CN102539206A - 缺血修饰白蛋白质控品的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,步骤:(1)采用健康人血清,调节pH值7.0~7.5;(2)向血清中加入0.1~100mm具有变价中心的金属离子盐或具有分子平面性的金属有机复合物,然后加入0.1~100mm过氧化氢;(3)在35~40℃光照下反应10~30min;(4)将步骤(3)反应所得溶液在20~25℃,pH7.5~8.0,0.1~1000mm透析缓冲液中透析12~24h;(5)按常规技术添加防腐剂,混合均匀后,分装、测定。本发明具有原料来源充足,易获得,制备工艺简单,添加剂数量少,生产成本低,非特异性干扰小,无需复溶,均一性好,瓶间差异小的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种缺血修饰白蛋白质控品的制备方法。
背景技术
急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndromes,ACS)有不同的临床表现,但均有一个相同的病理生理过程,即动脉粥样硬化斑块脱落、血小板聚集和血栓形成,导致冠状动脉狭窄、阻塞,而引起心肌缺血,如果心肌缺血时间延长会导致心肌细胞坏死和心肌损伤。因此,在心肌坏死之前鉴别出心肌缺血,尽早明确诊断和开始治疗对于病人是至关重要的。当前心脏缺血的诊断多依赖于心电图的ST段和T波的改变,这是心肌缺血最简便、最迅速和最廉价的检查方法,但心梗的病人也可多表现为心电图未见异常,其灵敏度低于50%。单光子发射计算机成像显示的急性心肌灌注异常和超声心动图显示的室壁运动异常是诊断心肌缺血较好的指标,这两种方法都有很高的敏感性、特异性和阴性预测值,但在实际工作中不能随时检查且费用高昂,如果不与以前的检查结果对比则很难识别新出现的缺血区。目前临床应用的心肌缺血标志物中,肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌红蛋白等在心脏受损坏时能从心肌细胞释放入血,但这些酶也存在于骨骼肌,骨骼肌损伤时这些酶也会释放入血,故特异性差。心肌肌钙蛋白I或T具有高特异性,但其在心脏损伤发生6-12 h之后才能从血中检测出,且对心肌细胞损伤的特异性高,对可逆的心肌缺血多为阴性。因此,为能尽早诊断ACS,需要一种能早期检测且灵敏度和特异性较高的心肌缺血标志物。
人血清白蛋白(HAS)是一种循环蛋白,其氨基酸末端序列为人类所特有,能与金属钴、铜和镍等离子结合,在缺血/再灌注发生时,由于自由基等破坏了血清白蛋白的氨基酸序列,而导致白蛋白与过渡金属的结合能力改变,这种因缺血而发生与过渡金属结合能力改变的白蛋白称为缺血修饰白蛋白(Ischemia Modified Albumin,IMA)。IMA在心肌缺血后数分钟内即迅速升高,是心肌缺血发生后到发生细胞坏死之前的一个非常早期的指标。研究显示,IMA在心肌可逆的心肌缺血阶段血中浓度即迅速升高,可早期并灵敏的反应心肌缺血状况,将心肌缺血的诊断窗由原来的缺血发生4-6 h提前到5-10 min。
目前,基于白蛋白钴结合能力试验间接推测IMA含量的诊断试剂盒在国内外均已出现,但因缺乏国际标准,每个试剂厂商均定义自己的IMA单位,所以造成了检测结果随生产厂家、试剂种类不同而可能出现不一致的现象,给该项目的推广应用带来了极大困难。此外,在IMA检测质量管理体系中,应用质控品进行室内质控和参加室间的质量评价是保证实验室检测结果质量、减少误差,使不同实验室之间的结果具有较好可比性的重要措施。由于HSA 氮端序列的特殊性,排除了从其他动物获取人IMA的可能性,也因IMA与HSA的区别很小,可能只有2-4个氨基酸的差异,因此将其与HSA分离纯化也很困难。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足,提供一种能保证IMA测定的稳定性的缺血修饰白蛋白质控品的制备方法。
为了解决上述技术问题,本发明采用的技术方案为:一种缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,包括以下步骤:
(1)采用健康人血清,调节pH值至7.0~7.5;
(2)向上述已调节pH值的血清中加入0.1~100 mM(mmol/L) 具有变价中心的金属离子盐或具有分子平面性的金属有机复合物,然后加入0.1~100 mM 过氧化氢(上述的0.1~100 mM浓度是指加入金属离子盐或具有分子平面性的金属有机复合物,以及过氧化氢之后,上述各组分在总物质即血清加上金属离子盐或具有分子平面性的金属有机复合物,以及过氧化氢后中的浓度);
(3)35~40℃光照条件下反应10~30 min;
(4) 反应所得溶液在20~25℃,pH 7.5~8.0,0.1~1000 mM透析缓冲液中透析12~24 h,得到质控品;
(5)步骤(4)制得的质控品按常规技术添加防腐剂,混合均匀后,分装、测定。
上述IMA质控品的制备方法,步骤(2)中所述的具有变价中心的金属离子盐为Fe3+、Fe2+,Cu2+、Cu+,Mn4+、 Mn2+或Mo离子盐中的一种,如硫酸亚铁、硫酸铜等。
上述IMA质控品的制备方法,步骤(2)中所述的具有分子平面性的金属有机复合物金属酞菁、金属卟啉(如铁卟啉等)、金属席夫碱等。
上述IMA质控品的制备方法,步骤(3)中所述的光照条件的光为紫外光、可见光等中的一种。
上述IMA质控品的制备方法,步骤(4)中所述的透析缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、咪唑缓冲液等中的一种。
上述IMA质控品的制备方法,步骤(5)中所述的防腐剂为叠氮钠(NaN3)或PC防腐剂(如4-氯-3,5-二甲基苯酚)等中的一种。
上述健康人血清,也可以是不同个体的混合血清。
本发明的优点和有益效果:
1、选用健康人混合血清为材料,来源充足,易获得。
2、制备工艺简单,添加剂数量少,生产成本低。
3、以健康人的混合血清为原料,最大限度地避免了可能发生的基质效应,细菌污染,溶血,脂浊等非特异性干扰。
4、液体型质控品,无需复溶,均一性好,瓶间差异小。
具体实施方式
下面通过实施例进一步详细描述本发明,但本发明不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
(1)收集排除了传染病、常见病的健康人血清100 ml,作为血清原料,调节pH值至7.2;
(2)加入9.2 mM FeSO4和39 mM的过氧化氢;
(3)37℃紫外光照射下反应20 min;
(4)25℃,pH 7.5,10 mM Tris-HCl缓冲液中透析12 h;
(5)加入0.1 ml 4-氯-3,5-二甲基苯酚,混合均匀后分装于玻璃瓶中,每瓶分装量为1 ml,采用ELISA试剂盒对其进行定值。
实施例2
(1)收集排除了传染病、常见病的健康人血清100 ml,作为血清原料,调节pH值至7.5;
(2) 加入1 mM铁卟啉和10 mM过氧化氢;
(3)37℃,可见光汞灯照射下反应30 min;
(4)25℃, pH 8.0,100 mM磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液缓冲液中透析24 h;
(5)加入0.1 g NaN3,混合均匀后分装于玻璃瓶中,每瓶分装量为1 ml,采用ELISA试剂盒对其进行定值。
实施例3
(1)收集排除了传染病、常见病的健康人血清100 ml,作为血清原料,调节pH值至7.0;
(2)加入0.5 mM CuSO4和50 mM的过氧化氢;
(3)37℃可见光汞灯照射下反应15 min;
(4)25℃,pH 7.8,100 mM 咪唑缓冲液中透析18 h;
(5)加入0.1 ml 4-氯-3,5-二甲基苯酚,混合均匀后分装于玻璃瓶中,每瓶分装量为1 ml,采用ELISA试剂盒对其进行定值。
实施例4
(1)收集排除了传染病、常见病的健康人血清100 ml,作为血清原料,调节pH值至7.2;
(2)加入50 mM 氯化酞菁铜 和25 mM的过氧化氢;
(3)37℃紫外光照射下反应30 min;
(4)25℃,pH 7.5,100 mM 磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中透析18 h;
(5)加入0.1g NaN3,混合均匀后分装于玻璃瓶中,每瓶分装量为1 ml,采用ELISA试剂盒对其进行定值。
以上实施例是对本发明的说明和进一步解释,而不是对本发明的限制,在本发明的精神和权利保护范围内所做的任何修改,都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)采用健康人血清,调节pH值至7.0~7.5;
(2)向上述已调节pH值的血清中加入0.1~100 mM具有变价中心的金属离子盐或具有分子平面性的金属有机复合物,然后加入0.1~100 mM 过氧化氢;
(3)在35~40℃光照条件下反应10~30 min;
(4)将步骤(3)反应所得溶液在20~25℃,pH 7.5~8.0,0.1~1000 mM透析缓冲液中透析12~24 h,得到质控品;
(5)步骤(4)制得的质控品按常规技术添加防腐剂,混合均匀后,分装、测定。
2.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的具有变价中心的金属离子盐为Fe3+、Fe2+,Cu2+、Cu+,Mn4+、 Mn2+或Mo离子盐中的一种。
3.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:步骤(2)中所述的具有分子平面性的金属有机复合物金属酞菁、金属卟啉或金属席夫碱中的一种。
4.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:步骤(3)中所述的光照条件的光为紫外光、可见光中的一种。
5.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:步骤(4)中所述的透析缓冲液为Tris-HCl缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、咪唑缓冲液中的一种。
6.根据权利要求1所述的缺血修饰白蛋白质控品的制备方法,其特征在于:步骤(5)中所述的防腐剂为叠氮钠或PC防腐剂中的一种。
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