CN102526775B - 99Tcm标记的叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
99Tcm标记的叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸（99Tcm-PFDH）及其制备方法，属于放射性药物及核医学领域。本发明是将PFDH、还原剂氯化亚锡和高锝酸（99TcmO4 -）混匀30min，即得到锝-99m标记的PFDH。本发明的99Tcm-PFDH用于核医学诊断显像。
Description
技术领域
99Tcm标记的叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸（99Tcm -PFDH）及其制备方法，属于放射性药物及核医学领域。
背景技术
自1986年发现叶酸（folic acid，folate，FA）受体是由受体介导的内吞途径进入细胞以来，人们开始对叶酸作为靶向载体进行深入研究。叶酸受体是一种糖基化磷酯酰肌醇连接的膜糖蛋白，分子量为38－40kD，已鉴定出三种叶酸受体的异构体，分别为α-FR、β-FR和γ-FR。叶酸受体FR在正常组织中的表达高度保守，只在肺、肾、脉络膜、胎盘中有低到中等水平表达，以β-FR为主，而在多数肿瘤细胞中超表达。α-FR在一些上皮细胞系肿瘤，如卵巢癌、肾癌、子宫癌、睾丸癌、脑瘤、结肠癌和肺腺癌等高水平表达；β-FR在其他许多肿瘤，如乳腺癌、脑瘤、睾丸癌、头颈部肿瘤、粒系白血病等高水平表达；γ-FR在组织中难以检测。转移瘤比原位、恶性程度低的肿瘤表达更多的叶酸受体。叶酸与叶酸受体具有较高的亲和力（KD=10−10
mol/L）。叶酸可与低分子量的药物或大分子量的共轭化合物连接，这些共价结合的叶酸衍生物与叶酸受体的亲和力几乎不受影响，都可靶向具有叶酸受体的肿瘤细胞。因此，可以通过将叶酸与放射性核素或治疗药物连接，靶向癌细胞的叶酸受体，从而达到诊断和治疗的目的。
目前用于标记叶酸受体靶向放射性药物的核素主要67 /68Ga、111In、99Tcm、64Cu、18 F 及11C等。其中111 In-DTPA-folate是第一个研制并完成Ⅱ期临床的叶酸受体靶向肿瘤显像剂。但由于111In的核素性质并不理想，且来源不易，价格昂贵，因而该药物并没有进一步商品化，真正进入临床使用。与111 In及其他放射性核素相比，99Tcm具有优良的核性质(t1/2 = 6.02h，Eγ=140keV)和化学性质，并可以通过99Mo-99Tcm医用核素发生器方便得到，是目前临床放射性显像诊断的首选核素。99Tcm
标记叶酸及叶酸类似物已成为叶酸受体靶向放射性药物进一步研究的重点。已报道的99Tcm标记的叶酸肿瘤显像剂普遍存在着肿瘤摄取率不理想、腹腔放射性本底较高、靶/非靶比值偏低等缺点。尽管目前还没有一种99Tcm 标记的叶酸肿瘤显像剂能完全满足临床的需求，但是近年来针对上述问题，叶酸活性分子的修饰、连接剂的选择及放射性核素99Tcm
的标记策略等方面开展了一系列工作并取得了一定的进展。
尽管叶酸分子有很强的修饰容忍度，但研究表明，并不是所有叶酸衍生物都能保持较高的受体亲合性。如果99Tcm标记偶联物的连接链太短，偶联在叶酸分子上的99Tcm 标记基团就可能产生很强的位阻效应，阻碍靶向基团进入叶酸受体的“结合空腔”而导致药物与叶酸受体的亲合性变差。因而对连接链部位的选择和修饰也成为99Tcm标记的叶酸肿瘤显像剂设计的一个重点。除传统的烷基链外，近年来99Tcm标记的叶酸偶联物更倾向于选择如聚乙二醇、聚乙二醇片断及多聚酰胺等亲水性连接链。这些连接链的引入，一方面增加了99Tcm标记的叶酸偶联分子的柔性、降低了叶酸衍生物与叶酸受体结合时的位阻；另一方面，亲水性基团的引入可以调节99Tcm标记的叶酸偶联物的药代动力学性能，改善肿瘤组织/ 非靶组织比值，并避免由肝胆代谢造成的高腹腔本底。
纳米技术的出现为癌症的早期诊断和治疗带来了新的希望。纳米材料由于其独特的物理和化学性能、表面效应、微尺寸效应、量子效应及其结构所具有的高表面活性、独特的光电性质、特殊表面效应和体积效应等，使其在环境、生物、医学等领域的研究中具有广阔的应用前景。它是现代科学(工程学、生物学、物理学和化学等)和现代技术(微电子学技术、计算机技术、高分辨显微技术、核分析技术等)结合的产物。由纳米技术和医学结合形成的纳米医学在疾病的诊断和治疗等方面已取得突破性进展，表现出了强劲的发展势头。
20世纪90年代初，Maeda等研究表明，实体瘤丰富的具不连续性的血管及产生的因子使水溶性高分子聚合物易于通过血液循环进入实体瘤组织，由于肿瘤部位的淋巴循环较正常组织的渗透率低，聚合物一旦进入，很难由淋巴循环离开，而是倾向于进入靶肿瘤细胞，称为“增强透过及滞留效应（EPR effect）”，目前已为药学界所接受。作为高分子聚合物具有生物相容性、非免疫原性以及可根据使用目的对结构进行修饰的特点。我们先前的工作合成了聚丙烯酸羟乙酯（PRH）聚合物，并进行了I-125的标记及肿瘤模型显像，取得了较好的效果。在此基础上，以PRH为载体，再连接上叶酸和DTPA，通过聚合物的EPR效应和叶酸受体的靶向性，从而达到被动靶向、主动靶向和物理靶向相结合的作用，研制出一种全新的肿瘤显像剂。
发明内容
本发明的目的是提出一种新型的肿瘤显像剂：锝-99m标记的叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸（99Tcm-PFDH）。同时，本发明还提出了该锝-99m标记PFDH的制备方法，以及它在人或动物器官或组织中作为显像剂的用途。
本发明的技术方案：叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸的化学结构式如下，简写为PFDH。
本发明提供一种放射性锝-99m标记的叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸，简写为99Tcm-PFDH，其结构式如下：
式中200≤x≤400，5≤y≤10，1≤z<5。
其制备方法为：将PFDH、还原剂氯化亚锡和高锝酸（99TcmO4 -）混匀30min，即得到锝-99m标记的PFDH。在EPP管中加入0.5-5mg PFDH（用0.01mol/L
PBS，pH7.2溶解）、1-2mg
氯化亚锡（用0.15mol/L HCl溶解）和新鲜淋洗的高锝酸（99TcmO4 -），反应总体积控制100-300μL，15-80℃充分混匀30min，即得到锝-99m标记的PFDH。
该锝-99m标记的PFDH可用于核医学肿瘤诊断显像。
所述叶酸－聚丙烯酸羟乙酯－二乙烯三胺五乙酸为自制产品，其制备方法已另行申请专利。现将其制备方法公开如下。制备步骤为：
（1）制备聚丙烯酸羟乙酯聚合物：
5 mg 偶氮二异戊酸，100 mg N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，900mg甲基丙烯酸羟乙酯溶于3mL蒸馏水中，后在氮气保护下加热至60℃聚合6小时，将得到的聚合物在无水乙醚中沉淀、洗涤后真空干燥，得到聚丙烯酸羟乙酯聚合物。
（2）制备叶酸羟基琥珀酯：
叶酸（1g，2.26mmol)溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺，加入0.31g(1.52 mmol)二环己基碳二亚胺(DCC)和0.257g(2.26mmol)N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。避光反应过夜后过滤除去副产物。滤液用100mL丙酮︰乙醚体积比为3︰7的混合沉淀剂中沉淀，并用该丙酮乙醚混合液冲洗。
（3）制备叶酸-聚丙烯酸羟乙酯：
将所得聚丙烯酸羟乙酯聚合物溶于5mL二甲亚砜中，溶解后加入微量1-2滴三乙胺作为催化剂与合成的叶酸羟基琥珀酯500mg反应搅拌过夜，将得到的叶酸修饰聚合物在无水乙醚中沉淀、洗涤后真空干燥，制得叶酸-聚丙烯酸羟乙酯；
（4）制备叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸：
将所得叶酸-聚丙烯酸羟乙酯溶于5mL二甲亚砜后加入80mg 乙二胺四乙酸酸酐常温搅拌过夜，反应结束后反应液在丙酮︰乙醚体积比1︰2的沉淀剂中沉淀提纯得到产物PFDH。
本发明的有益效果：
（1）制备工艺简单，标记物稳定，便于临床、科研及药物开发的进一步应用；
（2）本发明提出了一种新的肿瘤显像剂，对叶酸进行了修饰和改进，利用聚合物的EPR效应，增加了对肿瘤的靶向性，从而提高肿瘤显像的效果。
（3）99Tcm-PFDH具有生物相容性、非免疫原性，安全无毒，对肿瘤的靶向性好，具有良好的应用前景。
具体实施方案
实施例1
锝-99m标记PFDH的制备及其性能测定。
1、99Tcm -PFDH的制备
将PFDH、还原剂氯化亚锡和高锝酸（99TcmO4 -）混匀30min，即得到锝-99m标记的PFDH。在EPP管中加入0.5-5mg PFDH（用0.01mol/L
PBS，pH7.2溶解）、1-2mg
氯化亚锡（用0.15mol/L HCl溶解）和新鲜淋洗的高锝酸（99TcmO4 -），反应总体积控制100-300μl，15-80℃充分混匀30min，即得到99Tcm-PFDH。
2、99Tcm-PFDH放化纯测定
TLC法，新华一号纸为支持物，展开剂以乙酸乙酯:水:乙醇＝10:10:4（体积比）配制，采用双体系法，在体系1水相中，99TcmO2、99TcmO4 -、99Tcm-PFDH的Rf值分别为0.7-0.9、0、0.8-0.9。在体系2酯相中，99TcmO2、99TcmO4 -、99Tcm-PFDH的Rf值分别为0、0.4-0.5、0。
3、99Tcm-PFDH体外稳定性的测定
标记化合物分别加到PBS和新生牛血清溶液的试管中，37℃孵育，振荡，分别在30min、1h、2h、4h和6h后测放射化学纯度，考察 99Tcm-PFDH在体外的稳定性。实验结果表明，99Tcm-PFDH
37℃下在PBS和新生牛血清溶液中存放6h，其放化纯仍大于90%。
4、99Tcm-PFDH在小鼠体内的生物分布
按照本实施例制备好标记率大于95%的99Tcm-PFDH溶液。将36只正常ICR小鼠随机分成6组，雌雄各半，每组6只。经小鼠从尾静脉注射0.2mL（0.74MBq）标记化合物，分别于30，60，120，240，360min处死小鼠，收集血、脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脏、骨、肌肉、脂肪、胰腺、甲状腺、性腺称重后用γ计数器测放射性计数，并计算各脏器和组织的摄取量（%ID/g），实验结果以
(SD)表示。结果显示
| %ID/g（SD） | 30min | 60min | 120min | 240min | 360min |
| 血 | 1.68(0.47) | 0.89（0.18） | 0.78（0.22） | 0.46（0.08） | 0.35（0.03） |
| 脑 | 0.01(0.00) | 0.00（0.00） | 0.00（0.00） | 0.00（0.00） | 0.00（0.00） |
| 心 | 0.05(0.03) | 0.03（0.01） | 0.02（0.01） | 0.01（0.00） | 0.01（0.00） |
| 肝 | 0.11(0.03) | 0.10（0.02） | 0.08（0.03） | 0.07（0.02） | 0.04（0.01） |
| 脾 | 0.03(0.01) | 0.03（0.01） | 0.03（0.03） | 0.01（0.00） | 0.01（0.00） |
| 肠 | 0.11(0.03) | 0.06（0.01） | 0.05（0.04） | 0.03（0.00） | 0.02（0.00） |
| 肾 | 0.83(0.18) | 0.70（0.11） | 0.57（0.28） | 0.42（0.12） | 0.27（0.06） |
| 胃 | 0.07(0.02) | 0.10（0.02） | 0.07（0.02） | 0.05（0.02） | 0.04（0.01） |
| 脏 | 0.05(0.02) | 0.06（0.03） | 0.04（0.02） | 0.03（0.01） | 0.02（0.00） |
| 骨 | 0.03(0.01) | 0.04（0.05） | 0.02（0.02） | 0.01（0.01） | 0.01（0.00） |
| 肌肉 | 0.03(0.03) | 0.11（0.17） | 0.01（0.00） | 0.01（0.00） | 0.01（0.00） |
| 脂肪 | 0.03(0.01) | 0.04（0.02） | 0.03（0.02） | 0.01（0.01） | 0.01（0.00） |
| 性腺 | 0.03(0.02) | 0.03（0.02） | 0.09（0.17） | 001（0.00） | 0.01（0.00） |
| 甲状腺 | 0.26(0.22) | 0.42（0.31） | 0.13（0.11） | 0.09（0.08） | 0.08（0.07） |
| 淋巴 | 0.03(0.01) | 0.27（0.54） | 0.14（0.26） | 0.01（0.01） | 0.02（0.02） |
| 胰腺 | 0.08(0.10) | 0.03（0.01） | 0.02（0.01） | 0.01（0.00） | 0.01（0.00） |
5、99Tcm-PFDH小鼠肿瘤模型显像
裸鼠于前肢腋部皮下接种KB细胞和Bxpc-3细胞（3× 106/0.1
mL），4周后肿瘤长至1cm，从小鼠尾静脉注射0.2mL（0.74MBq）99Tcm-PFDH，)，将其俯卧位固定于板上．使四肢充分伸展，采用针孔准直器，能峰140KeV，用SPECT（Philips公司Sky Light）进行图像采集和分析，采集10 min，观察注射后30、60、120、240min在肿瘤中的摄取。结果表明：小鼠肿瘤组织与对侧正常肌肉相比表现为高摄取，说明此标记物可能成为一种良好的肿瘤显像剂。
Claims (2)
1.一种放射性锝-99m标记的叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸，简写为99Tcm -PFDH，其结构式为：
式中200≤x≤400，5≤y≤10，1≤z<5。
2.权利要求1所述的放射性锝-99m标记的叶酸－聚丙烯酸羟乙酯－二乙烯三胺五乙酸的制备方法，其特征在于：在EPP管中加入用0.01mol/L PBS、pH7.2溶解的0.5-5mg PFDH、用0.15mol/L HCl溶解的1-2mg 氯化亚锡和新鲜淋洗的高锝酸99TcmO4 -，反应总体积控制100-300μL，15-80℃充分混匀30min，即得到99Tcm –PFDH；
所述叶酸－聚丙烯酸羟乙酯－二乙烯三胺五乙酸为自制产品，其制备步骤为：
（1）制备聚丙烯酸羟乙酯聚合物：
5 mg 偶氮二异戊酸，100 mg N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐盐酸盐，900mg甲基丙烯酸羟乙酯溶于3mL蒸馏水中，后在氮气保护下加热至60℃聚合6小时，将得到的聚合物在无水乙醚中沉淀、洗涤后真空干燥，得到聚丙烯酸羟乙酯聚合物；
（2）制备叶酸羟基琥珀酯：
叶酸1g溶于20mL N，N-二甲基甲酰胺，加入0.31g二环己基碳二亚胺和0.257gN-羟基琥珀酰亚胺；
避光反应过夜后过滤除去副产物；
滤液用100mL丙酮︰乙醚体积比为3︰7的混合沉淀剂中沉淀，并用该丙酮乙醚混合液冲洗；
（3）制备叶酸-聚丙烯酸羟乙酯：
将所得聚丙烯酸羟乙酯聚合物溶于5mL二甲亚砜中，溶解后加入微量1-2滴三乙胺作为催化剂与合成的叶酸羟基琥珀酯500mg反应搅拌过夜，将得到的叶酸修饰聚合物在无水乙醚中沉淀、洗涤后真空干燥，制得叶酸-聚丙烯酸羟乙酯；
（4）制备叶酸-聚丙烯酸羟乙酯-二乙烯三胺五乙酸：
将所得叶酸-聚丙烯酸羟乙酯溶于5mL二甲亚砜后加入80mg 乙二胺四乙酸酸酐常温搅拌过夜，反应结束后反应液在丙酮︰乙醚体积比1︰2的沉淀剂中沉淀提纯得到产物PFDH。
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