CN102488697B

CN102488697B - 一种寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型h1n1流感病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN102488697B
Application number: CN 201110408962
Authority: CN
Inventors: 王伟; 于广利; 郝翠; 管华诗
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2011-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2031-12-09
Also published as: CN102488697A

Abstract

本发明提供了一种寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒的药物中的应用。本发明通过实验不仅证明了寡聚甘露糖醛酸OM在体外对H1N1亚型的甲型流感病毒感染的狗肾上皮细胞具有较好的保护作用，可以有效地降低病毒的复制,其作用效果与阳性对照药利巴韦林相当。而且，OM还可以显著减少甲型H1N1流感病毒感染引起的小鼠死亡，延长生存时间。本发明提供的寡聚甘露糖醛酸OM具有水溶性好、稳定性高和安全低毒等优点，在体内外实验中都证明OM具有良好的抗甲型H1N1流感病毒活性，预示该寡聚甘露糖醛酸有开发成抗甲型流感病毒药物的前景。

Description

一种寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于海洋药物领域，涉及到寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用。

背景技术

甲型流感病毒(Influenza A Virus，IAV)属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)且有包膜的负链RNA病毒，根据其表面的血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)的结构及基因特性的不同可分为若干亚型，如H1N1、H5N1及H3N2等。IAV在上个世纪至少引起三次大规模的流感爆发，其中最严重的是1918-1919年间爆发的西班牙流感，造成了超过4000万人死亡。自2009年4月以来，发源于墨西哥的H1N1亚型的甲型流感病毒造成了世界范围的流感爆发，给人类的健康带来了巨大威胁。据世界卫生组织统计，全球每年约有6亿人感染流感，约30万人死于流感，直接经济损失超过100亿美元。

目前，治疗甲型流感病毒的药物主要有两大类，分别是以离子通道蛋白(M2)为靶点的金刚烷胺和金刚乙胺以及以神经氨酸酶(NA)为靶点的扎那米韦(zanamivir)和奥司他韦(oseltamivir)。由于流感病毒是分节段的RNA病毒，容易发生变异并容易对现有药物产生耐药性，如欧洲已经出现了对金刚烷胺及奥司他韦产生耐药性的IAV毒株。此外，现有的抗流感病毒药物大多具有不同程度的毒副作用，尤其是离子通道阻断剂具有神经毒性等副作用。因此，研发低毒有效的抗IAV药物十分迫切。

以糖为基础的药物研发是本世纪生化药物研究领域的热点之一。海洋多糖特别是来源于褐藻的酸性多糖具有良好的抗病毒作用。国内外大量研究表明，褐藻多糖及其衍生物具有抗人类免疫缺陷病毒HIV及甲型流感病毒IAV的显著活性(Miao et al.，Biochem.Pharmacol.，2004，68：641-649；Lee et al.，Chem.Pharm.Bull.，2004，52(9)：1091-1094)。但是多糖药物的分子量大，溶解性和吸收性较差，导致其生物利用度很低从而限制了其在临床上的应用。国内外学者已经报道了一些关于褐藻寡糖的制备和应用方面的专利(ZL01107952.5，CN1414002A，CN1562050A，CN101037456A)，但是还没有关于寡聚甘露糖醛酸在抗甲型H1N1流感病毒方面的研究和应用报道。

发明内容

针对现有技术中治疗甲型流感病毒的药物容易产生耐药性且具有毒副作用的缺点，本发明提供了寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用。本发明提供的寡聚甘露糖醛酸(OM)具有其分子量小、溶解性和稳定性好的特点，并且此寡聚甘露糖醛酸在体内外实验中都呈现出很好的抗甲型H1N1流感病毒的活性。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

本发明提供了寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用。

所述寡聚甘露糖醛酸的糖残基是由D-甘露糖醛酸组成，并以β-1，4-糖苷键连接，重均分子量为＜6KD，其分子式可表述为[C₆H₈O₆]_n，其中n＝2-34。

对技术方案的进一步改进：所述寡聚甘露糖醛酸在浓度为40μmol/L以上可显著抑制甲型H1N1流感病毒在狗肾上皮细胞(MDCK)中的感染和增殖。

对技术方案的进一步改进：所述寡聚甘露糖醛酸在40mg/kg/day的剂量下可显著减轻甲型H1N1流感病毒IAV感染引起的小鼠肺部炎症。

对技术方案的进一步改进：对IAV病毒感染小鼠的肺指数抑制率达到34.9％，对于IAV感染小鼠的死亡保护率达到50％。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明选取来源于海洋褐藻的低分子量的新型寡聚甘露糖醛酸OM为研究对象，在体内外水平上揭示其抗甲型H1N1流感病毒感染和增殖的作用。

本发明经实验证实寡聚甘露糖醛酸OM可以很好地抑制甲型H1N1流感病毒对于狗肾上皮细胞的感染和增殖过程，其作用效果与阳性对照药利巴韦林相近。寡聚甘露糖醛酸OM可以显著减轻甲型H1N1流感病毒感染引起的小鼠肺部炎症，减轻流感引起的小鼠体重下降症状，从而对小鼠起到治疗和保护作用。此外，寡聚甘露糖醛酸OM还可以显著减少IAV感染引起的小鼠死亡，延长生存时间。

本发明证实寡聚甘露糖醛酸OM无论在细胞水平还是动物水平上都可以很好地抑制甲型H1N1流感病毒的感染和增殖过程，揭示该化合物具有开发成抗甲型流感病毒药物的广阔前景。

结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1表明本发明中寡聚甘露糖醛酸OM对于感染甲型H1N1流感病毒小鼠的死亡保护作用。图1中，病毒对照组为只感染病毒而不加药的模型对照组；利巴韦林组为阳性药处理组；寡糖OM组为寡聚甘露糖醛酸处理组；给药剂量为40mg/kg/day；病毒对照组给予同样体积的生理盐水。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

本发明采用酸降解法从海藻多糖褐藻胶中制备并分离获得低分子量的寡聚甘露糖醛酸OM(在专利ZL01107952.5和ZL01127533.2中记载有寡聚甘露糖醛酸OM的制备方法)，并试验其在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用。

本发明制得的所述寡聚甘露糖醛酸OM的糖残基是D-甘露糖醛酸，并以β-1，4-糖苷键连接，重均分子量为＜6KD，其分子式可表述为[C₆H₈O₆]_n，其中n＝2-34。

按照国际公认的方法，评价了它对甲型H1N1流感病毒的体内外感染和增殖的影响。

实施例1、寡聚甘露糖醛酸OM体外抗甲型H1N1流感病毒增殖作用

利用甲型流感病毒小鼠适应株H1N1(A/PR/8/34，中科院武汉病毒所提供)感染狗肾上皮细胞(MDCK)建立细胞模型，并利用此细胞模型结合细胞病变(CPE)抑制试验和噻唑篮(MTT)比色法分别检测寡聚甘露糖醛酸OM对于IAV的抑制活性以及细胞毒性的大小，并且计算半数抑制浓度IC50和半数细胞毒性浓度CC50。阳性对照药物选择利巴韦林。

实验结果如表1所示，寡聚甘露糖醛酸OM对于IAV的抑制活性非常显著(IC₅₀＝38.3μM)，且细胞毒性较小(CC₅₀＝420μM)，治疗指数SI(CC₅₀/IC₅₀)达到11.0。与广谱的抗病毒药物利巴韦林相比，寡聚甘露糖醛酸OM起效的药物浓度更低，IC₅₀值远小于利巴韦林(IC₅₀＝91.3μM)，且两者的治疗指数(SI)都大于10.0。说明寡聚甘露糖醛酸OM具有较好的体外抑制甲型流感病毒增殖的作用。

表1：寡聚甘露糖醛酸OM体外抗甲型H1N1流感病毒活性

实施例2、寡聚甘露糖醛酸OM在体内抗甲型H1N1流感病毒感染作用

1)、OM对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺病变与体重的影响

利用鼠肺适应株H1N1(A/PR/8/34)病毒液滴鼻感染SPF级的昆明小鼠建立动物模型，用此小鼠模型检验寡聚甘露糖醛酸OM在体内抗IAV感染的效果。

将14-16g的SPF级的雌性昆明小鼠40只按体重分为病毒对照组，正常对照组，阳性药利巴韦林组和寡聚甘露糖醛酸组，每组10只。除正常组外，其它各组均在乙醚轻度麻醉下以10LD₅₀的IAV病毒液滴鼻感染，每鼠40μL。利巴韦林组和寡糖药物组从病毒感染前1天开始腹腔注射给药，连续给药7天后断食8h，称重后解剖并测定小鼠的肺指数(肺指数＝(肺重/体重)×100)和肺指数抑制率(肺指数抑制率＝(病毒组平均肺指数-实验组平均肺指数)/病毒组平均肺指数×100％)。具体结果如表2所示。

在每天每千克体重给药40mg的情况下，寡聚甘露糖醛酸处理的小鼠肺指数明显降低，肺指数抑制率达到34.9％；肺指数显著低于病毒组的1.29±0.21(P＜0.01)，甚至优于阳性药组。此外，寡聚甘露糖醛酸OM还可以显著降低小鼠体重下降的症状(P＜0.01)。说明寡聚甘露糖醛酸OM可以显著减轻IAV感染引起的小鼠肺部炎症，从而对小鼠起到保护作用。

表2：寡聚甘露糖醛酸OM对甲型H1N1流感病毒致小鼠肺炎的抑制效果

##P＜0.01，与正常对照组相比；**P＜0.01，与模型组(病每对照组)相比；(n＝10；X±SD)

2)、OM对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的生存率的影响

利用鼠肺适应株H1N1(A/PR/8/34)病毒液滴鼻感染SPF级的昆明小鼠建立动物模型，并用此小鼠模型检验寡聚甘露糖醛酸OM在体内抗IAV感染的效果。在病毒感染14天后，统计各组小鼠的死亡情况，并计算药物对于小鼠的死亡保护率(死亡保护率＝模型组死亡率-实验组死亡率)。具体结果见表3和图1。

实验结果表明，在每天每千克体重给药40mg的情况下，寡聚甘露糖醛酸OM处理的小鼠死亡率明显降低，死亡抑制率达到50％，甚至优于阳性药组(40％)。说明寡聚甘露糖醛酸OM可以显著减轻IAV感染引起的小鼠死亡，延长生存时间。

表3：寡聚甘露糖醛酸OM对于感染甲型H1N1流感病毒小鼠的保护作用

综上，本实验结果表明寡聚甘露糖醛酸OM在一定浓度下，没有任何细胞毒性；寡聚甘露糖醛酸OM在体外可以显著抑制甲型H1N1亚型流感病毒的增殖，具有很好的抗甲型流感病毒作用；在小鼠攻毒保护实验中通过存活率、平均存活时间、鼠肺病变、肺指数抑制率、平均体重等多个参数评定显示寡聚甘露糖醛酸OM具有较好的抗甲型H1N1流感病毒活性。

本发明的产品来源于海藻，具有资源丰富、成本低廉和安全性高等诸多优点，并且在体内外水平上都证明其具有较好的抗甲型H1N1流感病毒感染和增殖的作用，为该类药物的开发提供了新的途径。

以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，其特征在于所述寡聚甘露糖醛酸的糖残基是由D-甘露糖醛酸组成，并以β-1，4-糖苷键连接，重均分子量为<6 kDa，其分子式可表述为[C₆H₈O₆]_n，其中n=2-34。

2.根据权利要求1所述的寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，其特征在于所述寡聚甘露糖醛酸在浓度为40 μmol/L 以上可显著抑制甲型H1N1流感病毒在狗肾上皮细胞中的感染和增殖, 半数抑制浓度IC₅₀为38.3 μM。

3.根据权利要求1所述的寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1流感病毒药物中的应用，其特征在于所述寡聚甘露糖醛酸在40 mg/kg/day的剂量下可显著减轻甲型H1NI流感病毒感染引起的小鼠肺部炎症, 降低死亡率。

4.根据权利要求3所述的寡聚甘露糖醛酸在制备抗甲型H1N1亚型的流感病毒药物中的应用，其特征在于对甲型H1N1流感病毒感染小鼠的肺指数抑制率达到34.9%, 对于甲型H1N1流感感染小鼠的死亡保护率达到50%。