％以上，18h累计释放达到96.6％。而本发明制备的甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂在24h内的甲磺酸达氟沙星的累积释放率约为46％，7天累积释放达到99.8％，比原料药释放时间增长9倍，有明显的缓释效果。微球在释放过程中的前两个小时内累积释放率约为10％，没有发生突释效应。

实施例10 应用实施例(实施例4所得甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂在猪体内的血浆药动学特征及生物利用度试验)

动物试验：选8头健康的杜长大三元杂交去势公猪(体重15kg±5kg)，按体重随机分成A、B两组，每组4头，按2×2交叉设计进行试验。试验前常规饲养观察7天，给药前禁食24h，不禁饮水。第一次给药，A组肌内注射甲磺酸达氟沙星普通注射液，B组肌内注射甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂；在第一周期结束后，间隔7天，A组肌内注射甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂，B组肌内注射甲磺酸达氟沙星普通注射液，剂量均为2.5mg/kg b.w.。

样品采集：注射甲磺酸达氟沙星普通注射剂的动物分别在给药前和给药后0.167h，0.333h，0.5h，0.667h，1h，1.5h，2h，4h，6h，9h，12h，24h，36h，48h及72h采集前腔静脉血3～5mL；注射甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的动物分别在给药前和给药后0.4h，0.667h，1h，1.5h，2h，4h，6h，9h，12h，24h，36h，48h，72h，96h及120h采集前腔静脉血液3～5mL。血液采用肝素抗凝，3000r/min离心10min，取上层血浆，密封保存于-20℃，待测。

样品处理：取血浆样品于室温自然解冻。准确吸取血浆0.5mL于10mL的离心管中，加入磷酸10μL，漩涡混合1min后，加入乙腈2mL，漩涡混合5min，8000r/min 4℃离心15min，吸取上清液。然后往沉淀中再加入乙腈1mL作二次提取。合并两次提取的上清液，50℃氮气吹干。残渣用的流动相A 0.5mL溶解，15000r/min离心15min，取上清液过0.45μm滤膜，HPLC检测。

色谱条件：色谱柱为Zorbax SB-Aq柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液(pH 3.0)∶B(乙腈)＝80∶20(V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：282nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

工作曲线：准确吸取空白猪血浆0.5mL于10mL的离心管中，添加适量甲磺酸达氟沙星标准工作液，使其药物浓度分别为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL和2μg/mL，漩涡混合1min后静置30min。按照所述的样品处理方法处理后，用HPLC测定。每个浓度样品测定5次，重复5天，将所得峰面积与对应添加浓度进行拟合，绘制工作曲线，得出回归方程。猪血浆中甲磺酸达氟沙星的浓度在0.05μg/mL～2μg/mL范围内线性关系良好，线性回归方程为y＝112925x-1840.4，相关系数r＝0.9997。

检测限与定量限：取空白猪血浆0.5mL，加入适当浓度的标准溶液，配制一系列浓度较低的样品，按所述的样品处理方法处理后，用HPLC检测。每个浓度5个重复，重复5天，取25次测定结果均值S和N，以达到S/N＝3时样品的最低浓度为方法的检测限，回收率和变异系数均达到定量分析要求时样品的最低浓度确定为方法的定量限。该方法甲磺酸达氟沙星的检测限为0.02μg/mL，定量限为0.05μg/mL。

准确度与精密度：准确吸取空白猪血浆0.5mL于10mL的离心管中，分别加入甲磺酸达氟沙星标准溶液适量，使血浆中药物浓度分别为0.05μg/mL、0.5μg/mL和2μg/mL，漩涡混合1min后静置30min。按所述方法进行样品处理，用HPLC检测。每个浓度样品5个重复，重复5天，分别计算回收率、日内和日间相对标准偏差(RSD)。血浆中甲磺酸达氟沙星添加浓度为0.05～2μg/mL时的平均回收率为88.3％～99.1％，日内和日间RSD均小于10％(见表7)。表明该方法能满足药物动力学试验。

表7 甲磺酸达氟沙星在猪血浆中的准确度与精密度结果

数据处理：用药动学软件WinNonlin(Version 5.2.1)对血药浓度-时间数据进行拟合，分别用非房室模型与房室模型模拟每头猪的药动学参数。利用药动学参数，通过房室模型公式，计算出药物在体内有效浓度维持时间。

结果与分析：两种甲磺酸达氟沙星制剂经肌内给药后，血浆中甲磺酸达氟沙星的经时过程经药动学软件WinNonlin(Version 5.2.1)程序拟合均符合有吸收二室模型，药时曲线见图11，药动学参数见表8。与普通注射剂比较，甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂在体内的吸收、分布和消除速度减慢，消除半衰期从15h延长至40h，生物利用度为普通制剂的127.5％。经计算，微球注射液的有效浓度维持时间为265.2h，为普通注射液(102.2h)的2.5倍。通过计算分析可制定微球制剂的治疗给药方案为：肌内注射，一次量，每1kg体重猪5mg，单次给药。而《兽药质量标准(2003年版)》(中华人民共和国农业部公告第307号，2003)制定甲磺酸甲磺酸达氟沙星注射液的给药方案：肌内注射，一次量，每1kg体重猪1.25～2.5mg，一日1次，连用3天。可见把甲磺酸达氟沙星制备成缓释微球可提高药物作用时间，减少给药次数，临床使用更方便。

表8 肌注给药后甲磺酸达氟沙星在猪体内的药动学参数

实施例11 应用实施例(实施例4甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂在猪体内的残留消除规律研究)

动物试验：

选择健康“杜长大”去势公猪20头，体重30kg±5kg，自由采食饮水，常规饲养观察10天后，按5mg/kgb.w.剂量于颈部肌内注射甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂1次，并标记注射部位。分别于给药后的1、3、9、27和39d随机抽取4头猪屠宰，取背最长肌、肝脏、肾脏、注射部位肌肉和腹部脂肪，均质后于-20℃保存，待测。

组织样品处理

提取：将于-20℃保存的肌肉、脂肪、肝脏、肾脏组织取出室温解冻。称取均质组织样品5g±0.01g于50mL具塞塑料离心管中，加入PBS溶液(pH7.0)8mL，乙腈2mL，漩涡混合5min，10000r/min 4℃离心10min，取上清液至100mL具塞塑料离心管中，残渣继续用10mL PBS/乙腈(v/v＝4∶1)分别提取两次。合并三次提取的上清液，加入正己烷30mL，漩涡混合20min，3000r/min离心8min，弃掉正己烷层。下层液体中加入0.2mol/L HCl溶液6mL，混合均匀后5000r/min离心10min，上清液用PCX固相萃取小柱净化。

净化：先用甲醇3mL、去离子水3mL、0.2mol/L HCl溶液3mL活化，上样，然后用2％盐酸酸化甲醇3mL及0.2mol/L HCl溶液3mL淋洗，用真空固相萃取装置抽干，用6％氨水氨化甲醇6mL洗脱药物，收集洗脱液，50℃水浴氮气吹干，残渣用1mL流动相A溶解后于15000r/min离心10min，取上清液用HPLC检测。

色谱条件：色谱柱为Zorbax SB-Aq柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：A(磷酸二氢钾-柠檬酸缓冲液，pH 3.0)∶B(乙腈)＝82∶18(V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：282nm；柱温：30℃；进样量：50μL。

工作曲线：取空白肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织5.0g，加入适量甲磺酸达氟沙星标准溶液，使组织中含药物浓度分别为20μg/kg、100μg/kg、500μg/kg、2500μg/kg和4000μg/kg，按照所述方法进行处理，用HPLC检测，每个浓度样品5个重复，不同时间重复上述操作5次，将所得峰面积与对应添加浓度进行拟合，绘制工作曲线。结果表明，在20～4000μg/kg浓度范围内，甲磺酸达氟沙星在猪的4种可食性组织中的浓度与其对应的峰面积具有良好的线性关系，相关系数(r)均在0.999以上。

检测限与定量限：取空白猪肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织5.0g，加入适当浓度的甲磺酸达氟沙星标准溶液，使样品中含有较低浓度的药物，按照所述方法进行样品处理后，用HPLC检测，每个浓度重复5次，在不同时间重复操作5次，取25次测定结果均值S和N，以达到S/N＝3时样品的最低浓度为该方法的检测限，回收率和变异系数均达到定量分析要求时样品的最低浓度确定为方法的定量限。该方法对4种组织中甲磺酸达氟沙星的检测限均为10μg/kg，定量限均为20μg/kg。

准确度与精密度：取空白猪肌肉、肝脏、肾脏、脂肪组织5.0g，加入适当浓度的甲磺酸达氟沙星标准溶液，使肌肉中药物浓度分别为20μg/kg、00μg/kg、200μg/kg；使肝脏和肾脏中药物浓度分别为20μg/kg、200μg/kg、400μg/kg；使脂肪中药物浓度分别为20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg。按照所述方法进行样品处理，用HPLC检测，每个浓度样品测定5次，重复5天，分别计算回收率、日内和日间相对标准偏差(RSD)。结果显示，在添加浓度范围内，甲磺酸达氟沙星在4种组织中的平均回收率均在80％～100％之间，日间相对标准偏差RSD＜10％，符合兽药残留定量检测方法要求。见表9

表9 甲磺酸达氟沙星在猪的各种可食性组织中准确度与精密度结果

数据处理：采集的组织样品按所述方法处理后用HPLC检测，计算出各时间点每种组织中甲磺酸达氟沙星残留浓度，采用EMEA推荐的方法，用休药期软件WT1.4以双侧95％置信限计算这两种药物在各组织中的休药期。

结果与分析：给猪肌内注射5mg/kg b.w.甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂后，各可食性组织中的残留消除曲线如图12所示，各可食性组织在各屠宰点的残留量结果如表10。通过软件计算分析，得出各可食性组织(除注射部位外)的休药期为：肌肉38.8d、肝脏39.0d、肾脏35.2d、脂肪36.0d。综合分析，建议甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的休药期不少于39天。

表10 甲磺酸达氟沙星在猪的各种可食性组织中残留量

注：ND为药物浓度低于检测方法定量限；(n)表示括号内为能检测到药物浓度的样本数。

Claims (6)

1.一种兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂，其特征在于，所述制剂甲磺酸达氟沙星微球包含甲磺酸达氟沙星和海藻酸钠多糖交联物，按质量百分比计，甲磺酸达氟沙星占微球重量的11.45～21.01％，海藻酸钠多糖交联物占微球重量的78.99～88.55％，所述甲磺酸达氟沙星被包裹或包埋在在所述海藻酸钠多糖交联物中，所述微球的平均粒径在8～9μm，载药量按w/w计为11.45％～21.01％，药物包封率按w/w计为59.54～88.20％，

其是通过包含如下步骤制备的：

(1)配制水相溶液：将海藻酸钠、抗氧化剂加去离子水溶解，水浴加热搅拌至完全溶解后，加入甲磺酸达氟沙星水溶液，继续搅拌至混合均匀，得到水相溶液；

(2)配制油相溶液：量取注射用大豆油，加入乳化剂，搅拌均匀，得到油相溶液；

(3)乳化：在水浴加热高速搅拌的条件下，将步骤(2)的油相溶液加至步骤(1)的水相溶液中，乳化，制备成W/O型乳液；

(4)交联固化：在持续高速搅拌的条件下，往步骤(3)所得乳液中缓慢滴加交联剂进行交联固化，使乳滴固化形成微球；

(5)在步骤(4)所得溶液中加入无水乙醇，搅拌脱水30min，离心，弃去上层液体，将沉淀用无水乙醇反复洗涤2～3次，最后将含微球的溶液用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1Mpa下真空干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂粉末；

其中

步骤(1)所述抗氧化剂为亚硫酸氢钙，其浓度按W/V计为0.2％，所述水相溶液中海藻酸钠的质量百分比浓度按W/W计为1～10％，甲磺酸达氟沙星与海藻酸钠的质量比为0.5∶1～2∶1，水浴加热温度为40℃；

步骤(2)所述乳化剂为Span-80，其在油相中的质量体积比浓度为1～15％；

步骤(3)水浴加热温度为50～55℃，搅拌速度为800～2000r/min；油相溶液与水相溶液的体积比为1～10∶1，乳化时间为0.5～3h；

步骤(4)所述搅拌速度为800～2000r/min，交联时间为1～5h，交联剂为氯化钙-醋酸锌溶液，其中氯化钙-醋酸锌溶液中的氯化钙浓度为4～10％，醋酸锌浓度为3～8％，交联剂与水相溶液的体积比为1∶5～2∶1；

步骤(5)所述离心转速为3000～7000r/min。

2.权利要求1所述兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂，其特征在于

步骤(1)所述海藻酸钠的质量百分比浓度为2.0％，甲磺酸达氟沙星与海藻酸钠的质量比为1∶1；

步骤(2)所述乳化剂为Span-80在油相中的质量体积比为5％；

步骤(3)的水浴加热温度为50～55℃，搅拌速度为1500r/min，所述油相溶液与水相溶液的体积比为1∶1，乳化时间为50min；

步骤(4)的搅拌速度为1500r/min，交联时间为2h，所述氯化钙-醋酸锌溶液中的氯化钙浓度为6％，醋酸锌浓度为4％，所述的交联剂与水相溶液的体积比为1∶3；

步骤(5)的离心转速为6000r/min。

3.权利要求1所述兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的制备方法，其特征在于，先将海藻酸钠和甲磺酸达氟沙星混溶于去离子水中，以注射用大豆油作为油相，高速搅拌下乳化成稳定乳液，然后滴加交联剂使乳滴固化形成微球，通过洗涤、离心、过滤、干燥，即得甲磺酸达氟沙星缓释微球，其步骤包括：

(1)配制水相溶液：将海藻酸钠、抗氧化剂加去离子水溶解，水浴加热搅拌至完全溶解后，加入甲磺酸达氟沙星水溶液，继续搅拌至混合均匀，得到水相溶液；

(2)配制油相溶液：量取注射用大豆油，加入乳化剂，搅拌均匀，得到油相溶液；

(3)乳化：在水浴加热高速搅拌的条件下，将步骤(2)的油相溶液加至步骤(1)的水相溶液中，乳化，制备成W/O型乳液；

(4)交联固化：在持续高速搅拌的条件下，往步骤(3)所得乳液中缓慢滴加交联剂进行交联固化，使乳滴固化形成微球；

(5)在步骤(4)所得溶液中加入无水乙醇，搅拌脱水30min，离心，弃去上层液体，将沉淀用无水乙醇反复洗涤2～3次，最后将含微球的溶液用0.45μm滤膜过滤，40℃、0.1MPa真空干燥，得到甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂粉末；

其中

步骤(1)所述抗氧化剂为亚硫酸氢钙，其浓度按W/V计为0.2％，所述水相溶液中海藻酸钠的质量百分比浓度按W/W计为1～10％，甲磺酸达氟沙星与海藻酸钠的质量比为0.5∶1～2∶1，水浴加热温度为40℃；

步骤(2)所述乳化剂为Span-80，其在油相中的质量体积比浓度按w/v计为1～15％；

步骤(3)水浴加热温度为50～55℃，搅拌速度为800～2000r/min；油相溶液与水相溶液的体积比为1～10∶1，乳化时间为0.5～3h；

步骤(4)所述搅拌速度为800～2000r/min，交联时间为1～5h，交联剂为氯化钙-醋酸锌溶液，其中氯化钙-醋酸锌溶液中的氯化钙浓度为4～10％，醋酸锌浓度为3～8％，交联剂与水相溶液的体积比为1∶5～2∶1；

步骤(5)所述离心转速为3000～7000r/min。

4.权利要求3所述兽用甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂的制备方法，其特征在于

步骤(1)所述海藻酸钠的质量百分比浓度为2.0％，甲磺酸达氟沙星与海藻酸钠的质量比为1∶1；

步骤(2)所述乳化剂为Span-80在油相中的质量体积比为5％；

步骤(3)的水浴加热温度为50～55℃，搅拌速度为1500r/min，所述油相溶液与水相溶液的体积比为1∶1，乳化时间为50min；

步骤(4)的搅拌速度为1500r/min，交联时间为2h，所述氯化钙-醋酸锌溶液中的氯化钙浓度为6％，醋酸锌浓度为4％，所述的交联剂与水相溶液的体积比为1∶3；

步骤(5)的离心转速为6000r/min。

5.权利要求1所述的甲磺酸达氟沙星缓释微球制剂在畜禽药学中可接受的应用，其中包括在治疗畜禽敏感性细菌引起的呼吸道或消化道感染中的应用。

6.权利要求5的应用，其特征在于，所述的方法是，以甲磺酸达氟沙星计，肌内注射一次，给药剂量为每1kg体重5mg/kg b.w。

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