CN102531194A - 一种生物脱铬介质及其制备方法、生物脱铬方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物脱铬方法。本发明提供了一种生物脱铬介质，所述介质包括互相吸附的红细菌Pannonibacter phragmitetus LSSE-09菌株和聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性纳米颗粒，其中所述菌株的保藏编号为CGMCC No.3512，该生物脱铬介质的制备方法包括以下步骤：1)聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备；2)脱铬微生物细菌的培养；3)生物脱铬介质的制备及收集。本发明的生物脱铬方法包括将上述制备的生物脱铬介质加入含Cr⁶⁺的废水中，在好氧或厌氧环境中进行脱铬的步骤。本发明的方法大幅度降低了传质阻力，工业前景广阔。

Description

一种生物脱铬介质及其制备方法、生物脱铬方法

技术领域

本发明涉及生物脱铬领域，具体地，本发明一种生物脱铬介质及其制备方法、生物脱铬方法。

背景技术

金属铬具有广泛的工业用途，其化合物广泛存在于铬盐生产、纺织品染色、染料生产及制革、电镀等行业所排放的废水中。工业废水中常见的铬化合物为Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)两种价态，其中Cr(Ⅲ)是人体必需的微量元素，其毒性是Cr(Ⅵ)的百分之一，通常只有在较高浓度时才对植物有危害，而对动物的毒性较低或无毒。Cr(Ⅲ)参与体内糖类的新陈代谢过程，成人每天需要从食物中摄入50～200μg的Cr(Ⅲ)，若缺乏会导致高血脂和高胆固醇等(Baral，A.and R.D.Engelken，Chromium-based regulationsand greening in metal fnishing industries in the USA.Environmental Science & Policy，2002.5(2)：p.121-133.)；但是Cr(Ⅵ)属于高毒性污染物，也是铬盐工业排放的主要污染物之一，对人体危害极大。Cr(Ⅵ)在自然界水体中常以CrO₄ ^2-形态存在，在人体的生理pH值时，CrO₄ ^2-极易通过阴离子转运蛋白进入细胞体内，从而引起基因变异和致癌。中华人民共和国《污水综合排放标准》将Cr(Ⅵ)列为优先考虑的一类污染物之一，规定工业排放物中六价铬含量不高于0.5mg/l，包括三价铬在内的总铬含量不高于1.5mg/l。同时世界卫生组织规定饮用水中六价铬含量应不高于0.05mg/l。因此Cr(Ⅵ)的污染治理也就成为环保工作者的重要课题之一。

工业废水中Cr(Ⅵ)的脱除方法仍存在很多不足。鉴于常规物理化学法的高成本、低效率和大量含铬污泥的产生，正在兴起的生物催化脱铬技术，以其具有高效率、低成本、微生物自身可以不断繁殖及无二次污染等诸多优点，有望代替常规的物理化学法来处理大量含铬废水。国内外已经将水体重金属污染的研究重点集中在新兴的生物技术领域(S.Sultan，S.Hasnain，Reduction of toxic hexavalent chromium byOchrobactrum intermedium strain SDCr-5 stimulated by heavy metals，BioresourceTechnology 98(2007)340-344.Volesky，B.，Detoxification of metal-bearing effluents：biosorption for the next century.Hydrometallurgy，2001.59(2-3)：p.203-216.)。生物富集技术处理含铬重金属废水是指利用对Cr(Ⅵ)具有耐受性的活体微生物的新陈代谢作用将废水中具有生物毒性的Cr(Ⅵ)还原为毒性较低的Cr(Ⅲ)，从而脱除了废水中的Cr(Ⅵ)。目前生物脱铬研究最多的是利用游离细胞脱铬，其特点是脱铬速率快，但是存在严重缺点：游离细胞不易回收利用，且活性较易流失。细胞固定化技术能给生物催化剂(细胞)提供一个受保护的微环境，有望增加细胞的耐受能力；简化生物催化剂的回收过程；利用生物催化剂的可重复使用性，降低其生产成本。目前报道的生物脱铬固定化方法主要是包埋固定化方法：比如海藻酸钠微球固定化、聚乙烯醇交联固定化和琼脂糖固定化等(M.N.Kathiravan，R.Karthiga Rani，R.Karthick，K.Muthukumar，Mass transfer studies on the reduction of Cr(VI)using calcium alginateimmobilized Bacillus sp.in packed bed reactor，Bioresour.Technol.101(2010)853-858.P.Pattanapipitpaisal，N.L.Brown，L.E.Macaskie，Chromate reduction by Microbacteriumliquefaciens immobilised in polyvinyl alcohol，Biotechnol Lett 23(2001)61-65.A.C.Humphries，K.P.Nott，L.D.Hall，L.E.Macaskie，Reduction of Cr(VI)by immobilizedcells of Desulfovibrio vulgaris NCIMB 8303 and Microbacterium sp.NCIMB 13776，Biotechnol Bioeng 90(2005)589-596.)。这些常规方法均能制得实心的微球，有利于菌体回收及循环利用，并且能较长时间保持菌体的催化活性，但是常规方法使得固定化的菌体表面额外附着了一层包埋介质(海藻酸钠、聚乙烯醇、琼脂糖等)，这层凝胶介质的存在增加了反应底物Cr(Ⅵ)到达菌体表面的阻力，使得单位时间内到达菌体表面的Cr(Ⅵ)的物质量较游离细胞大为降低。传质阻力的存在导致了脱铬速率较低，极大地限制了固定化技术的推广应用。因此迫切需要开发一种能够保持菌体活性和较低的传质阻力的新方法，以期满足生物脱铬技术的工业化要求。此外，目前报道的脱铬细菌大都存在着耐受及还原Cr(Ⅵ)浓度较低的情况，细菌生长所需要的培养基及培养条件也比较苛刻，且大多局限于酸性或中性含铬废水的处理，还原速率慢，工业应用甚少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物脱铬介质。

本发明的再一目的在于提供一种制备上述生物脱铬介质的方法。

本发明的还一目的在于提供一种生物脱铬方法。

根据本发明的生物脱铬介质，所述介质包括互相吸附的红细菌Pannonibacterphragmitetus LSSE-09菌株和超顺磁性纳米颗粒，其中所述菌株的保藏编号为CGMCC No.3512。

根据本发明的生物脱铬介质，所述的超顺磁性纳米颗粒为聚乙烯亚胺修饰的带有正电荷的纳米颗粒。

根据本发明的制备上述生物脱铬介质的方法，所述的方法包括以下步骤：

1)聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备：混合三氯化铁和氯化亚铁，加入浓氨水溶液，反应体系变黑后先后加入柠檬酸钠和聚乙烯亚胺，恒温，冷却，分离后得到聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

2)脱铬微生物细菌的培养：选取红细菌Pannonibacterphragmitetus LSSE-09菌株，保藏编号为CGMCC No.3512，在培养基中培养，收集微生物菌体；

3)生物脱铬介质的收集：将步骤1)中的聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒和步骤2)中的菌体在缓冲体系中混合均匀，通过外加磁场进行收集，得到生物脱铬介质。

本发明的生物脱铬介质的制备方法是采用柠檬酸钠和PEI修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒作为固定化介质，通过吸附在脱铬红细菌Pannonibacter phragmitetusLSSE-09的菌体表面，在外加磁场的作用下达到了磁分离及固定化的性能，固定化的细菌也具备高效的脱铬能力。具体地，本发明的生物脱铬介质的制备方法具体包括以下步骤：

1、PEI修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备：

采用共沉淀法制备，其反应原理为：2Fe³⁺+Fe²⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O；在盛有100mL蒸馏水的500mL搅拌式反应器中按Fe³⁺和Fe²⁺物质的量之比为2∶1的比例加入三氯化铁(FeCl₃·6H₂O)和氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)，在氮气保护下升温到85℃至90℃，倾入过量浓氨水溶液，反应体系变黑后立即加入柠檬酸钠(C₆H₅O₇Na₃·2H₂O)，几分钟后再加入适量的聚乙烯亚胺(Poly(ethyleneimine)，分子量：10172Da，简称PEI)；继续恒温2小时，冷却至室温；产物用磁铁分离后，经去离子水反复清洗，得到在水中稳定分散的PEI修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒。

2、脱铬微生物细菌的培养：

挑取营养斜面保存的Pannonibacter phragmitetus LSSE-09菌株(保存编号CGMCC No.3512)，加入40毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。37℃，150转/分摇床培养12-24小时后，再按1％接种量将其加入500毫升的基础培养基中，12-36小时后，离心得到菌体后再用0.9％的生理盐水洗涤，往复三遍收集菌体。

3、生物脱铬介质的制备

取一定量的菌体置于Tris-HCl缓冲体系中(0.05mol/L，pH 9.0)，加入少量磁流体，使磁颗粒与细菌之间的比值为1：20～500(g/g)，充分混合均匀，通过外加磁场进行收集，并倾去上清液，实现了脱铬微生物的磁分离-固定化，得到生物脱铬介质。

根据本发明的生物脱铬方法，所述的方法包括将上述的生物脱铬介质加入含Cr⁶⁺的废水中，在好氧或厌氧环境中进行脱铬，脱铬完成后在外加磁场下回收、重复使用所述生物脱铬介质。

根据本发明的一具体实施例中生物脱铬方法，该方法包括以下步骤：

1、生物脱铬介质脱除碱性含铬废水中的Cr(Ⅵ)：

将生物脱铬介质置于反应体系中，加入一定量的重铬酸钾(K₂Cr₂O₇)，使Cr(Ⅵ)浓度为0-1000mg/L，加入3-6g/L的电子供体以加快反应速率，通入氮气排净体系内的空气并使其保持厌氧环境，反应最佳温度为30-37℃，每隔一定时间取样，检测上清液中的Cr(Ⅵ)含量。所述的反应体系为pH 9.0-10的Tris-HCl缓冲液。所述的电子供体为醋酸钠或乳酸钠或丙酮酸钠或葡萄糖。

2、生物脱铬介质的回收分离及重复使用：

上述的脱铬过程完成后，在外加磁场的作用下，分离收集生物脱铬介质；在回收的生物脱铬介质中重新加入缓冲液、电子供体和K₂Cr₂O₇，在厌氧环境下重复进行生物脱铬反应。

根据本发明的生物脱铬方法，该方法包括以下步骤：

1)聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备：混合三氯化铁和氯化亚铁，加入浓氨水溶液，反应体系变黑后先后加入柠檬酸钠和聚乙烯亚胺，恒温，冷却，分离后得到聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

2)脱铬微生物细菌的培养：选取红细菌Pannonibacter phragmitetus LSSE-09菌株，保藏编号为CGMCC No.3512，在培养基中培养，收集微生物菌体；

4)生物脱铬介质的收集：将步骤1)中的聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒和步骤2)中的菌体在缓冲体系中混合均匀，通过外加磁场进行收集，得到生物脱铬介质；

4)生物脱铬介质脱除废水中的Cr⁶⁺：将步骤3)中赋磁性细胞加入含Cr⁶⁺体系中，进行脱铬；

5)生物脱铬介质的回收、重复使用：将步骤4)中生物脱铬介质在外加磁场下分离、收集、循环使用。

生物脱铬介质的制备及收集机理：

超顺磁性纳米颗粒稳定分散的机理：在水溶液中新鲜沉淀的Fe₃O₄纳米颗粒的表面有丰富的羟基(-OH)，柠檬酸钠被选定为基底修饰物，因为它含有大量的羧基，能与纳米颗粒表面的羟基发生反应与纳米颗粒稳定结合，而且颗粒表面因为含有的大量多余羧基(-COOH)而带负电荷，电荷的排斥力提高了纳米颗粒的空间稳定性(A.Bee，R.Massart，S.Neveu，Synthesis of very fine maghemite particles，J.Magn.Magn.Mater.149(1995)6-9.)。将制备得到的带有羧基纳米颗粒用PEI进行修饰，由于PEI本身带有大量的氨基(-NH₂)，部分氨基能与羧基进一步反应，从而形成稳定的、表面带大量氨基的功能化磁性纳米颗粒。在溶液中由于氨基的质子化导致其带有大量正电荷(O.Boussif，F.Lezoualc′h，M.A.Zanta，M.D.Mergny，D.Scherman，B.Demeneix，J.P.Behr，A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells inculture and in vivo：polyethylenimine，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(1995)7297-7301.)，因此PEI修饰的磁性纳米颗粒表面上带有大量的正电荷，实验测得其等电点(isoelectric point)为11.5。也就是说，在pH小于11.5的时候，磁颗粒表面会带大量的正电荷。

生物介质制备中纳米颗粒吸附分离-固定化红细菌的机理：红细菌Pannonibacterphragmitetus LSSE-09是一种革兰氏阴性菌，细胞壁中脂多糖的存在使得细菌整体带负电荷(K.Vijayaraghavan，Y.S.Yun，Bacterial biosorbents and biosorption，Biotechnol.Adv.26(2008)266-291.)。因此正负电荷的相互吸引使得纳米颗粒易于吸附在具体表面，从而完成了碱性环境下整个超顺磁性纳米颗粒吸附分离-固定化红细菌的过程。

在制备本发明的生物脱铬介质时，新鲜沉淀的Fe₃O₄纳米颗粒的表面有丰富的羟基(-OH)，结合现有技术和本领域公知常识，具有羧基官能团的物质均能和反应制备得到表面带有负电荷的纳米颗粒，而不仅仅局限于本发明的柠檬酸，但是柠檬酸相比其他物质具有更好的效果，同样再进行修饰使该颗粒表面具有正电荷时可以选取具有氨基官能团的物质而不局限于本发明的PEI，但PEI具有更好效果。

将本发明制备的生物脱铬介质应用于脱除含铬工业废水中Cr(Ⅵ)时，菌能以碳源氮源等有机物作为营养物及电子供体，氧化分解有机物的同时将电子专一性地转移给Cr(Ⅵ)，将所述的Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，同时生成了Cr(OH)₃沉淀，从而去除废水中的Cr(Ⅵ)，实现本发明的目的。

本发明的生物脱铬应用方法有：(1)用磁颗粒固定化的菌体，在好氧条件下加入电子供体用于废水中Cr(Ⅵ)的脱除；(2)用磁颗粒固定化的菌体，在厌氧条件下不加入电子供体，直接用于废水中Cr(Ⅵ)的脱除；(3)用磁颗粒固定化的菌体，在厌氧条件下加入电子供体，加快了反应速率，用于废水中Cr(Ⅵ)的脱除；(4)用磁颗粒固定化菌体，置于磁稳定流化床反应器中脱除Cr(Ⅵ)。

本发明的生物脱铬介质既可以在好氧环境下加入电子供体进行脱铬，也可以在厌氧环境中不加入电子供体进行脱铬。若在厌氧环境中加入适量电子供体，则能大大提高脱铬速度，且此时脱铬速率最快。脱铬反应的有效范围为pH 9.0-10.0，最佳温度为37℃。所述的电子供体为醋酸钠或乳酸钠或丙酮酸钠或葡萄糖。

根据本发明提供的制备生物脱铬介质的方法，该方法是通过柠檬酸钠和聚乙烯亚胺(Poly(ethyleneimine)，简称PEI，分子量：10172Da)修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒作为固定化介质，该磁性颗粒通过静电作用吸附在脱铬红细菌Pannonibacterphragmitetus LSSE-09的菌体表面，在外加磁场的作用下，脱铬细胞能从反应体系中磁分离并固定化。传统固定化包埋技术造成了菌体表面覆盖了一层凝胶状物质，额外增加了反应底物Cr(Ⅵ)到达菌体表面的阻力，即增加了传质阻力，而PEI修饰的磁性纳米颗粒固定化方法只需要少量磁性纳米颗粒，在菌体表面局部覆盖便能达到较好的固定化效果(如图3)，因此反应底物Cr(Ⅵ)可以直接到达大部分的菌体表面，进而保持了与游离细胞相似的反应速率。总体而言，与传统的固定化技术相比，该方法降低了传质阻力的同时，保持了与游离细胞相似的脱铬活性。

在本发明提供的生物脱铬方法中，磁颗粒的分散性及稳定性较高，制备工艺简单，生产成本低；生物脱铬介质具有活性和稳定性高，能有效克服传质阻力，脱铬速率快；在外加磁场的作用下，能够迅速回收分离生物脱铬介质，固定化细胞易于再生和重复使用，而且适用于磁稳定流化床中使用。固定化细胞在碱性环境及好氧厌氧情况下，均能表现出专一、快速、有效地将废水中Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ)，同时生成Cr(OH)₃沉淀，从而降低了废水中的总铬浓度，避免了对环境的污染。

本发明的生物脱铬方法，是通过在红细菌LSSE-09(Pannonibacter phragmitetusLSSE-09，CGMCC No.3512)的菌体表面吸附上超顺磁性的Fe₃O₄纳米颗粒，使得该菌能从反应体系中进行磁分离并固定化，与常规的固定化方法相比，该固定化工艺大大降低了传质阻力，提高了脱铬速率，并且简化了细胞分离和固定化步骤，而且，菌株LSSE-09能够在碱性环境下生长并处理含Cr(Ⅵ)废水，还原速率快，具有普通细菌还原法无可比拟的优势。实验结果表明，超顺磁性的Fe₃O₄纳米颗粒固定化的红细菌能够在碱性环境下处理含Cr(Ⅵ)废水，并且还原速率快、效率高，具有普通包埋固定化方法无可比拟的优势。该技术推动了生物法治理碱性含Cr(Ⅵ)废水的发展，有助于解决困扰我国铬盐、电镀等化工行业的含铬废水污染问题。因此，本发明的超顺磁纳米颗粒吸附分离-固定化红细菌生物脱铬工艺具有广阔的理论研究价值和工业应用前景。

本发明的优点在于：

1、本发明的方法克服现有的生物脱铬技术游离细胞重复利用困难，而固定化细胞步骤繁琐且存在传质阻力的缺点，通过将红细菌LSSE-09(Pannonibacterphragmitetus LSSE-09，CGMCC No.3512)的菌体表面吸附上超顺磁性的Fe₃O₄纳米颗粒，在外加磁场的作用下，使得该菌能从反应体系中进行磁分离并固定化，与常规的固定化方法相比，该固定化工艺大大降低了传质阻力，提高了脱铬速率，并且简化了细胞分离和固定化步骤，与游离细胞相比，磁颗粒固定化的细胞活性保持较好，其脱铬速率相近，并具有重复使用的优点。

2、本发明的方法克服了反应体系中游离细胞难以快速分离，以及常规的离心分离成本高，步骤复杂的弊端。

3、本发明的方法与常规的包埋法固定微生物相比，大幅度降低了传质阻力，具有其不可比拟的优势。总体而言，该方法工艺简单，工业前景广阔。

附图说明

图1为本发明超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒的透射电镜图；

图2为PEI修饰的磁颗粒与赋磁性细胞的红外谱图；

图3为本发明生物脱铬介质的透射电镜图，其中

A、细胞表面的磁颗粒；  B、缓冲液的少量结晶产物1

C、缓冲液的少量结晶产物2；

图4为本发明的磁滞曲线：其中曲线(a)：磁颗粒固定化的细胞σs＝16.3emu/g；曲线(b)：PEI修饰的磁颗粒σs＝62.3emu/g；

图5为本发明生物脱铬介质与游离细胞在厌氧及电子供体存在时的脱铬活性比较；

图6为本发明生物脱铬介质和游离细胞在厌氧及电子供体存在时的重复脱铬曲线。

根据本发明的脱铬红细菌，Pannonibacter phragmitetus LSSE-09，其保藏编号为CGMCC No.3512(于2009年12月16日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)。

具体实施方式

实施例1制备生物脱铬介质及脱除废水中的铬

1、超顺磁性纳米颗粒的制备

采用共沉淀法制备，其反应原理为：2Fe³⁺+Fe²⁺+8OH^-→Fe₃O₄+4H₂O；在盛有200mL蒸馏水的500mL搅拌式反应器中按Fe³⁺和Fe²⁺物质的量之比为2∶1的比例加入8.672mmol三氯化铁(FeCl₃·6H₂O)和4.336mmol氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)，在氮气保护下升温到85℃至90℃，倾入0.375mol浓氨水溶液，反应体系变黑后立即加入0.26mmol柠檬酸钠，反应变黑五分钟后再加入0.26mmol PEI(分子量10172Da)，继续恒温2小时，冷却至室温；产物用磁铁分离后，经去离子水反复清洗，得到在水中稳定分散的PEI修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒。

图1为制备的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒的透射电镜照片，可以看出，Fe₃O₄纳米颗粒的尺寸为10-20nm，颗粒分散明显。图2为PEI修饰的磁颗粒与赋磁性细胞的红外谱图，波数584cm^-1为Fe-O的振动峰，是Fe₃O₄纳米颗粒的典型特征峰。波数3425cm^-1为PEI上的N-H伸缩振动峰，1628cm^-1为氨基官能团的相应振动峰，表明Fe₃O₄纳米颗粒表面有PEI的存在(X.G.Chen，H.J.Park，Chemical characteristics ofo-carboxymethyl chitosans related to the preparation conditions，Carbohydr.Polym.53(2003)355-359；L.Yang，C.Guo，S.Chen，F.Wang，J.Wang，Z.An，C.Liu，H.Liu，pH-sensitive magnetic ion exchanger for protein separation，Ind.Eng.Chem.Res.48(2008)944-950.)。另外，波数1452和1083cm^-1分别对应C-H弯曲和C-N伸缩振动峰，表明柠檬酸钠的羧基(-COOH)与PEI的氨基(-NH₂)发生了反应，形成了C-N键并负载在磁颗粒的表面(S.B.Deng，Y.P.Ting，Characterization of PEI-modifiedbiomass and biosorption of Cu(II)，Pb(II)and Ni(II)，Water Res.39(2005)2167-2177.)。红外谱图的分析结果表明，PEI被成功修饰在磁颗粒的表面。图3可以看出赋磁细胞的表面吸附了一定量的磁颗粒，成功表明细胞可以进行磁分离固定化。其中B和C为Tris-Hcl缓冲液的少量结晶产物，并不影响磁分离及固定化结果。图4可以看出PEI修饰的Fe₃O₄纳米颗粒及赋磁细胞的磁化曲线都无磁滞现象，在外加磁场H＝0时，剩余磁化强度Mr＝0，矫顽力Hc＝0，具有超顺磁性。纳米颗粒及赋磁细胞的比饱和磁化强度(σ_s)分别高达62.349和16.308emu/g，结果表明使用普通的用磁铁即可实现快速分离。

2、LSSE-09细胞的获得

挑取营养斜面培养的LSSE-09菌株，加入40毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。37℃，150转/分摇床培养12-24小时后，再按1％接种量将其加入500毫升的基础培养基中，12-36小时后，离心得到菌体后再用0.9％的生理盐水洗涤，往复三遍获得菌体。

3、生物脱铬介质的制备及收集

挑取营养斜面培养的LSSE-09菌株，加入40毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。37℃，150转/分摇床培养12-24小时后，再按1％接种量将其加入500毫升的基础培养基中，12-36小时后，离心得到菌体后再用0.9％的生理盐水洗涤，往复三遍获得菌体。取一定量的菌体置于Tris-HCl缓冲体系中(0.05mol/L，pH 9.0)，加入少量磁性颗粒悬浮液，使磁颗粒与细菌之间的比值为1/50(g/g)，充分混合均匀，通过外加磁场进行收集，并倾去上清液，实现了脱铬微生物的磁分离-固定化，得到生物脱铬介质。

4、生物脱铬介质脱除碱性含铬废水中的Cr(Ⅵ)

将步骤3中生物脱铬介质置于0.05M Tris-Hcl缓冲体系反应体系中，分别加入K₂Cr₂O₇浓溶液使Cr(Ⅵ)浓度为350mg/L左右，加入3-6g/L的电子供体并调整pH值为9.0-10.0，通入氮气3min以排尽体系中的氧气而达到厌氧环境，通完氮气后用橡胶塞将反应体系封闭，置于摇床中，在温度为37℃，150r/min的摇床反应条件下进行脱铬反应。每隔一定时间用针头插入反应体系中取样，检测上清液中的Cr(Ⅵ)含量。所述的电子供体为醋酸钠或乳酸钠或丙酮酸钠或葡萄糖。

因为厌氧环境中加入电子供体时，脱铬速率最快，因此实验比较了生物脱铬介质与游离细胞在厌氧及电子供体存在时的脱铬活性。如图5所示，纳米颗粒的存在对赋磁细胞并无明显的生物毒性，生物脱铬介质的脱铬活性很高，且与游离细胞接近。二者都能在20min内将350mg/L的Cr(Ⅵ)全部脱除。

5、生物脱铬介质的回收分离及重复使用

上述的脱铬过程完成后，在外加磁场的作用下，分离收集生物脱铬介质；在回收的生物脱铬介质中重新加入缓冲液、电子供体和K₂Cr₂O₇，进行重复生物脱铬反应。附图6为本发明生物脱铬介质在厌氧及电子供体存在时的重复脱铬曲线。可以看出生物脱铬介质至少可以重复使用6次，循环使用时其脱铬活性较游离细胞稍低，主要是由于磁分离过程中少量菌体的损失不可避免。总体而言，生物脱铬介质的性能表现较好。

实施例2制备生物脱铬介质及脱除废水中的铬

1、生物脱铬介质的制备

挑取营养斜面培养的LSSE-09菌株，加入40毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。37℃，150转/分摇床培养12-24小时后，再按1％接种量将其加入500毫升的基础培养基中，12-36小时后，离心得到菌体后再用0.9％的生理盐水洗涤，往复三遍获得菌体。取一定量的菌体置于Tris-HCl缓冲体系中(0.05mol/L，pH 9.0)，加入实施实例1中制备的磁性颗粒，使磁颗粒与细菌之间的比值为1/20(g/g)，充分混合均匀，通过外加磁场进行收集，并倾去上清液，实现了脱铬微生物的磁分离-固定化，得到生物脱铬介质。

2、生物脱铬介质脱除碱性含铬废水中的Cr(Ⅵ)

将步骤1中的生物脱铬介质置于0.05M Tris-Hcl缓冲体系反应体系中，分别加入K₂Cr₂O₇浓溶液使Cr(Ⅵ)浓度为350mg/L左右，加入3-6g/l的电子供体并调整pH值为9.0-10.0，通入氮气3min以排尽体系中的氧气而达到厌氧环境，通完氮气后用橡胶塞将反应体系封闭，置于摇床中，在温度为37℃，150r/min的摇床反应条件下进行脱铬反应。每隔一定时间用针头插入反应体系中取样，检测上清液中的Cr(Ⅵ)含量。所述的电子供体为醋酸钠或乳酸钠或丙酮酸钠或葡萄糖。

因为厌氧环境中加入电子供体时，脱铬速率最快，因此实验比较了生物脱铬介质与游离细胞在厌氧及电子供体存在时的脱铬活性。实验结果表明，纳米颗粒的存在对赋磁细胞并无明显的生物毒性，生物脱铬介质的脱铬活性很高，且与游离细胞接近。二者都能在20min内将350mg/L的Cr(Ⅵ)全部脱除。

3、生物脱铬介质的回收分离及重复使用

上述的脱铬过程完成后，在外加磁场的作用下，分离收集生物脱铬介质；在回收的生物脱铬介质中重新加入缓冲液、电子供体和K₂Cr₂O₇，进行重复生物脱铬反应。本发明步骤1制备的生物脱铬介质在厌氧及电子供体存在时的重复脱铬性能较好。实验结果表明生物脱铬介质至少可以重复使用6次，循环使用时其脱铬活性较游离细胞稍低，主要是由于磁分离过程中少量菌体的损失不可避免。总体而言，生物脱铬介质的性能表现较好，与磁颗粒与细菌之间的比值为1/50(g/g)时制备的固定化细胞脱铬性能相同。

实施例3制备生物脱铬介质及脱除废水中的铬

1、生物脱铬介质的制备

挑取营养斜面培养的LSSE-09菌株，加入40毫升的基础培养基中。培养基的成份：去离子水1000毫升，胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L。37℃，150转/分摇床培养12-24小时后，再按1％接种量将其加入500毫升的基础培养基中，12-36小时后，离心得到菌体后再用0.9％的生理盐水洗涤，往复三遍获得菌体。取一定量的菌体置于Tris-HCl缓冲体系中(0.05mol/L，pH 9.0)，加入少量实施实例1中制备的磁性颗粒，使磁颗粒与细菌之间的比值为1/500(g/g)，充分混合均匀，通过外加磁场进行收集，并倾去上清液，实现了脱铬微生物的磁分离-固定化，得到生物脱铬介质。

2、生物脱铬介质脱除碱性含铬废水中的Cr(Ⅵ)

将步骤1制备的生物脱铬介质置于0.05M Tris-Hcl缓冲体系反应体系中，分别加入K₂Cr₂O₇浓溶液使Cr(Ⅵ)浓度为350mg/L左右，加入3-6g/l的电子供体并调整pH值为9.0-10.0，通入氮气3min以排尽体系中的氧气而达到厌氧环境，通完氮气后用橡胶塞将反应体系封闭，置于摇床中，在温度为37℃，150r/min的摇床反应条件下进行脱铬反应。每隔一定时间用针头插入反应体系中取样，检测上清液中的Cr(Ⅵ)含量。所述的电子供体为醋酸钠或乳酸钠或丙酮酸钠或葡萄糖。

因为厌氧环境中加入电子供体时，脱铬速率最快，因此实验比较了生物脱铬介质与游离细胞在厌氧及电子供体存在时的脱铬活性。实验结果表明，纳米颗粒的存在对赋磁细胞并无明显的生物毒性，生物脱铬介质的脱铬活性很高，且与游离细胞接近。二者都能在20min内将350mg/L的Cr(Ⅵ)全部脱除。

3、生物脱铬介质的回收分离及重复使用

上述的脱铬过程完成后，在外加磁场的作用下，分离收集生物脱铬介质；在回收的生物脱铬介质中重新加入缓冲液、电子供体和K₂Cr₂O₇，进行重复生物脱铬反应。本发明实施实例3制备的生物脱铬介质在厌氧及电子供体存在时的重复脱铬性能较好。实验结果表明生物脱铬介质至少可以重复使用6次，循环使用时其脱铬活性较游离细胞稍低，主要是由于磁分离过程中少量菌体的损失不可避免。总体而言，生物脱铬介质的性能表现较好，与磁颗粒与细菌之间的比值为1/50(g/g)时制备的固定化细胞脱铬性能相同。

Claims (11)

1.一种生物脱铬介质，其特征在于，所述介质包括互相吸附的红细菌Pannonibacter phragmitetus LSSE-09菌株和超顺磁性纳米颗粒，其中所述菌株的保藏编号为CGMCC No.3512。

2.根据权利要求1所述的生物脱铬介质，其特征在于，所述的超顺磁性纳米颗粒为带有正电荷的聚乙烯亚胺修饰的纳米颗粒。

3.一种制备权利要求1所述的生物脱铬介质的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备：混合三氯化铁和氯化亚铁，加入浓氨水溶液，反应体系变黑后先后加入柠檬酸钠和聚乙烯亚胺，恒温，冷却，分离后得到聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

2)脱铬微生物细菌的培养：选取红细菌Pannonibacter phragmitetus LSSE-09菌株，保藏编号为CGMCC No.3512，在培养基中培养，收集微生物菌体；

3)生物脱铬介质的收集：将步骤1)中的聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒和步骤2)中的菌体在缓冲体系中混合均匀，通过外加磁场进行收集，得到生物脱铬介质。

4.根据权利要求3所述的制备生物脱铬介质的方法，其特征在于，所述的步骤3)中超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒和菌体的质量比为1∶20～500。

5.一种生物脱铬方法，其特征在于，所述的方法包括将权利要求1的生物脱铬介质加入含Cr⁶⁺的废水中，在好氧或厌氧环境中进行脱铬的步骤。

6.根据权利要求5所述的脱铬方法，其特征在于，脱铬条件为：温度37℃，pH9.0～10.0。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括在外加磁场下回收、重复使用所述生物脱铬介质的步骤。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述的外加磁场的强度≤6000奥斯特。

9.根据权利要求5所述的脱铬方法，其特征在于，脱铬时加入电子供体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的电子供体为醋酸钠、乳酸钠、丙酮酸钠或葡萄糖。

11.一种生物脱铬方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性纳米颗粒的制备：混合三氯化铁和氯化亚铁，加入浓氨水溶液，反应体系变黑后先后加入柠檬酸钠和聚乙烯亚胺，恒温，冷却，分离后得到聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒；

2)脱铬微生物细菌的培养：选取红细菌Pannonibacter phragmitetus LSSE-09菌株，保藏编号为CGMCC No.3512，在培养基中培养，收集微生物菌体；

3)生物脱铬介质的收集：将步骤1)中的聚乙烯亚胺修饰的超顺磁性Fe₃O₄纳米颗粒和步骤2)中的菌体在缓冲体系中混合均匀，通过外加磁场进行收集，得到生物脱铬介质；

4)生物脱铬介质脱除废水中的Cr⁶⁺：将步骤3)得到的生物脱铬介质加入含Cr⁶⁺体系中，进行脱铬；

5)生物脱铬介质的回收、重复使用：将步骤4)中生物脱铬介质在外加磁场下分离、收集、循环使用。

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