CN111524559B - 一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法 - Google Patents

一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法，属于农药数据分析技术领域，所述分析方法，包括以下步骤：1)以不同浓度的被试化学物作用于被试生物进行慢性毒性试验，测定获得若干组终点效应数据；2)将步骤1)中获得的若干组终点效应数据进行归类；3)利用步骤2)归类后的数据构建假设检验模型，根据假设检验模型统计量的显著性取值结果，同一组终点效应数据中，选择未产生显著效应的最高被试化学物浓度确定为组内NOEC；在不同组终点效应数据中，选择NOEC数值最小的组的NOEC为所述被试化学物对所述被试生物的最大无作用浓度。本发明所述分析方法能够保证分析能效和准确性。

Description

一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法
技术领域
本发明属于农药数据分析技术领域，尤其涉及一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法。
背景技术
研究化学物的毒性效应是预测化学物安全接触限量的必要手段，无可观察效应浓度(non-observed effect concentration，NOEC)是其中一项重要参数。NOEC是指与对照相比，在一定时间内对试验生物未产生显著效应的最高受试物浓度。该指标是评价化学物慢性毒性影响的重要指标，是制订化学物卫生标准不可或缺的依据。因NOEC与阈剂量(产生损害作用的最小剂量)非常接近，需要可靠的试验数据和敏感准确的统计方法支撑数据分析。现有技术中，常用差异显著性分析和多重比较(多用Dunnet-t检验)，通过比较处理组平均值与对照组平均值之间的差异显著性，决定处理浓度组是否为NOEC；也有直接以EC1(1％有效抑制浓度)作为NOEC临界值。上述方法或简单粗糙，或对数据性质缺乏考量，忽略数据类型、单调性、正态性和方差齐性对分析方法适用性的要求，一味套用参数统计方法，无法保证统计分析的能效和结果的准确。
因此，鉴于现有技术的缺陷，亟需一种基于试验数据性质判断的统计策略NOEC进行有效的分析。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法；所述分析方法能够保证分析能效和准确性。
本发明提供了一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法，包括以下步骤：
1)以不同浓度的被试化学物作用于被试生物进行慢性毒性试验，测定获得若干组终点效应数据；
2)将步骤1)中获得的若干组终点效应数据按照以下顺序进行归类：①数据具有单调性；②数据为不具有单调性的二分类变量；③数据为不具有单调性的连续型变量，数据符合正态分布且方差齐性；④数据为不具有单调性的连续型变量，数据仅符合正态分布；⑤数据为不具有单调性的连续型变量，数据不符合正态分布；
3)利用步骤2)归类后的数据构建假设检验模型，根据假设检验模型统计量的显著性取值结果，同一组终点效应数据中，选择未产生显著效应的最高被试化学物浓度确定为组内NOEC；在不同组终点效应数据中，选择NOEC数值最小的组的NOEC为所述被试化学物对所述被试生物的最大无作用浓度；
当数据符合①时，采用趋势检验模型；
当数据符合②时，采用非参数成对比较检验模型；
当数据符合③时，采用成对比较检验模型；
当数据符合④时，采用异方差成对比较检验模型；
当数据符合⑤时：采用非参数成对比较检验模型。
优选的，所述被试生物包括动物。
优选的，所述动物包括昆虫和鸟类。
优选的，当所述被试生物为赤眼蜂时，所述终点效应数据包括产卵量、羽化率、成蜂存活时间、寄生率、死亡率和孵化率中的一种或几种。
优选的，当所述被试生物为赤眼蜂时，步骤1)中所述被试化学物作用于赤眼蜂的方法为卵卡浸渍法。
优选的，当所述被试生物为鹌鹑时，所述终点效应数据包括14日存活率、胚胎成活率、孵化率、羽化率、饲喂量、体重、日均产蛋数、平均产蛋量和死胎比例中的一种或几种。
优选的，当所述被试生物为鹌鹑时，步骤1)中所述被试化学物作用于鹌鹑的方法为饲喂鹌鹑掺有被试化学物的饲料。
优选的，步骤1)中所述不同浓度包括4～10个不同的浓度。
优选的，所述趋势检验模型包括Jonckheere-Terpstra检验；所述非参数成对比较检验模型包括基于Bonferroni-Holm校正的Fisher精确检验；所述成对比较检验模型包括Dunnett's检验；所述异方差成对比较检验模型包括Tamhane-Dunnett检验；所述非参数成对比较检验模型包括基于Bonferroni-Holm校正的Mann-Whitney检验。
本发明的有益效果:本发明提供的一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法，通过对慢性毒性试验的终点效应数据归类，不同类型的数据采用不同的趋势检验模型，能够保证分析能效和准确性。
附图说明
图1为本发明的NOEC分析方法流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法，包括以下步骤：
1)以不同浓度的被试化学物作用于被试生物进行慢性毒性试验，测定获得若干组终点效应数据；
2)将步骤1)中获得的若干组终点效应数据按照以下顺序进行归类：①数据具有单调性；②数据为不具有单调性的二分类变量；③数据为不具有单调性的连续型变量，数据符合正态分布且方差齐性；④数据为不具有单调性的连续型变量，数据仅符合正态分布；⑤数据为不具有单调性的连续型变量，数据不符合正态分布；
3)利用步骤2)归类后的数据构建假设检验模型，根据假设检验模型统计量的显著性取值结果，同一组终点效应数据中，选择未产生显著效应的最高被试化学物浓度确定为组内NOEC；在不同组终点效应数据中，选择NOEC数值最小的组的NOEC为所述被试化学物对所述被试生物的最大无作用浓度；当数据符合①时，采用趋势检验模型；当数据符合②时，采用非参数成对比较检验模型；当数据符合③时，采用成对比较检验模型；当数据符合④时，采用异方差成对比较检验模型；当数据符合⑤时：采用非参数成对比较检验模型。
在本发明中，以不同浓度的被试化学物作用于被试生物进行慢性毒性试验，测定获得若干组终点效应数据。本发明对所述被试化学物的种类没有特殊限定，任何种类的化学物均可，可以为单一的化合物，也可以为多组分的化学物质；在本发明具体实施过程中，所述化学物通常为农药，例如果乐、吡虫啉、啶虫脒和2甲4氯等。在本发明中，所述不同浓度优选的包括4～10个不同的浓度，更优选的包括6个不同的浓度，优选的包括一个空白对照和5个不同的被试化学物的浓度。本发明对所述被试化学物设定的不同浓度之间的差值或比值没有特殊限定，可以采用等差、等比设置，也可以采用无规律设置。本发明对所述被试生物的种类没有特殊限定，优选为动物，更优选的包括昆虫和鸟类；在本发明具体实施过程中，以赤眼蜂和鹌鹑为例。
在本发明中，当所述被试生物为赤眼蜂时，所述终点效应数据包括产卵量、羽化率、成蜂存活时间、寄生率、死亡率和孵化率中的一种或几种。在本发明具体实施过程中，所述终点效应数据包括产卵量、羽化率和成蜂存活时间。在本发明中，当所述被试生物为赤眼蜂时，所述被试化学物以果乐和吡虫啉为例；所述被试化学物作用于赤眼蜂的方法优选为卵卡浸渍法，本发明对所述卵卡浸渍法的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的卵卡浸渍法操作即可，详细步骤参见实施例记载。
在本发明中，当所述被试生物为鹌鹑时，所述终点效应数据包括14日存活率、胚胎成活率、孵化率、羽化率、饲喂量、体重、日均产蛋数、平均产蛋量和死胎比例中的一种或几种。在本发明具体实施过程中，所述终点效应数据包括体重、日均产蛋数和死胎比例。在本发明中，当所述被试生物为鹌鹑时，所述被试化学物以啶虫脒和2甲4氯为例；所述被试化学物作用于鹌鹑的方法为饲喂鹌鹑掺有被试化学物的饲料。在本发明中，优选的饲喂鹌鹑掺有被试化学物的饲料40～48d，统计体重、日均产蛋数、平均产蛋量和死胎比例。
本发明在获得的若干组终点效应数据后，将所述若干组终点效应数据按照以下顺序进行归类：①数据具有单调性；②数据为不具有单调性的二分类变量；③数据为不具有单调性的连续型变量，数据符合正态分布且方差齐性；④数据为不具有单调性的连续型变量，数据仅符合正态分布；⑤数据为不具有单调性的连续型变量，数据不符合正态分布。在本发明中，优选的对所述终点效应数据分析后归类；所述分析包括数据类型、单调性、正态性和方差齐性；所述分析的方法采用现有技术中的分析方法进行；其中数据类型分为二分类变量和连续型变量两类；单调性通过剂量反应关系散点图直观判断；数据正态性通过Shapiro-Wilk Test W检验；方差齐性通过Levene检验。
本发明在对所述终点效应数据归类后，利用归类后的数据构建假设检验模型，根据假设检验模型统计量的显著性取值结果，同一组终点效应数据中，选择未产生显著效应的最高被试化学物浓度确定为组内NOEC；在不同组终点效应数据中，选择NOEC数值最小的组的NOEC为所述被试化学物对所述被试生物的最大无作用浓度。
在本发明中，当数据符合①时，采用趋势检验模型；当数据符合②时，采用非参数成对比较检验模型；当数据符合③时，采用成对比较检验模型；当数据符合④时，采用异方差成对比较检验模型；当数据符合⑤时：采用非参数成对比较检验模型。在本发明中，所述趋势检验模型优选的包括Jonckheere-Terpstra检验；所述非参数成对比较检验模型优选的包括基于Bonferroni-Holm校正的Fisher精确检验；所述成对比较检验模型优选的包括Dunnett's检验；所述异方差成对比较检验模型优选的包括Tamhane-Dunnett检验；所述非参数成对比较检验模型优选的包括基于Bonferroni-Holm校正的Mann-Whitney检验。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
果乐和吡虫啉对赤眼蜂的NOEC测定
第一步，慢性毒性试验数据的获取。获取化学物慢性毒性试验数据，数据包括试验设计(处理与重复)、浓度水平和被试物终点效应等。
赤眼蜂是目前国内外应用最广、影响最大的天敌昆虫之一。而化学农药作为控制虫害的重要手段，在消灭害虫的同时也可能对其天敌产生毒副作用。通过开展农药对玉米螟赤眼蜂的慢性毒性影响试验，明确农药对天敌的安全性。试验以赤眼蜂为被试生物，乐果和吡虫啉为被试化学物，终点效应为产卵量、羽化率和成蜂存活时间。每个被试物试验组有6个处理浓度(含空白对照1个和被试物5个浓度，详见表1)。
采用卵卡浸渍法，每个指形管放入1.0cm×2.0cm米蛾卵卡(约100粒卵)后引入羽化4～6h成蜂约20头，供其寄生24h后去除成蜂。144h后，将卵卡分别在不同浓度供试药液中浸5s，取出晾干后，装入指形管中，用黑布封口后放回培养箱中至成蜂羽化完毕。以0.1％曲拉通(Triton X－100)水溶液作空白对照，每处理重复9次，分为3组，分别用于观察3个终点效应，即每个终点效应有3个重复。第1组用于调查产卵量；第2组用于检查成蜂羽化数，计算成蜂羽化率(羽化率＝成蜂羽化数/黑卵粒数×100％)；第3组用于调查成蜂存活时间。如果羽化出蜂数量小于30头或活力低无法自主转移至新指形管中，则不进行寄生率和存活时间调查。
第二步，数据性质的解析。对终点效应数据的数据类型、单调性、正态性和方差齐性按现有技术分别进行分析，明确数据的性质。数据类型分为二分类变量和连续型变量两类；单调性通过剂量反应关系散点图直观判断；数据正态性通过Shapiro-Wilk Test W检验；方差齐性通过Levene检验。
数据性质可分为以下五类：(1)第一类数据性质：数据具有单调性；(2)第二类数据性质：数据为不具有单调性的二分类变量；(3)第三类数据性质：数据为不具有单调性的连续型变量，数据符合正态分布且方差齐性；(4)第四类数据性质：数据为不具有单调性的连续型变量，数据仅符合正态分布；(5)第五类数据性质：数据为不具有单调性的连续型变量，数据不符合正态分布。
本实施例中，乐果试验组下产卵量数据符合第一类数据性质：连续型变量，符合单调性；羽化率数据符合第二类数据性质：二分类变量，不符合单调性；成蜂存活时间数据符合第三类数据性质：连续型变量，不符合单调性，数据符合正态性、方差齐性。
吡虫啉试验组下产卵量数据符合第四类数据性质：连续型变量，不符合单调性，数据符合正态性，方差不齐；羽化率数据符合第一类数据性质：二分类变量，符合单调性；成蜂存活时间数据符合第五类数据性质：连续型变量，不符合单调性，非正态。通过明确上述数据性质，以便确定分析方法。
第三步，基于数据性质，构建NOEC分析假设检验模型，筛选出与对照组差异不显著的处理组。
NOEC的解析可视作是“证明毒害存在”的过程。本质上，除非数据提供足够的证据来得出毒性结论，否则被试物则被假定为无毒。假设检验模型不仅能通过总体特征假设、抽样统计推断对被试物的毒性做出评估，而且为各种数据类型提供了丰富的参数或非参数检验方案，即使在因变量数据不具备单调性、分布不易判定或不符合正态、方差齐性假设的情况下，该模型依然有适用的解决方案。现有技术常用参数方法(多用Dunnet-t检验)，通过比较处理组平均值与对照组平均值之间的差异显著性，决定处理浓度组是否为NOEC，忽视因变量数据类型、单调性和数据分布特征，无法保证统计功效和结果的生物学意义。而基于数据性质判断的假设检验模型则可避免现有方法的盲目性，在综合数据性质和方法统计属性的前提下推断被试物的剂量反应关系。
假设检验模型的具体步骤如下：
当数据符合第一类数据性质，采用趋势检验模型。针对乐果试验组下产卵量数据和吡虫啉试验组下羽化率数据，采用Jonckheere-Terpstra检验。
当数据符合第二类数据性质，采用非参数成对比较检验模型。针对乐果试验组下羽化率数据，采用基于Bonferroni-Holm校正的Fisher精确检验。
当数据符合第三类数据性质，采用成对比较检验模型。针对乐果试验组下成蜂存活时间数据，采用Dunnett's检验。
当数据符合第四类数据性质，采用异方差成对比较检验模型。针对吡虫啉试验组下产卵量数据，采用Tamhane-Dunnett检验。
当数据符合第五类数据性质：采用非参数成对比较检验模型。针对吡虫啉试验组下成蜂存活时间数据，采用基于Bonferroni-Holm校正的Mann-Whitney检验。
上述检验模型可用SPSS软件进行检验，涉及Bonferroni-Holm校正的由分析人员自行完成。
按上述模型，根据各检验模型统计量的显著性取值，判断各终点效应揭示的NOEC。针对乐果，经产卵量计算赤眼蜂慢性毒性NOEC为100mg/L；经羽化率计算赤眼蜂慢性毒性NOEC为200mg/L、经成蜂存活时间计算赤眼蜂慢性毒性NOEC为400mg/L。针对吡虫啉，经产卵量计算赤眼蜂慢性毒性NOEC为80mg/L；经羽化率计算赤眼蜂慢性毒性NOEC为40mg/L、经成蜂存活时间计算赤眼蜂慢性毒性NOEC为160mg/L。
表1乐果和吡虫啉对赤眼蜂产卵量、羽化率及成蜂存活时间的影响
Figure BDA0002463460120000081
第四步，NOEC的分析确定。根据统计检验结果，单一组终点效应，将未产生显著效应的最高受试物浓度确定为组内的NOEC；多组终点效应综合评价，将多个单一组终点效应NOEC中最小的受试物浓度确定为NOEC。
综合各终点效应在试验浓度下的检验分析结果，乐果的NOEC为100mg/L；吡虫啉的NOEC为40mg/L。
验证：用浓度为90mg/L的乐果和空白对照再进行试验，调查赤眼蜂产卵量，两者无显著差异。
用浓度为35mg/L吡虫啉和空白对照再进行试验，调查赤眼蜂羽化率，两者无显著差异。
实施例2
第一步，慢性毒性试验数据的获取。
以鹌鹑慢性毒性(生长与繁殖)影响试验为例。农药在农业生产中的普遍使用，对在农田觅食为主的鸟类产生了巨大的影响。鸟类接触低剂量或毒性略低的农药，虽然不引起死亡，但其生长和繁殖等行为会受影响。通过评估鸟类等环境毒理学模式生物毒性试验结果，结合田间暴露水平，外推到野生环境，可更全面了解农药的环境风险。
试验以鹌鹑为被试生物，啶虫脒和2甲4氯为被试化学物，终点效应为体重、日均产蛋数和死胎比例。每个被试物试验组有6个处理浓度(含空白对照1个和被试物5个浓度，详见表2记载)。
选用龄期为30天、体重90～110g、健康活泼的鹤鹑供试。每笼10只，雌雄分别饲养。长期给鹌鹑饲喂相同含量的染毒饲料，每天2次，投饲料量为平均每只每天20g。饲喂后记录各处理鹌鹑体重；统计40～48天内的产蛋数；收集45～50天的蛋，用禽类专用孵化箱各处理分别孵化，统计死胎比例。本实施例中，终点效应数据为体重、产蛋数和死胎比例。
第二步，数据性质的解析。
对终点效应数据的数据类型、单调性、正态性和方差齐性按现有技术分别进行分析，明确数据的性质。
本实施例中，啶虫脒试验组下体重数据符合第三类数据性质：连续型变量，不符合单调性，数据符合正态性、方差齐性；产蛋数数据符合第五类数据性质：连续型变量，不符合单调性，非正态；死胎比例数据符合第二类数据性质：二分类变量，不符合单调性。
2甲4氯试验组下体重数据符合第四类数据性质：连续型变量，不符合单调性，数据符合正态性，方差不齐；产蛋数数据符合第一类数据性质：连续型变量，符合单调性；死胎比例数据符合第一类数据性质：二分类变量，符合单调性。通过明确上述数据性质，以便确定分析方法。
第三步，基于数据性质，构建NOEC分析假设检验模型，筛选出与对照组差异不显著的处理组。
假设检验模型的具体步骤如下：
当数据符合第一类数据性质，采用趋势检验模型。针对2甲4氯试验组下产蛋数数据和死胎比例数据，采用Jonckheere-Terpstra检验。
当数据符合第二类数据性质，采用非参数成对比较检验模型。针对啶虫脒试验组下死胎比例数据，采用基于Bonferroni-Holm校正的Fisher精确检验。
当数据符合第三类数据性质，采用成对比较检验模型。针对啶虫脒试验组下体重数据，采用Dunnett's检验。
当数据符合第四类数据性质，采用异方差成对比较检验模型。针对2甲4氯试验组下体重数据，采用Tamhane-Dunnett检验。
当数据符合第五类数据性质：采用非参数成对比较检验模型。针对啶虫脒试验组下产蛋数数据，采用基于Bonferroni-Holm校正的Mann-Whitney检验。
上述检验模型可用SPSS软件进行检验，涉及Bonferroni-Holm校正的由分析人员自行完成。
按上述模型，根据各检验模型统计量的显著性取值，判断各终点效应揭示的NOEC。针对啶虫脒，经体重、产蛋数和死胎比例计算鹌鹑慢性毒性NOEC为130mg/kg饲料。针对2甲4氯，经体重计算鹌鹑慢性毒性NOEC为25mg/kg饲料；经产蛋数计算鹌鹑慢性毒性NOEC为500mg/kg饲料、经死胎比例计算鹌鹑慢性毒性NOEC为25mg/kg饲料。
表2啶虫脒和2甲4氯对鹌鹑体重、产蛋数和死胎比例的影响
Figure BDA0002463460120000101
Figure BDA0002463460120000111
第四步，NOEC的分析确定。
综合各终点效应在试验浓度下的检验分析结果，啶虫脒的NOEC为130mg/kg饲料；2甲4氯的NOEC为25mg/kg饲料。
验证：用浓度为125mg/L啶虫脒和空白对照再进行试验，调查鹌鹑体重、产蛋数和死胎比例，无显著差异。
用浓度为20mg/L2甲4氯和空白对照再进行试验，调查鹌鹑体重，两者无显著差异。
由上述实施例可知，本发明提供的分析方法，通过对慢性毒性试验的终点效应数据归类，不同类型的数据采用不同的趋势检验模型，能够保证分析能效和准确性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种化学物对生物的最大无作用浓度的分析方法，由以下步骤组成：
1)以不同浓度的被试化学物作用于被试生物进行慢性毒性试验，测定获得若干组终点效应数据；所述不同浓度采用无规律设置；
2)将步骤1)中获得的若干组终点效应数据按照以下顺序进行归类：①数据具有单调性；②数据为不具有单调性的二分类变量；③数据为不具有单调性的连续型变量，数据符合正态分布且方差齐性；④数据为不具有单调性的连续型变量，数据仅符合正态分布；⑤数据为不具有单调性的连续型变量，数据不符合正态分布；对所述终点效应数据进行分析后归类；所述分析为数据类型、单调性、正态性和方差齐性；
3)利用步骤2)归类后的数据构建假设检验模型，根据假设检验模型统计量的显著性取值结果，同一组终点效应数据中，选择未产生显著效应的最高被试化学物浓度确定为组内NOEC；在不同组终点效应数据中，选择NOEC数值最小的组的NOEC为所述被试化学物对所述被试生物的最大无作用浓度；
当数据符合①时，采用趋势检验模型；
当数据符合②时，采用非参数成对比较检验模型；
当数据符合③时，采用成对比较检验模型；
当数据符合④时，采用异方差成对比较检验模型；
当数据符合⑤时：采用非参数成对比较检验模型。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述被试生物包括动物。
3.根据权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述动物包括昆虫和鸟类。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，当所述被试生物为赤眼蜂时，所述终点效应数据包括产卵量、羽化率、成蜂存活时间、寄生率、死亡率和孵化率中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其特征在于，当所述被试生物为赤眼蜂时，步骤1)中所述被试化学物作用于赤眼蜂的方法为卵卡浸渍法。
6.根据权利要求3所述的分析方法，其特征在于，当所述被试生物为鹌鹑时，所述终点效应数据包括14日存活率、胚胎成活率、孵化率、羽化率、饲喂量、体重、日均产蛋数、平均产蛋量和死胎比例中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的分析方法，其特征在于，当所述被试生物为鹌鹑时，步骤1)中所述被试化学物作用于鹌鹑的方法为饲喂鹌鹑掺有被试化学物的饲料。
8.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，步骤1)中所述不同浓度包括4～10个不同的浓度。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述趋势检验模型包括Jonckheere-Terpstra检验；所述非参数成对比较检验模型包括基于Bonferroni-Holm校正的Fisher精确检验；所述成对比较检验模型包括Dunnett's检验；所述异方差成对比较检验模型包括Tamhane-Dunnett检验；所述非参数成对比较检验模型包括基于Bonferroni-Holm校正的Mann-Whitney检验。
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