CN110208483B

CN110208483B - 一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法

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Publication number: CN110208483B
Application number: CN201910625493.0A
Authority: CN
Inventors: 张拿慧; 凌云; 彭自然; 朱荧
Original assignee: Shanghai Ocean University
Current assignee: Shanghai Ocean University
Priority date: 2019-07-11
Filing date: 2019-07-11
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2039-07-11
Also published as: CN110208483A

Abstract

本发明公开了一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法，包括：选择糠虾作为试验的甲壳类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养，准备待测水样储备液，通过糠虾的急性毒性和慢性毒性预试验分别筛选浓度梯度范围，设置差距小的浓度梯度，以海水作为对照组，待测水样作为试验组，同时进行糠虾的急性毒性和慢性毒性试验，记录糠虾和环境的变化，对数据进行方差分析，绘制糠虾死亡率曲线，结合糠虾的体征情况和水体指标变化判断水质毒性。本发明克服现有技术中没有适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法的缺陷，有利于制定海洋污水排放国家标准。

Description

一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法

技术领域

本发明涉及一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法，具体涉及急性毒性和慢性毒性试验检测海水水质毒性的方法。

背景技术

海洋废水和流出水排放如石油的泄漏、船舶尾气脱硫废液的排放、船舶压载水的排放、生活污水排放等含有大量有毒有害物质，如船舶尾气脱硫洗涤水中含有重金属、多环芳烃等，船舶压载水处理过程中会产生消毒副产物。海洋污染物种类繁多，毒性持续性强、扩散范围广，这些将导致海洋污染难以控制，经过长时间的积累后爆发会对海洋生态环境造成巨大伤害。

生物毒性试验是常用的生物毒性评价方法之一，生物毒性测试能够分析污染物之间的拮抗或协同作用，通过受试生物特定指标的变化反映污染物对生物的危害程度，综合判断水体污染程度，预测水中污染物对环境生物的健康风险，目前已广泛应用于饮用水和再生水回用等淡水领域的安全评价中。现有技术中已有藻类、甲壳类和鱼类的毒性测试方法，但是所选受试物种是淡水物种，目前国内还没有适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法，生物毒性试验的试验生物大多选择淡水鱼类、贝类等，这些方法仅适用于淡水领域，选择合适的受试生物进行海水毒性试验成为研究重点。糠虾是一种对环境污染很敏感的试验生物，其敏感性高于其它常见生物种类如蚤类、桡足类、双壳类、十足目动物和鱼类等，并在试验室内大量培养时可以保持良好的生理状态，其具有相对较小的体积(体长一般1cm左右)，易于培养繁殖，是食物链中的重要组成部分。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中没有适用于含盐条件下的水生生态毒性测试方法的缺陷，提供一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法，利用糠虾作为受试生物，以标准海水为对照组，通过急性毒性和慢性毒性试验探究海洋类不同待测水样对糠虾的影响，明确直观地反应出海洋水质毒性大小，有利于制定海洋污水排放国家标准。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法，包括以下步骤：

(1)选择糠虾作为试验的甲壳类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养；

(2)待测水样储备液的准备；

(3)首先进行预试验，找出合理范围的浓度梯度；其次确定一个浓度范围进行正式试验，设置差距较小的浓度梯度进行正式试验；

(4)以标准海水作为对照组，待测水样作为试验组，同时进行糠虾的急性毒性和慢性毒性试验，急性毒性试验分别在0，24，48，72，96小时后观察糠虾的死亡率；慢性毒性试验分别在0，1，2，3，4，5，6，7天后观察糠虾的死亡及各项指标变化；

(5)绘制糠虾死亡率曲线及毒性试验过程中的糠虾各项指标变化；

(6)将待测水样造成的糠虾死亡及通过观察生物毒性试验过程中的体征情况来判断水质毒性的大小。

上述方法中，所述的标准水是盐度在25‰-30‰浓度的海水。

上述方法中，试验前糠虾需驯养一段时间，使其适应试验环境，待其状态稳定后开始试验。

上述方法中，试验过程中对糠虾进行喂食，避免由于饥饿造成糠虾间的自相残杀。

上述方法中，对待测水样进行一个范围缩小的预试验，预试验后确定差距较小的浓度范围进行正式试验，进一步缩小浓度梯度进行考察研究。

上述方法中，进行糠虾急性毒性试验时，每个浓度梯度设置两个平行样，每个平行样糠虾数量10尾；进行糠虾慢性毒性毒性试验时，每个浓度梯度设置八个平行样，每个平行样糠虾数量5尾。其中每组对照试验所用的糠虾的大小必须相同，筛选出同等大小的糠虾进行毒性试验，确保试验的准确性。

上述方法中，对待测水样进行生物毒性试验时，每组试验设定多组平行样，取其平均值，减少试验误差。

上述方法中，进行生物毒性试验时，保证对照组和试验组的水质条件(温度、溶解氧、pH等)不变，排除外在因素对试验结果的影响。

上述方法中，毒性试验过程中需要测溶解氧、pH、温度等，用这些指标判断水质，把指标控制在正常的范围内以排除这些因素对试验造成的影响。

本发明的有益效果是：利用敏感性水生生物做毒性试验探究海洋水质的毒性，根据此试验判断当下海洋环境水质对水生生物是否具有危害性。建立海洋水质毒性试验方法，不同种类的海洋水质对于各类水生生物的影响为海水检测制定标准提供依据。另外，本发明毒性试验方法适用于测试船舶尾气脱硫废水、船舶压载水等海洋介质毒性，具有通用性和可行性。

附图说明

图1是96h萘对糠虾的死亡率曲线。

图2是96h硫酸钠对糠虾的死亡率曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

以下实例中选用船舶尾气脱硫废水中常见的污染物萘和硫酸钠为毒物，利用本发明建立的生物毒性方法进行毒性试验测试，探究船舶尾气脱硫废液的海洋环境毒性效应。

具体试验步骤如下：

(1)选择糠虾作为毒性试验的甲壳类生物，在与测试水样水质条件相同的标准水中进行驯养，驯养七天，驯养期间，给糠虾喂食，定期清理水中的杂物，每1-2天换一次水，每次换水量控制在容器容量的1/3左右。

(2)制备待测水样储备液，试验过程中按需要将其稀释成试验所需的浓度。

(3)急性毒性试验：小心地将糠虾从驯养容器中转移至各试验组装有1.5升海水的方体缸中，每个试验组放入10尾糠虾，并设置两组平行。

慢性毒性试验：小心地将糠虾从驯养容器中转移至各试验组装有800毫升海水的石英容器中，每个试验组放入5尾糠虾，并设置八组平行。

(4)以标准海水水样作为对照组，待测水样作为试验组，进行糠虾的毒性试验，首先进行预试验，后再进行正式试验；通过预试验不断地缩小浓度梯度，最后选取合适的浓度范围进行正式试验；

(5)利用预试验筛选出的浓度梯度做毒性试验的正式试验：

设置急性毒性试验萘的浓度为：0μg/L、20μg/L、33.1μg/L、54.8μg/L、90.6μg/L、150μg/L，硫酸钠的浓度为：0g/L、3g/L、3.95g/L、5.20g/L、6.84g/L、9g/L；急性毒性试验采用流水式，调节水流流速为20mL/min，试验进行96小时，在试验开始时测量温度、pH和溶解氧，之后每隔24小时测量。保证温度为23±1℃、pH为8.1±0.2、溶解氧大于60％。试验期间保持足够的光照，试验中及时清理虾的粪便，及时捞出死亡的糠虾。

设置慢性毒性试验萘的浓度为：0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、70μg/L，硫酸钠浓度为：0g/L、0.5g/L、1g/L、3g/L、4g/L、6g/L；慢性毒性试验采用半静态式，试验进行7天，试验时每隔24小时从每个烧杯中吸出150毫升溶液并加入相同量、相同浓度的新配制的溶液，试验期间保持足够的光照，及时清理糠虾的粪便，及时捞出死亡的糠虾。

(6)试验过程中记录糠虾的剩余量。其中，慢性毒性试验开始和结束时分别测量糠虾的体长、体重，溶解氧、pH、温度等，并对数据进行方差分析，并在试验过程中仔细查看糠虾的状况，结合生长等生物学指标，评判待测水样中污染物的分布、积累和释放情况。急性毒性试验过程中定期测量水中溶解氧、pH、温度等，保证溶解氧、pH、温度满足毒性试验的条件。

(7)绘制糠虾死亡率曲线及毒性试验过程中的糠虾各项指标变化曲线。

(8)以糠虾死亡率及糠虾各项体征变化情况表示水样的水质毒性，为正确评价污染物对海洋生物的毒性效应，制定海水污染物风险评价方法提供理论依据。

实施例1

在不同萘浓度：0μg/L，20μg/L，33.1μg/L，54.8μg/L，90.6μg/L，150μg/L，糠虾急性毒性试验过程中pH值、溶解氧和温度的变化如表1所示，96h后糠虾的死亡率如图1所示。

表1：萘对糠虾急毒试验的水质参数

实施例2

在不同硫酸钠浓度：0g/L、3g/L、3.95g/L、5.20g/L、6.84g/L、9g/L，糠虾急性毒性试验过程中pH值、溶解氧和温度的变化如表2所示，96h后糠虾的死亡率如图2所示。

表2：硫酸钠对糠虾急毒试验的水质参数

根据实施例1和2的糠虾急性毒性试验数据计算可得：萘对糠虾的96h LC₅₀(半致死浓度)为65.27μg/L，其95％置信区间范围为51.42～82.85μg/L；硫酸钠对糠虾的96h LC₅₀为5.73g/L，其95％置信区间范围5.02～6.54g/L。通过测量试验中的pH值、溶解氧和温度，试验数据如表1和表2所示，pH值、溶解氧和温度都在合理的范围内小幅波动，符合糠虾的生长条件，同时说明毒物浓度是影响试验结果的单一因素，不受其他因素的影响，证明试验的可行性。

实施例3

试验进行7天后，在不同萘浓度为：0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、70μg/L下，糠虾慢性毒性试验过程中糠虾的存活数量、平均体重、平均体长、雌性数量、平均繁殖数等变化如表3-表6所示。

表3：糠虾慢性毒性试验存活数量

表4：糠虾慢性毒性试验平均体重和体长

表5：糠虾慢性毒性试验雌性数量

浓度(μg/L)	平均值±标准偏差	显著差异
			对照组	2.00±1.41	无
5	2.50±1.29	P＝0.97>0.05，差异性不显著
			10	2.00±0.82	P＝1>0.05，差异性不显著
20	2.25±1.26	P＝0.999>0.05，差异性不显著
			50	2.75±1.71	P＝0.871>0.05，差异性不显著
70	2.25±0.96	P＝0.999>0.05，差异性不显著

表6：糠虾慢性毒性试验平均繁殖数量

浓度(μg/L)	平均值±标准偏差	显著差异
			对照组	2.04±0.75	无
5	1.98±0.37	P＝1>0.05，差异性不显著
			10	2.13±0.25	P＝0.998>0.05，差异性不显著
20	1.81±0.24	P＝0.878>0.05，差异性不显著
			50	1.21±0.25	0.01<P＝0.033<0.05，差异性显著
70	1.13±0.25	0.01<P＝0.018<0.05，差异性显著

实施例4

试验进行7天后，在不同硫酸钠浓度为：0g/L、0.5g/L、1g/L、3g/L、4g/L、6g/L下，糠虾慢性毒性试验过程中糠虾的存活数量、平均体重、平均体长、平均繁殖数变化如下表7-表10所示。

表7：糠虾慢性毒性试验存活数量

表8：糠虾慢性毒性试验平均体重和体长

表9：糠虾慢性毒性试验雌性数量

浓度(g/L)	平均值±标准偏差	显著差异
			对照组	2.00±0.82	无
0.5	2.00±1.15	P＝0.646＞0.05，差异性不显著
			1	3.25±1.26	P＝0.998>0.05，差异性不显著
3	1.75±1.71	P＝0.451>0.05，差异性不显著
			4	2.50±1.29	P＝0.961>0.05，差异性不显著
6	1.75±0.50	P＝0.451>0.05，差异性不显著

表10：糠虾慢性毒性试验平均繁殖数量

浓度(g/L)	平均值±标准偏差	显著差异
			对照组	1.06±0.375	无
0.5	0.84±0.191	P＝0.923>0.05，差异性不显著
			1	0.58±0.501	P＝0.441>.05，差异性不显著
3	0.44±0.427	P＝0.220>0.05，差异性不显著
			4	0.38±0.479	P＝0.157>0.05，差异性不显著
6	0	0.01<P＝0.015<0.05，差异性显著

根据实施例3和4的糠虾慢性毒性试验数据分析，从萘对糠虾的慢性毒性试验数据可得，NOEC(最大无作用浓度)为10μg/L，LOEC(最低可见效应浓度)为20μg/L。萘的慢性毒性试验开始前，测量的糠虾平均体重为3.13mg，平均体长为9.4mm，由表4可知试验结束后试验组糠虾的平均体重和体长均有显著变化；从硫酸根对糠虾的慢性毒性试验数据可得，NOEC(最大无作用浓度)为0.5g/L，LOEC(最低可见效应浓度)为1g/L，硫酸根的慢性毒性试验开始前，测量的糠虾平均体重为4.19mg，平均体长为9.5mm，由表8可知试验结束后试验组糠虾的平均体重和体长均有显著变化，结合表中数据可以得出结论：低浓度的毒物会影响糠虾的生长发育速度，高浓度的毒物会阻碍甚至抑制糠虾的正常生长发育。

具体实施例是检测船舶尾气脱硫洗涤水中主要污染物对糠虾的毒性试验，可以发现不管是毒物硫酸根和多环芳烃萘，均可对糠虾造成强烈的刺激，影响糠虾的生长、发育和繁殖，造成糠虾的病变、畸变甚至死亡。具体表现在毒物使得糠虾产卵总数减少，糠虾生殖周期紊乱、生殖间隔拉长、存活率降低等一系列影响。

由此可见，脱硫洗涤水的排放会对水生态系统造成一定的危害作用，不仅会影响水生生物的正常生长、发育，或死亡，并且毒物在生物体内蓄积，通过食物链的关系，毒物最终会进入到食物链顶端的人类，对人类的身体健康产生影响。总之，通过本实施例试验结果为进行船舶尾气脱硫洗涤水污染物的危险性评价、制定水质标准和环境卫生标准提供依据，也对评判受试污染物对试验动物的致癌性提供参考价值。

上述所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的包含范围之内。

Claims

1.一种海洋甲壳类水生态毒性试验方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在与待测水样水质条件相同的盐度在25‰-30‰浓度的海水中驯养糠虾七天，驯期间喂食，定期清理水中杂物，每1-2天换一次水，每次换水量控制在容器容量的1/3；

(2)以海水为对照组、待测水样为试验组，在不同毒物浓度梯度条件下进行急性毒性试验和慢性毒性试验，试验过程中喂食，及时清理粪便、捞出死亡糠虾，保持对照组和试验组水质条件不变、糠虾大小相同，光照充足；其中：

所述急性毒性试验为：驯养后的糠虾按照每组数量为10尾装入1.5升海水的容器中，每个毒物浓度梯度设置两组平行，采用流水式，水流流速为20mL/min，试验时间为96小时，保持温度为22-25℃、pH为7.6-8.0、溶解氧大于60％，分别在0、24、48、72和96小时观察记录水质指标pH、溶解氧和温度和糠虾生长指标存活数量、体重、体长、雌性数量和平均繁殖数的变化；

所述慢性毒性试验为：驯养后的糠虾装入800毫升海水的容器中，每个毒物浓度梯度设置八个平行样，每个平行样糠虾数量5尾，采用半静态式，试验时间为7天，每间隔24小时分别从每个容器中取出150毫升溶液，再加入150毫升与试验开始设置浓度梯度相同浓度的溶液，分别在0、1、2、3、4、5、6和7天观察记录水质指标pH、溶解氧和温度和糠虾生长指标存活数量、体重、体长、雌性数量和平均繁殖数的变化；

(3)对步骤(2)中所得数据进行分析，判断水质毒性；

所述毒物为硫酸钠和萘，急性毒性试验中萘的浓度梯度为0μg/L、20μg/L、33.1μg/L、54.8μg/L、90.6μg/L、150μg/L，硫酸钠的浓度梯度为0g/L、3g/L、3.95g/L、5.20g/L、6.84g/L、9g/L；慢性毒性试验中萘的浓度梯度为0μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、70μg/L，硫酸钠的浓度梯度为0g/L、0.5g/L、1g/L、3g/L、4g/L、6g/L。

2.一种检测海洋水生态毒性的方法，通过权利要求1所述海洋甲壳类水生态毒性试验方法实现。