CN102550390A - 一种利用白菜型油菜拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用白菜型油菜拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法，包括利用甘蓝型油菜与甘蓝杂交，染色体加倍获得一种六倍体，将六倍体与遗传变异丰富的白菜型油菜杂交，获得新型甘蓝型油菜。其特征是以六倍体为桥梁，与遗传变异丰富的白菜型油菜杂交，可以快速、简便有效地获得具白菜型油菜遗传成分的新型甘蓝型油菜，拓宽现有甘蓝型油菜的种质资源。
Description
技术领域
本发明属于植物新品系选育技术领域，具体涉及到一种利用白菜型油菜拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法。其国际专利分类号为A01H1/04。
背景技术
甘蓝型油菜（Brassica napus，AACC）是由白菜型油菜（B. rapa，AA）和甘蓝（B. oleracea，CC）自然杂交，染色体加倍进化而来的异源四倍体。与白菜型油菜相比，甘蓝型油菜狭窄的遗传基础限制了其遗传改良。利用白菜型油菜的遗传变异创建新型甘蓝型油菜是拓宽甘蓝型油菜种质资源的重要途径。
传统创建新型甘蓝型油菜的方法有两种，一种是通过甘蓝与白菜型油菜杂交，获得的人工合成甘蓝型油菜。该方法虽然能有效拓宽现有甘蓝型油菜的遗传基础（参见Seyis 等. Plant Breeding. 2003，122：473-478），但是由于白菜型油菜与甘蓝的杂交亲和性障碍，需采用胚挽救等技术获得杂种(参见Wen等. Euphytica. 2008，162：81-89)，并且获得的人工合成甘蓝型油菜自交结实性差，其倍性稳定需要的周期长（参见Robert 等Plant Cell. 2007，19：3403-3417），这些不足限制了该方法的广泛使用。另外一种方法，通过甘蓝型油菜与白菜型油菜杂交，然后对杂交后代或者与甘蓝型油菜回交后代进行选育，获得含有白菜型油菜遗传背景的甘蓝型油菜。该方法虽然被育种家广为采用，但是因为杂交的低世代出现大量非整倍体，使得选育的周期长，选育的过程繁琐。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便、快速有效地利用白菜型油菜广泛的遗传变异创建甘蓝型油菜的方法，拓宽甘蓝型油菜遗传基础。
本发明方法是将传统的利用白菜型油菜与甘蓝杂交获得新型甘蓝型油菜，和利用白菜型油菜与甘蓝型油菜杂交，在后代中选育新型甘蓝型油菜的方法，革新为利用基因型为AACCCC六倍体为桥梁，与白菜型油菜有性杂交，获得新型甘蓝型油菜的方法。从而达到利用白菜型油菜的遗传基础拓宽现有甘蓝型油菜种质资源。
本发明的具体方法如下：
本方法通过用甘蓝（CC）与现有双低优良性状的甘蓝型油菜(AACC)杂交、染色体加倍获得一种六倍体（AACCCC），以该六倍体为桥梁，与白菜型油菜杂交，创建新型甘蓝型油菜，拓宽甘蓝型油菜遗传基础，具体包括以下步骤：
1.六倍体的获得
选取优良的甘蓝型油菜与甘蓝有性杂交，授粉7-10天后对幼胚进行胚挽救获得种间杂种。利用秋水仙碱诱导染色体加倍，或者组织培养中，植株自然加倍，获得异源六倍体。
2.新型甘蓝型油菜的创建
以六倍体作为母本，人工去雄，授予遗传变异丰富的白菜型油菜花粉，或者以白菜型油菜为母本，授予六倍体的花粉，种子成熟后收获，获得新型甘蓝型油菜。
3.新型甘蓝型油菜的鉴定
利用形态学、花粉育性以及细胞学观察来鉴定获得的新型甘蓝型油菜。获得的新型甘蓝型油菜形态介于亲本之间，有较好的花粉育性育性，染色体数目为38条。
本发明的优点：本发明通过甘蓝型油菜与甘蓝杂交合成异源六倍体，并以六倍体作为桥梁，与遗传变异丰富的白菜型油菜杂交，获得具有白菜型油菜遗传成分的甘蓝型油菜。该方法简便、快速有效地利用白菜型油菜广泛的遗传变异拓宽现有甘蓝型油菜种质资源。
具体实施方式
以下为本发明方法的一种具体实施方式，但并不是对本发明方法的限定，任何不超离本发明实质内容的变换，仍应属于本发明的保护范围。
实施例1：
1.六倍体的获得
以甘蓝（品系为K154-2）为母本，剥蕾去雄，授予甘蓝型油菜（品系为GH-6）的花粉，有性杂交；或者以甘蓝型油菜（品系为GH-6）为母本，剥蕾去雄，授予甘蓝（品系为K154-2）的花粉，有性杂交。以甘蓝型油菜中双9号作为母本，剥蕾去雄，授予甘蓝（品系R9054）的花粉，有性杂交。采用胚挽救方式获得种间杂种试管苗。通过快繁技术获得大量的试管苗，利用秋水仙碱诱导染色体加倍，或者组织培养中，植株自然加倍，获得三种杂交方式的六倍体株系，分别是H-1，H-2，H-3。
胚挽救方法具体步骤是：摘取授粉7-10天后的子房，70%的酒精灭菌30s，无菌水洗一次，用10 %的次氯酸钠表面消毒15min，无菌水洗三次，每次5min，剥离幼胚，接种到含有2%蔗糖，1/2 MS培养基中。（1/2 MS培养基的成分是NH4NO3（825mg/L）+ KNO3(950mg/L) + CaCl2.2H2O (220mg/L) + MgSO4.7H2O (185mg/L) + KH2PO4 (85mg/L) + KI (0.83mg/L) + H3BO3 (6.2mg/L) + MnSO4.4H2O (22.3mg/L) + ZnSO4.7H2O (8.6mg/L) + Na2MoO4.2H2O (0.25mg/L) + CuSO4.5H2O (0.025mg/L) + CoCl2.6H2O (0.025mg/L) + Na2EDTA (37.3mg/L) + FeSO4.7H2O (27.8mg/L) + 肌醇 (100mg/L) + 烟酸 (0.5mg/L) + 盐酸吡哆醇（VB6） (0.5mg/L) + VB1 (0.1mg/L) + 甘氨酸（2.0mg/L））。放置到18小时光照，8小时暗处理，20℃的光照培养室中培育。
秋水仙碱诱导具体方法：对发芽的植株转入MS + 3mg/L IBA + 0.2mg/L NAA培养基中快繁2-3次，获得大量植株用于秋水仙碱诱导加倍。实验材料于100mg/L秋水仙碱 + MS + 3mg/L IBA + 0.2mg/L NAA培养基中培养7-10天，发现膨大愈伤后，然后转入MS + 3mg/L IBA + 0.2mg/L NAA的培养基中培养15-20天成苗，最后转入MS + 0.5mg/L IBA生根。种植田间，检测其花粉育性和结实性，筛选染色体加倍成功的六倍体。
2.新型甘蓝型油菜的创建
以六倍体植株H-1，H-2,和H-3为母本，进行人工去雄，授予白菜型油菜花粉，或者以白菜型油菜为母本，授予六倍体的花粉，有性杂交。获得新型甘蓝型油菜。
实施例2
以甘蓝（品系为K154-2）与甘蓝型油菜（品系为GH-6）杂交获得的六倍体（H-1）作为母本，人工去雄，授予两个春性白菜型油菜（Pusa Kalyani，Tori 7）、两个冬性白菜型油菜（Svalof 0308，CGN07221）和半冬性白菜型油菜（Si Yue Man，6Y733，6Y812, 7F158,7F159,7F161,7F267）的花粉。发现六倍体与不同生态型的白菜型油菜杂交的可交配性均强，达到平均结实率为8.76粒/荚。种子成熟，获得新型甘蓝型油菜。
实施例3
以甘蓝型油菜（品系为GH-6）与羽衣甘蓝（品系为K154-2）杂交获得的六倍体（H-2）作为母本，人工去雄，授予半冬性油菜（Si Yue Man，6Y733，6Y812，Chiffu，7F180,7F181,7F182,7F183），两个春性白菜型油菜（Pusa Kalyani，Tori 7）、两个冬性白菜型油菜（Svalof 0308，CGN07221）的花粉，以及白菜型油菜7F018与7F136的杂交种QF032花粉，其与不同生态型的白菜型油菜杂交的可交配性均强，平均结实率为8.2粒/荚。以6Y812作为母本，与H-2杂交的结籽率为6.49粒/荚。种子成熟，获得新型甘蓝型油菜。
实施例4
以甘蓝型油菜中双9号与甘蓝（品系R9054）杂交获得的六倍体（H-3）作为母本，授予白菜型油菜6Y733的花粉，结籽率为2.3粒/荚；反交的结籽率为4.42粒/荚。种子成熟，获得新型甘蓝型油菜。
以上获得的新型甘蓝型油菜的鉴定：
对新型甘蓝型油菜进行形态学，花粉育性和细胞学的鉴定。鉴定结果显示，所有的六倍体与白菜型油菜的杂交种的形态介于六倍体与白菜型油菜之间，花粉育性平均为90.54%，染色体数目与甘蓝型油菜的染色体数目一致，为38条。
花粉育性鉴定的具体方法：天气晴朗，取当天新开的花2朵，取出长、短雄蕊各一枚，滴一滴醋酸洋红染液，将花粉抖落在玻片上，在显微镜下观察、计数。大而圆，且能被染成红色的为可育花粉，不能被染上色的小而瘪的花粉为不育花粉。每单株观察花粉的总数在200-300个左右。
细胞学鉴定的具体方法：取植株幼小花蕾，用0.002M的8-羟基喹啉处理，并置于室温（25℃）中，处理3-4h后用卡诺固定液（乙醇:冰醋酸 = 3:1）固定24h以上，4℃保存。固定好的子房用1M HCl在60℃恒温水浴锅中水解8min，用10%改良卡宝品红染色敲片压片，在显微镜下观察并记录染色体数目。
Claims (3)
1.一种利用白菜型油菜拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法，其特征在于：
所述本方法通过用甘蓝（CC）与甘蓝型油菜(AACC)杂交、染色体加倍获得一种六倍体（AACCCC），以该六倍体为桥梁，与白菜型油菜杂交，创建新型甘蓝型油菜，具体包括以下步骤：
（1）六倍体的获得
选取甘蓝型油菜(AACC)与甘蓝（CC）有性杂交，授粉7-10天后对幼胚进行胚挽救获得种间杂种；然后利用秋水仙碱诱导染色体加倍，或者组织培养中，植株自然加倍，获得基因组结构为AACCCC的异源六倍体；
（2）新型甘蓝型油菜的创建
以所述异源六倍体作为母本，人工去雄，授予白菜型油菜花粉，或者以白菜型油菜为母本，授予六倍体的花粉，种子成熟后收获，获得新型甘蓝型油菜。
2.根据权利要求书1所述的利用白菜型油菜拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法，其特征在于：所述胚挽救方法具体步骤是：摘取授粉7-10天后的子房，70%的酒精灭菌30s，无菌水洗一次，用10 %的次氯酸钠表面消毒15min，无菌水洗三次，每次5min，剥离幼胚，接种到含有2%蔗糖，1/2 MS培养基中，放置到18小时光照，8小时暗处理，20 ℃的光照培养室中培育。
3.根据权利要求书1和2所述的利用白菜型油菜拓宽甘蓝型油菜遗传变异的方法，其特征在于：所述利用秋水仙碱诱导染色体加倍的具体方法如下：对发芽的植株转入MS + 3mg/L IBA + 0.2mg/L NAA培养基中快繁2-3次，获得大量植株用于秋水仙碱诱导加倍；实验材料于100mg/L秋水仙碱 + MS + 3mg/L IBA + 0.2mg/L NAA培养基中培养7-10天，发现膨大愈伤后，然后转入MS + 3mg/L IBA + 0.2mg/L NAA的培养基中培养15-20天成苗，最后转入MS + 0.5mg/L IBA生根；种植田间，检测其花粉育性和结实性，筛选染色体加倍成功的六倍体。
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