CN105784932A - 一种农药对蜜蜂的风险评价方法 - Google Patents

一种农药对蜜蜂的风险评价方法 Download PDF

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何明远
薛白
王长宾
朱志峰
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Abstract

本发明公开了一种农药对蜜蜂的风险评价方法，方法步骤如下：(1)试验用蜂为1～3日龄的幼蜂；(2)进行预试验：(3)正试验，(4)试验开始后连续10天观察幼蜂的死亡数、亚致死作用、异常行为；(5)药剂对幼蜂NOEC值的测定。试验方法科学可行，通过此方法，来检测环境中的农药，从而保护有益生物蜜蜂，保护生态环境。

Description

一种农药对蜜蜂的风险评价方法
技术领域
本发明涉及农药风险评价方法，具体涉及一种农药对蜜蜂的风险评价方法。
背景技术
蜜蜂是农业生产中主要的授粉物种。蜜蜂授粉可减少农药化肥的施用，适宜生态农业和绿色农业的发展；对维护农业生物多样性、稳定性具有重要生态功能。有研究显示：全球约87.5％的开花植物依靠昆虫授粉，其中87种为主要粮食作物，占世界粮食总产量的35％，而蜜蜂约占授粉昆虫总数的80％，无论是人工饲养还是野生存在，都在作物授粉方面发挥着巨大作用。同时蜜蜂授粉所产生的经济效益也相当可观，每年仅我国由蜜蜂传花授粉带来的经济效益就高达150亿元。因此，蜜蜂具有重大的生态和经济价值。但蜜蜂对农药敏感程度极高，滥用或误用农药都将破坏蜜蜂栖息地及其食物来源，从而对蜜蜂产生严重威胁。1990年至今，因农药中毒导致蜜蜂死亡、蜂群数量骤减的现象遍及北美、欧洲、亚洲等许多国家，已成为全球普遍关注的环境污染与生物安全问题。
为保护生态系统健康，从源头控制高风险性农药对环境生物产生的潜在不良影响，我国环保部、农业部也逐渐将农药对蜜蜂生物毒性与安全性评价列为农药登记管理、农药使用环境安全管理的重要内容之一，并制定了农药对蜜蜂急性毒性试验准则。但迄今为止，我国作为农药生产和使用第一大国，并未建立完整的农药对蜜蜂安全性风险评价体系。总体来看：我国农药对蜜蜂生物安全性风险评价工作比较落后，表现在实验方法上缺乏亚慢性、慢性试验方法，评价体系缺乏立体多层次实验。
农药对蜜蜂的风险评价，是研究农药对蜜蜂种群影响的科学方式。为了正确、合理、科学地评价，各国相继制定了一系列的试验准则和评价方式。如在初级风险评估方面美国制定了农药对蜜蜂的急性接触毒性试验准则，但尚无急性经口毒性试验准则。
发明内容
本发明公开了一种农药对蜜蜂慢性10d饲喂毒性试验的方法和药剂NOEC值的测定方法，完善了农药对蜜蜂安全性评估工作方法。
本发明的实验方案为：
一种农药对蜜蜂的风险评价方法，方法步骤如下：
(1)试验用蜂为1～3日龄的幼蜂；
(2)进行预试验：以供低于试药剂LC50值设置4～8种浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行连续10天饲喂，每个浓度3次重复，每个重复10只幼蜂；
(3)正试验：根据预试验结果范围，将供试药剂先用溶剂溶解后，再用50％蔗糖水溶液稀释并配制成含药糖水连续10天对幼蜂进行饲喂；设空白对照组、溶剂对照组各15次重复，处理组10次重复，每个重复10只幼蜂；试验期间每隔24±1h更换含药糖水，每天饲喂前后用分析天平对饲喂管进行称重，以获得每24h糖水消耗量；
(4)试验开始后连续观察幼蜂的死亡数、亚致死作用、异常行为；记录各处理组每天的食物摄取量及整个实验期间的累积摄取量；
(5)药剂对幼蜂NOEC值的测定：不可见效应浓度(NOEC)值用通过方差分析得出：若与空白试验组没有显著性差异的最高浓度，即为NOEC值；或通过浓度-效应关系得出：与空白实验组相比，根据实验测试所得的浓度-效应关系，其影响程度低于空白的10％的浓度，即视为NOEC值；LOEC值的测定：最低可见效应浓度(LOEC)，通过供试物对幼蜂的毒性效应和空白对照组相比有统计学显著性差异(p＜0.05)的最低浓度，及供试物对供试蜜蜂有不利影响的最低浓度。
优选的，步骤(2)如下：进行预试验：以供试药剂LC50值的1/10～1/800设置4～8种浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行连续10天饲喂，每个浓度3次重复，每个重复10只幼蜂；
优选的，步骤(3)中，处理组以供试药剂LC50值的1/10、1/50、1/100、1/200、1/400、1/800的比例设置4～8种浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行饲喂。
优选的，步骤(1)中1～3日龄的幼蜂的收集方法为：待蜂王在新脾上产卵之日算起，间隔19日左右将封盖子脾放入小暗盒中，然后将小暗盒打小孔后放入温度控制在33±2℃，相对湿度60～80％，黑暗条件下的人工气候箱，待新蜂出房，用毛刷将其刷入幼蜂饲喂盒中，用花粉和花蜜混匀后喂食1～3天，收集幼蜂。
优选的，步骤(3)中的幼蜂进行饲喂试验在温度为33±2℃，湿度60～70％人工气候室中进行。
优选的，步骤(3)中根据预试验结果范围，将供试药剂先用溶剂溶解后，再用50％蔗糖水溶液稀释并配制成含药糖水连续10天对幼蜂进行饲喂。
本发明的有益效果：
1、试验方法科学可行。
2、为农药对蜜蜂风险评估提供方法，同时完善农药对蜜蜂整个世代影响评估方法。
3、通过此方法，来检测环境中的农药，从而保护有益生物蜜蜂，保护生态环境。
4、国内研究尚少，本发明属于创新型评价方法。本发明建立了农药对幼蜂慢性10d饲喂毒性试验方法为该领域的创新。
附图说明
图1是对照组及吡虫啉各处理组10天饲喂期间24h糖水平均消耗量趋势图；
图2是10天试验期间吡虫啉不同剂量处理组与对照组的累计死亡率对比分析图；
图3是对照组及噻虫嗪各处理组10天饲喂期间24h糖水平均消耗量趋势图；
图4是10天试验期间噻虫嗪不同剂量处理组与对照的累计死亡率对比分析图；
具体实施方式
以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的发明范围。该技术领域的技术工程师可根据上述发明的内容作出一些非本质性的改进和调整。
实施例1：
新烟碱类杀虫剂被广泛用于种子、土壤和茎叶处理，其中最主要的用途为种子包衣，用以防治地下害虫。新烟碱类杀虫剂作为内吸性杀虫剂，决定了药剂可通过植物根系转移到花粉、花蜜及吐露中，但含量较低，可能不会对采集蜂造成急性毒性影响，但是不同龄期的蜜蜂接触药剂的途径(如成蜂进食的花蜜多于花粉，幼虫则相反)和对药剂的敏感性均存在差异。哺育蜂(也叫工勤蜂)和幼虫对新烟碱类杀虫剂更为敏感。所以低剂量新烟碱类杀虫剂对蜜蜂种群发育同样存在潜在风险。
1.1供试生物
本试验使用的供试生物为意大利蜜蜂(ApismelliferaL)，由中国农业科学院蜜蜂研究所提供。饲养条件为室外培养，人工控制。试验用蜂为1～3日龄的幼蜂。
1.2幼蜂收集
按照蜜蜂生物学特性，将新巢础介绍到蜂群，工蜂蜜蜡造脾，待蜂王在新脾上产卵之日算起，间隔19日左右将封盖子脾放入小暗盒中，然后将小暗盒打小孔后放入温度控制在33±2℃，相对湿度60～80％，黑暗条件下的人工气候箱，待新蜂出房，用毛刷将其刷入幼蜂饲喂盒中，用花粉和花蜜混匀后喂食1～3天，收集足够健康幼蜂用于试验。
1.3供试药剂
97.3％吡虫啉原药由农业部农药检定所提供。
1.4主要设备及器具
蜂笼(钢制长方体框架，一面为可抽式玻璃，底部和顶部有孔，长13cm×宽6cm×高10cm)、滤纸、注射器、温湿度记录仪器、移液枪、分析天平、工业加湿器、人工气候室、烧杯、容量瓶等。
1.5试验方法
预试验：根据97.3％吡虫啉原药对蜜蜂急性经口毒性试验结果，以供试药剂LC50值的1/10、1/50、1/100、1/200、1/400、1/800设置一系列浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行连续10天饲喂，设每个处理3次重复，每个重复10只幼蜂。确定药剂对幼蜂无毒性效应范围。
正试验：根据预试验结果范围，将供试药剂先用溶剂溶解后，再用50％蔗糖水溶液稀释并配制成一系列含药糖水连续10天对幼蜂进行饲喂。试验在温度为33±2℃，湿度60～70％人工气候室中进行。设空白对照组、溶剂对照组各15次重复，处理组10次重复，每个重复10只幼蜂。试验10天期间每隔24±1h更换含药糖水，每天饲喂前后用分析天平对饲喂管进行称重，以获得每24h糖水消耗量。
1.6结果与分析
1.6.1吡虫啉对蜜蜂幼蜂10d慢性饲喂毒性试验结果
试验开始后连续10天观察幼蜂的死亡数、亚致死作用、异常行为；记录各处理组每天的食物摄取量及整个实验期间的累积摄取量；求出供试物对幼蜂的端点值，即无作用剂量值(NOEC)。
表110d试验期间糖水平均消耗量
注：D＝day天数DM＝daymean平均每天由上表1可知，空白对照组、溶剂对照组以及各吡虫啉处理组D1～D10糖水平均消耗量。空白对照组和溶剂对照组平均消耗量分别为50.29、46.92mg/bee。吡虫啉饲喂幼蜂试验剂量水平从1.25μga.i./L到3.11μga.i./L六组试验10天期间的24h糖水平均消耗量的平均值分别44.82、46.95、46.39、46.92、49.44、52.17mg/bee。
如图1所示，吡虫啉不同浓度处理组与对照组的24h糖水平均消耗量并没有显著不同，空白对照组、溶剂对照组以及吡虫啉不同浓度处理组24h糖水平均消耗量呈递减趋势，试验最后一天的24h糖水消耗量与第一天相比，24h糖水平均消耗量下降到一半或不到一半。
表2吡虫啉不同剂量对幼蜂10天饲喂期间的平均累计摄入量
注：D＝day饲喂天数
由表2可知，吡虫啉饲喂幼蜂试验的剂量水平从1.25μga.i./L到3.11μga.i./L六组的第10天平均累计摄入量分别为0.475、0.574、0.702、0.872、1.08、1.347nga.i./bee。
表3吡虫啉不同剂量条件下对幼蜂10天饲喂期间的累计死亡率
注：D＝day饲喂天数
根据10天试验期间空白对照、溶剂对照和吡虫啉不同剂量饲喂幼蜂的死亡率及行为观察，得出10天试验期间的累计死亡率，如表3。
由图2可知，不同剂量处理组的累积死亡率曲线图与两组对照比较，可以看出处理组1.25μga.i./L、1.50μga.i./L、1.80μga.i./L、2.16μga.i./L、2.59μga.i./L与空白对照试验组的累计死亡率曲线图无显著性差异，3.11μga.i./L剂量处理组与空白对照试验组的累计死亡率曲线图有显著性差异。
表4吡虫啉不同剂量对幼蜂10天试验饲喂期间的校正死亡率
注：D＝day饲喂天数；校正死亡率(％)＝(t-c/100-c)*100T＝死亡率(％)C＝对照组死亡率(％)
由表4可知，吡虫啉饲喂幼蜂试验的剂量水平从1.25μga.i./L到3.11μga.i./L六组试验期间第十天的校正死亡率分别为1％、1％、2％、3％、4.73％、8％。
药剂对幼蜂NOEC值的测定
不可见效应浓度(NoObservedEffectConcentration,NOEC)值可以用下述方法确定:(1)通过方差分析：若与空白试验组没有显著性差异的最高浓度，即为NOEC值。(本试验即采用此法)。(2)浓度-效应关系：与空白实验组相比，根据实验测试所得的浓度-效应关系，其影响程度低于空白的10％的浓度，也可以视为NOEC值。
吡虫啉的溶剂对照和空白对照做T-test的P值＝1.00>0.05，可知溶剂对照和空白对照没有显著差异，因此下表的吡虫啉不同剂量处理组应与溶剂对照做T-test分析。
表5吡虫啉不同剂量处理组与溶剂对照试验组T-test
由表5可知，吡虫啉不同剂量处理组与溶剂试验组做T-test分析，剂量3.11μga.i./L处理组的P值<0.05，该组与溶剂空白试验组有差异显著，浓度为2.59μga.i./L的P值>0.05，该组与溶剂空白试验组没有显著性差异且是最高浓度的一组，故吡虫啉对幼蜂的LOEC为3.11μga.i./L，NOEC估计值为2.59μga.i./L,即1.08nga.i./幼蜂。
实施例2：噻虫嗪对蜜蜂幼蜂慢性10d饲喂毒性试验结果
1、试验方法
预试验：根据96％噻虫嗪原药对蜜蜂急性经口毒性试验结果，以供试药剂LC50值的1/10、1/50、1/100、1/200、1/400、1/800设置一系列浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行连续10天饲喂，设每个处理3次重复，每个重复10只幼蜂。确定药剂对幼蜂无毒性效应范围。正试验：根据预试验结果范围，将供试药剂先用溶剂溶解后，再用50％蔗糖水溶液稀释并配制成一系列含药糖水连续10天对幼蜂进行饲喂。试验在温度为33±2℃，湿度60～70％人工气候室中进行。设空白对照组、溶剂对照组各15个重复，处理组10个重复，每个重复10只幼蜂。试验10天期间每隔24±1h更换含药糖水，每天饲喂前后用分析天平对饲喂管进行称重，以获得每24h糖水消耗量。
2、试验结果：
表610天试验饲喂期间的24h糖水平均消耗量
注：D＝day天数DM＝daymean平均每天
由上表可知，噻虫嗪饲喂幼蜂试验的剂量水平从2.00μga.i./L到4.98μga.i./L六组试验10天期间的24h糖水平均消耗量的平均值分别为47.32、48.06、47.94、49.33、52.72、56.24mg/bee，空白试验组的平均值49.62mg/bee,及溶剂对照实验组的平均值为48.74mg/bee。
由图3可知，噻虫嗪不同剂量处理组的24h糖水平均消耗量明显减少，试验最后一天的24h糖水消耗量与第一天相比，24h糖水平均消耗量下降到一半或不到一半。试验数据表明，每天的24h糖水平均消耗量是可变的，呈递减趋势，且噻虫嗪不同剂量处理组与对照组的24h糖水平均消耗量并没有显著不同。
表7噻虫嗪不同剂量对蜜蜂10天试验饲喂期间的平均累计摄入量
注：D＝day饲喂天数
由表7可知，噻虫嗪饲喂幼蜂试验的剂量水平从2.00μga.i./L到4.98μga.i./L六组的第10天平均累计摄入量分别为0.788、0.948、1.14、1.513、1.709、2.343nga.i./bee。
表8噻虫嗪不同剂量对蜜蜂10天试验饲喂期间的累计死亡率thiamethoxam
注：D＝day饲喂天数
根据10天试验期间空白对照、溶剂对照和96％噻虫嗪原药不同浓度剂量饲喂幼蜂的死亡率及行为观察，得出10天试验期间的累计死亡率，如上表8。
同样由图4可知，不同剂量处理组的累积死亡率曲线图与两组对照比较，可以看出剂量处理组2.00μga.i./L、2.40μga.i./L、2.88μga.i./L、3.46μga.i./L与空白对照试验组的累计死亡率曲线图无显著性差异，4.15μga.i./L、4.98μga.i./L剂量处理组与空白对照试验组的累计死亡率曲线图有显著性差异。
表9噻虫嗪不同剂量对蜜蜂10天试验饲喂期间的校正死亡率
注：D＝day饲喂天数M校正死亡率(％)＝(t-c/100-c)*100T＝死亡率(％)C＝对照组死亡率(％)
噻虫嗪的溶剂对照和空白对照做T-test的P值＝1.00>0.05，可知溶剂对照和空白对照没有显著差异，因此下表的噻虫嗪不同剂量处理组应与溶剂对照做T-test分析。
表10噻虫嗪不同剂量处理组与溶剂对照试验组T-test
由上表可知，噻虫嗪不同剂量处理组与溶剂试验组做T-test分析，其中剂量4.15μga.i./L、4.98μga.i./L两个剂量处理组的P值均<0.05，可知两组与空白试验组有差异显著，且浓度为3.46μga.i./L处理组的P值>0.05，该组与溶剂试验组没有显著性差异，且是最高浓度的一组，故噻虫嗪对幼蜂的LOEC为4.98μga.i./L，NOEC估计值为3.46μga.i./L,即1.51nga.i./幼蜂。

Claims (6)

1.一种农药对蜜蜂的风险评价方法，其特征在于：方法步骤如下：
(1)试验用蜂为1～3日龄的幼蜂；
(2)进行预试验：以低于供试药剂LC50值设置4～8种浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行连续10天饲喂，每个浓度3次重复，每个重复10只幼蜂；
(3)正试验：根据预试验结果范围，将供试药剂先用溶剂溶解后，再用50％蔗糖水溶液稀释并配制成含药糖水连续10天对幼蜂进行饲喂；设空白对照组、溶剂对照组各15次重复，处理组10次重复，每个重复10只幼蜂；试验期间每隔24±1h更换含药糖水，每天饲喂前后用分析天平对饲喂管进行称重，以获得每24h糖水消耗量；
(4)试验开始后连续观察幼蜂的死亡数、亚致死作用、异常行为；记录各处理组每天的食物摄取量及整个实验期间的累积摄取量；
(5)药剂对幼蜂NOEC值的测定：不可见效应浓度(NOEC)值用通过方差分析得出：若与空白试验组没有显著性差异的最高浓度，即为NOEC值；或通过浓度-效应关系得出：与空白实验组相比，根据实验测试所得的浓度-效应关系，其影响程度低于空白的10％的浓度，即视为NOEC值；LOEC值的测定：最低可见效应浓度(LOEC)，通过供试物对幼蜂的毒性效应和空白对照组相比有统计学显著性差异(p＜0.05)的最低浓度，及供试物对供试蜜蜂有不利影响的最低浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)如下：
进行预试验：以供试药剂LC50值的1/10～1/800设置4～8种浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行连续10天饲喂，每个浓度3次重复，每个重复10只幼蜂。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，处理组以供试药剂LC50值的1/10、1/50、1/100、1/200、1/400、1/800的比例设置4～8种浓度梯度配置成含药糖水对幼蜂进行饲喂。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(1)中1～3日龄的幼蜂的收集方法为：待蜂王在新脾上产卵之日算起，间隔19日左右将封盖子脾放入小暗盒中，然后将小暗盒打小孔后放入温度控制在33±2℃，相对湿度60～80％，黑暗条件下的人工气候箱，待新蜂出房，用毛刷将其刷入幼蜂饲喂盒中，用花粉和花蜜混匀后喂食1～3天，收集幼蜂。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)中的幼蜂进行饲喂试验在温度为33±2℃，湿度60～70％人工气候室中进行。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(3)中根据预试验结果范围，将供试药剂先用溶剂溶解后，再用50％蔗糖水溶液稀释并配制成含药糖水连续10天对幼蜂进行饲喂。
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