CN105026930B - 用于测量来自皮肤的抗微生物肽作为对微生物天然防护的客观量度的非侵入性方法 - Google Patents

用于测量来自皮肤的抗微生物肽作为对微生物天然防护的客观量度的非侵入性方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于测量受试者皮肤健康的非侵入性方法，该非侵入性方法包括收集来自受试者的上皮细胞/皮肤细胞样品；检测在上皮细胞样品/皮肤细胞样品中的一种或多种抗微生物肽生物标记的含量；诊断受试者是否具有由于微生物侵袭皮肤而引发的防御机制或基于一种或多种抗微生物肽生物标记的含量测量系统是否与环境稳态平衡，所述一种或多种抗微生物肽生物标记选自组蛋白H2B型1‑M、组蛋白H2A、组蛋白H4、蛋白S100‑A7、蛋白S100‑A8、蛋白S100‑A9、组织蛋白酶G、中性粒细胞防御素3(防御素，α3)(HNP‑3)、皮离蛋白、核糖核酸酶7(RNA酶7)、人β防御素2(nBD‑2)和β防御素103(hBD‑3)以及在表1中列出的那些，其中AMP家族包括杀菌通透性增加蛋白(BPI)、防御素、组蛋白、成孔毒素、S100蛋白、细胞毒素、丝氨酸蛋白酶S1、双氧化酶、转录调节物、以及它们的混合物。本发明还公开了一种评估用于皮肤健康的产品功效的非侵入性方法。

Description

用于测量来自皮肤的抗微生物肽作为对微生物天然防护的客 观量度的非侵入性方法
技术领域
本发明涉及用于测量与由于微生物侵袭皮肤而引发的防御机制相关联的一种或多种生物标记的量的方法、或基于一种或多种抗微生物肽生物标记的含量测量系统是否与环境稳态平衡、以及这些生物标记的量的关联与相关性，因为它直接关联哺乳动物皮肤健康的改善。
背景技术
头皮/皮肤是显著的器官系统，由起到对环境侵袭的第一道防线功能的多个特化组织构成。虽然早期的研究主要集中于皮肤的阻隔功能，已经变得清楚的一点是这个器官是动态的：对甚至是环境中微小的变化感测并响应，从而帮助保持内稳态。环境影响诸如太阳辐射、污染、或者甚至皮肤护理产品的施用导致复杂的级联事件，它们最终导致数百或者数千个基因表达的改变。基因表达的这些改变一般被翻译成催化化学反应的蛋白生成的改变(或积聚、释放、改性等等)，最终导致细胞响应。随着这些化学反应的进行，常常留下代谢副产物作为已经发生了何种化学过程的指示。分析与给定皮肤病症例如头皮屑相关联的这些所得蛋白和小分子生物标记可提供有价值的信息，用于了解病症以及开发用于诊断和/或改善皮肤病症目的的产品。头皮屑是一种常见的慢性复发性头皮病症，具有片状剥落和瘙痒感。头皮屑的发病机理是复杂的，并且好像是头皮、微生物区系和宿主免疫系统之间相互作用的结果。对这种病症的许多之前的工作已经集中于检查一些表面水平的现象。传统的基于专家观察的评估及基于自我观察的评估与基于大型仪器的在生理水平上的表皮结构和功能评估相结合。新的生物分子学能力达到了病理生理的理解深度，而非之前用传统研究方法达到的理解深度；然而，对导致这种病症的关键症状的分子事件的清晰了解仍未出现。为了解释这些关键分子事件，可通过皮肤表面的胶带剥除、随后通过化学或生物分析方法，来非侵入性地获得生物分子取样。组胺最近被鉴定为头皮瘙痒的敏感生物标记。需要另外的生物标记以允许更详细的头皮屑病症的病理生理描述，以及用作指示头皮屑治疗方案程度和完成度的相关量度。受关注的一个此类区域是抗微生物肽(AMP)。
抗微生物肽(AMP)是进化上保守的分子，涉及广泛多种生物体的防御机制。在细菌、昆虫、植物和脊椎动物中产生的AMP保护生物体不受广泛多种传染性病原体的侵袭。在哺乳动物中，这些肽防御细菌、病毒、真菌、和某些寄生虫。最近，已经证明了AMP的新生物学效应，诸如内毒素中和作用、趋化及免疫调节活性、诱导血管新生和创伤修复。因此，这些分子是先天免疫系统的关键组分和生物标记的引人注目的候选者。具体地，针对皮肤和头皮，AMP对于皮肤和头皮健康是重要的，这是由于一旦表皮的物理结构已经受到损伤，它们能够进行化学防御或形成屏障。AMP在生物体的主要屏障诸如皮肤和粘膜上皮以及皮肤中潜在的微生物侵入部位诸如毛囊结构和汗腺上表达，从而阻止病原体定植宿主组织。此外，这些肽以颗粒形式存储在吞噬细胞内，在那里它们帮助杀灭被吞噬的微生物。抗微生物肽的作用模式存在差异，并且包括破坏细胞膜、干扰代谢、以及靶向细胞质组分。AMP难以分类，这归因于它们显著的多样性。基于它们的氨基酸组成、大小和构象结构，可将AMP分成若干类型，诸如具有α螺旋结构的肽、具有由二硫键稳定的β片层结构的肽、具有延伸结构的肽、以及具有环状结构的肽。所有这些AMP的特性共同使得这些肽成为新型生物标记的引人注目的候选者。
发明内容
本发明的一个实施例涉及用于测量受试者皮肤健康的非侵入性方法，该非侵入性方法包括收集来自受试者的上皮细胞/皮肤细胞样品；检测在上皮细胞样品/皮肤细胞样品中的一种或多种抗微生物肽生物标记的含量；诊断受试者是否具有由于微生物侵袭皮肤而引发的防御机制或基于一种或多种抗微生物肽生物标记的含量测量系统是否与环境稳态平衡，该一种或多种抗微生物肽生物标记选自组蛋白H2B型1-M、组蛋白H2A、组蛋白H4、蛋白S100-A7、蛋白S100-A8、蛋白S100-A9、组织蛋白酶G、中性粒细胞防御素3(防御素，α3)(HNP-3)、皮离蛋白、核糖核酸酶7(RNA酶7)、人β防御素2(hBD-2)和β防御素103(hBD-3)或在表1中列出的那些，其中AMP家族包括BPI、防御素、组蛋白、成孔毒素、S100蛋白、细胞毒素、丝氨酸蛋白酶S1、双氧化酶、转录调节物。
附图说明
图1是示出无头皮屑受试者对头皮屑患者的hBD2含量的比较的图。
图2是示出头皮屑患者在用去头皮屑洗发剂或非去头皮屑洗发剂治疗三周后hBD2偏离基线的变化的图。
图3是示出头皮屑患者在用包含1％ZPT的洗发剂治疗三周后的hBD2归一化结果的图。
表1是相关抗微生物肽的列表。
表2是通过iTRAQ方法检测的抗微生物肽的列表。示出在无头皮屑患者、头皮屑患者在基线处和用包含1％ZPT的洗发剂或1％的硫化硒洗发剂治疗三周的头皮屑患者之间的比较。
具体实施方式
尽管说明书通过特别指明并且清楚地要求保护本发明的权利要求作出结论，据信，本发明通过下列具体实施方式将更好地理解。
本发明可包含下列因素、由其组成、或基本上由其组成：本文所述的本发明的基本要素和限定条件、以及本文所述的或其它适用于旨在供哺乳动物消费的组合物的任何附加或任选成分、组分或限定条件。
除非另外指明，所有的百分比、份数和比率以本发明组合物的总重量计。所有与所列成分相关的此类重量均基于活性物质的含量计；并因此不包括可能包含在可商购获得的原料中的载体或副产物。
本发明的各个实施例中的组分和/或步骤，包括可任选加入的那些，详细描述于下文。
所有引用文献的相关部分均引入本文以供参考；任何文献的引用不可解释为是对其作为本发明的现有技术的认可。
除非另外特别说明，所有比率都是重量比率。
除非另外特别说明，所有温度是摄氏度。
除非另外指明，所有包括数量、百分比、分数和比例的量被理解为由词“约”所修饰，并且量不旨在显示有效数字。
除非另外指明，“一个”、“一种”和“所述”是指“一个或多个”。
本发明中“包括”指可加入其它不影响最终结果的成分。该术语包括术语“由…组成”和“基本上由…组成”。本发明的组合物和方法/过程可包括本文所述的本发明基本元素和限制，以及本文所述的任何附加或任选成分、组分、步骤或限制；由本文所述的本发明基本元素和限制，以及本文所述的任何附加或任选成分、组分、步骤或限制组成；和基本上由本文所述的本发明基本元素和限制，以及本文所述的任何附加或任选成分、组分、步骤或限制组成。
本文“有效的”是指一定量的受试品活性足够高以使待治疗病症发生显著积极的改善。受试品活性的有效量将随着待治疗的具体病症、病症的严重度、治疗持续时间、并发治疗的性质、以及类似因素而发生改变。
如本文所用，术语“差异含量”的生物分子可包括任何提高的或降低的含量。在一个实施例中，差异含量是指含量增加了：至少5％；至少10％；至少20％；至少30％；至少40％；至少50％；至少60％；至少70％；至少80％；至少90％；至少100％；至少110％；至少120％；至少130％；至少140％；至少150％；或更多。
在另一个实施例中，差异含量是指含量减少了：至少5％；至少10％；至少20％；至少30％；至少40％；至少50％；至少60％；至少70％；至少80％；至少90％；至少100％(即，不含生物分子)。生物分子以统计学上显著的差异含量表达(即，≤0.20(双侧)的P值用于确定统计学差异)
其使用Student T-test、Welch's 2-sample T-test或Matched Pair T-test进行测定。
术语“皮肤”是指脊椎动物的外蒙皮，其由两层细胞组成，分别是厚的内层(真皮)和薄的外层(表皮)。表皮是皮肤外部的非血管层。它由从内到外的五层上皮构成：(1)基底层(表皮基底层)；(2)棘层(表皮棘层)；(3)颗粒层(表皮颗粒层)；(4)透明层(表皮透明层)；和(5)角质层(表皮角质层)。
术语“样品”指来自受试者皮肤或表皮的任何制备物。
术语“非侵入性”指不需要将器械或装置插入皮肤或身体孔口进行诊断或治疗的方法。
术语“粘合剂装置”指通过将粘合剂或粘附材料用于基底以移除皮肤的表皮层的装置。例如，可使用粘合带诸如(聚丙烯酸酯粘合剂；CuDerm；Dallas TX)、Durapor、SebutapeTM(丙烯酸类聚合物膜；CuDerm；Dallas,TX)、TegadermTM、Duct胶带(333Duct Tape,Nashua胶带产品)、Tape(3M Scotch 810,St.Paul,Minn.)、DiamondTM(The Sellotape Company；Eindhoven,the Netherlands)、SentegaTM(聚丙烯胶带，Sentega Eiketten BV,Utrecht,The Netherlands)来给皮肤取样。所述粘合剂可为任何常用的压敏型粘合剂或那些在皮肤上快速固化的粘合剂(诸如氰基丙烯酸酯)。所述粘合剂可位于柔性的或固体的背衬上以使取样更容易。恒压装置(例如D-Squame PressureInstrument,CuDerm；Dallas,TX)可用于在取样期间向粘合剂装置施压。
来自组织的样品可通过本领域熟知的许多方法进行分离。用于分离样品的侵入性方法包括使用针(例如在血液取样期间)、以及不同组织的活组织检查、起泡和激光穿孔。由于这些技术的侵入性本质，存在提高的死亡率和发病率风险。此外，侵入性技术能够非故意地影响皮肤状态，这可能导致不精确的或虚假的结果。此外，侵入性技术难以对大群体实施。侵入性技术可能导致受试者不适并可能导致感染或其它副作用的风险增大。本发明提供用于测量皮肤中抗微生物肽的非侵入性方法。
术语“客观地”指无成见或偏见的。作为另外一种选择，任何专家或自我评估本质上是“客观的”。
术语“归一化”和/或“归一的”指一组头皮屑患者接近正常群体状态的程度。
术语“标准化”和/或“标准化的”指相对于在对应的粘合剂或粘合剂制品上测得的蛋白质的量的抗微生物蛋白值。非限制性实例将为ng抗微生物蛋白/μg可溶解蛋白。
术语“基线”指在研究开始时收集的信息，从中测量研究中存在的变化。基线样品可来自头皮屑患者或无头皮屑受试者。
在本发明的另一个实施例中，存在许多可使用的供选择“非侵入性”取样方法。
SebutapeTM：这是一种非侵入性方法，其中SebutapeTM(丙烯酸类聚合物膜；CuDerm；Dallas，TX)仅有非常轻微的粘性，并且可在不引起不适的情况下被施用并从甚至看得见红肿的皮肤移除。通过这种技术回收/测定的生物标记物已经包括蛋白质(例如细胞因子)、肽(例如神经肽)、和介质。在历史上，制造并售卖这种胶带用于皮脂收集并且因此能够用于脂质分析。
胶带是聚丙烯酸酯粘合剂，也由CuDerm制造。它可用于回收与SebutapeTM相同的生物标记物，但是也移除某些表皮结构蛋白(例如角质、包膜素)。它也已经被用于回收作为全身炎症标记的皮质醇和血清白蛋白、和角质层脂质。
杯擦洗(Cup Scrubs)：杯擦洗(Cup Scrubs)通常在缓冲液和非离子表面活性剂的存在下直接从皮肤表面提取蛋白质。杯擦洗(Cup Scrubs)主要用于回收可溶解的生物标记诸如细胞因子，但是也可用于回收小的有机分子。从杯擦洗中能够回收并定量比胶带剥除法多得多的细胞因子。这可能是由于若干原因。(a)由于存在洗涤剂并且它们是液体，杯擦洗法最可能地取样与胶带剥除法不同的蛋白质组。(b)用杯擦洗法，不必在收集样品后进一步提取细胞因子，因为它们已经存在于溶液中。
毛发拔除：拔除毛发是通常使用镊子从拔除对象身上通过机械拔出去除人或动物毛发的方法。毛发拔除的毛囊区域通常在缓冲液和非离子表面活性剂存在的情况下进行提取以回收可溶解生物标记诸如细胞因子，并且也能够用有机溶剂提取以回收小的有机分子。
动物(即，狗)收集方法：D-SquameTM胶带样品从狗皮肤上通过分开它们的毛皮(无剃刮)来收集。可从胶带中分析与皮肤炎症、分化和屏障完整性相关的多种生物标记，其包括总蛋白质、可溶解蛋白质、皮肤多个分析物特征(皮肤MAP)、皮肤细胞因子和角质层脂质(神经酰胺、胆固醇、脂肪酸)。
在本发明的一个实施例中，本发明提供非侵入性地获取用于分离抗微生物蛋白的样品的方法和分析。
在一个实施例中，粘合剂装置的使用可用于实现此类取样。
在准备此类用于头皮屑取样的取样研究中，在基线随访中有资质的分级人员将完成每个受试者的头皮附着鳞屑评分(ASFS)分级并且最高的片状剥落八分体将被鉴定用于胶带剥除取样。最高的片状剥落八分体将在一个治疗期后进行基线取样。将在每个时间点上从每个受试者中收集胶带剥除样品(例如基线和第三周)。
按需重复所述胶带剥除取样另外若干次，在之前的取样区域顶部的相同部位放置每个胶带盘。在收集样品后将胶带置于标记板中进行适当标记的孔内。
在取样后进行提取和定量程序。在本发明的一个实施例中，来自D-胶带样品提取物的抗微生物蛋白的定量可经由iTRAQ蛋白质分析或基于抗体的测定法进行。
iTRAQ(同位素标记相对和绝对定量)是一种不基于凝胶的蛋白质组学方法，最初由ABSciex开发。它也可同时用于在一个单独实验中经不同生物处理/处于不同条件下的样品的蛋白鉴定(http://en.wikipedia.org/wiki/Protein)和相对定量。该技术使用4-或8-同位素-编码的共价标记改变质量以标记来自蛋白消化的肽的N-末端和侧链胺。在标记来自不同样品/处理的所有肽后，收集样品并通过液相色谱串联质谱仪如LC-MALDI-TOF/TOFMS进行分析。
在本发明的这一实施例中，在准备经由iTRAQ的抗微生物肽分析时进行样品提取。
胶带样品板从-80℃冷冻机中移出，它们在样品收集后被储存在冷冻机中，并置于干冰上。将胶带插入预先标记的聚丙烯收集管中，粘合面朝内。
将包含5％的乙酸的提取缓冲液加入每个收集管中，并且随后在冰上超声处理进行提取。如果必要的话，将附加的胶带置于包含提取溶液的收集管中，并且重复提取过程作为浓缩样品的手段。从胶带剥除物中分离每个提取溶液并将每个样品的等分试样置于预先标记的聚丙烯收集管中，并冻存在-80℃下用于分析。另一份等分试样指定用BCATM ProteinAssay Kit，Pierce catalog#23227进行可溶解蛋白质分析。
在提取过程后，通过以下制造推荐的方案进行iTRAQ标记的iTRAQ测定。简而言之，将来自各种条件下的约10-50ug的等量蛋白质用胰蛋白酶在37℃下还原、烷基化并消化过夜。每个消化产物用特定的iTRAQ试剂(例如试剂113、114等等)标记并且随后混合在一起以产生单独样品混合物，利用质谱仪对其进行进一步的蛋白质鉴定和定量。
在本发明的一个实施例中，多重iTRAQ标记的样品使用Tempo LC-MALDI Spotter系统(ABSciex)或Waters CapLC-Proteineer Spotter(Bruker Daltonics)，经受1-5ul/min的低流量LC分离。从柱(0.1mm×15cm硅胶整体柱，购自Merck)中洗脱的肽持续与MALDI基质(α-氰基-4-羟基肉桂酸–CHCA)混合并自动点样到MALDI板上。MALDI-TOF/TOF分析在ABSciex MALDI AB4800 Plus或Bruker UltrafleXtreme MALDI-TOF/TOF系统上进行。收集MS和MS/MS数据。蛋白质鉴定和相对定量通过ProteinPilot软件(AB Sciex)或Mascot(MatrixScience)和WarpLC软件(Burker Daltonics)完成。对于蛋白质鉴定，用数据组搜索Uniprot以得到MALDI AB4800 Plus数据，并且搜索NCBInr以得到UltrafleXtreme MALDI数据。对于相对定量，利用MS/MS光谱的iTRAQ报告离子的信号计算所鉴定肽的相对丰度(比率)。来自特定蛋白质的肽的总比率表示该蛋白质的相对定量。使用供应商的软件包，不经任何修改初始自动处理所有质谱仪数据。质谱仪数据进一步用Statistical Analysis System(SASInstitute Inc.)处理以计算iTRAQ比率，用于蛋白的相对定量(表2)。随后根据样品体积调节化合物的相对定量值，并且标准化到通过上述BCA蛋白质测定法测定的提取物中的可溶解蛋白质的量。
在本发明的这一实施例中，在经由基于抗体的测定法的抗微生物肽分析准备中进行样品提取。
对于基于抗体的免疫测定法，将适当的标准提取缓冲液加入每个收集管中，并且随后在冰上超声处理提取。从胶带中分离每个提取溶液并将每个样品的等分试样置于96孔聚丙烯板的指定位置。然后用常规试剂诸如白蛋白补充胶带样品的提取物等分试样以帮助防止分析物在实验室器具壁上的损失，将其转移到96孔聚丙烯深孔板上并冻存在-80℃用于分析。另一份等分试样不补充试剂并且用BCATM Protein Assay Kit，Piercecatalog#23227分析可溶解蛋白质。
在提取过程后，可通过常规方法制备合适标准品和对照物。AMP将用基于Mesoscale Discovery平台的免疫测定法进行定量。可将结果报告为AMP的量/胶带剥除物的量，或者可通过用AMP的量除以也存在于胶带剥除提取物中的蛋白质的量将结果标准化。已经分别描述了蛋白质方法。通过标准统计方法和计算进行数据分析。
方法延伸
虽然上文描述了使用的确切方法，但在上述多个步骤中可使用许多另选的方法，它们是逻辑延伸。用于从胶带剥除物中分离AMP抗微生物蛋白的提取溶剂可为任何合适的含水的、有机物或有机物/含水混合物，其提供合适的回收。由于LC/MS/MS和GC/MS/MS的高选择性和敏感度，一般认为它是用于定量分析生物基质中有机分子的最先进方法。然而，可使用提供所需的敏感度和选择性的任何分析技术和/或其它方法，例如iTRAQ标记，随后利用液相色谱电喷雾电离质谱法、无标记定量质谱法和多反应监控(MRM)质谱法。例如，已经使用了用于评估AMP的其它方法，包括：NMR、毛细管电泳、超临界流体和其它色谱分离技术和/或它们的组合。类似地，也已经使用无分离技术的仪器方法，包括质谱法、电化学和荧光测定法。此外，也已经使用配体结合方法诸如竞争性和非竞争性酶联免疫吸附测定法(ELISA)和放射性免疫测定(RIA)或者其它标记方案。在如AMP的分析中基于酶的和基于抗体的测定法有长期的应用历史。使用基于细胞或组织的生物测定方法也可用作检测手段。在本发明的一个实施例中，毛发拔除引起的抗微生物蛋白的定量可利用与用于胶带剥除样品的方法相同的碱性提取和分析方法进行。
胶带剥除提取物的蛋白质测定：
用上述适用方法测得的皮肤胶带剥除物样品上的AMP含量可用胶带剥除提取物中存在的蛋白质的量进行标准化。通过用抗微生物蛋白含量除以胶带剥除提取物中的蛋白质的量完成标准化。
在胶带剥除提取物中的蛋白质的量或用于测定皮肤中抗微生物肽含量的等同基质可使用文献中描述的多种蛋白质测定方法进行测定。此类方法的实例包括总氮测定、总氨基酸测定和基于任何比色、荧光、化学发光方法的蛋白质测定。这些方法可涉及或可不涉及在蛋白质测定前进一步制备胶带剥除提取物的样品。下文给出了胶带剥除提取物中用于蛋白质测定的特定方法的非限制性实例。对蛋白质测定方法、它们的适用性和限制的综述在Thermo Scientific Pierce Protein Assay Technical Handbook中进行了描述，其可从下文的链接中下载，以引用方式并入本文。www.piercenet.com/Files/1601669_PAssayFINAL_Intl.pdf.关于蛋白质测定的其它信息可见于Redinbaugh，M.G.和Turley，R.B.(1986).Adaptation of the bicinchoninic acid protein assay for use withmicrotiter plates and sucrose gradient fractions.Anal.Biochem.153，267-271，以引用方式并入本文。
用BCATM Protein Assay Kit(Pierce)提取并分析取样自人皮肤的粘合带的蛋白质含量。用常规的提取缓冲液提取取样自人皮肤的胶带剥除物。在提取后，将胶带提取物的等分试样转移到96孔聚丙烯深孔板中并储存在2-8℃用于蛋白质测定。
BCATM Protein Assay Kit的作用机制为在碱性介质中由蛋白质将Cu2+还原成Cu1+并由二喹啉甲酸(BCA)敏感选择性比色检测Cu+1。通过一个Cu1+离子螯合两个BCA分子形成的紫色反应产物表现出在562nm波长处的强吸光度。使用酶标仪测量光密度(OD)。提高的牛血清白蛋白(BSA)的浓度(以微克每毫升(μg/mL)表示)在该测定法中用于生成校准曲线。从BSA原液中制备的合适测定QC将用于监控样品分析期间的测定法性能。
在本发明的一个可供选择的实施例中，可直接测量粘合剂或粘合剂制品上的蛋白质来完成蛋白质测定，诸如用850A(CuDerm Corporation,Dallas,Texas)测量蛋白质。
实例
用于AMP分析的基本过程
受试者由有资质的分级人员进行评估以确定他们的头皮状态。头皮屑受试者由有资质的分级人员评估鉴定他们的可见片状剥落水平。无头皮屑的健康头皮受试者进行基线评估以确定每个生物标记的归一化水平。受试者通过有资质的分级人员在两个分开的临床研究中进行鉴定；研究#1和研究#2。在研究#1中，有60个无头皮屑受试者，对他们进行hBD2基线含量的评估。有119个头皮屑患者用包含1％的ZPT的去头皮屑洗发剂治疗，115个头皮屑患者用包含1％的硫化硒的去头皮屑洗发剂治疗，并且60个头皮屑受试者用不含去头皮屑活性物质的非去头皮屑洗发剂治疗。评估受试者的人β防御素2(hBD2)基线含量，并且在使用产品三周后再次评估。
在研究#2中，有121个无头皮屑受试者，311个头皮屑受试者用包含1％的ZPT的洗发剂治疗，并且63个头皮屑受试者用包含1％的硫化硒的洗发剂治疗。每组的胶带剥除样品利用iTRAQ方法进行分析。
头皮屑受试者用去头皮屑洗发剂(包含1％的吡啶硫酮锌或1％的硫化硒或无去头皮屑活性成分的洗发剂组合物)治疗三周，从由有资质的分级人员在基线随访上测定的最高片状剥落八分体中收集胶带剥除样品。对于头皮屑受试者，在基线和三周产品治疗后获取头皮胶带剥除物。对于无头皮屑受试者，仅在基线获取头皮胶带剥除物。将胶带保存在-80℃直到进行提取。通过分开毛发进行含头皮屑部位的取样，所述取样通过施用D-胶带(CuDerm Corporation)并按需摩擦该胶带。对于无头皮屑受试者，对无片状剥落的部位取样。将胶带置于预先标记的12孔培养盘中进行贮藏。
用常规的提取缓冲液并在冰上超声处理来提取样品。胶带样品提取物的等分试样随后被转移到预先标记的聚丙烯收集管中并冻存在-80℃下以进行分析。另一份等分试样指定用BCATM Protein Assay Kit，Pierce catalog#23227进行可溶解蛋白质分析。
在提取后，通过iTRAQ分析或基于免疫测定的方法分析样品的蛋白质表达谱。将化合物的相对定量值标准化到通过上述BCA蛋白质测定法测定的提取物中的可溶解蛋白质的量。对来自去头皮屑洗发剂治疗组的样品进行基线和三周分析，并且对无头皮屑组的样品仅进行基线分析。AMP经由iTRAQ进行检测，并且基于在Uniprot和NCBInr数据库中匹配的已知化学结构进行鉴定。AMP通过基于免疫的测定法，使用适当的标准品和对照物，利用基于Mesoscale Discovery平台的免疫测定法进行定量，Mesoscale Discovery平台被专门设计用于每个单个的AMP。配对t检验用于分析无头皮屑(健康的)受试者、头皮屑基线和经头皮屑治疗的受试者之间的差异。对经头皮屑治疗的受试者和无头皮屑受试者进行比较，以确定在用去头皮屑产品治疗后的归一化程度。
结果概述
数据的统计学分析：收集在基线和第三周(治疗后)的头皮屑受试者和在基线的无头皮屑受试者的数据。假设在受试者之间以及受试者之内(基线->第三周)的分析物含量变化较大，在分析前将数据转化成log10标度是更有效的。对当量log10比值(即，log10(第三周/基线))进行统计学分析。将最后报告的结果重新转化成它们的初始标度(或者偏离基线值的％变化)以便于说明。使用SAS JMP(Version 7.0.2)软件进行所有统计学分析。使用≤0.20(双侧)的P值确定统计学差异。
相关的抗微生物肽在表1中示出。表1包含84种已知的抗微生物肽，它们经由UniProt分类并审查。列出了非冗余的UniProt条目名称连同常用的蛋白质名称。在这个研究中通过iTRAQ的11个蛋白质鉴定也在表1中示出。通过iTRAQ鉴定的十一个蛋白质中的七个与已知的AMP匹配。它们是：P81534(HBD3)、P59666(HNP-3)、P81605(皮离蛋白)、P05109(S100A8)、P06702(S100A9)、P08311(组织蛋白酶G)、和Q9H1E1(RNA酶7)。通过iTRAQ鉴定的抗微生物蛋白包括大部分归类的AMP。
表2列出在这个研究中通过iTRAQ鉴定的11个蛋白，它们具有至少一个统计学上显著的组间差异。虽然表2中的这些蛋白质中的若干蛋白质尚未被官方归类为AMP，有多个参考文献表明这些蛋白质行使AMP的功能，每个文献以引用方式并入本文(Lee DY等人，Histone H4 is a major component of the antimicrobial action of humansebocytes J Invest Dermatol.2009年10月；129(10):2489-96.doi:10.1038/jid.2009.106.Epub 2009年6月18日，以引用的方式并入本文；Pavia，KE等人，NovelHistone-Derived Antimicrobial Peptides Use Different AntimicrobialMechanisms.Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Biomembranes Volume 1818，Issue3，2012年3月，869至876页，以引用的方式并入本文；R.等人，Antimicrobialpsoriasin(S100A7)protects human skin from Escherichia coli infection.NatureImmunology 6，57-64(2004)在线公布：2004年11月28日；|doi:10.1038/ni1142，以引用的方式并入本文。
除了报道的抗微生物功能之外，它们的分子结构类似于一些已知的AMP家族(例如组蛋白和S100蛋白)。表2中的数据显示无头皮屑受试者基线和头皮屑受试者基线、以及用包含1％的ZPT或包含1％的硫化硒的洗发剂治疗三周后的头皮屑受试者对其基线的抗微生物肽的比率和相关联的P值，该抗微生物肽通过iTRAQ方法鉴定。另外，治疗过的头皮屑受试者与无头皮屑受试者的比较表示为对健康状态的归一化的指示。
鉴定了以下抗微生物肽：组蛋白H2B型1-M、组蛋白H2A、组蛋白H4、蛋白S100-A7、蛋白S100-A8、蛋白S100-A9、组织蛋白酶G、中性粒细胞防御素3(防御素，α3)(HNP-3)、皮离蛋白、核糖核酸酶7(RNA酶7)、和β-防御素103(hBD-3)。如比率>1所示，在基线处头皮屑受试者中的所有AMP相对于无头皮屑受试者增加，但皮离蛋白除外，其在头皮屑受试者中低于无头皮屑受试者。在用包含1％的ZPT或1％的硫化硒的去头皮屑洗发剂治疗后，在头皮屑受试者中增加的所有AMP的比率降低，指示改善。皮离蛋白比基线增加，指示改善。当经头皮屑治疗的受试者的头皮屑含量与无头皮屑受试者相比时，多个AMP返回到与健康头皮相关联的含量，这通过≤1的比率(或≥1的皮离蛋白比率)进行指示。
图1中的数据说明头皮屑hBD2含量比非头皮屑含量显著更高(P值＝<0.0001)。用这些hBD2含量除以在胶带剥除提取物中的蛋白质的量。从独立的无头皮屑组中测定hBD2含量以确定正常皮肤的hBD2含量。
图2中的数据说明用去头皮屑洗发剂治疗三周后的hBD2含量与基线含量相比存在33％的减少(P值<0.0001)。hBD2的减少符合与无头皮屑群体的含量比较所显示的改善。去头皮屑洗发剂展示对非去头皮屑洗发剂的显著改善(P值＝0.046)。用上述适用方法测得的人头皮胶带剥除样品上的hBD2含量可用胶带剥除提取物中存在的蛋白质的量进行标准化。已经用这些hBD2含量除以胶带剥除提取物中的蛋白质的量。
图3中的数据说明去头皮屑治疗将hBd2含量减少到与上文图1中讨论的无头皮屑组的hBd2含量一致。这是一种有用的有益效果传达手段，头皮屑群体期望恢复到符合正常和/或健康状态的值。
在特定实施例中，此类性能评估可对比较在用去头皮屑组合物治疗前后的受试者的皮肤健康状态有利。例如，如果受试者转换或保持某一去头皮屑组合物或治疗方案，一些去头皮屑组合物可发挥更快的见效速度，这将被受试者体会到。允许客观测量受试者的特定皮肤健康有益效果的评估可允许在用特定去头皮屑组合物或治疗方案治疗前以及在受试者转换特定去头皮屑组合物或治疗方案后比较受试者的状态。另外，此种评估可用作一种支持认证工具，其支持特定治疗或治疗方案声称提供的特定皮肤健康有益效果。例如，如果一种特定组合物或治疗方案宣称其将减少瘙痒症状，如本文所公开的评估可用于支持声称的具体健康状态有益效果，示出受试者的瘙痒不适情况已经减少了。可得益于去头皮屑组合物和治疗方案的皮肤健康非限制性状况包括瘙痒、片状剥落、过敏、皮肤屏障完整性、干燥、氧化应激反应和氧化损伤、自身防御、天然保护。
也可将许多分析的结果作为营销或广告信息来使用，以促进特定产品、产品组合和技术的有效性。可放置在产品包装上的可由本发明证实的广告宣传语的实例包括但不限于确立宣传语(例如，“临床证明”或“测试显示”)、用前和用后宣传语(例如，“用后头皮屑减轻到50％以下”)、单体宣传语、比较宣传语、因数宣传语(例如，“3倍的头皮屑减少量”)、以及预防和治疗宣传语。例如，产品包装可提及分析，并且可展示产品的经客观证明的有效性或比较信息。另外，还可将分析数据用于与不同的生活习惯相关的临床信息，所述生活习惯可与或可不与不同的产品或产品组联合使用。
另一个实施例包括其中标准化生物标记在施用吡啶硫酮锌洗发剂后，在与施用前的生物标记的基线含量进行比较时存在变化。在另一个实施例中，标准化分子生物标记在施用硫化硒洗发剂后，在与施用前的生物标记基线含量进行比较时存在变化。在另一个实施例中，可测量生物标记，其确定与治疗后的正常群体相比皮肤健康发生至少5％的改善。在另一个实施例中，与治疗后的正常群体相比皮肤健康发生至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％和更高至100％的改善。在另一个实施例中，在头皮屑和非头皮屑(无治疗)之间可存在至少5％的差值。另外，在头皮屑和非头皮屑之间可存在至少10％的差值，在头皮屑和非头皮屑之间可存在至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，以及更高至100％或更高的差值。
本文所公开的量纲和值不应理解为严格限于所引用的精确值。相反，除非另外指明，每个这样的量纲旨在表示所述值以及该值附近的函数等效范围。例如，所公开的量纲“40mm”旨在表示“约40mm”。
在发明详述中所有引用文献的相关部分均引入本发明以供参考。任何文献的引用不可理解为是对其作为本发明的现有技术的认可。当本文献中术语的任何含义或定义与引入本文以供参考的文献中相同术语的任何含义或定义冲突时，将以赋予本文献中那个术语的含义或定义为准。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，但是对那些本领域的技术人员显而易见的是，在不背离本发明的实质和范围的情况下可作出许多其它的改变和变型。因此，所附权利要求中旨在包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。
表1：
#仍未包括在UniProt AMP列表中的蛋白，但是它们的抗微生物功能已经被提及(ref)
表2：
关键词：
D＝头皮屑
ND＝非头皮屑
ZPT＝1％的ZPT洗发剂
硫化硒＝1％的硫化硒洗发剂
NA＝未分析。

Claims (15)

1.一种非诊断目的的用于测量受试者的头皮屑的非侵入性方法，所述非侵入性方法包括：
a)收集来自所述受试者的皮肤细胞样品；
b)检测在所述皮肤细胞样品中的一种或多种抗微生物肽生物标记的含量；
c)诊断所述受试者是否具有由于微生物侵袭皮肤而引发的防御机制或基于一种或多种抗微生物肽生物标记的所述含量测量系统是否与环境稳态平衡，所述一种或多种抗微生物肽生物标记选自人β防御素2；
d)测定相比于基线样品所述上皮细胞中的所述抗微生物肽生物标记的量。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
a)收集来自所述受试者的皮肤细胞样品；
b)检测在所述皮肤细胞样品中的人β防御素2生物标记的含量；
c)基于人β防御素2的所述含量诊断所述受试者是否具有头皮屑，这通过测定相比于正常人群所述皮肤细胞中的所述人β防御素-2生物标记的量进行。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中皮肤细胞是上皮细胞，所述皮肤细胞样品是上皮细胞样品。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括：
a)将粘合剂制品施用到哺乳动物的上皮；
b)使上皮细胞粘附到所述粘合剂制品；
c)从所述哺乳动物的上皮移除所述粘合剂制品；
d)使用用于提取的标准实验室方法制备所述粘合剂制品；
e)从粘附到所述粘合剂制品的所述上皮细胞中提取人β防御素2生物标记；
f)从粘附到所述粘合剂制品的所述上皮细胞中测量所述人β防御素2生物标记；
g)测定治疗后相比于基线样品所述上皮细胞中的所述人β防御素2生物标记的量。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中皮肤细胞样品的收集来自由以下项组成的组：粘合剂制品、毛发拔除、皮肤洗涤、以及它们的混合。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述抗微生物肽生物标记的含量通过用所述生物标记除以所述粘合剂制品上的蛋白质的量进行标准化。
7.根据权利要求4中任一项所述的方法，其中所述上皮包含角质层。
8.根据权利要求1、2、4中任一项所述的方法，其中治疗后生物标记含量的水平在与生物标记的基线含量进行比较时存在变化。
9.根据权利要求6所述的方法，其中标准化生物标记在施用抗真菌毛发治疗后，在与所述施用前的生物标记基线含量进行比较时存在偏离基线的变化。
10.根据权利要求6所述的方法，其中治疗后标准化人β防御素2生物标记在与所述施用前的人β防御素2生物标记的基线含量进行比较时存在33％的减少。
11.根据权利要求6所述的方法，其中标准化生物标记在施用吡啶硫酮锌洗发剂后在与所述施用前的生物标记的基线含量进行比较时存在变化。
12.根据权利要求6所述的方法，其中标准化分子生物标记在施用硫化硒洗发剂后在与所述施用前的生物标记的基线含量进行比较时存在变化。
13.根据权利要求1、2、4中任一项所述的方法，其中相比于正常群体在皮肤健康方面存在至少5％的改善。
14.根据权利要求1、2、4中任一项所述的方法，其中在头皮屑群体的头皮屑治疗和非头皮屑治疗之间存在至少5％的差值。
15.根据权利要求4所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
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