CN102549437B - 测量作为瘙痒的客观量度的皮肤中的组胺的非侵入性方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测量表皮中的组胺的方法，所述方法包括将粘附制品施用到哺乳动物的上皮；使上皮细胞粘附到所述粘附制品；从哺乳动物的上皮移除粘附制品；使用用于萃取的标准实验室方法来制备粘附制品；从粘附到所述粘附制品的上皮细胞萃取组胺；测量粘附到所述粘附制品的上皮细胞中的组胺；测定与基线样品相比组胺在上皮细胞中的量。此外，本发明还公开了客观地测量哺乳动物的瘙痒感的方法，并且其中组胺从基线水平降低，所述降低与瘙痒感的降低直接成比例。

Description

测量作为瘙痒的客观量度的皮肤中的组胺的非侵入性方法
发明领域
本发明涉及测量皮肤样品中的组胺量和组胺量的客观联系与关联的方法，因为它与哺乳动物的瘙痒感直接相关联。
发明背景
过去已经评估过瘙痒症状在头皮皮炎中的严重性。与不健康的头皮相关联的最为频繁描述的症状是瘙痒。这也是最令人烦恼的症状，其对患者的生活质量具有最大的负面影响。
关于瘙痒的一般生理学，瘙痒感代表在皮肤表面启动的复杂生理学途径的终止。许多刺激能够启动最终导致瘙痒感的级联事件。所述刺激与真皮中的特定受体细胞一起触发组胺的释放。组胺然后结合到神经末梢，启动沿神经纤维的电传导途径，其沿脊柱被转移直到被脑部接收并感到瘙痒。
一般来讲，虽然存在广泛的潜在瘙痒介质，但组胺被认为是典型的瘙痒生理化学介质。组胺是一种小分子胺，其在1927年被证明是皮肤组织的天然组分(因此该名称来自希腊语单词“组织”，histos)。组胺对瘙痒的直接作用的关键证据是抗组胺剂能够非常有效地减轻一些皮肤病症中的瘙痒。支持组胺作用的另一个观点是它能够用于实验性地引发瘙痒。
就具体实例而言，已经研究了多种特定皮肤病症的组胺和瘙痒之间的关联程度。在组胺水平和病症例如荨麻疹和昆虫叮咬的瘙痒严重性之间存在极大的关联。与特应性皮炎之间的关联未被很好地确定。已经发现湿疹和牛皮癣患者皮肤中的组胺水平较高。甚至已发现干燥的皮肤导致较高的组胺水平。
虽然先前未曾研究过头皮屑和皮脂溢性皮炎中的组胺水平，但在瘙痒严重性和组胺水平之间可能存在极大的关联。首先，牛皮癣和头皮屑都具有许多共同的病因学特征，从而使得将对牛皮癣建立的组胺-瘙痒关联应用于头皮屑也是可能的。它也已经得到证明：[Harding，C.，A.Moore，J.Rogers，H.Meldrum等人，Dandruff：a condition characterized by decreased levels ofintercellular lipids in scalp stratum corneum and impaired barrier function.Arch.Dermatol.Res.，2002.294：第221-230页]，响应于局部施用的组胺，头皮屑患者的瘙痒发生率提高，从而证明了与头皮屑相关联的头皮瘙痒与组胺的生理学关联。
可作为瘙痒介质的供选择的生物标记物是P物质(Substance P)和大麻素类。其它可能的介质由Neurophysiology of Pruritus；Cutaneous Elicitation ofItch；Arch Dermatol./第139卷，2003年11月提供，并且它们以引用方式并入本文。
发明概述
本发明的一个实施方案涉及测量表皮中的组胺的方法，所述方法包括将粘附制品施用到哺乳动物的上皮；使上皮细胞粘附到粘附制品；从哺乳动物的上皮移除粘附制品；使用用于萃取的标准实验室方法来制备粘附制品；从粘附到所述粘附制品的上皮细胞中萃取组胺；测量粘附到所述粘附制品的上皮细胞中的组胺；测定与基线样品相比组胺在上皮细胞中的量。
本发明的另一个实施方案是客观地测量哺乳动物的瘙痒感的方法，所述方法包括以下步骤：将粘附制品施用到哺乳动物的上皮；使粘附制品与上皮细胞粘附；从哺乳动物的上皮移除粘附制品；使用用于萃取的标准实验室方法来制备粘附制品；从粘附到所述粘附制品的上皮细胞中萃取组胺；测量粘附到所述粘附制品的上皮细胞中的组胺；并且测定与基线样品相比组胺在上皮细胞中的量。
对于本领域的技术人员来讲，通过阅读本说明书的公开内容，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得显而易见。
附图概述
图1是在用抗头屑洗发剂处理后与基线相比组胺减少的测量结果。
图2是在用抗头屑洗发剂处理后与基线相比组胺水平降低的测量结果。
图3是与无头皮屑组和用抗头屑洗发剂处理后相比较的组胺水平的测量结果。
图4是用抗头屑洗发剂处理的测量结果，所述处理已经导致组胺相对于无头皮屑水平改善了79％
图5是用抗头屑洗发剂处理三周后测量瘙痒感的视觉类似物标度的测量结果。
图6和图7是基线和用抗头屑洗发剂处理三周后的组胺测量结果的并列型直接比较，其通过测量基线和用抗头屑洗发剂处理三周后的瘙痒感测量结果进行。
发明详述
虽然在说明书之后提供了特别指出和清楚地要求保护本发明的权利要求书，但是据信，通过下面的描述可以更好地理解本发明。
本发明可包括、由或基本上由本文所述的本发明的基本成分和限制以及本文所述的任何另外的或任选的成分、组分或限制组成。
除非另外指明，所有的百分比、份数和比率均按本发明组合物的总重量计。所有与所列成分相关的此类重量均基于活性物质的含量计，并因此不包括可能包含在可商购获得的原料中的载体或副产物。
本发明的各个实施方案中的组分和/或步骤，包括可任选加入的那些，详细描述于下文。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
除非另外特别说明，所有比率都是重量比。
除非另外特别说明，所有温度均以摄氏度为单位。
除非另外指明，所有包括数量、百分比、分数和比例的量均被理解为由词“约”所修饰，并且量并不旨在表示有效数字。
除非另外说明，“一个”和“所述”是指“一个或多个”。
本文中“包括”是指可加入不影响最终结果的其它步骤和成分。此术语包括术语“由...组成”和“基本上由...组成”。本发明组合物和方法/过程可包括、由和基本上由本文所述的本发明基本元素和限制以及本文所述的任何附加的或任选的成分、组分、步骤或限制组成。
本发明中，“有效”是指主题活性物质的量足够高以能够向待治疗的病症提供积极有效的改善。主题活性物质的有效量将随待治疗的具体病症、病症的严重程度、疗程、同期联合治疗的特性等因素而变化。
术语“皮肤”指脊椎动物的外皮，其由两层细胞组成，分别是厚的内层(真皮)和薄的外层(表皮)。表皮是皮肤外部的非血管层。它由从内到外的五层上皮构成：(1)基底层(表皮基底层)；(2)棘层(棘细胞层)；(3)颗粒层(表皮颗粒层)；(4)透明层(表皮透明层)；和(5)角质层(表皮角质层)。
术语“样品”指来自受试者皮肤或表皮的任何制备物。
术语“非侵入性”指不需要将器械或装置插入皮肤或身体孔口进行诊断或治疗的方法。
术语“粘合装置”指通过在基底上使用粘合剂或粘附材料以移除皮肤的表皮层的装置。例如可使用粘性胶带如D-Squame(聚丙烯酸酯粘合剂；CuDerm；Dallas TX)、Durapor、SebutapeTM(丙烯酸类聚合物膜；CuDern；Dallas，TX)、TegadermTM、Duct胶带(333Duct Tape，Nashua胶带产品)、Scotch Tape(3M Scotch 810，St.Paul，Minn.)、DiamondTM(The Sellotape Company；Eindhoven，the Netherlands)、SentegaTM(聚丙烯胶带，Sentega Eiketten BV，Utrecht，The Netherlands)来给皮肤取样。所述粘合剂可为任何常用的压敏型粘合剂或那些在皮肤上快速固化的胶粘剂(例如氰基丙烯酸酯)。所述粘合剂可在柔性的或刚性的背衬上以使取样更容易。恒压装置(例如DesquamePressure Instrument，CuDerm；Dallas，TX)可用于在取样期间给粘合装置施压。
来自组织的样品可通过本领域熟知的任何数目的装置来分离。用于分离样品的侵入性方法包括使用针(例如在血液采样期间)，以及不同组织的活组织检查、起泡和激光穿孔。由于这些技术的侵入性本质，存在增加的死亡率和发病率风险。此外，侵入性技术能够非故意地影响皮肤状态，这可能导致不精确的或虚假的结果。此外，侵入性技术难以对大种群实施。侵入性技术可能导致受试者不适并且可能导致感染的风险增大或其它副作用。本发明提供用于测量皮肤中组胺的非侵入性方法。
术语“客观地”指无成见的或无偏见的。作为另外一种选择，任何专家或自我评估本质上是“客观的”。
术语“正常化”和/或“正常的”指一组瘙痒患者接近无瘙痒状态组或正常状态组的程度。
术语“标准化”和/或“标准化的”指相对于在对应的粘合剂或粘附制品上测得的蛋白质量的组胺值。非限制性实例将为ng组胺/μg可溶解蛋白。
术语“基线”指在研究开始时收集的信息，从中测量研究中存在的变化。
在本发明的另一个实施方案中，存在许多可使用的供选择“非侵入性”取样方法。
SebutapeTM：这是一种非侵入性方法，其中SebutapeTM(丙烯酸类聚合物膜；CuDerm；Dallas，TX)仅有非常轻微的粘性，并且可被施用到甚至看得见红肿的皮肤并从所述皮肤上移除而不会引起不适。通过这种技术回收/测定的生物标记物已经包括蛋白质(例如细胞因子)、肽(例如神经肽)、和小分子(例如一氧化氮)介质。在历史上，制造并售卖这种胶带用于皮脂收集并且因此能够用于脂质分析。
D-Squame：D-Squame胶带是聚丙烯酸酯粘合剂，也由CuDerm制造。它可用于回收与SebutapeTM相同的生物标记物，但也移除某些表皮结构蛋白(例如角质、包膜素)。它也已经被用于回收作为全身炎症标记的皮质醇和血清白蛋白、小分子和角质层脂质。
杯刮法(Cup Scrubs)：杯刮法通常在缓冲液和非离子表面活性剂的存在下直接从皮肤表面提取蛋白质。杯刮法主要用于回收可溶解的生物标记物例如细胞因子，但是也可用于回收小的有机分子。从杯刮法中能够回收并定量比胶带剥离法多得多的细胞因子。这可能是由于多个原因：(a)由于存在洗涤剂并且它们是液体，杯刮法最可能地取样与胶条法不同的蛋白质组；(b)用杯刮法，不必在收集样品后进一步提取细胞因子，因为它们已经存在于溶液中。
动物(即狗)收集方法：D-Squame：D-SquameTM胶带样品从狗皮肤上通过它们的毛皮(无需剃刮)来收集。可从胶带中分析与皮肤炎症相关的多种生物标记物、分化和屏障完整性，其包括总蛋白、可溶解蛋白、皮肤多个分析物特征(皮肤MAP)、皮肤细胞因子和角质层脂质(神经酰胺、胆固醇、脂肪酸)。
在本发明的一个实施方案中，本发明提供非侵入地获取用于分离组胺的样品的方法和分析。
在一个实施方案中，粘合装置可用于完成此类取样。
在此类用于头皮屑取样的取样研究中，在基线随访中定量筛分机将完成每个受试者的头皮粘附鳞屑评分(ASFS)分级，并且最高的片状剥落八分体将被鉴定成用于胶带剥离取样。最高的片状剥落八分体将在第3周进行基线取样。将在每个时间点上从每个受试者中收集胶带剥离样品(基线和第3周)。
就每个受试者而言，将有两个胶带剥离取样位点，它们都在相同八分体(即，在基线和第3周的最高片状剥落八分体)内并且通过合适的方法准备头皮以进行取样。
按需另外重复所述胶带剥离取样若干次，在之前的取样区域顶部的相同位点放置每个D-Squame胶带盘。在收集样品后将D-Squame胶带置于标记板中适当地标记的孔内。
在取样后进行萃取和定量程序。在本发明的一个实施方案中，可使用High Sensitivity Enzyme Immunoassay进行D-SquameTape Samples的提取物的组胺定量。(Histamine EIA试剂盒(US Distributor，Cayman#589651/Histamine EIA kit Manufacture(France)，SPbio #A05890)
在本发明的该实施方案中，在制备中使用Histamine Sensitivity Enyme测定法进行的样品萃取是：D-SquameTape Samples板从-80℃冷冻机中移出，它们在样品收集后被储存在其中，并被置于干冰上。将胶带插入预先标记的聚丙烯收集管中，粘合面朝内。将合适的标准萃取缓冲液加入到每个收集管中，然后在冰上用超声处理萃取30分钟。从胶带中分离每个萃取溶液并将每个样品的等分试样置于96孔聚丙烯板的指定位置。然后用常规试剂例如白蛋白补充D-SquameTape样品的萃取物等分试样以帮助防止分析物在实验室器具壁上的损失，将其转移到96孔聚丙烯深孔板上并在-80℃温度下冻存以用于组胺分析。另一份等分试样不补充试剂并且用BCATM ProteinAssay Kit，Pierce catalog #23227分析可溶解的蛋白。
在萃取过程后，可通过常规方法来制备组胺标准品和对照物。组胺将用购自SPI-BIO、由Cayman Chemical Co.分装的组胺酶免疫测定方法(EIA)试剂盒来定量。可通过常规方法来制备洗涤缓冲液、衍生试剂、Histamine ACHe示踪剂和Ellman试剂。将标准品、对照物和样品固定在深孔板内。用缓冲液来清洗板并将标准品、空白、样品和质量控制物加到板中，并在4℃温度下孵育24小时。然后在加入Elman试剂之前清洗板并在室温下避光孵育。可通过标准分光光度法来读板。通过标准统计方法和计算进行数据分析。
在本发明的另一个实施方案中，可使用反相梯度高效液相色谱法与串联质谱仪(HPLC/MS/MS)从粘附制品、胶带的萃取物中定量组胺。
将得自人类受试者的头皮的胶带剥离物(单个或多个胶带剥离物)置于单个聚丙烯小瓶中，在每个小瓶中加入稳定的同位素标记的组胺(D4-组胺)内标(ISTD)，然后在酸溶液中用超声波萃取10分钟。从胶带剥离物中分离每个提取物溶液并将每个样品的等分试样置于96孔聚丙烯板的指定位置。在96-孔聚丙烯板中用加入ISTD的酸溶液来制备一组组胺标准品，其包括合适的校准范围。使用反相梯度高效液相色谱法与串联质谱仪(HPLC/MS/MS)来分析标准品和头皮胶带剥离物的提取物。通过阳离子电喷雾(ESI)，使用表1所示的选择-反应-监测方案监测组胺和ISTD。通过给信号绘图构建标准曲线，本文将其定义为每个标准品与对应于标准品的组胺质量的峰面积比率(峰面积组胺/峰面积ISTD)。然后使用生成的回归方程式来倒算在校准基准和人类头皮提取物样品中的组胺质量。可将结果报告为组胺/胶带剥离物的质量，或者可通过除以也存在于胶带剥离提取物中的蛋白质的量将结果标准化。已经分别描述了蛋白质方法。
表1
  化合物   前体离子(m/z)   产物离子(m/z)
  组胺   112   95
  D4-组胺   116   99
方法延伸
虽然上文描述了使用的确切方法，但在上述多个步骤中可使用许多替代方法，它们是逻辑延伸。用于从胶带剥离物中的分离组胺的萃取溶剂可为任何合适的水、有机物或有机物/水混合物，其提供合适的组胺回收。虽然使用基于稳定同位素的分离方法，但也可使用化学内标或外标方法。由于LC/MS/MS的高选择性和敏感度，一般认为它们是用于定量分析生物基质中小有机分子的最先进方法。然而，可使用提供所需的敏感度和选择性的任何分析技术和/或其它方法。例如，已使用其它基于分离的方法，例如气相色谱法、液相色谱法、电泳法。已使用了带敏感度检测模块(例如质谱仪、电子捕集器、火焰电离器)的、有或没有衍生化的气相色谱法进行组胺分析。也已使用了带UV、电化学或荧光检测的、有或没有衍生化的高效液相色谱法。已评估了使用多种检测系统的毛细管电泳。类似地，也已使用了无分离技术的仪器方法，包括质谱仪、电化学和荧光测定法。此外，也已使用了配体结合方法例如竞争性和非竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射性免疫测定法(RIA)或者其它标记方案。在组胺分析中基于酶的测定法有长期的应用历史。使用基于细胞或组织的生物测定方法也可用作检测的方法。也已使用了组胺代谢物的测量结果提供对组胺水平的间接评估。
胶带剥离提取物的蛋白质测定：
用上述适用方法测得的皮肤胶带剥离物上的组胺水平可用胶带剥离提取物中存在的蛋白质的量来标准化。通过将组胺水平除以胶带剥离提取物中的蛋白质的量完成标准化。
在胶带剥离提取物中的蛋白质的量或用于测定皮肤组胺水平的当量基质可使用文献中描述的多种蛋白质测定方法来测定。此类方法的实例包括总氮测定、总氨基酸测定和基于任何色度、荧光、化学发光方法的蛋白质测定。这些方法可涉及或不涉及在蛋白质测定前进一步制备胶带剥离提取物的样品。下文给出了胶带剥离提取物中用于蛋白质测定的特定方法的非限制性实例。对蛋白质测定方法、它们的适用性和限制的综述在Thermo ScientificPierce Protein Assay Technical Handbook中进行了描述，其可从以下链接http://www.piercenet.com/Files/1601669_PAssayFINAL_Intl.pdf下载，其以引用方式并入本文。关于蛋白质测定的其它信息可见于Redinbaugh，M.G.和Turley，R.B.(1986)。Adaptation of the bicinchoninic acid protein assay for usewith microtiter plates and sucrose gradient fractions.Anal.Biochem.153，267-271，以引用方式并入本文。
将用BCATM Protein Assay Kit(Pierce)萃取并分析来自人类皮肤的粘合带的蛋白质含量。将用酸性萃取溶液萃取来自人类皮肤的胶带剥离物。在萃取后，将把胶带提取物的等分试样转移到96-孔聚丙烯深孔板中并在2-8℃温度下储存以用于蛋白质测定。
BCATM Protein Assay Kit基于碱性介质中的蛋白质将Cu2+还原成Cu1+原理，所述蛋白质偶联有通过二喹啉甲酸(BCA)的敏感选择性色度检测Cu+1。通过用一个Cu1+离子螯合2个BCA分子形成的紫色反应产物表现出在波长562nm的强吸光度。使用微板阅读器测量光密度(OD)。提高的牛血清白蛋白(BSA)的浓度(以微克每毫升(μg/mL)表示)在该测定法中用于生成校准曲线。从BSA原液中制备的合适测定QC将用于监控样品分析期间的测定法性能。
在本发明的一个可供选择的实施方案中，可直接测量胶带或粘附制品上的蛋白质来完成蛋白质测定，例如用SquameScan850A(CuDermCorporation，Dallas，Texas)测量蛋白质。
实施例
研究#1和研究#2中组胺工作的基本程序
头皮屑受试者通过定量筛分机在两个分开的临床研究中来鉴定；研究#1和研究#2。研究#2也包括无头皮屑受试者，也对他们进行基线评估以建立标准化的组胺水平(n＝121)。
受试者在用抗头皮屑洗发剂处理前，用常规的无调理剂的非头皮屑洗发剂清洗两周。在用抗头皮屑洗发剂(包含1-氧-2-巯基吡啶锌的洗发剂组合物)处理三周后，从由定量筛分机在基线随访上测定的最高片状剥落八分体中收集胶带剥离样品。在三周的产品处理后取头皮胶带剥离物作为基线。将胶带保存在-80℃温度下直到进行萃取。通过分开毛发进行头皮屑涉及位点的取样，所述取样通过施用D-Squame胶带(CuDerm Corporation)并按需摩擦该胶带。将胶带置于预先标记的12孔培养盘中进行贮藏。
在研究#1中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)方法收集并分析来自头皮表面的胶带。在研究#2中，通过反相梯度高效液相色谱法与串联质谱仪(HPLC/MS/MS)收集并分析在头皮表面下方的胶带。
研究#1，样品用常规的萃取缓冲液和超声波在冰上进行萃取然后给D-Squame胶带样品的萃取物等分试样补充常规试剂例如白蛋白帮助防止分析物在实验室器具壁上的损失，将其转移到96孔聚丙烯深孔板上并在-80℃温度下冻存以用于组胺分析。另一份等分试样不补充试剂并且用BCATMProtein Assay Kit，Pierce catalog #23227分析可溶解的蛋白质。
研究#2，用酸溶液萃取样品并将等分试样置于96-孔聚丙烯板中并在-80℃温度下冻存以用于组胺分析。
研究#1，来自D-Squame胶带样品的提取物中的组胺用购自SPIbio，part#A05890的High Sensitivity Enzyme Immunoassay试剂盒按照上述方法来定量。
研究#2，通过上述HPLC/MS/MS方法分析胶带剥离样品。
就两个研究而言，根据测量报告组胺浓度，并且也将组胺标准化到通过上述BCA蛋白质测定法测定的提取物中的可溶解蛋白质的量。在基线对3周的样品进行分析，所述样品来自抗头皮屑洗发剂处理组。
结果概述
组胺数据的统计学分析：收集在基线和第三3周(处理后)的头皮屑受试者和在基线的无头皮屑受试者的数据。假设在受试者之间以及受试者之内(基线-＞第3周)的组胺水平变化较大，在分析前将组胺数据转化成log10标度是更有效的。对当量log10比值(即，log10(第3周/基线))进行统计学分析。将最后报告的组胺结果重新转化成它们的初始标度(或者基线值的变化％)以便于说明。使用SAS JMP(版本7.0.2)软件进行所有统计学分析。使用≤0.10(单边)的P值来测定统计学显著性。
图1中的数据说明研究1中的组胺水平在用抗头皮屑洗发剂处理3周后降低了46％。这些组胺水平已经是除以胶带剥离提取物中的蛋白质的量的结果。
图2中的数据说明与基线相比，抗头皮屑洗发剂处理将组胺水平降低了46％(研究#2)和45％(研究#1)(P值＝≤0.001，单边)。这些组胺水平已经是除以胶带剥离提取物中的蛋白质的量的结果。
图3中的数据说明头皮屑组胺水平比无头皮屑水平显著更高(P值＝≤0.0001，单边)。用上述适用方法测得的人头皮胶带剥离物上的组胺水平可用胶带剥离提取物中存在的蛋白质的量来标准化。从独立的无头皮屑组中测定组胺水平以确定正常皮肤组胺水平。通过将组胺水平除以胶带剥离提取物中的蛋白质的量来完成标准化。此外这一数据说明抗头皮屑处理将组胺水平恢复到上文讨论的无头皮屑组的组胺水平。(单边p值0.12)。
图4中的数据说明在进行3周的抗头皮屑处理后与无头皮屑组相比有79％的组胺水平改善。作为另外一种选择，这一数据说明恢复至健康皮肤状态的79％。这是一种有用的有益效果传达手段，头皮屑患者期望恢复到正常和/或健康状态。这通过用从基线到三周的组胺水平变化除以基线和无头皮屑水平之间的差值并乘以100来计算。
图5中的数据说明经三周处理后瘙痒感非常显著地减轻。这将是一种客观的测量手段，其基于自我评估，使用视觉类似物标度。然而，图6和7中的数据提供了关联瘙痒感的客观测量结果，其中所述组胺测量结果(以ng/μg蛋白质表示)直接关联相同受试者组的视觉类似物标度的瘙痒感数据。这种直接关联已经提供了以前未知的瘙痒感的客观测量。客观测量常用于评估皮肤病症并且通常涉及专家评估和/或自我评估。虽然这些类型的测量是有用的，但是它们实质上存在评估员的偏好。客观测量不存在偏好问题，因此提供较严谨的科学数据。
可存在高度侵入性的瘙痒客观测量方法例如活组织检查或抽血，但由于该取样方法的侵入性本质，它们的用途受到限制。此外，可存在低客观性的测量方法，其可用低侵入性测量方法来测量瘙痒，然而此类测量方法的客观性较差。因此，本发明提供了高度客观的瘙痒感测量手段，其具有以前未知的低侵入性。
本文所公开的量纲和值不旨在被理解为严格地限于所述的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲均是指所引用数值和围绕那个数值的功能上等同的范围。例如，所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。
在发明详述中所有引用文献的相关部分均引入本发明以供参考。任何文献的引用不可理解为是对其作为本发明的现有技术的认可。当本文件中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中同一术语的任何含义或定义矛盾时，应当服从在本文件中赋予该术语的含义或定义。
尽管已用具体实施方案来说明和描述了本发明，但对于本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和保护范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，随附权利要求书中旨在涵盖本发明范围内的所有这些改变和变型。

Claims (5)

1.一种通过非侵入性测量表皮中的组胺的试剂用于制备说明抗真菌洗发剂对瘙痒感是否有改善的试剂中的用途，其包括：
a)施用抗真菌洗发剂，然后将粘附制品施用到哺乳动物的上皮；
b)使上皮细胞粘附到所述粘附制品；
c)从所述哺乳动物的上皮移除所述粘附制品；
d)使用用于萃取的标准实验室方法来制备所述粘附制品；
e)从粘附到所述粘附制品的上皮细胞中萃取组胺；
f)测量来自粘附到所述粘附制品的上皮细胞的组胺；
g)测定与在施用抗真菌洗发剂之前哺乳动物上皮中组胺基线样品相比组胺在所述上皮细胞中的量；
其中通过将所述组胺除以所述粘附制品上的蛋白质的量来标准化所述组胺。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述上皮包括角质层。
3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述哺乳动物是人类。
4.如权利要求1所述的用途，其中将所述粘附制品施用到患有皮炎的受试者的上皮。
5.如权利要求1所述的用途，其中将所述粘附制品施用到患有头皮屑的受试者的上皮。
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