CN102507889B - 一种利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用浮萍叶状体分离对重金属进行生物毒性评价的方法。运用浮萍对重金属的毒理反应即叶状体的两片叶子分离现象与重金属的种类和浓度之间建立相关关系，通过叶片的分离时间来对受试水样的生物毒性进行评价。本方法的优点在于浮萍对某些重金属（铜、铁等）毒性反应敏感，反应时间较短，从而缩短试验的时间，节约成本，简化操作。由于浮萍叶状体对重金属具有如此敏感的生理生态反应，且观测直接，可以作为水生生物监测污水毒理效应系统的有效补充方法。
Description
技术领域
本发明属于生物检测领域，具体涉及一种利用浮萍评价重金属生物毒性的方法。
背景技术
浮萍（Lemna minor Linn）是一种高等水生维管束植物，早在20世纪50年代，国外的毒理学家就提出应用浮萍进行毒理试验以监测水环境质量，并建立了标准试验方法。欧洲标准（BS EN ISO 20079:2006）介绍了以浮萍叶片数的变化作为监测指标，试验过程中每天记录生长指标叶片数，通过叶片数计算生长速率抑制率从而得出EC50（ R=（lnXt2-lnXt1）/T2-T1，Xtn代表Tn天时所测指标值，R代表生长速度，Ir=（Rc-Rt）/Rc×100% (Ir生长抑制率，Rc对照组生长率，Rt处理组生长率)，以受试水样的浓度对数对抑制率作图，求出EC50）。
欧洲标准介绍的方法试验周期为7天，相对来说试验周期较长。试验设的对照培养有两种选择：采用蒸馏水和营养液。对于用蒸馏水作对照，由于试验周期较长且浮萍生长需要营养，因此对照组的日生长速率值偏低，而且表现不一致，同时会出现营养缺乏导致的叶片发黄现象等，在此情况下，对照组浮萍不能正常生长因此影响了对照试验的准确性；选用营养液作为对照时，为了保证各处理的一致性，各处理组相应的也要添加等量的营养液，营养液的添加可能会破坏受试水样的组分，营养成分的存在也可能影响毒性测试结果的准确性，使EC50值受到影响。
浮萍通常情况下是以出芽生殖为主，这种生殖方式类似于酵母的出芽生殖。正常生长状态下浮萍的叶状体通常含有2~5片叶子（frond）。当浮萍受到逆境胁迫或营养胁迫时是不能够完成出芽生殖的。在逆境胁迫下不仅浮萍的出芽生殖受到影响，叶状体也会受到影响，表现之一是叶状体分离，形成单叶，形成的单叶不能够增殖。发明人在研究过程中通过观察发现：叶状体的分离对不同重金属污染表现敏感，并经过试验发现在铜、铁、锌、铬这四种重金属的处理下，短时间内，浮萍便表现出了叶状体分离现象。通过观测浮萍叶状体分离速度，来判断污水毒性的强弱。此方法旨在调整试验周期，可将试验周期缩短为约1天，解决长周期试验所带来的对照组的结果不确定问题，建立运用浮萍快速监测污水的方法，使得污水的生物监测更简便、快速和准确。
发明内容
本发明的目的是通过寻找一种新的试验方法和指标，简化试验过程，建立一种比现有方法更快速便捷的试验方法，即提供一种利用浮萍叶状体分离对重金属进行生物毒性评价的方法。
本发明运用浮萍对重金属的毒理反应即叶状体的两片叶子分离现象与重金属的种类和浓度之间建立相关关系，通过培养过程中叶片的分离时间来对受试水样的生物毒性进行评价。
本发明具体试验操作如下：
a．挑选浮萍并将其根剪成1mm~2mm后于受试水样中培养；
b．24℃~25℃连续光照条件下培养，光照条件为85~135uE/m2/s1、400~700nm；
c．试验过程记录：记录首次出现叶状体分离的时间及单叶片数，随后间隔时间记录每株浮萍的单叶片数；
d. 毒性评价：根据步骤c所记录的单叶片数评价受试水样的毒性，若出现单叶片，即说明水样受到污染，叶状体分离现象越迅速，则水样受污染程度越严重。
优选地，步骤a中挑选的浮萍每株含有两个或三个叶状体，一共挑选10株~15株；步骤b中培养时间为1天，步骤c中记录时间为15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h；步骤b中光照温度为24℃。
更优选地，步骤c每次记录浮萍的形态变化，包括根分离、叶片发黄情况，以进一步判断水样毒性。
采用本方法检测水样毒性时，浮萍对Fe、Cu、Cr的毒性反应在20min时就能观察到，而Zn的反应时间为4小时。且对Cu的检测尤为灵敏，在0.00064mmol/L的Cu存在下就可观察到毒性效应，此时培养时间为2h。
本方法的优点在于浮萍对某些重金属（铜、铁等）毒性反应敏感，反应时间较短，从而缩短试验的时间，节约成本，简化操作。由于浮萍叶状体对重金属具有如此敏感的生理生态反应，且观测直接，可以作为水生生物监测污水毒理效应系统的有效补充方法。本发明主要在于监测技术和指标上的创新，浮萍的这种对于含有重金属的污水特定的毒理反应弥补了传统监测指标（叶片数）的缺陷。
本发明的优点还在于叶片分离是浮萍对重金属离子毒性的生理反应，该反应直观迅速，不用通过试验手段测量，在试验观察上不存在系统误差，以此来表征污水毒性具有参考价值，反应了污水的急性毒性。急性毒性是指机体(人或试验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，甚至引起死亡。急性毒性试验也可为慢性毒性试验设计提供参考，如污水浓度系列的配置从而达到优化慢性毒性试验的目的。
本发明还有以下有益效果：
1、以叶片分离数为试验指标无需复杂的试验步骤和试验仪器，节约试验成本；
2、减少人为主观因素，使客观性增强，减少试验的系统误差；
3、此观测指标对重金属反应敏感，并且反应稳定；
4、试验周期约为一天，大大缩短了现有方法的试验周期，缩减时间成本；
5、摒除了现有方法存在对照可能影响试验结果的准确性，因此提高了试验阴性对照的可靠性。
附图说明
图1为 CuSO4处理下叶片分离情况；
图2为FeSO4处理下叶片分离情况；
图3为ZnSO4处理下叶片分离情况；
图4为K2Cr2O7处理下叶片分离情况。
具体实施方式
试验材料：浮萍（Lemna minor Linn）、培养皿、培养箱、含重金属污水样品；时间：2010.6~2010.12；温度：25℃。
试验过程：
1. 贮存培养（stock culture）
将浮萍接种于STEINBERG medium中25℃连续光照(85~135uE/m2/s1(400~700nm))条件下培养以用于水质检测，STEINBERG medium配方如下：
STEINBERG medium配方（pH 5.3~5.7）
注：用0.1mol/L的HCl或NaOH调节pH
2. 试验步骤：
a．以纯水将待检测水稀释成不同浓度梯度（至少五个浓度梯度），每种浓度三个重复；
b．挑选10株大小一致的浮萍（每株含有三个叶状体）将其根剪成1mm后于受试水样中培养（比较吸收强度对毒性物质的反应差异）；
c．25℃连续光照(85~135uE/m2/s1(400~700nm))条件下培养1天；
d．试验记录过程：于处理为15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h时记录单叶片数。在此期间每次记录浮萍的形态变化包括根分离、叶片发黄情况。
3、试验结果与分析
本试验通过对铜、铁、锌、铬4种重金属对浮萍进行生物毒性试验，所得结果如图1-图4。
由试验结果可以看出这四种重金属均对浮萍叶状体存在毒性作用，使浮萍正常生长状态下叶状体分离，且反应时间迅速，除Zn的反应时间为4小时外，浮萍对其余三种重金属的毒性反应在20min时就可观察到，毒性的大小和金属离子的浓度存在着相关关系，表现为浓度越大，叶状体分离现象更迅速更严重。
由本试验得出的四种重金属对浮萍叶状体分离毒性的大小顺序为：Cu>Cr>Fe>Zn，其中在Cu处理下，在处理时间为4小时时浓度为0.064mmol/L的Cu处理下，浮萍全部变成单叶，此时叶状体颜色并无异常现象，表现为绿色，但在处理时间为6小时的情况下，叶片开始发黄变为褐色，并逐渐萎焉死亡，在此过程中并没有发现根脱落现象。Zn作为浮萍正常生长的一种微量元素，但是在所选试验浓度0.1mmol/L（相当于营养液浓度的160倍）下对浮萍也存在毒害作用。但在实验周期为24h小时时，浮萍的叶片表现为失绿现象，叶状体部分变为白色，并未出现萎焉现象。亚铁离子和六价铬离子在浓度为0.1mmol/L条件下对浮萍的毒害作用较强，叶状体分离速度也较快，出现在处理1—2h后。浮萍叶状体分离对Cu的响应更为敏感迅速，表现在0.00064mmol/L的硫酸铜处理下也可观察到毒性效应。
浮萍对铁、铜、锌、铬这四种重金属的毒性响应在叶状体分离上是一致的，响应时间与浓度呈正比，因此用叶状体分离指标来评价这几种重金属毒性大小，及初步确定水质中某种重金属的浓度是可行的，并且基于此建立的方法具有快速简便及对于铜的毒性检测限低的优点。
Claims (4)
1.一种利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于：运用浮萍对重金属的毒理反应即叶状体的两片叶子分离现象与重金属的种类和浓度之间建立相关关系，通过培养过程中叶片的分离时间来对受试水样的生物毒性进行评价；
具体试验操作如下：
a.挑选浮萍并将其根剪成1mm～2mm后于受试水样中培养；
b.24℃～25℃连续光照条件下培养，光照条件为85～135uE/m2/s1、400～700nm；
c.试验过程记录：记录首次出现叶状体分离的时间及单叶片数，随后间隔时间记录每株浮萍的单叶片数；
d.毒性评价：根据步骤c所记录的单叶片数评价受试水样的毒性，若出现单叶片，即说明水样受到污染，叶状体分离现象越迅速，则水样受污染程度越严重；所述重金属为Fe、Cu、Zn、Cr，其中对Fe、Cu、Cr的毒性反应在20min时就能观察到，而Zn的反应时间为4小时；所述步骤c每次记录浮萍的形态变化，包括根分离、叶片发黄情况，以进一步判断水样毒性；
对于重金属为Cu时，最低检出限为0.00064mmol/L；当培养2h或以后才出现叶状体分离时，可判断受试水样的Cu浓度小于或等于最低检出限。
2.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤a中挑选的浮萍每株含有两个或三个叶状体，一共挑选10株～15株。
3.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤b中培养时间为1天，步骤c中记录时间为15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h。
4.如权利要求1所述的利用浮萍对重金属进行生物毒性评价的方法，其特征在于步骤b中光照温度为24℃。
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