CN110275005B - 一种海洋鱼类水生态毒性试验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种海洋鱼类水生态毒性试验方法，包括：选择虾虎鱼作为试验的鱼类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养，准备待测水样储备液，先通过虾虎鱼的急性毒性和慢性毒性预试验分别筛选浓度梯度范围，设置差距小的浓度梯度，以海水作为对照组，待测水样作为试验组，同时进行虾虎鱼的急性毒性和慢性毒性试验，记录虾虎鱼和环境的变化，对数据进行方差分析，绘制虾虎鱼死亡率曲线，结合虾虎鱼的体征情况和水体指标变化判断水质毒性；克服目前国内对于鱼类毒性试验研究较为单一，没有适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法的问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种海洋鱼类水生态毒性试验方法，具体涉及急性毒性和慢性毒性两类毒性试验，用于检测海洋水生态毒性。
背景技术
毒性实验作为传统的物质毒性的测定方法，是一种为众人所广泛认可的实验方法，且具有通用性和可重复性，其数据可作为其他相关实验的数据基础，也可通过实验结论更加有效的控制该毒物。毒性试验包括：急性毒性实验、慢性毒性试验、遗传毒性试验和内分泌干扰毒性试验。目前国内对于鱼类毒性试验研究较为单一，研究较多的是急性毒性试验，具体指机体(人或实验动物)一次(或24小时内多次)接触外来化合物之后所引起的中毒效应，然而一种毒性试验不能起到一个综合评价水质的方法，通过几种毒性试验的试验结果综合评价会使得试验结果更有说服力。
鱼类毒性试验是常用的生物毒性评价方法之一，能够在一定程度上综合反映出水体的污染状况及污染物的联合毒性，适于测定工业废水的实际毒性，试验取值可作为对水体进行卫生综合评价的指标，鱼类毒性试验简单、易得、相对直观，适用于突发性污染事件。目前广泛应用于江、河、湖、海等水域环境调查以及印染、造纸、个人护理用品、农药等废水的毒性检测。但是国内鱼类毒性研究涉及较多的是淡水领域，试验所选用的鱼种通常都是淡水鱼，对于海水介质领域暂未涉及，为保护海洋生态环境，寻找适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法，建立符合我国海洋环境保护的海洋水质的水生生物毒性测试方法迫在眉睫。
发明内容
目前国内对于鱼类毒性试验研究较为单一，研究较多的是急性毒性试验，国内鱼类毒性研究涉及较多的是淡水领域，试验所选用的鱼种通常都是淡水鱼，目前还没有适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法，迫切需要建立符合海洋水质的水生生物毒性测试方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种海洋鱼类水生态毒性试验方法，包括以下步骤：
(1)选择虾虎鱼作为试验的鱼类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养；
(2)待测水样储备液的准备；
(3)首先进行预试验，找出合理范围的浓度梯度；其次确定一个浓度范围进行正式试验，设置差距较小的浓度梯度进行正式试验；
(4)以海水作为对照组，待测水样作为试验组，同时进行虾虎鱼的急性毒性和慢性毒性试验，急性毒性试验分别在0，24，48，72，96小时后观察虾虎鱼的死亡率；慢性毒性试验分别在0，1，2，3，4，5，6，7天后观察虾虎鱼的死亡及各项指标变化；
(5)绘制虾虎鱼死亡率曲线及毒性试验过程中的虾虎鱼各项指标变化；
(6)将待测水样造成的虾虎鱼死亡率及通过观察生物毒性试验过程中的体征情况来判断水质毒性的大小。
上述方法中，所述的标准水是盐度在25‰-30‰浓度的海水。
上述方法中，试验前虾虎鱼需驯养一段时间，使其适应试验环境，待其状态稳定后开始试验。
上述方法中，试验前1天对虾虎鱼禁止喂食，试验过程中禁止喂食。
上述方法中，对待测水样进行一个范围缩小的预试验，预试验后确定差距较小的浓度范围进行正式试验，进一步缩小浓度梯度进行考察研究。
上述方法中，进行虾虎鱼急性毒性试验时，每组虾虎鱼数量为10尾，设置两组平行；进行慢性毒性试验时，每组虾虎鱼数量为10尾，设置四组平行；其中，每组对照试验所用的虾虎鱼的大小相同，筛选出同等大小的虾虎鱼进行毒性试验，确保试验的准确性。
上述方法中，对待测水样进行生物毒性试验时，每组试验设定多组平行样，取其平均值，减少试验误差。
上述方法中，进行生物毒性试验时，保证对照组和试验组的水质条件(温度、溶解氧、pH等)不变，排除外在因素对试验结果的影响。
上述方法中，毒性试验过程中需要测溶解氧、pH、温度等，用这些指标判断水质，把指标控制在正常的范围内以排除这些因素对试验造成的影响。
一种检测海洋水生态毒性的方法，通过上述海洋鱼类水生态毒性试验方法实现。
本发明的有益效果在于：利用敏感性水生生物做毒性试验探究海洋水质的毒性，根据此试验判断当下海洋环境中废水的排放对水生生物是否具有危害性，建立海洋介质毒性试验方法，检测不同种类的海洋水质对于各类水生生物的影响，为海水检测制定标准提供依据。
附图说明
图1是萘对虾虎鱼的96h急性毒性效应。
图2是硫酸钠对虾虎鱼的96h急性毒性效应。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
以下实例中选用船舶尾气脱硫废水中常见的污染物萘和硫酸钠为毒物，利用本发明建立的生物毒性方法进行毒性试验测试，探究船舶尾气脱硫废液的海洋环境毒性效应。
具体试验步骤如下：
(1)选择虾虎鱼作为毒性试验的鱼类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养，驯养七天，驯养期间，给虾虎鱼喂食，定期清理水中的杂物，每1-2天换一次水，每次换水量控制在1/3左右，试验开始前一天及试验过程中禁止喂食。
(2)制备待测水样储备液，试验过程中按需要将其稀释成试验所需的浓度。
(3)急性毒性试验：小心地将虾虎鱼从驯养容器中转移至各试验组装有1.5升海水的方体缸中，每个试验组放入10尾虾虎鱼，并设置两组平行。
慢性毒性试验：小心地将虾虎鱼从驯养容器中转移至各试验组装有800毫升海水的石英容器中，每个试验组放入10尾虾虎鱼，并设置四组平行。
(4)以海水水样作为对照组，待测水样作为试验组，进行虾虎鱼的毒性试验，首先进行预试验，后再进行正式试验；通过预试验不断地缩小浓度梯度，最后选取合适的浓度范围进行正式试验；
(5)利用预试验筛选出的浓度梯度做毒性试验的正式试验：
设置急性毒性试验萘的浓度为：0μg/L、20μg/L、35.6μg/L、63.37μg/L、112.8μg/L、200μg/L，硫酸钠的浓度为：0g/L、3g/L、4.23g/L、5.96g/L、8.41g/L、12g/L；急性毒性试验采用流水式，调节水流流速为20mL/min，试验进行96小时，在试验开始时测量温度、pH和溶解氧，之后每隔24小时测量。保证温度为23±1℃、pH为7.8±0.2、溶解氧大于60％。试验期间保持足够的光照，试验中及时清理虾的粪便，及时捞出死亡的虾虎鱼。
设置慢性毒性试验萘的浓度为：0μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L，硫酸钠浓度为：0g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L；慢性毒性试验采用半静态式，试验进行7天，试验时每隔24小时从每个烧杯中吸出150毫升溶液并加入相同量、相同浓度的新配制的溶液，试验期间保持足够的光照，及时清理虾虎鱼的粪便，及时捞出死亡的虾虎鱼。
(6)试验过程中记录虾虎鱼的剩余量。其中，慢性毒性试验开始和结束时分别测量虾虎鱼的体长、体重，溶解氧、pH、温度等，并对数据进行方差分析，并在试验过程中仔细查看虾虎鱼的状况，结合生长等生物学指标，评判待测水样污染物的分布、积累和释放情况。急性毒性试验过程中定期测量水中溶解氧、pH、温度等，保证溶解氧、pH、温度满足毒性试验的条件。
(7)绘制虾虎鱼死亡率曲线及毒性试验过程中的虾虎鱼各项指标变化。
(8)以虾虎鱼死亡率及虾虎鱼各项体征变化情况表示水样的水质毒性，为正确评价污染物对海洋生物的毒性效应，制定海水污染物风险评价方法提供理论依据。
实施例1
在不同萘浓度：0μg/L、20μg/L、35.6μg/L、63.37μg/L、112.8μg/L、200μg/L下，测试虾虎鱼急性毒性试验过程中水质条件变化，包括pH、溶解氧、温度，如表1所示，萘对虾虎鱼的急性毒性效应如图1所示。
表1：萘对鱼类急性毒性的水质参数
实施例2
在不同硫酸钠浓度：0g/L、3g/L、4.23g/L、5.96g/L、8.41g/L、12g/L下，测试虾虎鱼急性毒性试验过程中水质条件变化，包括pH、溶解氧、温度，如表2所示；硫酸钠对虾虎鱼的急性毒性效应如图2所示。
表2：硫酸钠对鱼类急性毒性的水质参数
根据实施例1和2的虾虎鱼急性毒性试验数据计算可得：萘对虾虎鱼的96h LC50为100.23μg/L，其95％置信区间范围为77.77～129.15μg/L，由该数据可知萘对于虾虎鱼为极毒毒性。硫酸钠对虾虎鱼的96h LC50为7.55g/L，其95％置信区间范围为7.25～8.90g/L，由数据可知硫酸钠对虾虎鱼为低等毒性。通过测量试验中的pH值、溶解氧和温度，试验数据如表1和表2所示，pH值、溶解氧和温度都在合理的范围内小幅波动，符合虾虎鱼的生长条件，同时说明毒物浓度是影响试验结果的单一因素，不受其他因素的影响，证明试验的可行性。
实施例3
试验进行7天后，在不同萘浓度为：0μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L下，虾虎鱼慢性毒性试验过程中虾虎鱼的存活数量、体重和体长变化如表3和表4所示。
表3：虾虎鱼存活数量
表4：虾虎鱼体重/体长变化
实施例4
试验进行7天后，在不同硫酸钠浓度为：0g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L下，虾虎鱼慢性毒性试验过程中虾虎鱼的存活数量、体重和体长变化如表5和表6所示。
表5：虾虎鱼存活数量
表6：虾虎鱼体重/体长变化
根据实施例3和4的虾虎鱼慢性毒性试验数据分析，试验结束时，对照组的鱼存活率满足高于90％的条件，且试验前后对照组的鱼体重均有增长，说明本次试验结果有效。首先，从萘对虾虎鱼的慢性毒性试验数据可得，萘对虾虎鱼的NOEC为20μg/L。试验过程中虾虎鱼的平均体重有所增加，试验前平均体重为1.85g，体重范围在1.79～1.91g之间。试验后平均体重为2.05g，体重范围在1.90～2.19g之间，虾虎鱼体重平均增加量约为0.2g。试验过程中虾虎鱼的平均体长略微增加，试验前平均体长为3.133cm，整体体长范围在3.006～3.260cm之间，试验后平均体长为3.250cm，整体体长范围在3.140～3.360cm之间，虾虎鱼平均体长增长量为0.117cm。其次，从硫酸根对虾虎鱼的毒性试验数据可得，硫酸钠对虾虎鱼的NOEC为1g/L，试验过程中虾虎鱼的平均体重有所增加，试验前平均体重为1.897g，体重变化范围在1.82～1.97g之间，试验后平均体重为2.05g，体重变化范围在1.89～2.20g之间，虾虎鱼体重平均增加量约为0.15g。试验过程中虾虎鱼的平均体长略微增加，试验前平均体长为3.200cm，整体体长范围在3.024～3.376cm之间，试验后平均体长为3.300cm，整体体长范围在3.080～3.520cm之间，虾虎鱼平均体长增长量为0.1cm。通过试验我们发现，毒性试验过程中虾虎鱼的体重和体长的变化量随著毒物浓度的升高而逐渐减小。
具体实施例中，检测船舶尾气脱硫洗涤水中主要污染物对虾虎鱼的毒性试验研究，可以发现，不管是毒物硫酸根和多环芳烃萘，均可对虾虎鱼造成强烈的刺激，高浓度硫酸钠和萘对水生态系统造成一定影响，对其生长发育造成不良影响，可能产生畸变，甚至导致鱼类死亡。由此可见，脱硫洗涤水的排放会对水生态系统造成一定的危害作用，这不仅会影响水生生物的正常生长、发育，或死亡，并且毒物在生物体内蓄积，通过食物链的关系，毒物最终会进入到食物链顶端的我们人类，从而对人类的身体健康也会产生影响。总之，通过本实施例试验研究结果为进行船舶尾气脱硫洗涤水污染物的危险性评价、制定水质标准和环境卫生标准提供了依据，也对评判受试污染物对试验动物的致癌性提供一定的参考价值。
上述所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的包含范围之内。
Claims (2)
1.一种海洋鱼类水生态毒性试验方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)在与待测水样水质条件相同的盐度在25‰-30‰浓度的海水中驯养虾虎鱼七天，期间喂食，定期清理水中杂物，每1-2天换一次水，每次换水量控制在容器容量的1/3，试验开始前一天禁食；
(2)以海水为对照组、待测水样为试验组，在不同毒物浓度梯度条件下进行急性毒性试验和慢性毒性试验，试验过程中虾虎鱼禁止喂食，及时清理粪便、捞出死亡鱼体，保持对照组和试验组水质条件不变、鱼体大小相同，光照充足；其中：
所述急性毒性试验为：驯养后的虾虎鱼每组数量为10尾装入1.5升海水的容器中，每个毒物浓度梯度设置两组平行，采用流水式，水流流速为20mL/min，试验时间为96小时，保持温度为22-25℃、pH为7.6-8.0、溶解氧大于60％，并分别在0、24、48、72和96小时观察记录水质指标pH、溶解氧和温度和虾虎鱼生长指标存活数量、体重和体长的变化；
所述慢性毒性试验为：驯养后的虾虎鱼装入800毫升海水的容器中，每组虾虎鱼数量为10尾，每个毒物浓度梯度设置四组平行，采用半静态式，试验时间为7天，每间隔24小时分别从每个容器中取出150毫升溶液，再加入150毫升与试验开始设置浓度梯度相同浓度的溶液，分别在0、1、2、3、4、5、6和7天观察记录水质指标pH、溶解氧和温度和虾虎鱼生长指标存活数量、体重和体长的变化；
(3)对步骤(2)中所得数据进行分析，判断水质毒性；
所述毒物包括硫酸钠和萘，所述急性毒性试验中萘的浓度梯度为0μg/L、20μg/L、35.6μg/L、63.37μg/L、112.8μg/L、200μg/L，硫酸钠的浓度梯度为0g/L、3g/L、4.23g/L、5.96g/L、8.41g/L、12g/L；所述慢性毒性试验中萘的浓度梯度为0μg/L、20μg/L、40μg/L、60μg/L、80μg/L、100μg/L，硫酸钠的浓度梯度为0g/L、1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、8g/L。
2.一种检测海洋水生态毒性的方法，其特征在于，通过权利要求1所述海洋鱼类水生态毒性试验方法实现。
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