CN102532343A - 天然活性葡寡六糖的Cap-Tag固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种天然活性葡寡六糖的Cap-Tag固相合成方法，属于有机化学及固相合成技术范畴。如通式I所示，利用Merrifield等固相树脂，首先将对羟基苄醇连接在固相树脂上，然后将葡萄糖一位活泼羟基通过适当长度的连接臂连接在固相树脂上。再将葡萄单糖依次连接在还原端葡萄糖上，缺续的葡萄寡糖采用Cap-Tag策略分离，最终产物脱保护后并从固相上释放出来，得到了葡寡六糖分子。本方法操作简单，无需特别的仪器设备，为建立快速、高效的固相合成寡糖分子的方法或者设计构造固相寡糖合成仪提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然活性天然活性葡寡六糖的分子的Cap-Tag策略的固相合成方法，属于有机化学技术范畴。
背景技术
寡糖是生物体内重要的信息物质，在很多生理过程中起着关键的作用。当与蛋白质结合时能得到糖蛋白，蛋白质的结构与功能都随之改变，而寡糖与脂结合得到糖脂，后者在细胞之间识别及信号传导中的作用不可或缺。胞壁寡糖在细胞之间的通讯、识别和相互作用、胚胎发生、转移、信号传递、细胞运动与黏附以及病原与宿主细胞的相互作用方面起着重要作用。如寡糖能激活植物的防卫系统，诱导根瘤菌的固氮作用，还与炎症、癌症、心血管症密切相关等，寡糖的这些重要作用使它成为生命科学关注的焦点。最新的研究表明：一定结构的葡寡糖及其蛋白缀合物显示出较好的抗癌活性，而且硫酸酯化的衍生物表现出很好的血管再生作用，与临床应用的肝素具有同等功效。
虽然各种方法和策略已经在寡糖合成中得到成功应用，但寡糖及其缀合物的合成仍然是有机合成中最为繁琐最为艰巨的工作之一，而固相合成是提高多肽及寡糖系列化合物合成效率的方法之一。我们设计了Cap-Tag策略用于寡糖的固相合成，从而避免了合成过程中的反应不完全导致的缺续等一系列问题。
发明内容
本发明的目的是利用快速高效的Cap-Tag策略的固相合成方法实现MMP寡糖分子的快速、大量的合成工作，从而进一步开展其生物活性的研究。
本发明涉及一种天然活性葡寡六糖的Cap-Tag固相合成方法，属于有机化学及固相合成技术范畴。如通式I所示，利用Merrifield等固相树脂，首先将对羟基苄醇连接在固相树脂上，然后将葡萄糖一位活泼羟基通过适当长度的连接臂连接在固相树脂上。再将葡萄单糖依次连接在还原端葡萄糖上，缺续的葡萄寡糖采用Cap-Tag策略分离，最终产物脱保护后并从固相上释放出来，得到了葡寡六糖分子。本方法操作简单，无需特别的仪器设备，为建立快速、高效的固相合成寡糖分子的方法或者设计构造固相寡糖合成仪提供了基础。
通式I
具体实施方式：
11.4克甘露糖硫苷(50.9毫摩尔)溶于100毫升的N，N’-二甲基甲酰胺中，反应体系温度降低，然后加入9.75毫升2-甲氧基丙烯(102毫摩尔)和438毫克对甲苯磺酸，反应混合物在0～5℃条件下剧烈搅拌直至TLC检测原料已完全消失(～5小时左右)。随后加入干燥的无水碳酸钠，在低温下继续搅拌约1小时。反应体系加入二氯甲烷后水洗，有机相用无水硫酸钠干燥，产物在乙酸乙酯-石油醚中重结晶得到白色固体2(11.1克，产率83％)。
将7.92克化合物2(30.00毫摩尔)和8.25克二丁基氧化锡(33.00毫摩尔)置于150毫升MeOH中，加热回流至溶液变为澄清，然后将反应溶液浓缩至干，并用甲苯带三次后高真空油泵抽干。残渣与7.50毫升碘甲烷(120毫摩尔)溶于干燥的150毫升N，N’-二甲基甲酰胺中，然后加热至50℃反应3小时至TLC检测反应完毕。反应溶液浓缩至干后，加入乙酸乙酯，固体过滤，有机相水洗后干燥。将溶液在减压条件下浓缩蒸除溶剂后，用硅胶色谱柱分离纯化剩余物(淋洗液为乙酸乙酯∶石油醚，1∶3)得到泡沫状白色固体化合物3(5.83克，产率70％)。
5.5克化合物3(19.8毫摩尔)溶于20毫升吡啶中，然后降温至0℃后，缓慢逐滴加入3.05克苯甲酰氯(21.7毫摩尔)，反应体系在室温下搅拌4小时。反应进程由TLC检测，原料消失后，逐滴加入甲醇。溶液浓缩至干，残渣加入二氯甲烷，依次用1N盐酸、饱和碳酸氢钠、饱和氯化钠溶液洗。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩至干再用乙酸乙酯-石油醚体系重结晶得到白色固体。将产物置于100毫升乙酸-水(v/v 4∶1)的溶液中，70℃搅拌4小时。TLC检测反应完毕，溶液浓缩至干并用甲苯共沸浓缩后得到糖浆状化合物4：[α]D25+95.1(c 2.25，CHCl3)。230毫克化合物4(0.50毫摩尔)和0.2毫升甲醇(5.00毫摩尔)溶于5毫升二氯甲烷中，体系置于氮气保护及0℃下，依次加入134毫克N-碘代丁二酰亚胺(0.60毫摩尔)和9微升TMSOTf(0.05毫摩尔)。反应溶液在此环境下搅拌2小时至TLC检测反应完毕。加入三乙胺中和反应后，将溶液在减压条件下浓缩蒸除溶剂后，用硅胶色谱柱分离纯化剩余物(淋洗液为乙酸乙酯∶石油醚，1∶5)得到无色糖浆状化合物5(193毫克，产率90％)。
取Merrifield固相树脂(0.8毫摩尔)溶胀于10毫升干燥的二氯甲烷中，然后加入1.5毫升三氯乙腈，反应体系降温至0℃后，再加入0.1毫升1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7(DBU)，反应体系在0℃下剧烈搅拌40分钟。溶液过滤后，树脂依次用CH2Cl2(4×10mL)，DMSO(4×10mL)，THF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗，真空干燥后用于下一步反应。
固相糖基化偶联通用步骤(Procedure A)：
在氮气下，将固相树脂受体7和受体5(2当量)用二氯甲烷(10mL/g)溶解或溶胀，加入4分子筛，室温下搅拌30min，然后将反应体系冷却到-40℃，10min后，慢慢加入催化剂路易斯酸(0.01～0.5当量)。反应体系在-0℃下反应2～5小时。然后过滤树脂，依次用CH2Cl2(4×10mL)，THF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗树脂，真空干燥，用于下一步反应。
将3.5克化合物4(10.2毫摩尔)溶于60毫升二氯甲烷中，溶液在加入1.54毫升三乙胺(15.3毫摩尔)后置于冰水浴0℃下，然后将1.06毫升乙酸酐(11.1毫摩尔)溶于6毫升二氯甲烷中逐滴加入。加入完毕后将反应体系逐渐升至室温，并持续搅拌8小时直至TLC检测原料基本消失，溶剂在低温条件下(＜30℃)直接浓缩至干。用硅胶色谱柱分离纯化剩余物(淋洗液为乙酸乙酯∶石油醚，1∶3)得到泡沫状白色固体9(3.6克，产率92％)。
将3.2克化合物9(6.90毫摩尔)和0.7毫升吡啶溶于60毫升二氯甲烷中置于0℃条件下，1.41克氯乙酸酐(8.28毫摩尔)在此条件下分批加入。反应体系逐渐升至室温搅拌过夜后，加入乙酸乙酯稀释。有机相依次用1N盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液洗后，用无水硫酸钠干燥。将溶液在减压条件下浓缩蒸除溶剂后，用硅胶色谱柱分离纯化剩余物(淋洗液为乙酸乙酯∶石油醚，1∶3)得到无色糖浆状化合物10(3.38克，产率88％)。
将1.0克化合物10(2.17毫摩尔)溶于20毫升丙酮和5毫升水中，室温条件下加入1.54克N-溴代丁二酰亚胺(8.68毫摩尔)后持续搅拌2小时。待TLC检测反应完毕后，混合物用二氯甲烷稀释，有机相依次用饱和硫代硫酸钠溶液，氯化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥。将溶液在减压条件下浓缩蒸除溶剂后得到无色糖浆状化合物7。将该化合物溶于10毫升二氯甲烷中，体系置于氮气保护和0℃下，依次加入0.65毫升三氯乙腈和0.06毫升1，8-二氮杂环[5，4，0]十一烯-7。待TLC检测反应完毕后，将溶液在减压条件下浓缩蒸除溶剂后，用硅胶色谱柱分离纯化剩余物(淋洗液为乙酸乙酯∶石油醚，1∶3)得到无色糖浆状化合物11(0.97克，产率80％)。
参考固相糖基化偶联通用步骤A，顺利得到连接在固相上的甘露二糖化合物12。同时，由于糖基化偶联反应产率不可能达到100％，所以固相上还剩余有受体化合物8，然后我们将固相树脂溶于干燥的吡啶及二氯甲烷中，加入R1OCl(R1＝含有N3基的酰基保护基)室温搅拌4～10小时候后，然后过滤树脂，依次用CH2Cl2(4×10mL)，THF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗树脂，真空干燥，用于下一步反应。
HDTC溶液的制备：
将0.73毫升水合肼(15毫摩尔)溶于30毫升乙醇-水(v/v，2∶1)中，加入2.61毫升二异丙基乙基胺(15毫摩尔)后，体系置于氮气保护及0℃下，0.7毫升二硫化碳(15毫摩尔)溶于6毫升1，4-二氧六环中逐滴加入至反应体系中。待滴加完毕后，封好置于冰箱中保存。
固相选择性脱除氯乙酰保护基通用步骤(Procedure B)：
固相树脂12溶胀在二氯甲烷(10mL/g)体系中，0℃下，加入过量的HDTC复合物(10当量)，室温下搅拌2h，然后过滤树脂，依次用CH2Cl2(4×10mL)，THF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗树脂，真空干燥，用于下一步反应。
在经过重复的偶联步骤A、自由羟基的捕获(Cap-Tag过程)、选择性脱除氯乙酰步骤B后，得到了连接在固相上的葡寡六糖。同时固相树脂上还连有一系列缺续的寡糖化合物，但是都被叠氮的酰基封堵，可以用其它树脂进行捕获。
然后将连接有葡寡六糖的固相树脂溶胀于干燥的2毫升无水甲醇中，逐滴加入1N甲醇钠溶液并调节pH值至9～10之间。反应体系在室温下搅拌2天。过滤树脂，依次用MeOH(4×10mL)，THF(4×10mL)和CH2Cl2(4×10mL)洗树脂，真空干燥，用于下一步反应。
干燥的糖苷固相树脂用TFA∶CHCl3(1∶4，V/V)(10mL/g)体系溶胀，室温下剧烈搅拌2h。过滤树脂，滤液用甲苯带干除去三氟乙酸，柱色谱纯化，便得到了目标分子MMP十二糖。[α]D 25+93.4(c 0.4，CHCl3)；1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ3.32，3.36，3.38(3s，12×3H，12OCH3)，3.50-3.59(m，11H)，3.66-3.71(m，25H)，3.77-3.81(m，24H)，3.92(m，1H)，4.09(m，1H)，4.13(s，10H)，4.73(d，1H，J1，2＝1.4Hz，H-1I)，5.10(d，1H，J＝1.66Hz)，5.14(s，10H)；selected13C NMR(100MHz，CDCl3)：δ56.7，61.4，66.6，72.8，81.3，102.0；MALDI-TOF-MS：calcd for C84H146O61：2130.83；Found：2154.0[M+Na]+.
Claims (9)
1.本发明涉及一种天然活性葡寡六糖的Cap-Tag固相合成方法，属于有机化学及固相合成技术范畴。如通式I所示，利用Merrifield等固相树脂，首先将对羟基苄醇连接在固相树脂上，然后将葡萄糖一位活泼羟基通过适当长度的连接臂连接在固相树脂上。再将葡萄单糖依次连接在还原端葡萄糖上，缺续的葡萄寡糖采用Cap-Tag策略分离，最终产物脱保护后并从固相上释放出来，得到了葡寡六糖分子。本方法操作简单，无需特别的仪器设备，为建立快速、高效的固相合成寡糖分子的方法或者设计构造固相寡糖合成仪提供了基础。
通式I
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Merrifield等固相树脂及连接臂辅助的固相合成反应构建葡寡六糖的系列寡糖分子。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用Cap-Tag策略的固相合成技术，其中使
用了含有叠氮基(N3)的保护基捕获自由羟基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，葡寡六糖及其硫酸酯化衍生物的合成。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，合成葡寡六糖过程中的一系列特征中间体。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，偶联过程中使用TMSOTf、BF3Et2O、HClO4-SiO2及AgOTf等路易斯酸作催化剂，用量为反应物的0.001-2000摩尔当量。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应温度在-100℃-100℃之间。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应时间在1分钟-200小时之间。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，反应用的各种溶剂包括二氯甲烷、甲苯等非极性溶剂以及N，N’-二甲基甲酰胺等极性溶剂。
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| PB01 | Publication | ||
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