CN102539586A - 一种分离和检测食用植物油中的氧化甘油酯的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化合物分离检测领域，涉及一种分离和检测食用植物油中的氧化甘油酯(oxidizedtriglyceride,ox-TG)的方法及其应用。本发明的分离和检测食用植物油中氧化甘油酯的方法，采用正相柱层析法和HPLC-GPC技术将氧化甘油酯从食用植物油中分离出来，进而与蒸发光散射检测器（ELSD）或示差折光检测器（RI）联用，通过色谱图中氧化甘油酯的出峰面积分析并定量检测氧化甘油酯在食用植物油中的含量，均为有效、准确的检测食用植物油中是否掺有餐厨废油脂的重要步骤；本发明方法可直接分离和检测食用植物油中的氧化甘油酯，并直接应用到定性检测食用植物油中是否含有餐厨废油脂。

Description

一种分离和检测食用植物油中的氧化甘油酯的方法及其应用

技术领域

本发明属于化合物分离检测领域，涉及一种分离和检测食用植物油中的氧化甘油酯的方法及其应用。

背景技术

餐厨废油脂，即广义的地沟油，主要包括三大类：阴沟油(狭义的地沟油)、泔水油(潲水油)、煎炸老油。阴沟油是指宾馆、酒楼等地沟隔油池中捞取的油腻漂浮物，呈黑褐色液膏状，有酸腐恶臭气味。泔水油是指剩饭、剩菜(通称泔水)收集后的上层浮油，经过提炼呈金黄色至暗红色，有酸腐味。煎炸老油是指在高温下反复用于煎炸食品，发生劣变，不可再继续食用的油脂。

三类餐厨废油脂都可通过不同程度地精炼加工来改变其感官性质和理化性质。

餐厨废油脂的精炼加工工艺简单，一般先将收集的餐厨废油脂(水、渣、油混合物)加热、脱渣，成为粗毛油。再通过加热和脱色(活性碳、白土、双氧水等)，成为脱色油。脱色油再经过高温脱臭，成为脱臭油。

以餐厨废油脂为原料加工生产的粗毛油，以及经不同程度精炼加工生产的脱色油和脱臭油，在本专利中都称为二次油。通过精炼加工餐厨废油脂，特别是脱臭的二次油，其色泽、气味、滋味等感官指标，以及酸价和过氧化值等理化指标接近或完全达到国家《食用植物油卫生标准》(GB2716-2005)，难以与合格食用植物油区分。

二次油因餐厨废油脂来源不同、精炼加工程度不同，不仅亚油酸、亚麻酸等必需脂肪酸，植物甾醇、生育酚等油脂伴随物含量大幅降低，营养价值显著降低，而且还残留数量不等的重金属、真菌毒素、油脂氧化物等有毒有害成分。该油被食用以后，特别是长期或大量食用，对人体健康不利。

本发明中所称掺入食用植物油中的餐厨废油脂，指上述源于餐厨废油脂的二次油。

餐厨废油脂多在简陋的小作坊加工，人员素质低，环境卫生差，设备试剂不符合食品生产要求等。二次油与大豆油、菜籽油、玉米油等普通的食用植物油相比，原料便宜、加工成本低。因此，二次油的价格，远低于普通的大豆油等食用植物油。经营二次油的不法分子，是将二次油掺混至食用植物油中，假冒合格食用植物油销售。

食用植物油中掺入餐厨废油脂，一般不直接将粗毛油往合格食用植物油中掺兑，通常是将精炼加工后的脱色油或脱臭油按一定比例混入合格的食用植物油中，假冒合格食用植物油销售获利。通常难以从色泽等感官指标，甚至酸价等理化指标来鉴别合格食用植物油中是否掺有二次油，特别是掺入的脱臭的二次油。

以下为现有的餐厨废油脂的检测技术及存在的不足：对于餐厨废油脂的检测方法，已有较多的报道，如下举八例。现有的各种方法无一例外，都存在特征指标专一性不强，或者检测灵敏度不高，或者检测准确性不高，仅能在一定范围内适用特定类型的餐厨废油脂的检测判定。

方法一：常规油脂理化指标法

根据目前各类食用植物油相关的质量和卫生国家标准，检测油脂的多种常规理化指标，如酸值、过氧化值、羰基价等。若这些常规理化指标中有一个或多个的检测数据不符合国家标准的强制性规定，则判定该油脂为餐厨废油脂。本技术的主要技术缺陷：一是餐厨废油脂可通过精炼，各项常规理化指标可达到完全符合或接近国家各类质量和卫生国家标准。二是在食用油脂的生产加工、贮藏运输和使用过程中，有多种不同因素，可使油脂的常规理化指标不符合国家标准，常规理化指标不达标未必是餐厨废油脂。

方法二：胆固醇含量判定法

一般植物油中仅含有极其微量(低于50PPM)的胆固醇，而动物油中含有大量的胆固醇。餐厨废油脂常是多种不同来源的废弃食用油脂混合而成，往往含动物油脂。本技术的主要技术缺陷是：有的餐饮废油脂中不含动物油，如用于煎炸面制品的煎炸老油等。该方法代表性不足，会造成误判。而且，目前国内检测油脂中胆固醇含量的主要方法是气相色谱技术，其检测灵敏度较低。当食用植物油中掺入的餐厨废油脂比例少于10％时，难以检出其中的胆固醇。

方法三：薄层色谱检测极性物法

薄层色谱技术对餐厨废油脂的二级氧化产物醛、酮类等进行分离检测。本技术的主要技术缺陷是：餐厨废油脂的极性成分醛、酮类物质在油脂的深度精炼(如脱臭)过程中，可以大部分被去除，而薄层色谱技术检测灵敏度极低，不适于检测深度精炼的餐厨废油脂。

方法四：电导率法

餐厨废油脂会混入大量的水溶性物质，如食盐等调味品、洗涤剂等，这类物质会大幅度升高水的电导率，而正常的食用油脂中水溶性物质含量极低。本技术的主要技术缺陷是：通过深度精炼，可以将餐厨废油脂中绝大部分的水溶性物质去除，不适用于深度精炼餐厨废油脂。

方法五：顶空-气相色谱联用质谱检测油脂的挥发性成分

该方法采用顶空取样技术或顶空固相微萃取进样技术，收集餐厨废油脂氧化产生的小分子挥发性物质，并进行气质联用检测。本技术的主要技术缺陷是：经脱臭精炼，油脂中的挥发性成分大部分都除去了，不适用于深度精炼餐厨废油脂。

方法六：脂肪酸相对不饱和度(U/S值)

天然的食用植物油含有高含量的不饱和脂肪酸，因此有着比较高的脂肪酸相对不饱和度(U/S值)，一般在4～6.2之间。然而相对于饱和脂肪酸而言，不饱和脂肪酸的热稳定性比较差，在高温下其氧化分解的速度远快于饱和脂肪酸，植物油的U/S值会不断降低。本技术的主要技术缺陷是：不同来源的餐厨废油脂的U/S值变化比较大，不同种类的植物油本身的U/S值变化也比较大，若在一个U/S比较大的植物油(如葵花籽油，U/S为6左右)中掺入一个U/S为3左右的餐厨废油，这样即使掺入量达50％，最终混合油的U/S值也可达4.5左右，而这个U/S值和正常的食用花生油和食用调和油的U/S基本一致，就很难判断了。

方法七：测真菌毒素法

主要技术缺陷是：并不是所有的餐厨废油脂中都有真菌毒素的，被真菌毒素污染的餐厨废油脂只是其中一部分。而且，通过深度精炼，可以将油脂中绝大部分的真菌毒素去除。

方法八：表面活性剂残留法

本技术的主要技术缺陷是：并不是所有的餐厨废油脂中都有表面活性剂残留的。而且，通过深度精炼，可以将油脂中大部分的表面活性剂残留去除。

总之，由于餐厨废油脂不是一种化学组分固定不变的物质，因来源不同、精炼加工程度不同，其内在物质组成会呈现或多或少的差异。因此，包括以上列举的现有的餐厨废油脂检测技术，都未能针对餐厨废油脂独有的特征指标及其量值，来进行检测判断，检测结果的判定都不能适用所有类型的餐厨废油脂。

理论上，要研究建立一个完善的餐厨废油脂鉴别方法，有两个关键。第一、餐厨废油脂的特征组分或专一性指标的确立，该指标充分体现餐厨废油脂的特性，并与合格食用植物油有显著性差异。第二、研究用的餐厨废油脂样品具有代表性。餐厨废油脂样品组分多变，无论何种类别、来源、精炼加工程度，都具备其特征性的样品才具有代表性，据此研究的数据才具价值。

制约餐厨废油脂检测技术研究的因素之一是取样难。餐厨废油脂的加工和交易多具隐蔽性和黑道规则，研究机构难以取到真实交易中的精炼餐厨废油脂，更不用说满足大样本量的要求。通常研究人员都是模拟餐厨废油脂工厂的加工精炼方法，利用实验室的条件，对采集的餐厨废油脂原油进行纸过滤、白土或活性炭脱色、水洗、真空脱臭，自制各级实验用的餐厨废油脂样品。即便是自制餐厨废油脂样品，也罕见大样本量的研究结果的统计报道。

另一困扰地沟油检测技术研究的因素是其组分多变。深入地对大样本的各种来源与精炼程度的餐厨废油脂的组分系统分析与统计，提炼出二次油的共性特征及其量值的研究工作，始终未见突破。研究中所用的餐厨废油脂样品都被假定具有代表性。

因此，也就不难理解，目前已有的餐厨废油脂检测方法仅在一定范围内有效，缺乏广泛的适用性，应用时或多或少暴露出误判、漏判的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种分离和检测食用植物油中氧化甘油酯的方法，以解决现有技术中难以分离并准确检测食用植物油中氧化甘油酯含量的问题，为解决现有技术中难以有效、准确的检测食用植物油中是否掺有餐厨废油脂问题的重要步骤。

本发明的食用植物油指掺有或未掺有餐厨废油脂的食用植物油。

所述的掺入食用植物油中的餐厨废油脂是指所有源于餐厨废油脂的二次油，主要包括以阴沟油、泔水油(潲水油、泔脚油)或煎炸老油为原料加工生产的粗毛油，以及由这些粗毛油再经不同程度精炼而加工生产的餐厨废油脂。

合格食用植物油在成为二次油的过程中，因餐具、调味料、水池、地沟、储运容器、精炼加工环节的影响，造成餐厨废油脂受到不同性质、不同程度的外源性污染。包括六种主要的重金属(Pb、Cu、Fe、Zn、Mn、Cr)、十二烷基磺酸钠、胆固醇、真菌毒素等。以及因氧化导致的酸价、过氧化值、色泽、气味等理化指标的变化。由于外源性污染具有污染源的变异性和污染程度的差异性，所有外源性指标都难以成为餐厨废油脂理想的特异性指标。而且，经过精炼易改善的理化指标也不适合作为餐厨废油脂的特征指标。

本发明的技术原理如下：无论哪种类型的餐厨废油脂，阴沟油或者泔水油(潲水油)或者煎炸老油，作为二次油，都必定经历或者高温、或者空气接触、或者光照射，因此食用植物油脂遭受到较高程度的氧化。作为食用植物油脂主要成分的甘油三酯，尤其是不饱和的甘油三酯，极易氧化成氧化甘油酯(其主要成分为氧化甘油三酯)。氧化甘油酯一旦形成，难以通过脱胶、脱酸、脱色、脱臭等油脂精炼加工后去除(甘油三酯氧化一般规律如图1所示)。其含量，合格食用植物油会显著低于餐厨废油脂。而氧化甘油酯在高温有氧的条件下，氧化甘油酯之间会进一步发生聚合反应形成聚甘油酯(主要是指由植物油中的氧化甘油酯聚合产生的氧化甘油三酯聚合物)。餐厨废油脂理想的特征指标应当高度关注食用植物油的主要成分——甘油三酯(国标一级食用油中含量约95％以上)在氧化过程中的化学结构的变化。这种变化具有以下特点：第一、内源性，不受外界污染源影响。第二、普遍性，与泔水油、阴沟油、煎炸老油的类别无关，只要是食用植物油。因此，探究内源性的甘油三酯在氧化过程中兼具特异性和稳定性(难以精炼去除)的产物，有望获得餐厨废油脂理想的特征指标。

本发明就是在此原理基础上提供了一种分离和检测食用植物油中氧化甘油酯的方法。本发明所述的食用植物油中氧化甘油酯的分子量一般在700～1200道尔顿左右(45～70碳原子左右)；所述的食用植物油中聚甘油酯的分子量一般在≥1500道尔顿左右(≥80碳原子左右)。

本发明的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，包括以下步骤：

1)、采用正相柱层析法分离提取食用植物油中的极性成分，所述极性成分主要包括聚甘油酯(oxidized triglyceride polymer，TGP)和氧化甘油酯(oxidized triglyceride，ox-TG)；

所述极性成分还包括甘油二酯、游离脂肪酸和甾醇以及其它油脂极性伴随物。

2)、采用HPLC-GPC技术(高效体积排阻凝胶色谱法)从步骤1)获得的极性成分中分离氧化甘油酯；其中GPC指凝胶渗透色谱法；

进一步的，所述正相柱层析法分离提取食用植物油中的极性成分，具体包括如下步骤：

1)将食用植物油溶解于有机溶剂中，得到食用植物油的溶液；

2)将食用植物油的溶液上柱层析柱，固定相为极性固体吸附剂；

3)用石油醚和乙醚的混合液作为洗涤液冲洗柱层析柱，弃去洗涤液；

4)洗涤之后，用洗脱液对柱层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；

5)洗脱液脱溶后获得所述极性成分。

较佳的，所述正相柱层析法采用中压快速制备型液相色谱法。

较佳的，所述正相柱层析法采用的层析柱为中压快速制备型液相FLASH柱。

步骤1)中，所述有机溶剂为30～60℃沸程的石油醚、60～90℃沸程的石油醚、正己烷、环己烷和氯仿中的一种或多种溶剂组成的混合液；

步骤2)中，所述极性固体吸附剂选自硅胶、硅酸镁和氧化铝；

较佳的，所述极性固体吸附剂的粒径为100～500目或25～150μm。例如，硅胶优选的目数为100～400目。更佳的，所述极性固体吸附剂的含水量为5％。

若采普通柱层析法，极性固体吸附剂的粒径可为100～500目。

若采用中压快速制备型液相色谱法，极性固体吸附剂的粒径可为25-150μm；优选的，粒径可为40～60μm。进一步的，采用中压快速制备型液相色谱法，所述极性固体吸附剂的孔径可为

本发明的中压快速制备型液相色谱法的压力控制为1～25Psi，流速控制为2～60mL/min。

步骤3)中，所述石油醚和乙醚的混合液中乙醚的体积百分比为0.5％～20％，所述混合液中的石油醚选自30～60℃沸程的石油醚和60～90℃沸程的石油醚；优选的，乙醚的体积百分比为13％；

步骤4)中，所述洗脱液为乙醚、四氢呋喃、甲基叔丁基醚和二氯甲烷中的一种或多种溶剂组成的混合液；

步骤5)中，所述洗脱液脱溶(即脱除溶剂或者干燥除去溶剂)可采用不高于60℃的温度下，用惰性气体将洗脱液吹干；所述惰性气体为氮气或氩气；也可采用不高于60℃的温度下，用旋转蒸发仪蒸干。

步骤2)至4)中，若采用普通柱层析法，极性固体吸附剂人工装填于玻璃的层析柱内形成分离用色谱柱，人工或机械地控制洗涤液、洗脱液的流速和组成比例以及被洗脱物质的收集。若采用中压快速制备型液相色谱法，通过工业化的装柱机(装填机)，极性固体吸附剂预装填入不同规格的塑料制备型FLASH柱内，铝箔密封包装后成为商品化的分离用色谱柱，其最大能耐受200Psi的液体压力，同时采用的仪器是中压快速制备液相纯化系统，与商品化的分离用制备型FLASH柱相配套，能自动化、实时精确的控制洗涤液、洗脱液的流速和组成配比，安装有检测器能同步监测被洗脱物质的组分和洗脱时间，配备自动收集器能部分或全部收集被选中的洗脱物质，中压快速制备液相纯化系统最大能耐受200Psi的液体压力。

进一步的，采用所述HPLC-GPC技术从获得的极性成分中分离氧化甘油酯，具体包括如下步骤：

1)、将所得的极性成分溶解于四氢呋喃中，得到极性成分的四氢呋喃溶液；

2)、将所得的极性成分的四氢呋喃溶液用尼龙滤膜过滤后，在高压下注入填有固定相的高效体积排阻凝胶色谱柱，采用流动相进行洗脱分离，收集含有分子量为700～1200道尔顿的洗脱液，即为氧化甘油酯洗脱液；所述固定相为苯乙烯-二乙烯苯交联共聚凝胶，所述流动相为氯仿、四氢呋喃、甲苯、二甲基甲酰胺、丙酮、甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种溶剂组成的混合液；

进一步的，步骤2)中，所述苯乙烯-二乙烯苯交联共聚凝胶的孔径为5～50nm、粒径为5μm，具有高分辨率；所述尼龙滤膜的公称孔径优选为0.22和0.45um；所述高效体积排阻凝胶色谱柱为不锈钢柱，所述不锈钢柱可采用内径为7～9mm、长为300mm的不锈钢柱，且采用所述不锈钢柱的流动相的流速可以为0.5～2mL/分钟；所述色谱柱的柱温可以为20～45℃。

本发明的检测食用植物油中氧化甘油酯含量的方法，包括如下步骤：

1)在采用上述分离氧化甘油酯方法中所述的HPLC-GPC技术分离氧化甘油酯时，洗脱并采用蒸发光散射检测器(ELSD)或示差折光检测器(RI)对洗脱物质进行分析检测，得到洗脱物质的HPLC-GPC色谱图(高效体积排阻凝胶色谱图)；

2)以标准的甘油三酯单体为标准定量和/或定性物质，依据步骤1)所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积计算获得食用植物油中氧化甘油酯的含量。

步骤2)中，具体为：以标准的甘油三酯单体为标准定量和/或定性物质，采用峰面积归一化定量法，即以步骤1)所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积占所有出峰物质总峰面积的百分比为氧化甘油酯在极性成分中的质量百分含量，此质量百分含量再乘以极性成分在食用植物油中的质量百分含量，即可计算获得食用植物油中氧化甘油酯的质量百分含量。

步骤2)中，所述氧化甘油酯色谱峰为分子量相当于或接近于标准甘油三酯单体分子量的物质的色谱峰；所述标准甘油三酯单体的分子量为900道尔顿左右；进一步的，所述标准甘油三酯单体的分子量为800～900道尔顿。

优选的，所述蒸发光散射检测器(ELSD)的载气为纯度大于99％的氮气；气体流速为5～95mL/分钟；蒸发管温度为40～120℃。优选的，所述的示差折光检测器检测池温度为20～40℃；进一步的，检测池温度为30～45℃。所述采用示差折光检测器的进样量可以为10～20ul。

本发明中，利用正相柱层析法分离提取油脂样品中极性成分(氧化甘油酯、聚甘油酯、甘油二酯、游离脂肪酸和甾醇以及其它油脂极性伴随物)，原理如下：氧化甘油酯的理化性质及分子量与正常的甘油三酯相近，两者间唯一显著的区别是，氧化甘油酯有一定的极性，在一定的条件下，可被极性固体吸附剂(如硅胶、硅酸镁、氧化铝等)所迟滞或吸附，而正常的甘油三酯极性极弱，不能被极性固体吸附剂所迟滞或吸附。聚甘油酯也能被极性固体吸附剂所迟滞或吸附，但其分子量一般明显大于正常甘油三酯的分子量。

HPLC-GPC技术是一种特殊的高效液相色谱(HPLC)法，是将被检测的物质溶于溶液中，再把样品溶液以高压的方式注入装填有固相吸附剂的全封闭的分离分析型色谱柱中。由于不同物质的化学性质不同，它们在固相吸附剂上的吸附和解吸附的性质、速度也不同，进而把不同物质相互分离开来，并先后从色谱柱上洗脱下来，最终被相应的检测器所检测，并转化为数字信息。

采用HPLC-GPC技术对氧化甘油酯和聚甘油酯进一步分离与定量测定，原理如下：HPLC-GPC法中，被检测物质在色谱柱上的吸附和解吸附的性质，与该物质的化学性质无关，仅仅由该物质的分子量所决定。物质的分子量越大，越难被HPLC-GPC色谱柱所吸附，就越早被洗脱出峰。氧化甘油酯和聚甘油酯的化学性质比较接近，用一般的HPLC法，很难将它们分离测定。但是采用HPLC-GPC法，由于聚甘油酯的分子量远大于氧化甘油酯，因此聚甘油酯率先从极性成分中洗脱分离出来，随后氧化甘油酯洗脱分离出来。所述分离出来的氧化甘油酯可以进一步被检测，采用峰面积归一化定量技术，所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积占所有出峰物质总峰面积的百分比，乘以极性成分在食用植物油中的质量百分含量，即可计算获得食用植物油中氧化甘油酯的质量百分含量。

本发明的分离和检测食用植物油中氧化甘油酯的方法，采用正相柱层析法和HPLC-GPC技术将氧化甘油酯从食用植物油中分离出来，进而与蒸发光散射检测器(ELSD)或示差折光检测器(RI)联用，通过高效体积排阻凝胶色谱图中氧化甘油酯的出峰面积分析并定量检测氧化甘油酯在食用植物油中的含量，均为有效、准确的检测食用植物油中是否掺有餐厨废油脂的重要步骤；本发明采用正相柱层析法以及高效体积排阻凝胶色谱法与蒸发光散射检测器/示差折光检测器联用(HPLC-GPC-ELSD/RI)可直接分离并检测食用植物油中的氧化甘油酯，并直接应用到定性和定量检测食用植物油中是否含有餐厨废油脂。

附图说明

图1.甘油三酯氧化为氧化甘油酯和聚甘油酯的一般规律示意图。

图2.HPLC-GPC-RI色谱图

图3制备脱色油的反应系统示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

实施例1

不同样本中氧化甘油酯含量的比较。

氧化甘油酯含量的检测方法：

一)、油脂极性成分的提取

方法1)普通柱层析法：先精确称油脂样品2.5克(M)，用20mL的30～60℃沸程的石油醚完全溶解后，再用30～60℃沸程的石油醚定容至50mL，取20mL样品溶液上硅胶层析柱(内径为21mm、长450mm的玻璃柱，内装填25克、含水量为5％的100～200目的硅胶)，用150mL的洗涤液(30～60℃沸程的石油醚∶乙醚＝87∶13)以2～2.5mL/分钟的流速冲洗硅胶层析柱，弃去洗涤液；再用150mL的乙醚以2～2.5mL/分钟的流速洗脱硅胶层析柱，收集全部的乙醚洗脱液于一个已经恒重称重的250mL的烧瓶中(空白烧瓶的质量为M₁克)，在不高于60℃的温度下，用旋转蒸发仪蒸干全部的乙醚后再恒重称重，此时获得残留物和烧瓶的总质量为M₂克，[(M₂-M₁)/M]×100％即为残留物——极性成分在油脂样品中的质量百分含量，再用[(M₂-M₁)×100]mL的四氢呋喃溶解极性成分，极性成分溶液经过0.45μm的尼龙滤膜过滤后，进行高效体积排阻凝胶色谱(HPLC-GPC，配备ELSD检测器或RI检测器)检测。

方法2)中压快速制备液相色谱法：取2支新的制备型FLASH柱(内径为30mm、长115mm的玻璃柱，内装填20克粒径为40～60um、孔径为的无定形硅胶)，上下串联后，连接入中压快速液相制备纯化系统的溶剂管路内，用洗涤液(30～60℃沸程的石油醚∶乙醚＝87∶13)以25mL/分钟的流速冲洗平衡串联的FLASH柱10～12分钟。然后称油脂样品1.0克(M)，用5mL的30～60℃沸程的石油醚完全溶解后，再用10mL的注射器注入串联的FLASH柱的液体入口处。用洗涤液(30～60℃沸程的石油醚∶乙醚＝87∶13)以25mL/分钟的流速洗涤串联的FLASH柱20分钟，弃去洗涤液，再用乙醚以25mL/分钟的流速洗脱串联的FLASH柱25分钟，收集全部的乙醚洗脱液于一个已经恒重称重的500mL的烧瓶中(空白烧瓶的质量为M₁克)，在不高于60℃的温度下，用旋转蒸发仪蒸干全部的乙醚后再恒重称重，此时获得残留物和烧瓶的总质量为M₂克，[(M₂-M₁)/M]×100％即为残留物——极性成分在油脂样品中质量百分含量，再用[(M₂-M₁)×100]mL的四氢呋喃溶解极性成分，极性成分溶液经过0.45um的尼龙滤膜过滤后，进行高效体积排阻凝胶色谱(HPLC-GPC，配备ELSD检测器或RI检测器)检测。

高效体积排阻凝胶色谱检测参数如下：

色谱柱：高效体积排阻凝胶色谱柱，内径为7.6mm，长300mm的不锈钢柱，内填有孔径为10nm、粒径为5um的高分辨率苯乙烯-二乙烯苯交联共聚凝胶，双柱联用。流动相：色谱纯的四氢呋喃。流速：0.8mL/分钟。柱温：35℃。检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)(载气：纯度大于99％的氮气；气体流速8mL/分钟；蒸发管温度90℃)或示差折光检测器(RI)(检测池温度35℃)。进样量：10ul。

以标准的甘油三酯单体的分子量为参照，对检测获得的高效体积排阻凝胶色谱图进行分析，凡是分子量相当于或接近于标准甘油三酯单体分子量(分子量为800～900道尔顿)的色谱峰均为氧化甘油酯的色谱峰。采用峰面积归一化定量法，即以所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积占所有出峰物质总峰面积的百分比为氧化甘油酯在极性成分中的质量百分含量，此质量百分含量再乘以极性成分在食用植物油中的质量百分含量，即可计算获得食用植物油中氧化甘油酯的质量百分含量。

按以上方法，每一个样品连续进行5次氧化甘油酯含量的检测，即5次平行性检测实验，要求这5次平行性检测的结果的相对标准偏差(RSD)小于12％，符合此条件的某个样品的5次平行性检测结果的平均值为该样品的最终测定值。

样品检测：

阴沟油：来自某饭店隔油池

泔水油：从某饭店的泔脚中分离获得

煎炸老油：来自某饭店的煎炸用油锅

一、粗毛油样本的制备：

1)泔水油粗毛油的制备

先将泔水原油放入40℃～60℃的恒温烘箱中，加热数小时，直至泔水原油完全熔化呈液态。用一个布氏漏斗，其中漏斗底部先垫上3层中速定性滤纸，再在其上铺一层0.5cm厚的硅藻土，最后在硅藻土层上再垫1层中速定性滤纸。用抽滤的方式，趁热对熔化的泔水原油进行过滤，并收集滤油，即为泔水油粗毛油。

2)阴沟油粗毛油的制备

先将阴沟油原油放入40℃～60℃的恒温烘箱中，加热数小时，直至阴沟油原油完全熔化呈液态。用一个布氏漏斗，其中漏斗底部先垫上3层中速定性滤纸，再在其上铺一层0.5cm厚的硅藻土，最后在硅藻土层上再垫1层中速定性滤纸。用抽滤的方式，趁热对熔化的阴沟油原油进行过滤，并收集滤油，即为阴沟油粗毛油。

3)煎炸老油粗毛油的制备

先将煎炸老油原油放入40℃～60℃的恒温烘箱中，加热数小时，直至煎炸老油原油完全熔化呈液态。用一个布氏漏斗，其中漏斗底部先垫上3层中速定性滤纸，再在其上铺一层0.5em厚的硅藻土，最后在硅藻土层上再垫1层中速定性滤纸。用抽滤的方式，趁热对熔化的煎炸老油原油进行过滤，并收集滤油，即为煎炸老油粗毛油。

二、脱色油样本的制备：

1)泔水油脱色油样品的制备

称取150～300克的泔水油粗毛油于600mL的烧杯中，均等地倒入2个250mL梨形分液漏斗中，用加热至70～95℃的蒸馏水振摇洗涤2次，每次100mL的蒸馏水，振摇2～3分钟。每次振摇洗涤后，静置分层，弃去下层的洗涤水。配制0.5～5％的磷酸水溶液，并加热至70～95℃。向每只分液漏斗中加入100mL的热磷酸溶液，充分振摇2～3分钟后，静置分层，弃去下层的酸水溶液，再加入70～95℃的新的磷酸水溶液，如此反复酸洗3次。然后再用70～95℃的蒸馏水进行水洗，每次入100mL的热蒸馏水，充分振摇2～3分钟后，静置分层，弃去下层的水洗溶液，反复洗3～4次，直到下层水洗溶液用广泛pH试纸测定的pH值为4～7左右。将水洗后的泔水油粗毛油全部倒入一个500mL的三口烧瓶中，并称重获得油重。将烧瓶密封后，连接上蒸馏冷凝管，再连接上真空泵，再把三口烧瓶放在温控式磁螺旋搅拌加热器的加热头上，形成一个密闭的反应系统(见图3所示)。以300～800rpm/min的速度进行搅拌，边搅拌边把油温加热至50～70℃，同时打开真空泵，维持整个反应系统700～740毫米汞柱的负压状态。此时，油内会有大量沸腾的气泡产生(是水蒸汽)，维持加热和真空状态，直到油中再无明显的气泡产生。关闭真空泵，解除反应系统的真空状态。在维持搅拌的状态下，把泔水油粗毛油加热至50～70℃，然后向三口烧瓶的泔水油中加入油质量1％～5％的活性白土和油质量1％～5％的活性碳。密封反应系统，开启真空泵，维持系统700～740毫米汞柱的负压状态，搅拌速度调至300～800rpm/min，维持50～70℃的油温，反应15～50钟。而后，将泔水油粗毛油加热至75～105℃，继续反应15～50分钟。反应结束后，关闭真空泵、冷凝水、搅拌和加热。取下装有泔水油脱色混合物的三口烧瓶，将其中的混合物倒入垫有三层滤纸的布氏漏斗中，进行抽滤。抽滤下的滤油收集于一个500mL的抽滤瓶中。第一次抽滤完成后，将获得的滤油重新倒入同一个布氏漏斗中再抽滤一次，收集滤油于一个新的500mL抽滤瓶中，即为脱色泔水油。

2)阴沟油脱色油样品的制备

称取150～300克的阴沟油粗毛油于600mL的烧杯中，均等地倒入2个250mL梨形分液漏斗中，用加热至70～95℃的蒸馏水振摇洗涤2次，每次100mL的蒸馏水，振摇2～3分钟。每次振摇洗涤后，静置分层，弃去下层的洗涤水。配制0.5～5％的磷酸水溶液，并加热至70～95℃。向每只分液漏斗中加入100mL的热磷酸溶液，充分振摇2～3分钟后，静置分层，弃去下层的酸水溶液，再加入70～95℃的新的磷酸水溶液，如此反复酸洗3次。然后再用70～95℃的蒸馏水进行水洗，每次入100mL的热蒸馏水，充分振摇2～3分钟后，静置分层，弃去下层的水洗溶液，反复洗3～4次，直到下层水洗溶液用广泛pH试纸测定的pH值为4～7左右。将水洗后的阴沟油粗毛油全部倒入一个500mL的三口烧瓶中，并称重获得油重。将烧瓶密封后，连接上蒸馏冷凝管，再连接上真空泵，再把三口烧瓶放在温控式磁螺旋搅拌加热器的加热头上，形成一个密闭的反应系统(见图4所示)。以300～800rpm/min的速度进行搅拌，边搅拌边把油温加热至50～70℃，同时打开真空泵，维持整个反应系统700～740毫米汞柱的负压状态。此时，油内会有大量沸腾的气泡产生(是水蒸汽)，维持加热和真空状态，直到油中再无明显的气泡产生。关闭真空泵，解除反应系统的真空状态。在维持搅拌的状态下，把阴沟油粗毛油加热至50～70℃，然后向三口烧瓶的阴沟油粗毛油中加入油质量1％～5％的活性白土和油质量1％～5％的活性碳。密封反应系统，开启真空泵，维持系统700～740毫米汞柱的负压状态，搅拌速度调至300～800rpm/min，维持50～70℃的油温，反应15～50钟。而后，将阴沟油粗毛油加热至75～105℃，继续反应15～50分钟。反应结束后，关闭真空泵、冷凝水、搅拌和加热。取下装有阴沟油脱色混合物的三口烧瓶，将其中的混合物倒入垫有三层滤纸的布氏漏斗中，进行抽滤。抽滤下的滤油收集于一个500mL的抽滤瓶中。第一次抽滤完成后，将获得的滤油重新倒入同一个布氏漏斗中再抽滤一次，收集滤油于一个新的500mL抽滤瓶中，即为脱色阴沟油。

3)煎炸老油脱色油样品的制备

称取150～300克的煎炸老油粗毛油于600mL的烧杯中，均等地倒入2个250mL梨形分液漏斗中，用加热至70～95℃的蒸馏水振摇洗涤2次，每次100mL的蒸馏水，振摇2～3分钟。每次振摇洗涤后，静置分层，弃去下层的洗涤水。配制0.5～5％的磷酸水溶液，并加热至70～95℃。向每只分液漏斗中加入100mL的热磷酸溶液，充分振摇2～3分钟后，静置分层，此时在顶层油层和底层酸水层间可能会出现乳化层，弃去酸水层合乳化层，尽可能保留顶层的油层，再加入70～95℃的新的磷酸水溶液，如此反复酸洗3次。然后再用70～95℃的蒸馏水进行水洗，每次入100mL的热蒸馏水，充分振摇2～3分钟后，静置分层，弃去下层的水洗溶液，反复洗3～4次，直到下层水洗溶液用广泛pH试纸测定的pH值为4～7左右。将水洗后的煎炸老油粗毛油全部倒入一个500mL的三口烧瓶中，并称重获得油重。将烧瓶密封后，连接上蒸馏冷凝管，再连接上真空泵，再把三口烧瓶放在温控式磁螺旋搅拌加热器的加热头上，形成一个密闭的反应系统(见图4所示)。以300～800rpm/min的速度进行搅拌，边搅拌边把油温加热至50～70℃，同时打开真空泵，维持整个反应系统700～740毫米汞柱的负压状态。此时，油内会有大量沸腾的气泡产生(是水蒸汽)，维持加热和真空状态，直到油中再无明显的气泡产生。关闭真空泵，解除反应系统的真空状态。在维持搅拌的状态下，把煎炸老油粗毛油加热至50～70℃，然后向三口烧瓶的煎炸老油粗毛油中加入油质量1％～5％的活性白土和油质量1％～5％的活性碳。密封反应系统，开启真空泵，维持系统700～740毫米汞柱的负压状态，搅拌速度调至300～800rpm/min，维持50～70℃的油温，反应15～50钟。而后，将煎炸老油粗毛油加热至75～105℃，继续反应15～50分钟。反应结束后，关闭真空泵、冷凝水、搅拌和加热。取下装有煎炸老油脱色混合物的三口烧瓶，将其中的混合物倒入垫有三层滤纸的布氏漏斗中，进行抽滤。抽滤下的滤油收集于一个500mL的抽滤瓶中。第一次抽滤完成后，将获得的滤油重新倒入同一个布氏漏斗中再抽滤一次，收集滤油于一个新的500mL抽滤瓶中，即为脱色煎炸老油。

三、脱臭油样本的制备

1)泔水油脱臭油样品的制备

将脱色泔水油倒入一个新的500mL三口烧瓶中，烧瓶放入温控式加热套内。将烧瓶密封后，连接上蒸馏冷凝管，再连接上真空泵，形成密闭的反应系统。打开真空泵和冷凝水，维持系统700～740毫米汞柱的负压状态。然后打开加热套，把油温升至170～250℃，维持真空状态，反应2～5小时。反应结束后，将三口烧瓶从加热套中取出，冷却至室温后，关闭真空泵和冷凝水，即获得脱臭泔水油。

2)阴沟油脱臭油样品的制备

将脱色阴沟油倒入一个新的500mL三口烧瓶中，烧瓶放入温控式加热套内。将烧瓶密封后，连接上蒸馏冷凝管，再连接上真空泵，形成密闭的反应系统。打开真空泵和冷凝水，维持系统700～740毫米汞柱的负压状态。然后打开加热套，把油温升至170～250℃，维持真空状态，反应2～5小时。反应结束后，将三口烧瓶从加热套中取出，冷却至室温后，关闭真空泵和冷凝水，即获得脱臭阴沟油。

3)煎炸老油脱臭油样品的制备

将脱色煎炸老油倒入一个新的500mL三口烧瓶中，烧瓶放入温控式加热套内。将烧瓶密封后，连接上蒸馏冷凝管，再连接上真空泵，形成密闭的反应系统。打开真空泵和冷凝水，维持系统700～740毫米汞柱的负压状态。然后打开加热套，把油温升至170～250℃，维持真空状态，反应2～5小时。反应结束后，将三口烧瓶从加热套中取出，冷却至室温后，关闭真空泵和冷凝水，即获得脱臭煎炸老油。

样本及检测结果：

	氧化甘油酯的含量(％)
		阴沟油制备的粗毛油	52.3
阴沟油制备的脱色油	39.9
		阴沟油制备的脱臭油	29.2
泔水油制备的粗毛油	34.4
		泔水油制备的脱色油	25.5
泔水油制备的脱臭油	19.7
		煎炸老油制备的粗毛油	36.2
煎炸老油制备的脱色油	25.9
		煎炸老油制备的脱臭油	20.0
国标一级浸出大豆油	1.6
		国标一级压榨玉米油	1.4
国标一级压榨菜籽油	1.3
		国标一级压榨花生油	1.5
国标一级压榨葵花籽油	1.6

	国标一级压榨菜籽油(％)	泔水油的粗毛油(％)	氧化甘油酯的含量(％)
				样本1	100	0	1.3
样本2	95	5	3.1
				样本3	90	10	4.7
样本4	80	20	8.1
				样本5	60	40	14.8
样本6	40	60	21.0
				样本7	0	100	34.4

	国标一级压榨菜籽油(％)	泔水油的脱臭油(％)	氧化甘油酯的含量(％)
				样本1	100％	0	1.3
样本2	95	5	2.2
				样本3	90	10	3.1
样本4	80	20	5.2
				样本5	60	40	8.8
样本6	40	60	12.5
				样本7	0	100％	19.7

结果分析：

由上可见，无论是何种来源的二次油，其氧化甘油酯的含量均远高于食用植物油中的含量，而且加工后，氧化甘油酯并未被去除，食用植物油中氧化甘油酯的含量低于2.0％，而二次油中氧化甘油酯的含量远超2.0％，以氧化甘油酯的含量为2.0％作为检测指标，可检出餐厨废油脂。

实施例2

样本检测

样本来源：来自某饭店的煎炸用油锅

检测方法：

第一步：样品中氧化甘油酯的定量检测

一)、油脂极性成分的提取

方法1)普通柱层析法：先精确称油脂样品2.5克(M)，用20mL的30～60℃沸程的石油醚完全溶解后，再用30～60℃沸程的石油醚定容至50mL，取20mL样品溶液上硅胶层析柱(内径为21mm、长450mm的玻璃柱，内装填25克、含水量为5％的100～500目的硅胶)，用150mL的洗涤液(30～60℃沸程的石油醚∶乙醚＝87∶13)以2～2.5mL/分钟的流速冲洗硅胶层析柱，弃去洗涤液；再用150mL的乙醚以2～2.5mL/分钟的流速洗脱硅胶层析柱，收集全部的乙醚洗脱液于一个已经恒重称重的250mL的烧瓶中(空白烧瓶的质量为M₁克)，在不高于60℃的温度下，用旋转蒸发仪蒸干全部的乙醚后再恒重称重，此时获得残留物和烧瓶的总质量为M₂克，[(M₂-M₁)/M]×100％即为残留物——极性成分在油脂样品中质量百分含量，再用[(M₂-M₁)×100]mL的四氢呋喃溶解极性成分，极性成分溶液经过0.45um的尼龙滤膜过滤后，进行高效体积排阻凝胶色谱(HPLC-GPC，配备ELSD检测器或RI检测器)检测。

方法2)中压快速制备液相色谱法：取2支新的制备型FLASH柱(内径为30mm、长115mm的FLASH柱，内装填20克粒径为40～60um、孔径为

的无定形硅胶)，上下串联后，连接入中压快速液相制备纯化系统的溶剂管路内，用洗涤液(30～60℃沸程的石油醚∶乙醚＝87∶13)以25mL/分钟的流速冲洗平衡串联的FLASH柱10～12分钟。然后称油脂样品1.0克(M)，用5mL的30～60℃沸程的石油醚完全溶解后，再用10mL的注射器注入串联的FLASH柱的液体入口处。用洗涤液(30～60℃沸程的石油醚∶乙醚＝87∶13)以25mL/分钟的流速洗涤串联的FLASH柱20分钟，弃去洗涤液，再用乙醚以25mL/分钟的流速洗脱串联的FLASH柱25分钟，收集全部的乙醚洗脱液于一个已经恒重称重的500mL的烧瓶中(空白烧瓶的质量为M₁克)，在不高于60℃的温度下，用旋转蒸发仪蒸干全部的乙醚后再恒重称重，此时获得残留物和烧瓶的总质量为M₂克，[(M₂-M₁)/M]×100％即为残留物——极性成分在油脂样品中质量百分含量，再用[(M₂-M₁)×100]mL的四氢呋喃溶解极性成分，极性成分溶液经过0.45um的尼龙滤膜过滤后，进行高效体积排阻凝胶色谱(HPLC-GPC，配备ELSD检测器或RI检测器)检测。

二)氧化甘油酯的检测

高效体积排阻凝胶色谱检测参数如下：

色谱柱：高效体积排阻凝胶色谱柱，内径为7.6mm，长300mm的不锈钢柱，内填有孔径为10nm、粒径为5um的高分辨率苯乙烯-二乙烯苯交联共聚凝胶，双柱联用。流动相：色谱纯的四氢呋喃。流速：0.8mL/分钟。柱温：35℃。检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)(载气：纯度大于99％的氮气；气体流速8mL/分钟；蒸发管温度90℃)或示差折光检测器(RI)。(检测池温度35℃)。进样量：10ul。。

以标准的甘油三酯单体的分子量为参照，对检测获得的高效体积排阻凝胶色谱图进行分析，凡是分子量相当于或接近于标准甘油三酯单体分子量(分子量为800～900道尔顿)的色谱峰均为氧化甘油酯的色谱峰。如图2所示。采用峰面积归一化定量技术，即以所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积占所有出峰物质总峰面积的百分比为氧化甘油酯在极性成分中的质量百分含量，此质量百分含量再乘以极性成分在食用植物油中的质量百分含量，即可计算获得食用植物油中氧化甘油酯的质量百分含量。

按以上方法，每一个样品连续进行5次氧化甘油酯含量的检测，即5次平行性检测实验，要求这5次平行性检测的结果的相对标准偏差(RSD)小于12％，符合此条件的某个样品的5次平行性检测结果的平均值为该样品的最终测定值。最后定量计算出氧化甘油酯的含量为6.2％。

第二步：结果判定

氧化甘油酯含量：6.2％≥2.0％

由于被检测的油脂样品中氧化甘油酯的含量远远超过指标含量(2.0％)，故判定该油脂样品中掺有餐厨废油脂。

Claims (15)

1.一种分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，包括如下步骤：

1)、采用正相柱层析法分离提取食用植物油中的极性成分，所述极性成分主要为聚甘油酯和氧化甘油酯；

2)、采用HPLC-GPC技术从步骤1)获得的极性成分中分离氧化甘油酯。

2.如权利要求1所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，所述极性成分还包括甘油二酯、游离脂肪酸和甾醇以及其它油脂极性伴随物。

3.如权利要求1所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，所述正相柱层析法分离提取食用植物油中的极性成分，具体包括如下步骤：

1)将食用植物油溶解于有机溶剂中，得到食用植物油的溶液；

2)将食用植物油的溶液上柱层析柱，固定相为极性固体吸附剂；

3)用石油醚和乙醚的混合液作为洗涤液冲洗柱层析柱，弃去洗涤液；

4)洗涤之后，用洗脱液对柱层析柱进行洗脱，并收集洗脱液；

5)洗脱液脱溶后获得所述极性成分。

4.如权利要求3所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，步骤1)中，所述有机溶剂为30～60℃沸程的石油醚、60～90℃沸程的石油醚、正己烷、环己烷和氯仿中的一种或多种溶剂组成的混合液；步骤2)中，所述极性固体吸附剂为硅胶、硅酸镁或氧化铝；

5.如权利要求4所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，步骤2)中，所述极性固体吸附剂的粒径为100～500目或25～150μm。

6.如权利要求3所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，步骤3)中，所述混合液中乙醚的体积百分比为0.5％～20％；所述混合液中的石油醚选自30～60℃沸程的石油醚和60～90℃沸程的石油醚；步骤4)中，所述洗脱液为乙醚、四氢呋喃、甲基叔丁基醚和二氯甲烷中的一种或多种溶剂组成的混合液。

7.如权利要求1-6任一所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，所述正相柱层析法采用普通柱层析法或中压快速制备型液相色谱法。

8.如权利要求7所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，所述正相柱层析法采用的层析柱为普通柱层析柱或中压快速制备型液相FLASH柱。

9.如权利要求1-8任一所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法，其特征在于，所述HPLC-GPC技术分离氧化甘油酯，具体包括如下步骤：

1)、将所得的极性成分溶解于四氢呋喃中，得到极性成分的四氢呋喃溶液；

2)、将所得的极性成分的四氢呋喃溶液用尼龙滤膜过滤后，在高压下注入填有固定相的高效体积排阻凝胶色谱柱，采用流动相进行洗脱分离，收集含有分子量为700～1200道尔顿洗脱物质的洗脱液；所述固定相为苯乙烯-二乙烯苯交联共聚凝胶，所述流动相为氯仿、四氢呋喃、二甲基甲酰胺、丙酮、甲苯、甲基叔丁基醚、二氯甲烷和乙酸乙酯中的一种或多种溶剂组成的混合液。

10.如权利要求1-9任一所述的分离食用植物油中氧化甘油酯的方法在掺入食用植物油中的餐厨废油脂的检测中的应用。

11.一种检测食用植物油中氧化甘油酯含量的方法，包括如下步骤：

1)在采用权利要求1-9任一所述的HPLC-GPC技术分离氧化甘油酯时，洗脱并采用蒸发光散射检测器或示差折光检测器对洗脱物质进行分析检测，得到洗脱物质的HPLC-GPC色谱图；

2)以标准的甘油三酯单体为标准定量和/或定性物质，依据步骤1)所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积计算获得食用植物油中氧化甘油酯的含量。

12.如权利要求11所述的检测食用植物油中氧化甘油酯含量的方法，其特征在于，步骤2)具体为：以步骤1)所得色谱图中氧化甘油酯色谱峰的出峰面积占所有出峰物质总峰面积的百分比为氧化甘油酯在极性成分中的质量百分含量，此质量百分含量再乘以极性成分在食用植物油中的质量百分含量，即可计算获得食用植物油中氧化甘油酯的质量百分含量。

13.如权利要求11所述的检测食用植物油中氧化甘油酯含量的方法，其特征在于，所述氧化甘油酯色谱峰为分子量相当于或接近于标准甘油三酯单体分子量的物质的色谱峰。

14.如权利要求11所述的检测食用植物油中氧化甘油酯含量的方法，其特征在于，所述蒸发光散射检测器的载气为纯度大于99％的氮气，气体流速为5～95mL/分钟，蒸发管温度为40～120℃；所述的示差折光检测器的检测池温度为20～40℃。

15.如权利要求11-14任一所述的检测食用植物油中氧化甘油酯含量的方法在掺入食用植物油中的餐厨废油脂的检测中的应用。

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