CN105918104A - 一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，解决了现有选育方法均需要经过胚挽救等技术，导致操作繁琐的问题。本发明包括利用甘蓝型油菜AnAnCnCn与白菜型油菜ArAr杂交获得三倍体种子AnArCn，三倍体种子AnArCn再经过人工诱导染色体加倍获得人工六倍体AnAnArArCnCn，将该人工六倍体AnAnArArCnCn与甘蓝CoCo杂交，获得新型甘蓝型油菜AnArCnCo。本发明具有简化操作步骤，能快速利用甘蓝广泛的遗传变异拓宽甘蓝型油菜的遗传基础等效果。

Description

一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法
技术领域
本发明涉及一种植物新品系选育方法，具体涉及一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法。
背景技术
甘蓝型油菜（Brassica napus, AnAnCnCn）是由白菜型油菜（Brassica rapa, ArAr）和甘蓝（Brassica oleracea, CoCo）自然杂交，染色体自然加倍进化而来的异源四倍体。与亲本种甘蓝相比，甘蓝型油菜进化和驯化历史短，遗传资源相对狭窄，利用甘蓝丰富的遗传变异创建新型甘蓝型油菜是改良和拓宽甘蓝型油菜现有种质资源的重要途径。
传统利用甘蓝资源创建新型甘蓝型油菜的方法有两种，一种是通过甘蓝与白菜型油菜杂交，创建人工合成的甘蓝型油菜。另外一种方法，则是通过甘蓝型油菜与甘蓝杂交，获得三倍体（AnCnCo），然后对杂交后代的不断自交，或者与甘蓝型油菜回交，选育含有甘蓝遗传背景的甘蓝型油菜（Li 等 Molecular Breeding 2014）。
采用上述两种方法，虽然能有效拓宽现有甘蓝型油菜的遗传基础，但是由于甘蓝与白菜型油菜之间、以及甘蓝与甘蓝型油菜之间的杂交亲和性障碍，导致两种方法均需采用胚挽救等技术获得杂种，否则会导致不能结实的情况产生，因而操作十分繁琐。
并且采用第一种方法时，获得的人工合成甘蓝型油菜自交结实性差，其染色体倍性稳定需要的周期较长，这些不足限制了该方法的广泛使用。而采用第二种方法时，一旦选出甘蓝型油菜类型，育性迅速恢复，但是获得的三倍体育性低，自交和杂交难结籽，使选育产生难度，育种周期也较长，选育过程繁琐。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：现有选育方法均需要经过胚挽救等技术，导致操作繁琐的问题，提供解决上述问题的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，包括利用甘蓝型油菜AnAnCnCn与白菜型油菜ArAr杂交获得三倍体种子AnArCn，三倍体种子AnArCn再经过人工诱导染色体加倍获得人工六倍体AnAnArArCnCn，将该人工六倍体AnAnArArCnCn与甘蓝CoCo杂交，获得新型甘蓝型油菜AnArCnCo。
发明人发现，由于六倍体AnAnArArCnCn与甘蓝CoCo的亲和性较高，在自然条件下可自然杂交结实。因而，本发明通过选育步骤的优化，先采用甘蓝型油菜AnAnCnCn与白菜型油菜ArAr杂交后，再经过染色体加倍处理获得六倍体AnAnArArCnCn，通过六倍体AnAnArArCnCn与甘蓝CoCo杂交获得新型甘蓝型油菜AnArCnCo。通过该步骤的优化后能有效避免甘蓝CoCo与甘蓝型油菜AnAnCnCn之间需要经过胚挽救才能结实的情况，进而使本发明选育的整个过程中均不需要进行胚挽救，操作更加简单。An、Ar、Cn、Co代表不同的基因组。
并且六倍体与甘蓝的杂交在田间自然条件下可成功，因而容易将多个品种的甘蓝的遗传物质转移到甘蓝型油菜中，能有效利用甘蓝广泛的遗传变异拓宽甘蓝型油菜的遗传基础。
本发明中的六倍体可长期使用，无需重复创建，极大地节约后期采用不同遗传变异性能甘蓝对甘蓝型油菜遗传多样性拓宽的时间。
本发明的具体培育过程包括：
（1）三倍体的获得
以甘蓝型油菜为母本，人工去雄，授以白菜型油菜花粉，田间自然条件下生长，至成熟期收获命名为T1的杂种种子AnArCn。或以白菜型油菜为母本，人工去雄，授以甘蓝型油菜花粉，田间自然条件下生长，至成熟期收获命名为T2的杂种种子AnArCn。
（2）六倍体的获得
将步骤（1）中收获的种子T1或T2进行表面消毒后，置于MS固体培养基上萌发获得组培苗，再将长出的组培苗转移到含100 mg/L秋水仙碱的分化培养基中诱导染色体加倍，获得与T1对应且命名为D1的人工六倍体AnAnArArCnCn，获得与T2对应且命名为D2的人工六倍体AnAnArArCnCn。
本步骤中组培苗的具体获得步骤为：
三倍体种子T1或T2经70%的酒精灭菌30s，无菌水洗3min，再用10 %的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水洗三次，每次5min，然后接种于MS培养基中，放置在18小时光照、8小时黑暗和20 ℃的光照培养室中培育后即获得组培苗。
为了达到更高的诱导效率，所述组培苗需先转入分化培养基中快繁2～3次，再转入MS培养基中培养后筛选出用于秋水仙碱诱导加倍的健壮组培苗。
本步骤中秋水仙碱诱导的具体方法为：
将上述健壮组培苗置于含100mg/L秋水仙碱的分化培养基中避光暗培养7～10天，植物组织出现膨大愈伤后，再将愈伤组织转入分化培养基中培养20～25天成苗，最后转入生根培养基中培养生根。
（3）新型甘蓝型油菜的创建
以六倍体D1或D2作为母本，人工去雄，分别授以遗传变异丰富的多种甘蓝的花粉，或者以多种甘蓝为母本，人工去雄后授予六倍体D1或D2的花粉，田间自然条件下生长，种子成熟后收获，获得新型甘蓝型油菜AnArCnCo。
本发明中，所述分化培养基由以下组分组成：
MS培养基，终浓度为3mg/L的6-BA，以及终浓度为0.2mg/L的NAA；
所述生根培养基由以下组分组成：
MS培养基，终浓度为0.5mg/L的IBA。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
1、本发明整个过程不需要进行胚挽救，因而该方法操作更加简便、周期短；
2、本发明的六倍体在自然条件下自交可结实，六倍体可长期使用，无需重复创建，节约大量六倍体重新培育的时间，能快速利用甘蓝广泛的遗传变异拓宽甘蓝型油菜的遗传基础；
3、六倍体与甘蓝的杂交在田间自然条件下可成功，容易将多份甘蓝的遗传物质转移到甘蓝型油菜中，操作更加简便容易。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例1
一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，包括：
以品系为中双11号的甘蓝型油菜为母本，品系为6Y733的白菜型油菜为父本，杂交后获得三倍体T1，采用染色体加倍后获得六倍体D1；以D1为母本人工去雄，分别授予3个栽培甘蓝和5个野生甘蓝的花粉，杂交后获得不同类型的新型甘蓝型油菜。
上述八个类型的甘蓝包括3个栽培甘蓝和5个野生甘蓝，其中3个栽培甘蓝分别为编号为①的白花芥蓝（Brassica alboglabra），编号为②的羽衣甘蓝（Brassica oleracea L. var. acephala），编号为③的抱子甘蓝（Brassica olerace var germmifera）。上述5个野生甘蓝均从欧洲各种质资源库征集而来，分别为编号为④的Brassica incana Ten.，从德国IPK institution征集，征集代号BRA1166；编号为⑤的Brassica montana Pourr.，从西班牙UPM大学征集, 征集代号651-6816-85；编号为⑥的Brassica insularis Moris.，从德国IPK征集,征集代号K8934；编号为⑦的Brassica villosa，从德国IPK征集,征集代号BRA2853；编号为⑧的Brassica bourgeaui，从西班牙UPM大学征集, 征集代号8856。
对本实施例获得的新型甘蓝型油菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数目均为38条。然后对六倍体D1与不同编号类型甘蓝杂交的结实率进行统计，统计结果如表1所示。同时，对上述不同编号类型甘蓝杂交后获得的新型甘蓝型油菜进行培育，上述不同类型的新型甘蓝型油菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺性状差异明显，遗传多样性丰富。本实施例还采用上述不同类型的新型甘蓝型油菜进行自交，对自交后的新型甘蓝型油菜的结实率进行统计，统计结果如表1所示。
表1
上述六倍体D1与不同类型甘蓝杂交的平均结实率为4.36粒/荚，上述新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率为7.01粒/荚。
实施例2
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中D1为父本，甘蓝为母本，甘蓝种类与实施例1中相同，杂交后获得新型甘蓝型油菜。
对本实施例杂交后获得的新型甘蓝型油菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数目均为38条，上述多份新型甘蓝型油菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺性状差异明显，遗传多样性丰富。
按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D1与不同类型甘蓝杂交后的平均结实率，以及不同类型的新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为3.15粒/荚，该自交结实率为4.11粒/荚。
实施例3
本实施例与实施例1的区别在于：本实施例中白菜型油菜6Y733为母本，甘蓝型油菜中双11号为父本，杂交后获得三倍体T2，采用染色体加倍后获得六倍体D2。以D2为母本，人工去雄，分别授予3个栽培甘蓝和5个野生甘蓝的花粉，杂交后获得不同类型的新型甘蓝型油菜。本实施例中该甘蓝种类与实施例1中相同。
对本实施例杂交后获得的新型甘蓝型油菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数目均为38条，上述多份新型甘蓝型油菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺性状差异明显，遗传多样性丰富。
按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D2与不同类型甘蓝杂交后的平均结实率，以及不同类型的新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为4.97粒/荚，自交结实率为8.48粒/荚。
实施例4
本实施例与实施例3的区别在于，本实施例中D2为父本，甘蓝为母本，甘蓝种类与实施例3中相同，杂交后获得新型甘蓝型油菜。
对本实施例杂交后获得的新型甘蓝型油菜的染色体数目进行检测，发现它们的染色体数目均为38条，上述多份新型甘蓝型油菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺性状差异明显，遗传多样性丰富。
按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D1与不同类型甘蓝杂交后的平均结实率，以及不同类型的新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为2.17粒/荚，该自交结实率为9.31粒/荚。
实施例5
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中甘蓝型油菜和白菜型油菜的品系不同，其他均与实施例1相同。
本实施例中该甘蓝型油菜的品系为中双9号，白菜型油菜的品系为5W394。按照实施例1中相同的检测方法检测六倍体D3与甘蓝杂交后的平均结实率，以及不同类型的新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率，该杂交结实率为5.96粒/荚，该自交结实率为8.21粒/荚。新型甘蓝型油菜的叶型、花色、株高、分枝数目和形态、开花期等多种农艺性状差异明显，遗传多样性丰富。
实施例6
本实施例与实施例1的区别在于，本实施例中甘蓝型油菜和甘蓝的品系不同，本实施例中选择为品系是中双9号的甘蓝型油菜，同时选择品系是R9054的甘蓝。
本实施例中甘蓝型油菜为母本，白菜型油菜为父本，杂交，染色体加倍获得六倍体D4，或甘蓝型油菜为父本，白菜型油菜为母本，杂交，染色体加倍获得六倍体D5。
D4为母本、甘蓝为父本杂交后的平均结实率为3.84，该新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率为7.63。
D4为父本、甘蓝为母本杂交后的平均结实率为2.66，该新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率为6.38。
D5为母本、甘蓝为父本杂交后的平均结实率为4.65，该新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率为8.92。
D5为父本、甘蓝为母本杂交后的平均结实率为2.97，该新型甘蓝型油菜自交后的平均结实率为6.28。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1. 一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，包括利用甘蓝型油菜AnAnCnCn与白菜型油菜ArAr杂交获得三倍体种子AnArCn，三倍体种子AnArCn再经过人工诱导染色体加倍获得人工六倍体AnAnArArCnCn，将该人工六倍体AnAnArArCnCn与甘蓝CoCo杂交，获得新型甘蓝型油菜AnArCnCo。
2. 根据权利要求1所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜AnAnCnCn为母本，剥蕾去雄，授予白菜型油菜ArAr的花粉，有性杂交获得三倍体种子AnArCn，三倍体种子AnArCn再经过人工诱导染色体加倍获得命名为D1的人工六倍体AnAnArArCnCn。
3. 根据权利要求1所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，所述白菜型油菜ArAr为母本，剥蕾去雄，授予甘蓝型油菜AnAnCnCn的花粉，有性杂交获得三倍体种子AnArCn，三倍体种子AnArCn再经过人工诱导染色体加倍获得命名为D2的人工六倍体AnAnArArCnCn。
4. 根据权利要求2或3所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，所述人工诱导染色体加倍的过程为：
将三倍体种子AnArCn通过无菌处理后置于MS培养基上培养获得组培苗，采用含100mg/L秋水仙碱的分化培养基诱导该组培苗分化出染色体加倍的人工六倍体AnAnArArCnCn。
5. 根据权利要求4所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，所述组培苗的获得步骤为：
三倍体种子AnArCn经70%的酒精灭菌30s，无菌水洗3min，再用10 %的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水洗三次，每次5min，然后接种于MS培养基中，放置在18小时光照、8小时黑暗和20 ℃的光照培养室中培育后获得组培苗。
6. 根据权利要求4所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，所述秋水仙碱诱导的具体方法为：
将组培苗置于含100mg/L秋水仙碱的分化培养基中避光暗培养7～10天，植物组织出现膨大愈伤后，再将愈伤组织转入分化培养基中培养20～25天成苗，最后转入生根培养基中培养生根。
7. 根据权利要求6所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，
所述分化培养基由以下组分组成：
MS培养基，终浓度为3mg/L的6-BA，以及终浓度为0.2mg/L的NAA；
所述生根培养基由以下组分组成：
MS培养基，终浓度为0.5mg/L的IBA。
8. 根据权利要求4所述的一种利用甘蓝拓宽甘蓝型油菜遗传多样性的方法，其特征在于，所述组培苗需先转入分化培养基中快繁2～3次，再转入MS培养基中培养后筛选出用于秋水仙碱诱导加倍的健壮组培苗。
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