CN102517636A - 原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉、多孔陶瓷及制法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉、多孔陶瓷及制法和应用。原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉通过下述制备方法得到：称取α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8的氨水的烧杯中，随后与钾盐反应，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h。多孔陶瓷材料的制备方法包括：制备原位生长晶须粉；在其中加入生物玻璃以及增稠剂，球磨使之混合均匀，得到混合浆料；用聚氨酯支架模板在0.75～1g/cm3进行浸浆，干燥得到坯体，将所得坯体烧结、保温、冷却，得到纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料。本发明的陶瓷材料，在同样孔隙率下的力学性能明显强于目前的同类产品，并且生物性能同样好，因此可适用于人工骨材料。

Description

原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉、多孔陶瓷及制法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种原位生长的纳米羟基磷灰石晶须粉及其制法，以及其制成的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料、制法及其作为人工骨支架的应用以及作为骨组织损伤修复材料的应用。

背景技术

各种原因造成的骨缺损、骨不连一直是外科领域中的老难题。目前在全球范围内，对具有良好生理功能无排异反应，用于骨缺损修复的人工骨组织，具有迫切和巨大的市场需求。在人工骨制造领域，国外研究机构和企业近年来投入了大量资源，并取得了一系列研究成果，一些用于缺损修复的人工骨材料开始进入临床应用。与此同时，骨支架材料的核心问题如生物相容性、孔隙率和机械强度等依旧存在很多问题需要解决。

专利CN1256153C公开了一种纳米氧化锆强韧化高孔隙率磷酸钙生物陶瓷，并将其应用于制备人工骨支架，该人工骨支架孔隙率高，孔径大小适当，不仅使氧化锆-磷酸钙易被降解吸收，而且骨组织易于长入，融合速度快，与宿主骨牢固结合，不会产生明显的排物反应，该生物陶瓷既可用于骨组织损伤修复，还可以用于体外细胞培养。然而，其缺点是孔隙率低，强度低，不能达到强度、孔隙率和生物学特性的完美结合。

发明内容

本发明的一个目的为提供一种强度、孔隙率和生物学特性均令人满意的材料。

发明人通过研究α-TCP水热法制备具有较强力学性能的HA晶须，得到形貌为针状的，直径为80nm左右，长度为1～2μm，长径比达到10以上的晶须。通过多次试验研究发现，初始pH值、水浴温度、反应时间等因素对产物(HA晶须)的形貌和尺寸有较大的影响。最终，筛选并确定了水化法制备HA晶须的工艺参数，并以此作为原位法制备HA晶须增强多孔生物陶瓷材料的工艺基础。

本发明提供一种原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉，其通过下述制备方法得到：称取α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8的氨水的烧杯中，随后与钾盐反应，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h，干燥得到原位生长晶须粉。

优选地，所述晶须单个直径为50-120nm，长度为1.5-2.0μm。

本发明还提供一种原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉的制备方法，包括以下步骤：称取等质量的α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8的氨水的烧杯中，随后按照(K+Ca)/P摩尔比为1.56～1.67加入KCl，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h，干燥得到原位生长晶须粉。

另一方面，本发明提供一种原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料，使用包含有如权利要求1或2所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须粉的原料制备而成。

优选地，所述多孔陶瓷材料的孔隙率为72％至93％，对应的力学强度为8.8～10.2MPa。

优选地，所述多孔陶瓷材料还经过表面修饰步骤：将羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料浸入稀碱液中浸泡1-2天，再放入到1-2倍SBF模拟体液中，36.5～37℃下于恒温震荡机中浸泡并持续震荡，即在羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料表面生成了规则图案。

优选地，所述多孔陶瓷材料表面的羟基磷灰石晶须大小宽度为60～120nm，晶须间的沟纹宽度为60～80nm。

另一方面，本发明还特工所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8，优选pH值为11.5，的氨水的烧杯中，随后加入钾盐，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h，干燥得到原位生长晶须粉；

(2)在步骤(1)所得原位晶须粉中加入不含硅的生物玻璃，其中原位晶须粉/生物玻璃质量比＝4～5∶1，优选4∶1，随后加入增稠剂，球磨使之混合均匀，得到混合浆料；

(3)将聚氨酯支架模板剪裁成所需要的形状后，在稀碱溶液中加热至50～60℃浸泡后，用去离子水清洗，然后将聚氨酯支架模板浸入步骤(2)所得的混合浆料中按照浸浆率0.75～1g/cm³进行浸浆，优选0.75g/cm³，将支架中的多余料浆碾出，干燥得到坯体；

(4)将步骤(3)所得坯体烧结、保温、冷却，得到纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料。

优选地，所述步骤(2)的浆料控制其粘度值为20～30mPa.s，优选26mPa.s。

优选的，在所述的晶须粉或陶瓷材料的制备方法中，所述α-TCP和β-TCP为等质量的。

优选的，在晶须粉或陶瓷材料的制备方法中，所述钾盐按照(K+Ca)/P摩尔比为1.56～1.67加入KCl，优选(K+Ca)/P摩尔比＝1.56。

本发明还涉及所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料制成的人工骨支架。

本发明还涉及所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料作为人工骨支架的应用或作为骨组织损伤修复材料的应用。

本发明通过羟基磷灰石纳米晶须原位生长的方法合成了的新型纳米羟基磷灰石晶须多孔磷酸钙陶瓷材料，该纳米多孔陶瓷材料可用于制作人工骨支架，本发明又通过纳米晶须原位生长的方法对纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料或骨支架进行表面纳米化和增强修饰，合成了具有高力学强度的多孔人工骨支架，骨支架的孔径大小、孔隙率可调节、孔隙相互贯通，骨支架内部和外表面全孔壁表面具有纳米图案化的人工骨支架。通过对其生物学性能进行研究发现该骨支架不仅具有高孔隙率、高力学强度，经万能力学测试机检测孔隙率在89％时支架强度约为9.2Mpa，而且具有良好的生物相容性，无细胞毒性和急慢性生物毒性，无过敏、溶血反应、无免疫源性，体外细胞学实验发现骨支架表面纳米图案化后对骨髓基质干细胞的黏附具有明显的促进作用，培养过程中有利于促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化，并对细胞的分泌功能具有促进功能，体内降解实验发现该骨支架具有降解性，成功修复了犬胫腓骨大段骨缺损。其力学性能和对细胞响应能力均明显强于目前的同类产品。并且由于表面的纳米颗粒化使材料对细胞和周围的组织具有了明显的正效应。

附图说明

图1为经过表面修饰纳米羟基磷灰石晶须多孔磷酸钙陶瓷人工骨支架的大体图像。

图2-1为实施例1-1的原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉的扫描电镜照片。

图2-2a和图2-2b为实施例1-1的原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉的投射电镜图片。

图3为实施例1-1制备的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架的显微结构图。

图4为实施例1-4得到的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架的低倍显微结构。

图5为实施例1-4的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架的断口显微结构图。

图6为实施例1-4的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架的原料、坯体与人工骨支架的XRD图谱。

图7为实施例1-4的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架表面的纳米图纹扫描电镜图像。

图8为生物试验的1.1(1)的正常培养的MC-3T3细胞形态。

图9为实施例1-4纳米羟基磷灰石晶须人工骨支架浸提液组细胞形态。

图10为生物试验的1.1(1)的阴性对照组细胞形态。

图11为扫描电镜下成骨细胞在实施例1-4原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架表面的生长情况。

图12A及12B为实施例1-4的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架间充质干细胞培养3天的细胞图像。

图12C及12D为普通人工骨支架骨髓间充质干细胞培养3天的图像。

图13A及13B为实施例1-4原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架间充质干细胞培养7天的细胞图像.

图13C及13D为普通人工骨支架骨髓间充质干细胞培养7天的图像。

图14A及14B为实施例1-4原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架间充质干细胞培养14天的细胞图像。

图14C及14D为普通人工骨支架骨髓间充质干细胞培养14天的图像。

具体实施方式

以下通过具体描述或举例的方式阐述本发明，但本领域技术人员应当理解的是，不应理解为对本发明保护范围的限制。

具体的，制备该纳米羟基磷灰石晶须多孔磷酸钙陶瓷材料基本工艺为：

(1)首先称取一定质量的α-TCP/β-TCP，优选等质量的，可使晶须在β-TCP中均匀分布，加入到装有pH值为11.2～11.8，优选11.5的1000ml氨水的烧杯中，随后加入钾盐，该盐的选取标准是保证溶液不产生变化并能引入钾离子，优选按照(K+Ca)/P摩尔比为1.56～1.67加入KCl，优选1.56，水浴并持续搅拌12～28h，优选24h，优选在水浴锅中进行，水浴温度90～95℃，搅拌器转速380～410转/分，优选400转/分，然后放入干燥箱中干燥，得到原位生长晶须粉。

(2)在步骤(1)所得原位晶须粉中加入生物玻璃，加入生物玻璃的目的是降低烧结温度，一般选择不含硅的生物玻璃，其中原位晶须粉/生物玻璃为4～5∶1，优选4∶1，随后加入增稠剂，其中增稠剂可选用常规试剂，可选的方案是糊精、MgO、PVA、聚乙二醇的混合试剂，加入量一般按照原料∶糊精∶MgO∶PVA∶聚乙二醇＝63∶5∶3∶1∶1计算，然后球磨4～6小时使上述物质混合均匀，控制浆料粘度值在20～30mPa.s左右，优选26mPa.s，停止球磨，得到混合浆料。

(3)将孔径为300～400μm的聚氨酯支架为模板剪裁成所需要的形状后，在8～10％NaOH溶液中加热至50～60℃浸泡4～6小时后，优选10％NaOH加热60℃浸泡4小时，用去离子水清洗，然后将聚氨酯支架模板浸入步骤(2)所得的混合浆料中按照0.75～1g/cm³(浸浆率＝聚氨酯支架浸浆后的质量/聚氨酯支架体积)进行浸浆，优选0.75g/cm³，将支架中的多余料浆碾出，该浸润和挤出操作可能需经过多次，即反复浸润并挤出多余料浆，置于恒温恒湿箱中干燥成坯体。

(4)将步骤(3)所得坯体烧结，烧结可置于电炉中进行，烧结温度优选为1000℃，保温时间优选2h，然后随炉冷却至室温，制成纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷支架。

通过对本发明方法制得的多孔陶瓷材料测孔隙率，孔隙率为72％至93％，并通过显微镜观察，其包含有原位生长的纳米羟基磷灰石晶须，单个晶须直径为50-120nm，长度为1.5-2.0μm。

通过对本发明制得的多孔陶瓷材料测力学强度，可得出不同空隙率下的力学强度均可达到8.8～10.2MPa，且在相同孔隙率下其强度比未加晶须的多孔磷酸钙材料平均高2.2～3.4MPa。利用相同浸浆率控制的相近孔隙率下的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强的多孔陶瓷材料(HA_W/β-TCP)，和现有的β-TCP的磷酸钙材料的力学强度测定结果，如下表所示(现有制备方法如具体实施方式的对照例所示，力学强度测定方法如性能测试部分所示)：

优选地，本发明还可以对烧结后的羟基磷灰石晶须多孔磷酸钙陶瓷材料进行表面修饰，该表面修饰包括以下步骤：

将羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料浸入8～10mol/LNaOH中浸泡1天，优选10mol/LNaOH，再放入到1～2浓度倍数SBF模拟体液中，优选1.5倍，于36.5～37℃下恒温震荡机中浸泡并持续震荡(90～100转/分)，优选36.5℃，震荡频率90转/分，由扫描电子显微镜观察得到，即在羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料表面生成了具有规则图形的纳米羟基磷灰石图案。其表面的羟基磷灰石晶须大小宽度60-200nm，晶须间的沟纹宽度为60-80nm，孔壁表面的纳米羟基磷灰石形状与单纯合成的纳米羟基磷灰石相似，但其形状较大。

本发明提供的一种人工骨支架，由纳米羟基磷灰石晶须多孔磷酸钙陶瓷材料或其经过表面修饰的材料构成，人工骨架的具体形状由前述陶瓷材料制备过程中的聚氨酯支架模型的形状决定。图3为合成的纳米人工骨的大体图片，人工骨支架有柱状、块状、人工椎体状等，可以满足临床多种形状的植骨需求。

由显微镜可观察到，人工骨内部有众多孔，孔径大小400至600μm，内部孔隙联通。通过显微镜观察经过表面修饰的骨支架的断口，可看出人工骨支架断口处可见材料内部有大量的纳米羟基磷灰石晶须形成，晶须的排列成簇状聚集，并有交叉，单个晶须直径在50-120nm之间，长度在1.5-2.0μm之间。

通过研究原料、坯体与烧结后人工骨支架的XRD图谱(由X射线衍射仪得到)，可看出由α-TCP和β-TCP组成的原料，经过水化反应后α-TCP完全转化为HA晶须，然后浸浆制成坯体孔，通过高温烧结制成人工骨支架，烧结后人工骨支架是由β-TCP和HA组成。

一、制备试验1

以下实施例所用仪器和设备的来源如下表1所示：

以下实施例所用原料的来源如下表2所示：

起始物的制备

1、α-TCP粉体的制备

按照现有技术中的常规方法进行制备：称取一定量的CaHPO₄·2H₂O和CaCO₃(CaHPO₄·2H₂O与CaCO₃的摩尔比为2∶1)，在无水乙醇介质中利用球磨机球磨24h以上取出，将混合料放入烘箱烘干，过60～80目筛后放入快热高温电阻炉煅烧，升温速率5～10℃/min，在1250℃煅烧保温5h，然后随炉冷却。反应过程见下，再将煅烧粉在无水乙醇介质中球磨24h以上，烘干后过60～80目筛备用。

2CaHPO₄·2H₂O+CaCO₃→Ca₃(PO₄)₂+CO₂↑+5H₂O↑

2、β-TCP粉体的制备

按照现有技术中的常规方法进行制备：采用化学沉淀法合成，将分析纯化学试剂Ca(NO₃)₂和(NH₄)H₂PO₄分别配制Ca(NO₃)₂和(NH₄)H₂PO₄的水溶液，再将两种溶液以一定流速和比例滴入到反应器中并充分搅拌使其反应，同时滴入浓氨水控制体系pH值在8～10范围内，化学反应过程见下。沉淀物经陈化、过滤后，用去离子水反复洗涤，直至pH值为7左右，再将沉淀物烘干，然后在850℃煅烧3h，最后将样品在无水乙醇介质中球磨24h，烘干过筛后备用。

9Ca(NO₃)₂+6(NH₄)H₂PO₄+12NH₃·H₂O→3Ca₃(PO₄)₂+18NH₄NO₃↑+12H₂O↑

3、生物玻璃粉(BG)的制备

按质量比P₂O₅∶CaO∶Na₂O∶MgO＝62∶14∶18∶6配制生物玻璃原料，其中P₂O₅选用NH₄H₂PO₄原料代替(以磷计)，Na₂O选用Na₂CO₃原料代替(以钠计)。按以上质量比称取一定原料(按总质量300g为准)放入球磨罐中用无水乙醇作为介质球磨混料4h后拿出烘干，将烘干的粉置入硅钼棒升降炉煅烧(升温速度5℃/min，其中100℃保温1h，400℃保温1h，700℃保温1h，1100℃保温1h)，保温结束后将熔化后的玻璃迅速倒入热的石墨模具使其在空气中冷却。将冷却后的玻璃砸碎，研磨，过筛，用无水乙醇球磨24h并烘干，再将烘干后的玻璃粉置入800℃硅钼棒高温电阻炉煅烧(升温速度5℃/min，800℃保温5h，然后随炉冷却)，将冷却后的玻璃砸碎，研磨，过筛，再用无水乙醇球磨24h后烘干备用。

4.以下实施例所用其他试剂若未提到，则是采用现有技术中的方法配置，例如1.5倍SBF模拟体液按成熟技术配制。(Na⁺：213mM，K⁺：7.5mM，Mg²⁺：2.25mM，Ca²⁺：3.75mM，Cl^-：221.7mM，HCO₃ ^-：6.3mM，HPO₄ ^2-：1.5mM，SO₄ ^2-：0.75mM)

纳米多孔磷酸钙陶瓷材料的制备

实施例1-1

首先称取等各15g的α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.5的氨水的烧杯中，随后按照(K+Ca)/P摩尔比为1.56加入KCl，置于水浴锅90℃水浴并持续搅拌(转速400转/分)24h，然后放入干燥箱中干燥，得到原位生长晶须粉。

按照原位晶须粉/生物玻璃粉质量比为4∶1的比例加入生物玻璃粉，随后按照晶须粉和生物玻璃粉原料∶糊精∶MgO∶PVA∶聚乙二醇的质量比为63∶5∶3∶1∶1加入糊精、MgO、PVA、聚乙二醇等增稠剂，球磨6小时使之混合均匀，用旋转式粘度计测浆料粘度值26mPa.s，停止球磨，得到混合浆料。然后分别选用孔径为400um的聚氨酯支架为模板剪裁成20mm×20mm×20mm的方块形状后，在10％NaOH溶液中加热至60℃浸泡4小时，利用超声波清洗仪用去离子水清洗后，将该聚氨酯模板浸入上述浆料中按照0.75g/cm³进行浸浆，将支架中的多余料浆碾出，经反复浸润并挤出多余料浆后，恒温恒湿箱(超级恒温器)中干燥成坯体，然后放入硅钼棒高温电阻炉中按烧结温度为1000℃烧结，并保温2h，然后随炉冷却至室温，制成纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷支架。

实施例1-2

首先称取等各15g的α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2的氨水的烧杯中，随后按照(K+Ca)/P摩尔比为1.67加入KCl，置于水浴锅95℃水浴并持续搅拌(转速410转/分)12h，然后放入数显电热鼓风干燥箱中干燥，得到原位生长晶须粉。

按照原位晶须粉/生物玻璃粉质量比为5∶1的比例加入生物玻璃粉，随后加入糊精、MgO、PVA、聚乙二醇(与原料比例为63∶5∶3∶1∶1)等增稠剂，球磨4小时使之混合均匀，用旋转式粘度计测浆料粘度值20mPa.s，停止球磨，得到混合浆料。然后分别选用孔径为400um的聚氨酯支架为模板剪裁成20mm×20mm×20mm的方块形状后，在8％NaOH溶液中加热至50℃浸泡6小时，用去离子水清洗后，将该聚氨酯模板浸入上述浆料中按照1g/cm³进行浸浆，将支架中的多余料浆碾出，经反复浸润并挤出多余料浆后，恒温恒湿箱中干燥成坯体，然后放入电炉中按烧结温度为1000℃烧结，并保温2h，然后随炉冷却至室温，制成纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷支架。

实施例1-3

首先称取各15g的α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.8的氨水的烧杯中，随后按照(K+Ca)/P摩尔比为1.6加入KCl，置于水浴锅92℃水浴并持续搅拌(转速380转/分)28h，然后放入干燥箱中干燥，得到原位生长晶须粉。

按照原位晶须粉/生物玻璃粉质量比为4.5∶1的比例加入生物玻璃粉，随后加入糊精、MgO、PVA、聚乙二醇(与原料比例为63∶5∶3∶1∶1)等增稠剂，球磨5小时使之混合均匀，用旋转式粘度计测浆料粘度值30mPa.s，停止球磨，得到混合浆料。然后分别选用孔径为400um的聚氨酯支架为模板剪裁成20mm×20mm×20mm的方块形状后，在8％NaOH溶液中加热至55℃浸泡5小时，用去离子水清洗后，将该聚氨酯模板浸入上述浆料中按照0.82g/cm³进行浸浆，将支架中的多余料浆碾出，经反复浸润并挤出多余料浆后，恒温恒湿箱中干燥成坯体，然后放入电炉中按烧结温度为1000℃烧结，并保温2h，然后随炉冷却至室温，制成纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷支架。

对照例(未加原位晶须的支架制备)：在15gβ-TCP粉中加入3.75g生物玻璃，其中β-TCP/生物玻璃为4∶1，随后按照原料与糊精、MgO、PVA、聚乙二醇比例为63∶5∶3∶1∶1加入增稠剂混合试剂，后球磨12小时使上述物质混合均匀，得到混合浆料。随后将孔径为400μm的聚氨酯支架为模板剪裁成所需要的形状后，10％NaOH加热60℃浸泡4小时，用去离子水清洗，然后将聚氨酯支架模板浸入混合浆料中按照0.75～1g/cm³进行浸浆，将支架中的多余料浆碾出，该浸润和挤出操作可能需经过多次，即反复浸润并挤出多余料浆，置于恒温恒湿箱中干燥成坯体。将所得坯体烧结，烧结可置于电炉中进行，烧结温度优选为1000℃，保温时间优选2h，然后随炉冷却至室温，制成磷酸钙多孔陶瓷人工骨支架。

二、性能测试试验

1.观察试验

(1)原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉

实施例1-1，1-2，1-3得到的原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉在显微镜下进行观察，发现已形成完整的HA晶须，单个晶须直径为50-120nm，长度为1.5-2.0μm。由透射电镜中观察单个晶须中的原子是严格规则排列的，并按照同一方向生长。其中实施例1-1得到的原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉的扫描电镜照片如图2-1所示。透射电镜图片如图2-2a和2-2b。

(2)纳米羟基磷灰石原位生长晶须增强多孔陶瓷支架

通过显微镜观察，实施例1-1，1-2，1-3包含有原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强陶瓷骨支架，单个晶须直径为50-120nm，长度为1.5-2.0μm。而对照例观察不到晶须结构。其中，实施例1-1得到的陶瓷支架的扫描电镜图如图3所示，由图中可以看到，陶瓷支架中含有部分长柱状晶粒，但是长度较短，直径较大，显示为粗短型柱状晶粒。

2.孔隙率测定试验

采用改良的液体位移法测定支架的孔隙率。选用一带有刻度的试管，置入体积为V1的无水乙醇。将支架浸入其中5min，接负压吸引脱气，使乙醇充盈于多孔支架的孔中，至无气泡逸出，记录此时乙醇体积(浸没支架)为V2。把浸满了乙醇的样品取出，剩余的乙醇V3。按下列公式计算支架孔隙率，每个样品测试三次，取平均值。

孔隙率＝(V1-V3)/(V2-V3)。

	实施例1	实施例2	实施例3
				浸浆量	0.75g/cm3	1g/cm3	0.8g/cm3
孔隙率	89％	72％	81％

3.力学强度测定实验

抗压强度测定

选取与本发明的孔隙率相当的对照例1，对照例2，对照例3得到的陶瓷材料，分别利用电子万能试验机(测试温度为300K)以5mm/min压缩速率测试其抗压强度。其中对照例1、2、3的材料按照上述对照例的方法制备，仅对浸浆率进行了特定选取(如下表所列)，抗压强度测定结果如下表所示。

实施例1

实施例2

实施例3

对照例1

对照例2

对照例3

浸浆率

0.75

1

0.8

1

0.79

0.75

孔隙率

89％

72％

81％

73％

84％

89％

力学强度

9.2MPa

10.2MPa

9.4MPa

8.6MPa

7.5MPa

7.1MPa

由上述结果可知，本发明的实施例1-1得到的孔隙率最优，其抗压强度比相同孔隙率下未加晶须的支架强度要高(对照例3)，对于支架材料来说其最理想，因此选用实施例1-1的陶瓷材料进行表面修饰试验。

三、纳米多孔磷酸钙陶瓷材料的表面修饰

实施例1-4

将实施例1-1的多孔陶瓷材料浸入10mol/LNaOH中浸泡1天，再放入到浓度1.5倍的SBF模拟体液中，于36.5℃下恒温震荡机中(90转/分)浸泡并持续震荡2周。

实施例1-5

将实施例1-1的多孔陶瓷材料浸入8mol/LNaOH中浸泡1天，再放入到1倍SBF模拟体液中，于37℃下恒温震荡机中(90转/分)浸泡并持续震荡2周。

实施例1-6

将实施例1-1的多孔陶瓷材料浸入10mol/LNaOH中浸泡1天，再放入到浓度2倍的SBF模拟体液中，于36.5℃下恒温震荡机中(90转/分)浸泡并持续震荡2周。

四、表征试验

1.显微镜观察

通过扫描电镜低倍观察，实施例1-4得到的人工骨支架如图4所示，人工骨孔径大小400至600μm，且内部孔隙相互联通。

通过扫描电镜高倍观察，实施例1-4得到的支架断口显微结构图的扫描电镜照片如图5所示，可看出人工骨支架断口处可见材料内部有大量的纳米羟基磷灰石晶须形成，晶须的排列成簇状聚集，并有交叉，单个晶须直径在50-120nm之间，长度在1.5-2.0μm之间。

利用显微镜观察得到，实施例1-4，1-5，1-6的原位生长纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷支架表面形成了具有规则图形的纳米羟基磷灰石图案，表面的羟基磷灰石晶须大小宽度60-200nm，晶须间的沟纹宽度为60-80nm。实施例1-4的扫描电子显微镜测定结果如图7所示，其表面的羟基磷灰石晶须大小宽度102nm左右，晶须间的沟纹宽度为68nm左右。

2.XRD图谱

图6是实施例1-4原料、坯体与烧结后人工骨支架的XRD图谱(由X射线衍射仪得到)，可看出原料是由α-TCP和β-TCP组成(见图6的曲线A)，经过水化反应后α-TCP完全转化为HA，然后浸浆制成坯体孔(见图6的曲线B)，通过高温烧结制成人工骨支架(见图6的曲线C)。

五、生物试验

1.纳米多孔陶瓷材料和纳米多孔陶瓷人工骨支架的生物学特性检测

1.1纳米多孔陶瓷材料浸提液对细胞生长的影响

(1)细胞形态观察法：

将实施例1-1，1-4，1-5和1-6的纳米多孔陶瓷骨支架浸提液、阴性参照材料聚乙烯浸提液3ml和正常培养液3ml(作为空白对照)，分别置于培养皿内，加入培养的对数生长期的MC-3T3细胞悬液3ml，细胞浓度为6×10⁴/ml，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下细胞培养箱培养。通过倒置相差显微镜观察细胞形态及生长情况，有无明显差别。

正常培养、实施例1-4、阴性对照实验得到对应的倒置相差显微镜下照片如图8、图9及图10。观察得出，细胞形态学观察发现该纳米陶瓷材料浸取液中，组细胞生长和形态与阴性对照组和正常培养组无明显差别，尤其是实施例1-4所得的结果与对照组几乎一致，提示纳米纳米陶瓷骨支架对细胞的生长无明显影响。

(2)细胞毒性检测

利用CCK-8法测定材料的细胞相对增值率及细胞毒性：制备MC-3T3细胞悬液5×10⁴个/ml，接种于96孔培养板，(分为实施例1-1，1-4，1-5和1-6纳米多孔陶瓷材料浸提液培养组、正常培养液培养组和空白对照组六组，每组各10孔)，共6块培养板，每孔200ul，置37℃、5％CO₂电热恒温培养箱培养24h。弃去原培养基，PBS液洗涤，分别加入200ul的100％浸提液、100ul相应的对照液、培养2d、4d、7d。加入10μlCCK-8，37℃、5％CO2、95％湿度培养箱内继续孵育4h后终止培养。用酶标仪在570nm波长下测定其光吸收值，记录结果。

评价方法：细胞相对增值率(RGR)＝(实验组OD均值/阴性对照组OD均值)×100％，根据计算值再进行细胞毒性分级。

所得结果见下表：

由结果得知，MTT法发现纳米多孔陶瓷材料浸提液组和阴性对照组细胞毒性均为0级，无细胞毒性；

(3)全身毒性反应检测

按50ml/kg实施例1-1，1-4，1-5，1-6所得纳米多孔陶瓷材料浸提液小鼠6只尾静脉注射，阴性对照为同批号生理盐水，阳性对照为6.4％苯酚溶液，注射后24h、48h、72h称量体重变化，观察一般状态、毒性表现及死亡情况。

材料毒性程度根据中毒症状分为无毒、轻度毒性、中度毒性、重度毒性和死亡(见表3)。

表3材料毒性分级

纳米陶瓷材料浸提液组小鼠的全身一般状况良好，未见明显毒性表现，体重均出现增加现象，72h观察期内活动如常，饮食饮水均正常，无动物死亡现象(与生理盐水阴性对照组一致)。各实验组不同观察期动物体重变化情况见表4，阳性对照组第二天死亡一只。

表4全身急性毒性试验动物体重变化结果(单位g，X土S)

(4)溶血反应检测

取实施例1-1，1-4，1-5，1-6纳米多孔陶瓷材料、聚乙烯(阴性对照)及聚氯乙稀(阳性对照)各5克，先用蒸馏水水洗2次，制备成粉体状，各分成3份，置于试管中加入生理盐水10ml充分振荡，37℃恒温水浴箱中30min后，加入稀释新鲜人静脉血0.2ml(8ml血加入10ml生理盐水稀释)，再次放入37℃水浴中继续60min，置于干燥的离心管中离心5分钟(2500r/min)，取上清液在波长545nm测光密度值(OD)。

溶血率＝(Dt-Dnc)/(Dpc-Dnc)×100％

公式中：Dt-实验样品的吸光值

Dnc-阴性对照的吸光值

Dpc-阳性对照的吸光值

阴性管＜0.03，阳性管A为0.8±0.30有效；

若材料的溶血率＜5％则说明材料符合医用材料的溶血实验要求，若溶血率＞5％，则预示材料有溶血作用。

实施例1-1，1-4，1-5，1-6所得纳米多孔陶瓷材料的溶血率数据如下表

由结果得出，实施例1-1，1-4，1-5，1-6的体外实验不引起溶血反应，符合非直接接触血液的医用生物材料能测试所提出的溶血率小于5％标准。

(5)纳米多孔陶瓷人工骨支架免疫与相容性实验

将实施例1-1，1-4，1-5，1-6所得人工骨支架植入5只新西兰大白兔股部肌袋内，在植入前和植入后3、7、14、21天不同时间点内抽血查T淋巴细胞亚型T4和T8数量并计算其比值，对数据进行统计学分析(统计学分析13.0采用SPSS 10.0统计分析软件，率的比较用x检验，计量资料采用t检验)；在植入后3、7、14、21天分别处死动物观察材料对植入局部周围组织致敏及炎性反应的影响。实施例1-1，1-4，1-5，1-6材料植入后周围组织大体和组织学观察未见明显的过敏、炎性及排斥反应，植入后血液内T淋巴细胞亚群各时间点与植入前血液中数值统计学结果无明显差别(具体数值见表5-1，5-2，5-3，5-4)，提示纳米氧化锆磷酸钙骨支架无免疫源性，体内植入具有良好的相容性。

表5-1实施例1-1人工骨支架植入前后T淋巴细胞亚群比较表

P＞0.05(各组间无统计学差异)

表5-2实施例1-4人工骨支架植入前后T淋巴细胞亚群比较表

表5-3实施例1-5人工骨支架植入前后T淋巴细胞亚群比较表

表5-4实施例1-6人工骨支架植入前后T淋巴细胞亚群比较表

以上生物学检测结果均符合医疗器械生物学评价ISO10993-1992和GB/T16886.1-1997标准。

1.2纳米多孔陶瓷人工骨支架对细胞的粘附、促进骨髓间充质细胞分化和分泌功能的检测

(1)对细胞粘附的影响

将MC3T3-E1细胞培养液配成以5×10⁶浓度后分别以2ml接种到实施例1.1，1-4，1-5，1-6所得纳米多孔陶瓷人工骨支架和同种异体骨条各5块上，常规培养，2天后培养液洗去未粘附细胞后，然后采用胰酶消化完全洗脱粘附在纳米人工骨和同种异体骨条上的细胞，经离心后进行细胞计数。培养2天后支架上细胞经胰酶消化，超声洗涤后洗脱下来的细胞经离心定容后细胞计数板计数，测五次取平均值，具体数值见表6。

结果显示实施例1-4，1-5，1-6纳米多孔陶瓷人工骨支架上MC3T3-E1细胞的粘附明显多于同种异体骨条上粘附的细胞，尤其是实施例1-4效果最佳，而实施例1-1未经表面修饰的纳米多孔陶瓷人工骨支架的粘附相当于同种异体骨条上粘附的细胞，提示孔壁纳米化后对细胞的粘附具有促进作用。

如图11为超微电镜下成骨细胞在实施例1-4表面纳米图案化的骨支架表面的生长情况。超微电镜下可见成骨细胞在表面纳米图案化的骨支架表面的生长情况时可以见到细胞在生长和分裂的时候在细胞的周围长出很多细小的微足，这些微足可以深入并附着在骨支架的纳米图案上，提示表面的纳米图案就是利于细胞微足附着和促进其向细胞向四周移动的“阶梯”。也是纳米图案对细胞的粘附和移动、分裂的促进作用的机制。

表6MC3T3-E1细胞在两种材料上培养2天后洗脱粘附细胞数

两种骨支架间比较P＜0.001，示细胞粘附增殖有显著性差异。

(2)促进骨髓间充质细胞向成骨细胞分化和分泌功能的研究

将人源性骨髓基质干细胞(hMSCs)分别接种到实施例1-1，1-4，1-5，1-6所得纳米多孔陶瓷人工骨支架和普通对照的磷酸钙骨支架上，在培养3、7、14天观察骨髓基质干细胞在两种骨支架上的生长、分化和分泌情况。

结果可见人脊髓间充质干细胞在实施例1-4，1-5，1-6纳米多孔陶瓷人工骨支架内粘附、增殖和分泌功能在3、7、14天均明显高于普通的人工骨支架，尤其是实施例1-4效果最佳，而实施例1-1未经表面修饰的人工骨支架的粘附、增殖和分泌功能基本与普通人工骨持平。提示纳米羟基磷灰石晶须增强及表面纳米化人工骨支架对骨髓间充质干细胞的分化和分泌具有促进功能。

图12A、B为实施例1-4纳米多孔陶瓷人工骨支架间充质干细胞培养3天的细胞图像，细胞大量粘附，整个覆盖孔壁，细胞排列规则；C、D为普通人工骨支架骨髓间充质干细胞培养3天的图像，显示细胞粘附较少，排列不规则。

图13A、B为实施例1-4纳米多孔陶瓷人工骨支架间充质干细胞培养7天的细胞图像，细胞生长茂盛并有重叠生长，高倍视野下可见细胞开始分泌较多的无机矿化颗粒；C、D为普通人工骨支架骨髓间充质干细胞培养7天的图像，显示细胞尚未完全覆盖骨支架孔壁，高倍视野下见细胞分泌也比较旺盛，细胞表面可见较多的矿化颗粒。

图14A、B为实施例1-4纳米多孔陶瓷人工骨支架间充质干细胞培养14天的细胞图像，细胞完全覆盖孔壁，表面可见完全矿化，已经无法看到人工骨材料孔壁，高倍视野下可见无机矿化颗粒堆积并高出细胞表面；C、D为普通人工骨支架骨髓间充质干细胞培养14天的图像，显示细胞基本覆盖骨支架孔壁，但尚可见到人工骨材料的孔壁，高倍视野下见细胞表面基本被矿化颗粒覆盖，但尚未见到大量矿化颗粒堆积现象。

1.3纳米多孔陶瓷人工骨支架修复动物骨缺损的实验

(1)纳米多孔陶瓷人工骨支架的体内降解实验

制作新西兰大白兔股部肌袋，在新西兰大白兔的股部肌袋植入实施例1-1，1-4，1-5，1-6所得纳米多孔陶瓷人工骨支架，分别在植入后8周、12周、24周取材，大体观察材料的外形、高温煅烧气化有机成分后观察残余无机成分，所得无机成分的质量如表7所示。

结果显示植入肌袋内的实施例1-1，1-4，1-5，1-6的纳米多孔陶瓷材料具有一定的降解性，即经过表面修饰和未经表面修饰的多孔陶瓷材料均表现出较好的降解性。其降解的过程是以边缘和人工骨的内部软化为主，但降解速率与单纯磷酸钙骨支架相比稍慢。

表7  肌袋内的纳米多孔陶瓷材料经煅烧后残余无机成分质量表

	实施例1-1	实施例1-4	实施例1-5	实施例1-6
					0周	2.00±0.00g	2.00±0.00g	2.00±0.00g	2.00±0.00g
8周	1.82±0.07g	1.76±0.06g	1.88±0.04g	1.86±0.03g
					12周	1.56±0.04g	1.54±0.12g	1.47±0.10g	1.56±0.08g
16周	1.22±0.22g	1.31±0.11g	1.20±0.17g	1.24±0.14g
					24周	1.01±0.21g	0.70±0.21g	0.78±0.12g	0.84±0.06g

(2)纳米多孔陶瓷人工骨支架修复动物骨缺损的实验研究

制作犬下肢胫腓骨大段骨缺损，然后将实施例1-1，1-4，1-5，1-6所得纳米人工骨支架植入到骨缺损处钢板固定，植入后3月后摄X线片观察动物骨缺损修复情况，同时处死动物，大体及显微观察动物骨缺损的修复情况。

实施例1-1，1-4，1-5，1-6纳米人工骨支架植入到犬胫腓骨骨缺损2.0cm后3月X线观察动物骨缺损修复，处死动物后观察到动物的骨缺损得到了修复，组织学观察见人工骨与上下端自体骨融合，人工骨部分降解，同时人工骨孔隙内有自体骨的长入，提示人工骨成功修复动物的大段骨缺损。

综上所述，本发明制得的纳米羟基磷灰石晶须多孔磷酸钙陶瓷材料由于具备原位生长的晶须，在相同的孔隙率下具有更强的力学强度，在表面修饰后具有更好地生物相容性能，并且试验证明没有毒性，更适用于作为人工骨材料。

Claims (13)

1.一种原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉，其通过下述制备方法得到：称取α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8的氨水的烧杯中，随后加入钾盐，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h，干燥得到原位生长晶须粉。

2.如权利要求1所述的晶须粉，其特征在于，所述晶须单个直径为50-120nm，长度为1.5-2.0μm。

3.一种原位生长纳米羟基磷灰石晶须粉的制备方法，包括以下步骤：称取等质量的α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8的氨水的烧杯中，随后加入钾盐，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h，干燥得到原位生长晶须粉。

4.一种原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料，使用包含有如权利要求1或2所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须粉的原料制备而成。

5.如权利要求4所述的陶瓷材料，其特征在于，所述材料的孔隙率为72％至93％，对应的力学强度为8.8～10.2MPa。

6.如权利要求4或5所述多孔磷酸钙陶瓷材料，其特征在于，所述材料还经过表面修饰步骤：将羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料浸入稀碱液中浸泡1-2天，再放入到1-2倍SBF模拟体液中，36.5～37℃下于恒温震荡机中浸泡并持续震荡，即在羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料表面生成了规则图案。

7.权利要求6所述多孔磷酸钙陶瓷材料，其特征在于，所述材料表面的羟基磷灰石晶须大小宽度为60～120nm，晶须间的沟纹宽度为60～80nm。

8.一种权利要求4或5所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取α-TCP和β-TCP，加入到装有pH值为11.2～11.8，优选pH值为11.5，的氨水的烧杯中，随后加入钾盐，90～95℃水浴并持续搅拌12～28h，干燥得到原位生长晶须粉；

(2)在步骤(1)所得原位晶须粉中加入不含硅的生物玻璃，其中原位晶须粉/生物玻璃质量比＝4～5∶1，优选4∶1，随后加入增稠剂，球磨使之混合均匀，得到混合浆料；

(3)将聚氨酯支架模板剪裁成所需要的形状后，在稀碱溶液中加热至50～60℃浸泡后，用去离子水清洗，然后将聚氨酯支架模板浸入步骤(2)所得的混合浆料中按照浸浆率0.75～1g/cm³进行浸浆，优选0.75g/cm³，将支架中的多余料浆碾出，干燥得到坯体；

(4)将步骤(3)所得坯体烧结、保温、冷却，得到纳米羟基磷灰石晶须多孔陶瓷材料。

9.如权利要求8所述的陶瓷材料的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)的浆料控制其粘度值为20～30mPa.s，优选26mPa.s。

10.如权利要求1所述的晶须粉、权利要求3所述的晶须粉的制备方法或权利要求8所述的陶瓷材料的制备方法，其特征在于，所述α-TCP和β-TCP为等质量的。

11.如权利要求1所述的晶须粉、权利要求3所述的晶须粉的制备方法或权利要求8所述的陶瓷材料的制备方法，其特征在于，所述钾盐按照(K+Ca)/P摩尔比为1.56～1.67加入KCl，优选(K+Ca)/P摩尔比＝1.56。

12.一种由权利要求4-7，10或11所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料制成的人工骨支架。

13.一种权利要求4-7，10或11所述的原位生长的纳米羟基磷灰石晶须增强多孔陶瓷材料作为人工骨支架的应用或作为骨组织损伤修复材料的应用。

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