CN102533803A

CN102533803A - 灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法

Info

Publication number: CN102533803A
Application number: CN2010105985073A
Authority: CN
Inventors: 姚泉洪; 孙静; 彭日荷; 熊爱生; 付晓燕; 田永生; 赵伟; 金晓芬; 韩红娟; 陈晨
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: SHANGHAI BAIXIN BIO-TECH CO LTD; Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-12-21
Filing date: 2010-12-21
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2030-12-21
Also published as: CN102533803B

Abstract

本发明涉及一种灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法。所述的灵芝漆酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该基因构建到真核表达载体中并转化入真核生物中，可用于灵芝漆酶的工业生产应用。

Description

灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法

技术领域

本发明涉及一种灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法。

背景技术

漆酶(EC 1.10.3.2)是一种含铜的氧化还原酶，属于氧化酶的蓝铜家族(Eur J Biochem187：341-352)。漆酶的应用范围很广，目前研究它的应用主要集中在它降解各种化工染料(J Ind Microbiol Biotechnol 31：127-132)、芳香族类化合物(Microbial Cell Factories 5：31)以及二酚、多酚类化合物(Process Biochemistry 45：507-513)的功能。除此之外，漆酶在不同的物种发挥不同的功能：在昆虫中，它们参与甲壳的硬化；在植物中，参与细胞壁形成，还与木质素化和去木质素有关；在芽孢杆菌中，则是和抗紫外线的孢子组装有关；在一些植物致病性真菌利用这类酶免除植物抗毒素和鞣酸的作用。众所周知，漆酶给工业生产方面带来了巨大的贡献。大量的漆酶基因从植物(J Chem Soc 43：472)、动物(万云洋，博士论文，武汉大学)和微生物(Microbiology 148：4003-4014)中分离出来，进行了系统的研究。

在NCBI数据库中，收集了很多微生物的全基因组的信息，其中编码蛋白的序列都被注释了。但是大部分的蛋白的生化功能和生理功能都是未知的。因此研究注释蛋白的功能可以完善这些酶学，并运用到工业应用中去。

多孔菌科灵芝属于白腐菌担子菌纲家族，是亚洲很受欢迎的药用菌类。它的化学成分较为复杂，含有多糖类、免疫调节蛋白(Phytochemistry 67：1985-2001)以及抗肿瘤蛋白(Immunol Invest 34：171-198)等。然而来自灵芝的漆酶生理生化特性研究和应用还很少。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种灵芝漆酶基因及其真核表达和纯化方法，即通过化学合成方法得到所述的漆酶基因，研究其生理生化特性，将其应用于真核生物的表达和纯化中。

本发明的技术方案是通过以下方式来实现的。

所述的灵芝漆酶基因，来自于灵芝，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示，其是通过化学合成方法制得的。即采用大量重叠的引物通过两步PCR进行全基因合成(PTDS)(Nucleic Acids Research，2004，32：e98)。该方法是通过重叠延伸获得合成基因的片段，再通过最外侧的引物将全长的基因扩增得到。该方法的一个明显优势就是不需要对引物进行磷酸化处理。而且通过高通量的DNA合成仪器，可以较为便利地获得大量的引物。

所述的灵芝漆酶基因，其具体合成方法如下：

1、引物设计

设计长度大概为60mer左右的覆盖整个灵芝漆酶基因的寡核苷酸的序列36个，作为引物。每相邻的两个寡核苷酸序列有20个碱基的重复。

利用PCR进行灵芝漆酶基因扩增，在100μl反应体系中，P2-P35共34个引物的添加量为2ng，外侧引物P1和P36添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃，30s，52℃，30s，72℃，1.5min，72℃10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共30个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收片段，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化于DH5α感受态中，即获得长度为1512bp的阳性克隆，即为本发明的灵芝漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNo 2所示。

将上述制得的漆酶基因转入真核生物细胞中。即将上述制得的漆酶基因直接与真核表达载体pYM7909(上海市农科院生物所实验室提供)相连，经过DH5α克隆过的环形质粒单酶切使其线性化，取约1μl的线性DNA与80μl毕赤酵母感受态细胞混合后进行点击转化，然后涂布于固体SD山梨醇培养基(20g/L琼脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，28℃继续培养3天后获得白色菌落。挑取经测活呈阳性的毕赤酵母进行细胞外分泌表达纯化，即获得纯化后的灵芝漆酶基因。

本发明的灵芝漆酶基因是一类应用非常广泛的生物用酶，通过克隆，可以高效合成本发明的漆酶基因，通过对该基因真核表达和纯化，可以将其应用于灵芝漆酶基因的工业生产中。

附图说明

图1为本发明的灵芝漆酶基因的化学合成方法策略图。

图2为以pYM7909质粒构建DNA表达单元的示意图。

图3为酶的最适温度、最适pH及温度和pH的稳定性结果，其中，图A为灵芝漆酶的最适温度；图B为该漆酶最适pH值；图C为该漆酶温度稳定性；图D为该漆酶pH稳定性。

图4为金属离子对酶活的影响。

图5为有机无机化合物对酶活的影响，其中1.对照，2.硫代硫酸钠，3.叠氮化钠，4.甘露醇，5.低亚硫酸钠，6.L型-丙氨酸，7.L型-组氨酸，8.L型-甘氨酸，9.L型-精氨酸，10.L型-天门冬氨酸，11.L型-苯丙氨酸。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科学出版社。)

实施例1 灵芝漆酶基因的化学合成

参看图1，以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)克隆制备本发明的灵芝漆酶基因。设计的引物如下：

P1：Tm＝54，60mer

GCT，GCT，GTC，GTC，GTC，AAT，GGT，GTC，TTC，CCT，GGT，CCA，CTG，ATC，ACT，GGC，AAC，AAG，GGA，GAC

P2：Tm＝54，60mer

TGT，GGT，TGG，TCA，GCT，GGT，CGA，TGA，CGT，TCA，GCT，GGA，ATC，TGT，CTC，CCT，TGT，TGC，CAG，TGA

P3：Tm＝54，60mer

CGA，CCA，GCT，GAC，CAA，CCA，CAC，CAT，GCT，GAA，GAC，CAC，CTC，CAT，CCA，CTG，GCA，TGG，CTT，CTT

P4：Tm＝54，60mer

GAT，GAA，GGC，AGG，ACC，ATC，AGC，CCA，GTT，AGT，ACC，TTT，CTG，GAA，GAA，GCC，ATG，CCA，GTG，GAT

P5：Tm＝54，60mer

CTG，ATG，GTC，CTG，CCT，TCA，TCA，ACC，AGT，GTC，CAA，TCG，CTT，CTG，GTC，ATT，CCT，TCC，TGT，ACG

P6：Tm＝54，60mer

TGA，TAC，CAG，AAG，GTG，CCA，GCT，TGA，TCT，GGA，ACT，TGA，AAG，TCG，TAC，AGG，AAG，GAA，TGA，CCA

P7：Tm＝54，60mer

GCT，GGC，ACC，TTC，TGG，TAT，CAC，TCT，CAT，CTG，TCT，ACT，CAG，TAC，TGT，GAT，GGT，CTG，AGA，GGT

P8：Tm＝54，60mer

GAC，CCT，TCA，GAG，GAT，CTT，TAG，GAT，CAT，AGA，CAA，CGA，ATG，GAC，CTC，TCA，GAC，CAT，CAC，AGT

P9：Tm＝54，60mer

TAA，AGA，TCC，TCT，GAA，GGG，TCT，GTA，CGA，TGT，TGA，TAA，CGA，TTC，TAC，TGT，TAT，CAC，TCT，GTC

P10：Tm＝54，60mer

GAA，GGA，AGG，TCC，AAG，TCT，GGC，AGC，AAC，ATG，ATA，CCA，GTC，AGA，CAG，AGT，GAT，AAC，AGT，AGA

P11：Tm＝54，60mer

CCA，GAC，TTG，GAC，CTT，CCT，TCC，CAC，TGG，GTT，CTG，ACT，CCA，CTC，TGA，TCA，ATG，GTC，TGG，GTA

P12：Tm＝54，60mer

TTG，ATG，ACA，GCA，AGA，CCA，GCA，GTA，GCG，TTG，GTG，GTG，GAT，CTA，CCC，AGA，CCA，TTG，ATC，AGA

P13：Tm＝54，60mer

GCT，GGT，CTT，GCT，GTC，ATC，AAC，GTC，ACC，CAA，GGC，AAG，AGA，TAC，AGA，TTC，AGA，CTG，GTC，TCC

P14：Tm＝54，60mer

GAC，CAT，CGA，TAG，AGA，AGG，TGT，AGT，TAG，GAT，CAC，AGG，ACA，GGG，AGA，CCA，GTC，TGA，ATC，TGT

P15：Tm＝54，60mer

CAC，CTT，CTC，TAT，CGA，TGG，TCA，TGA，CAT，GTC，CGT，CAT，CGA，AGC，TGA，TGG，CAT，TGC，TAC，TCA

P16：Tm＝54，60mer

CTG，AGC，AGA，GAA，GAT，TTG，GAT，AGC，GTT，AGC，AGT，GAC，AGG，TTG，AGT，AGC，AAT，GCC，ATC，AGC

P17：Tm＝54，60mer

TCC，AAA，TCT，TCT，CTG，CTC，AGA，GAT，ACT，CCT，TCG，TCC，TGA，CTG，CCA，ACC，AGA，CCA，TTG，GCA

P18：Tm＝54，60mer

CCG，ATG，TTT，CCG，AAG，GAA，GGA，TTG，GCT，CTG，ATC，CAG，TAG，TTG，CCA，ATG，GTC，TGG，TTG，GCA

P19：Tm＝54，60mer

CCT，TCC，TTC，GGA，AAC，ATC，GGT，TTC，ACC，AAT，GGC，ATC，AAC，TCT，GCC，ATC，CTG，AGA，TAC，TCT

P20：Tm＝54，60mer

TGG，TCT，GTT，GAG，CAG，TAG，TAG，GTT，CGA，TAG，GAT，CAG，CTC，CAG，AGT，ATC，TCA，GGA，TGG，CAG

P21：Tm＝54，60mer

TAC，TAC，TGC，TCA，ACA，GAC，CAC，TCA，GAA，CCT，GCT，GAA，CGA，AGT，TGA，TCT，GCA，TCC，ATT，CGT

P22：Tm＝54，60mer

AGT，ACC，ACC，TTG，AGT，AGC，TCT，ACC，AGG，AGT，CTG，CTT，AGC，AAC，GAA，TGG，ATG，CAG，ATC，AAC

P23：Tm＝54，60mer

GAG，CTA，CTC，AAG，GTG，GTA，CTG，ATG，TTG，CCA，TCA，ACA，TGG，TCT，TCA，ACT，TCA，ATG，GCT，CCA

P24：Tm＝54，60mer

ACA，GTT，GGT，GGA，GTG，AAG，GAA，GCG，TTG，TTG，ATG，AAG，AAG，TTG，GAG，CCA，TTG，AAG，TTG，AAG

P25：Tm＝54，60mer

TCC，TTC，ACT，CCA，CCA，ACT，GTT，CCT，GTC，CTG，CTT，CAG，ATT，CTG，TCT，GGT，GCA，CAA，GCA，GCT

P26：Tm＝54，60mer

TAG，GAA，GAG，TGT，AGA，CAG，AGC，CAG，ATG，GAA，GCA，GAT，CCT，GAG，CTG，CTT，GTG，CAC，CAG，ACA

P27：Tm＝54，60mer

CTC，TGT，CTA，CAC，TCT，TCC，TAT，CAA，CAA，GTC，CAT，CGA，ACT，CAC，CTT，TCC，TGC，TAC，TGT，CAA

P28：Tm＝54，60mer

GTG，ACC，ATG，CAG，GTG，GAA，TGG，ATG，TGG，AGC，ACC，AGG，AGC，ATT，GAC，AGT，AGC，AGG，AAA，GGT

P29：Tm＝54，60mer

CAT，TCC，ACC，TGC，ATG，GTC，ACT，CCT，TCG，CTG，TCG，TCA，GAA，GTG，CTG，GTT，CCA，CCG，AGT，ACA

P30：Tm＝54，60mer

CCA，GTG，GAG，ACG，ACG，TCT，CTC，CAG，ACA，GGG，TTG，TTG，TAG，TTG，TAC，TCG，GTG，GAA，CCA，GCA

P31：Tm＝54，60mer

AGA，GAC，GTC，GTC，TCC，ACT，GGT，ACT，CCT，GCT，GCT，GGT，GAT，AAC，GTC，ACC，ATC，AGA，TTC，CAG

P32：Tm＝54，60mer

CGA，TGT，GAC，AAT，GCA，GGA，ACC，AAG，GTC，CAG，GAT，TGT，CAG，TCT，GGA，ATC，TGA，TGG，TGA，CGT

P33：Tm＝54，60mer

GTT，CCT，GCA，TTG，TCA，CAT，CGA，CTT，TCA，TCT，CGA，AGC，TGG，CTT，TGC，TGT，TGT，CTT，TGC，TGA

P34：Tm＝54，60mer

CTG，TGG，AAC，ATG，GTT，GGC，AAG，AGA，AGT，GTC，AGC，AGT，GTC，TTC，AGC，AAA，GAC，AAC，AGC，AAA

P35：Tm＝54，60mer

TTG，CCA，ACC，ATG，TTC，CAC，AGG，CTT，GGT，CTG，ACC，TGT，GTC，CTA，CCT，ACG，ATG，CTC，TCT，CTG

P36：Tm＝54，40mer

GAG，CTC，TTA，GTG，GTC，GTC，AGC，AGA，GAG，AGC，ATC，GTA，GGT，A

利用PCR进行扩增，在100μl反应体系中，P2--P35共34个引物的添加量为2ng，外侧引物P1和P36添加量为30ng，扩增条件为：94℃预热1min；94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，72℃10min，使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，共30个循环。

PCR结束后，1％琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。获得阳性克隆，即为本发明的灵芝漆酶基因，其序列如SEQ ID No 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。将该SEQ ID No 1序列与来自灵芝的漆酶基因相比对，同源性为75.24％，具体如下：

1 GCTGCTGTCGTCGTCAATGGTGTCTTCCCTGGTCCACTGATCACTGGCAACAAGGGAGAC

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130 GCCGCCGTTGTGGTGAATGGTGTCTTCCCTGGGCCGCTCATCACAGGGAACAAGGGAGAC

61 AGATTCCAGCTGAACGTCATCGACCAGCTGACCAACCACACCATGCTGAAGACCACCTCC

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190 CGTTTCCAGCTGAATGTCATCGACCAACTGACGAACCACACAATGCTGAAGACCACCAGC

121 ATCCACTGGCATGGCTTCTTCCAGAAAGGTACTAACTGGGCTGATGGTCCTGCCTTCATC

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250 ATTCATTGGCATGGCTTTTTCCAGAAGGGCACGAACTGGGCGGATGGTCCCGCGTTCATC

181 AACCAGTGTCCAATCGCTTCTGGTCATTCCTTCCTGTACGACTTTCAAGTTCCAGATCAA

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310 AACCAGTGTCCGATTGCTAGCGGGCACTCGTTCCTCTACGATTTCCAGGTTCCGGATCAG

241 GCTGGCACCTTCTGGTATCACTCTCATCTGTCTACTCAGTACTGTGATGGTCTGAGAGGT

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370 GCCGGCACTTTTTGGTACCACAGCCATCTCTCCACGCAGTACTGTGACGGTCTCAGGGGT

301 CCATTCGTTGTCTATGATCCTAAAGATCCTCTGAAGGGTCTGTACGATGTTGATAACGAT

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430 CCATTCGTGGTATATGACCCTAAGGACCCCCTCAAGGGACTGTACGACGTCGACAACGAC

361 TCTACTGTTATCACTCTGTCTGACTGGTATCATGTTGCTGCCAGACTTGGACCTTCCTTC

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490 TCGACTGTGATCACCCTCTCCGACTGGTATCACGTGGCTGCCAGGCTTGGACCGAGCTTC

421 CCACTGGGTTCTGACTCCACTCTGATCAATGGTCTGGGTAGATCCACCACCAACGCTACT

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550 CCGCTCGGCTCGGACTCGACTCTCATCAATGGCCTTGGCCGTAGCACTACCAACGCTACC

481 GCTGGTCTTGCTGTCATCAACGTCACCCAAGGCAAGAGATACAGATTCAGACTGGTCTCC

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610 GCCGGCCTCGCTGTTATCAACGTCACACAGGGCAAACGTTATCGCTTCCGCCTTGTGTCC

541 CTGTCCTGTGATCCTAACTACACCTTCTCTATCGATGGTCATGACATGTCCGTCATCGAA

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670 TTGTCATGCGACCCCAACTACACCTTCAGCATCGACGGCCATGACATGTCCGTTATTGAG

601 GCTGATGGCATTGCTACTCAACCTGTCACTGCTAACGCTATCCAAATCTTCTCTGCTCAG

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730 GCGGATGGTATTGCAACGCAACCCGTGACCGCGAACGCTATTCAAATCTTCTCTGCTCAA

661 AGATACTCCTTCGTCCTGACTGCCAACCAGACCATTGGCAACTACTGGATCAGAGCCAAT

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790 CGATATTCTTTCGTGCTGACTGCAAATCAGACAATTGGCAACTATTGGATTCGCGCCAAC

721 CCTTCCTTCGGAAACATCGGTTTCACCAATGGCATCAACTCTGCCATCCTGAGATACTCT

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850 CCGAGCTTTGGAAATATTGGTTTCACGAATGGAATCAACTCTGCCATCCTGCGCTACTCG

781 GGAGCTGATCCTATCGAACCTACTACTGCTCAACAGACCACTCAGAACCTGCTGAACGAA

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910 GGAGCGGATCCCATCGAACCTACGACGGCCCAACAAACCACACAGAACCTCCTCAATGAG

841 GTTGATCTGCATCCATTCGTTGCTAAGCAGACTCCTGGTAGAGCTACTCAAGGTGGTACT

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970 GTCGACCTCCACCCCTTTGTCGCTAAACAGACGCCTGGCCGCGCTACACAGGGTGGTACC

901 GATGTTGCCATCAACATGGTCTTCAACTTCAATGGCTCCAACTTCTTCATCAACAACGCT

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1030 GATGTGGCCATCAACATGGTCTTCAACTTTAACGGCTCGAACTTCTTCATCAACAACGCG

961 TCCTTCACTCCACCAACTGTTCCTGTCCTGCTTCAGATTCTGTCTGGTGCACAAGCAGCT

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1090 TCCTTCACGCCTCCCACTGTCCCCGTCCTCCTTCAGATTTTGAGCGGCGCACAGGCCGCC

1021 CAGGATCTGCTTCCATCTGGCTCTGTCTACACTCTTCCTATCAACAAGTCCATCGAACTC

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1150 CAGGACCTCCTGCCTTCCGGAAGTGTCTACACGCTGCCGATCAACAAGTCCATCGAGCTC

1081 ACCTTTCCTGCTACTGTCAATGCTCCTGGTGCTCCACATCCATTCCACCTGCATGGTCAC

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1210 ACCTTCCCCGCCACGGTCAACGCCCCCGGGGCTCCCCACCCCTTCCACCTGCACGGTCAT

1141 TCCTTCGCTGTCGTCAGAAGTGCTGGTTCCACCGAGTACAACTACAACAACCCTGTCTGG

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1270 TCGTTCGCTGTGGTCCGCAGCGCCGGCTCCACAGAATACAACTATAACAATCCCGTATGG

1201 AGAGACGTCGTCTCCACTGGTACTCATGTTCCACAGGCTTGGTCTGACCTGTGTCCTACC

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1330 CGCGACGTCGTTTCGACCGGCACCCCTGCAGCGGGCGACAACGTCACGATCCGCTTCCAG

1261 TACGATGCTCTCTCTGCTGACGACCACTAAGAGCTCATCGACTTTCATCTCGAAGCTGGC

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1390 ACCGACAACCCCGGACCGTGGTTCCTCCATTGCCACATCGACTTCCATCTCGAGGCGGGC

1321 TTTGCTGTTGTCTTTGCTGAAGACACTGCTGACACTTCTCTTGCCAACCCTGCTGCTGGT

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1450 TTCGCTGTCGTGTTCGCCGAGGACACCGCTGATACTTCTCTGGCGAACCA...TGTCCCA

1381 GATAACGTCACCATCAGATTCCAGACTGACAATCCTGGACCTTGGTTCCTGCATTGTCAC

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1507 CAAGCATGGTCGGATCTTTGCCCGACGTACGATGCGCTCTCGGCTGATGATCACTGA

实施例2 灵芝漆酶基因在毕赤酵母中表达

将实施例1制得的漆酶基因直接与真核表达载体pYM7909相连，经过DH5α克隆过的环形质粒单酶切使其线性化，取约1μl的线性DNA与80μl毕赤酵母感受态细胞混合后进行点击转化，然后涂布于固体SD山梨醇培养基(20g/L琼脂，20g/L葡萄糖，146g/L山梨醇，SD)上，28℃继续培养3天后获得白色菌落。挑取多个经测活呈阳性的毕赤酵母，分别接种于3ml液体BMGY培养基(10g/L酵母提取物，10g/L胰蛋白胨，5μl生物素，1％甘油，SD)中，26℃摇床直到菌液的浓度达到OD₆₀₀为1.0时离心(12000rpm)收集菌体，再用液体BMMY培养基(SD)重悬毕赤酵母菌体，1％甲醇诱导3天，离心(12000rpm)分别收集上清测活，选取有活性的菌株活化。按上述方法进行大量培养，使得灵芝漆酶大量表达。

实施例3 灵芝漆酶基因的纯化

将实施例2中得到的培养液在5,000g重力加速度下离心5min，收集含有酶液上清，进行硫酸铵沉淀，所得到的蛋白沉淀用SD重悬，使用微孔滤膜过滤离心好的上清，上到Ni-Agarose柱上，纯化出目的蛋白，将目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起来。该目的蛋白即为纯化后的灵芝漆酶基因。

实施例4 灵芝漆酶基因的酶动力学特性分析

灵芝漆酶基因的酶动力学特性分析主要有2个底物。它们分别是：愈疮木酚和ABTS，反应采用实施例3中的体系。主要测定灵芝漆酶酶基因对不同底物的K_m和最大反应速度V_max，也就是在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度的增加而迅速增加；随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值(V_max)。

底物浓度与反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示：

v = \frac{V_{\max} [S]}{K_{m} + [S]}

式中，v：反应速度；K_m：米氏常数；V_max：酶反应最大速度；[S]：底物浓度。

采用Linewaver-Burk作图法测定K_m、V_max。该法是根据米氏方程的倒数形式，以1/v对1/[S]作图，得到一条直线。直线在横轴上的截距为-1/K_m，纵截距为1/V_max，求出K_m与V_max。

\frac{1}{v} = \frac{K_{m}}{V_{\max}} \cdot \frac{1}{[S]} + \frac{1}{V_{\max}}

本发明所用的2个底物及浓度为：愈疮木酚(Guaiacol，学名：邻甲氧基苯酚，从0.0343mM到0.343mM)，ABTS(从0.5mM到4mM)。所得到的结果如下表1所示。

表1

实施例5 灵芝漆酶基因的生理生化特性分析

对实施例3中的蛋白酶液上清做特定的生理生化特性分析。其分析过程是在下述的酶反应体系中进行的：100μl NaHPO₄-柠檬酸缓冲液(0.2M NaHPO₄，0.1M柠檬酸，pH 2.6)中含有1mM的反应底物ABTS。反应以加入50μl的酶液开始，反应是在55℃的水浴锅中进行10min，以加入50μl的1M氟化钠终止反应。然后在420nm处测量ABTS产物的释放量。本发明将一定数量的酶在每分钟催化1μmol的ABTS的活力定义为1U，灵芝漆酶基因的蛋白浓度是使用Bradford试剂盒来分析的。

本发明分析的生理生化特性主要有：酶的最适反应温度、酶的温度的稳定性，酶的最适反应的pH、pH的稳定性，金属离子对酶活的影响，以及有机和无机化合物对酶活的影响。

在研究酶的最适反应温度时，反应的温度从35℃开始，每隔5℃，一直到70℃。每个体系做3个重复试验(以下每个反应都是3次重复)；在研究酶的温度的稳定性时，主要测定酶在25、35、45和55℃这四个不同温度处理酶液，然后在最适温度下测定酶的残余活性；在研究酶的最适反应的pH时，选择柠檬酸-磷酸钠缓冲液(0.1M，pH 2.0-8.0)；在研究酶的pH的稳定性时，是先将酶在不同的pH的缓冲液中先处理24h，然后在酶的最适pH的测定酶的残余活性；在金属离子对酶活的影响，有机和无机化合物对酶活的影响是将酶用不同的影响因素处理，然后在酶的最佳反应体系中测定酶的残余活性。

实验表证：酶在55℃，pH 2.6时活性最高，虽然酶的热稳定性不高，在55℃处理20min后，酶的活性只有8.9％了。但是酶有个很好的pH稳定性，在pH＝8的缓冲液中处理24h后还有73％的活性(参看图3)。金属离子在低浓度1mM时，Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺对酶的影响不大，K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Cu²⁺对酶活有促进作用，Al³⁺、Fe²⁺、Fe³⁺对酶活有明显的抑制作用；当金属离子浓度增高到10mM时，K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺对酶活有明显的促进作用，Al³⁺、Zn²⁺、Fe²⁺、Fe³⁺能分别抑制29.64％、39.14％、12.12％和12.96％的活性。此外，经试验研究发现，该酶的活性能被10mM EDTA和SDS抑制(参看图4)。0.1mM的叠氮化钠、低亚硫酸钠和1mM硫代硫酸钠能够明显抑制酶活(参看图5)，且该酶还能够被1mM甘露醇和L型丙氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸等1种糖和6种L型氨基酸激活。

Claims

1.一种灵芝漆酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。

2.根据权利要求1所述的灵芝漆酶基因，其编码的核苷酸序列如SEQ ID No2所示。

3.权利要求1所述的灵芝漆酶基因在真核生物中的表达。

4.根据权利要求3所述的灵芝漆酶基因在真核生物中的表达，其特征在于，将所述灵芝漆酶基因与真核表达载体pYM 7909连接，转化至毕赤酵母菌，进行点击转化。

5.权利要求3所述的灵芝漆酶基因在真核生物中的表达的应用，其特征在于，挑取经测活呈阳性的毕赤酵母进行细胞外分泌表达纯化，以制备纯化的灵芝漆酶基因。