CN102482340A

CN102482340A - 因子viii蛋白向血小板的靶向递送

Info

Publication number: CN102482340A
Application number: CN2010800153191A
Authority: CN
Inventors: H.奥斯特加尔德; A.E.普萨特里; T.R.巴内特; J.布夏特; B.佩施克; M.科福德-汉森; M.A.曾德尔; C.贝伦斯; E.H.N.奥尔森; H.斯特尼克
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2009-04-06
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-04-06
Also published as: JP2012522529A; JP5770161B2; EP2417155A1; WO2010115866A1; US20120093840A1; JP2015166391A; ES2427627T3; CN102482340B; US20160251409A1; EP2417155B1

Abstract

本文描述的发明涉及包含至少一个与人因子VIII或其生物活性部分具有显著同一性(同源性)的氨基酸序列的新颖分子和多肽、有关的分子(诸如编码这样的多肽的核酸)、包含这样的多肽的组合物(诸如药物制剂)、以及制备和使用这样的多肽的方法。

Description

因子VIII蛋白向血小板的靶向递送

技术领域

本文描述的发明涉及包含至少一个与人因子VIII或其生物活性部分具有显著同一性(同源性)的氨基酸序列的多肽、有关的分子(诸如编码这样的多肽的核酸)、包含这样的多肽的组合物(诸如药物制剂)、以及制备和使用这样的多肽和有关的生物分子的方法。

背景技术

凝血因子VIII (“因子VIII”或“FVIII”)是一种重要的凝结因子。正常的FVIII的缺少会造成A型血友病，即一种遗传性出血障碍。因子VIII参与血液凝结的内源性途径。具体地，因子VIII是将因子X 转化成活化的因子Xa (在Ca⁺²和磷脂存在下)的因子IXa的辅因子。

因子VIII基因生成2种可选地剪接的转录物。转录物变体1编码大糖蛋白同种型a，其在血浆中循环，且与von Willebrand 因子(“vWF”)结合成非共价复合物。该蛋白经历多个切割事件。转录物变体2编码认为的小蛋白同种型b，其主要由因子VIIIc的磷脂结合域组成。该结合域是促凝剂活性所必需的。FVIII的结构是众所周知的(参见，例如，Thompson, Semin Thromb Hemost. 2003 Feb;29(1):11-22)。

在被凝血酶(因子IIa)活化后，因子VIIIa (FVIIIa)从FVIII:vWF复合物解离，以与因子Ixa相互作用，造成确定地表征的事件链，导致更多凝血酶的生成。凝血酶会将纤维蛋白原切割成纤维蛋白，其聚合并交联(使用因子XIII)成血块。FVIIIa在该过程中被活化的蛋白C (“aPC”)和因子Ixa蛋白水解地灭活，并迅速从血流中清除。

可以将从捐献的血浆浓缩的FVIII或可选地重组的FVIII施用给血友病患者，以恢复止血。因而，FVIII也称作抗血友病因子。

FVIII在体内具有约10-12小时的循环半衰期，因此非常希望提供具有延长的半衰期的FVIII类似物，以便降低治疗性/预防性静脉内FVIII输注的频率。

WO2009140598 公开了包括杂种分子的概念，所述杂种分子包含FVIII和GPIIb/IIIa特异性的抗体。但是，该概念可能导致GPIIb/IIIa受体的结合纤维蛋白原的能力的抑制，因而在施用这样的杂种FVIII分子以后，会降低形成初级血块（primary clot）的能力。因而，本领域需要生物活性的因子VIII分子，其具有以高亲和力结合血小板的能力。此外，本领域需要生物活性的因子VIII分子，其具有结合血小板的能力，同时基本上保留血小板的聚集并从而形成初级血块的能力。

发明概述

本发明提供了靶向分子，例如包含非抑制性的GPIIb/IIIa特异性的抗体的因子VIII (FVIII)分子，以及有关的分子、组合物，制备这样的分子的方法，和使用这样的分子和组合物的方法(例如，在A型血友病的治疗或调节中)。

在本文中将更完整地描述本发明的这些和其它方面、特征和优点。

附图说明

图1 图释了可能的方法，通过所述方法，可以将scFv化学地连接到FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列上，或作为含有FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列的多肽的一部分顺式地表达，从而得到修饰的FVIII分子。具体地显示了用于生产这样的分子的糖缀合、化学缀合和融合蛋白方法。在适用时，这些方法可以类似地用于制备本发明的其它FVIII分子。

图2 图释了血小板聚集。条显示了用F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (AP3-N8)或ReoPro?预处理的、SFLLRN (10 μM)活化的血小板中的聚集。显示的数据是双份测定的平均值±平均值标准差，其中将单独的SFLLRN (10 μM)设定为100%。

图3 图释了最终的靶向载体。

图4 图释了AP3-N8 2097 (A)和AP3-N8 MZ1 (C)以剂量-依赖性的方式结合人血小板。用过量的AP3-LC-HC scFV-FLAG (SEQ ID NO 22)，可以几乎完全竞争两种化合物的结合。

发明详述

在本发明的上下文中，因子VIII蛋白(或FVIII蛋白)是这样的蛋白，其包含与选自下述的氨基酸序列表现出至少约70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列：人因子VIII (SEQ ID NO:1)、或其成熟部分(即，其残基20-2351)、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式，如下所示。

因子VIII (SEQ ID NO:1)

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNSRHPSTRQKQFNATTIPENDIEKTDPWFAHRTPMPKIQNVSSSDLLMLLRQSPTPHGLSLSDLQEAKYETFSDDPSPGAIDSNNSLSEMTHFRPQLHHSGDMVFTPESGLQLRLNEKLGTTAATELKKLDFKVSSTSNNLISTIPSDNLAAGTDNTSSLGPPSMPVHYDSQLDTTLFGKKSSPLTESGGPLSLSEENNDSKLLESGLMNSQESSWGKNVSSTESGRLFKGKRAHGPALLTKDNALFKVSISLLKTNKTSNNSATNRKTHIDGPSLLIENSPSVWQNILESDTEFKKVTPLIHDRMLMDKNATALRLNHMSNKTTSSKNMEMVQQKKEGPIPPDAQNPDMSFFKMLFLPESARWIQRTHGKNSLNSGQGPSPKQLVSLGPEKSVEGQNFLSEKNKVVVGKGEFTKDVGLKEMVFPSSRNLFLTNLDNLHENNTHNQEKKIQEEIEKKETLIQENVVLPQIHTVTGTKNFMKNLFLLSTRQNVEGSYDGAYAPVLQDFRSLNDSTNRTKKHTAHFSKKGEEENLEGLGNQTKQIVEKYACTTRISPNTSQQNFVTQRSKRALKQFRLPLEETELEKRIIVDDTSTQWSKNMKHLTPSTLTQIDYNEKEKGAITQSPLSDCLTRSHSIPQANRSPLPIAKVSSFPSIRPIYLTRVLFQDNSSHLPAASYRKKDSGVQESSHFLQGAKKNNLSLAILTLEMTGDQREVGSLGTSATNSVTYKKVENTVLPKPDLPKTSGKVELLPKVHIYQKDLFPTETSNGSPGHLDLVEGSLLQGTEGAIKWNEANRPGKVPFLRVATESSAKTPSKLLDPLAWDNHYGTQIPKEEWKSQEKSPEKTAFKKKDTILSLNACESNHAIAAINEGQNKPEIEVTWAKQGRTERLCSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY

因子VIII B-结构域缺失形式 (SEQ ID NO:2)

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因子VIII B-结构域截短形式 (“N8”) (SEQ ID NO:3)

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在一个更具体的方面，本发明涉及靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NO:1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式表现出至少约75%、至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%同一性。

在一个再更具体的方面，本发明涉及靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 2、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式表现出至少约90%同一性 (诸如至少约93%同一性)。

在另一个方面，本发明提供了靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NO:1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分表现出至少约95%同一性。在更具体的方面，本发明提供了靶向的FVIII衍生物，其与SEQ ID NO:1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式表现出至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约98.5%、至少约99%、至少约99.5%、或至少约99.7%、至少约99.8%、或甚至至少约99.9%同一性。换而言之，在一个方面，本发明提供了靶向的FVIII衍生物，其特征在于，包含这样的氨基酸序列，该序列相对于SEQ ID NO:1、或其成熟部分、或其凝血酶活化部分、或其B结构域缺失/截短形式，被缺失、插入和/或置换了至少1个、通常至少2-3个、经常至少1-5、通常至少1-20个(诸如1-15、1-12、1-10、1-7、1-3、2-20、2-15、2-12、2-10、2-7、2-5、3-20、3-15、3-12、3-10、3-7、3-5、4-20、4-15、4-12、4-10、4-7、5-20、5-15、5-12、5-10或5-7个)氨基酸残基。

通常，将FVII “类似物”序列中至少约50%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、诸如约75%或更多、约80%或更多、约85%或更多、约90%%或更多、或甚至约95%或更多(诸如至少约97%、98%、99%、99.3%、99.5%、99.7%、99.8%)的置换表征为“保守置换”。通过在下述3个氨基酸分类表中的一个或多个中反映出的氨基酸类别内的置换，可以定义保守置换：

表1 –保守置换的氨基酸残基类别

氨基酸类别	氨基酸残基
		酸性残基	ASP和GLU
碱性残基	LYS、ARG和HIS
		亲水的不带电荷的残基	SER、THR、ASN和GLN
脂族的不带电荷的残基	GLY、ALA、VAL、LEU和ILE
		非极性的不带电荷的残基	CYS、MET和PRO
芳族的残基	PHE、TYR和TRP

表2 - 替代性的保守氨基酸残基置换组

1	丙氨酸(A)	丝氨酸(S)	苏氨酸(T)
				2	天冬氨酸(D)	谷氨酸(E)
3	天冬酰胺 (N)	谷氨酰胺 (Q)
				4	精氨酸(R)	赖氨酸(K)
5	异亮氨酸(I)	亮氨酸(L)	甲硫氨酸(M)
				6	苯丙氨酸(F)	酪氨酸(Y)	色氨酸(W)

表3 –氨基酸残基的其它替代性的物理的和功能的分类

含有醇基的残基	S和T
		脂族的残基	I、L、V和M
环烯基-相关的残基	F、H、W和Y
		疏水的残基	A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y
带负电荷的残基	D和E
		极性的残基	C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T
小残基	A、C、D、G、N、P、S、T和V
		非常小的残基	A、G和S
参与转角形式的残基	A、C、D、E、G、H、K、N、Q、R、S、P和T
		柔性的残基	E、Q、T、K、S、G、P、D、E和R

甚至更保守的氨基酸残基置换分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。使用在例如Creighton (1984) Proteins: Structure and Molecular Properties (1993年第2版), W.H. Freeman and Company中所述的原理，也可以形成其它氨基酸组。在有些情况下，基于2个或更多个这样的特征来进一步表征置换可能是有用的 (例如，用诸如Thr残基等“小的极性的”残基进行置换，在适当的上下文中可以代表高度保守的置换)。

术语“靶向的”、“靶向”等用于表示，所述FVIII分子以比野生型FVIII更大的亲和力和/或亲合力结合一种或多种生物分子(通常是其它蛋白，经常是细胞受体)和/或细胞(或其通常不被野生型FVIII结合)。如已经指出的，与对应的未修饰的蛋白(缺少“靶向因子”、但是在其它方面与靶向的FVIII蛋白相同的蛋白，所述“靶向因子”通常是氨基酸序列(靶向结构域)或分子(靶向部分))相比，本发明提供的靶向的分子可以表现出增加的稳定性。在一个具体方面，提供了表现出这种或其它希望的/修饰的性质的靶向的分子，其中FVIII的一种或更多种生物活性(例如，因子IX结合)没有显著减少。通常，这种活性的抑制量是约40%或更少、约30%或更少、约25%或更少、约20%或更少、约15%或更少、约10%或更少、约7%或更少、约5%或更少、或约3%或更少)。FVIII 生物活性的测定是本领域已知的(参见，例如，Mikaelsson 等人, Semin Hematol. 2001 Apr;38(2 Suppl 4):13-23)。

术语“减少的结合vWF的能力”在本文中意在包括这样的因子VIII变体，其中结合vWF的能力减少了至少50%、优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%和最优选约100%。通过ELISA等试验，可以测量FVIII与vWF的结合，或使用表面等离子体共振技术测量与固定化的vWF的直接结合。因子VIII中负责结合vWF的区域是跨残基 1670-1684的区域，如在EP0319315中所公开的。预见到，涉及该区域的因子VIII点和/或缺失突变会修饰结合vWF的能力。根据本发明特别优选的点突变的实例包括含有下述点突变的变体：Y1680F、Y1680R、Y1680N、Y1680C和E1682T。

侧基: 可以用不是非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的侧基，缀合根据本发明的因子VIII分子。在这方面，“侧基”是指天然地不是因子VIII分子的一部分的任意部分的共价连接。优选地，所述侧链为因子VIII分子提供延长的循环半衰期。侧链的缀合可以是融合蛋白和/或化学缀合和/或酶促缀合方法的形式。根据本发明的侧链通常选自由下述物质组成的列表中的一个或多个：亲水的聚合物、脂肪酸及其衍生物(有时称作“白蛋白结合物”)、白蛋白、转铁蛋白、弹性蛋白样肽、分离的Fc结构域、vWF的片段、抗体及其包含抗原结合序列的片段。合适的抗体的实例包括抗体或其片段，其具有结合具有相对长的循环半衰期的血液组分（例如红细胞、血小板、纤维蛋白原等）或结合血管壁（例如胶原）的能力。

不希望受理论的约束，预见到，与将侧基连接到具有正常的vWF结合能力的因子VIII分子上相比，将侧基连接到具有降低的vWF结合能力的因子VIII分子上会更有效地起作用的原因是，侧基在大因子VIII/vWF复合物中的相对尺寸相对较小。可以假设，相对较大的侧基在屏蔽游离的因子VIII免于清除中更有效地起作用。进一步假设，FVIII的半衰期与vWF的半衰期有关。具有减少的结合vWF的能力的FVIII分子最可能具有暴露的清除表位，所述表位通常已经被vWF屏蔽。因而假设，通过连接侧基，可以恢复该“清除屏蔽”。在其它情况下，通过例如把分子连接到具有相对长的循环半衰期的蛋白、细胞或血小板上，侧基（例如抗体片段）的连接可以起作用。与根据本发明的FVIII分子相连接，这样的分子可以进一步以更有效的方式靶向血小板（如果所述分子的FVIII部分具有减少的结合vWF的能力）。

亲水聚合物: 根据本发明的修饰基团/亲水聚合物优选地是非天然存在的。在一个实例中，“非天然存在的修饰基团”是聚合的修饰基团，其中至少一个聚合部分是非天然存在的。在另一个实例中，非天然存在的修饰基团是修饰的碳水化合物。选择由修饰基团官能化的部位，从而使它不会阻止“修饰的糖”酶促地添加到多肽上。“修饰的糖”也指任意的糖基模拟部分，其被修饰基团官能化，且是天然的或修饰的酶（例如糖基转移酶）的底物。

添加到多肽上的聚合的修饰基团可以改变这种多肽的性质，例如，它的生物利用率、生物活性或它在体内的半衰期。根据本发明的示例性的聚合物包括线性的或分支的水溶性的聚合物，且可以包括一个或多个独立地选择的聚合部分，例如聚(亚烷基二醇)和其衍生物。根据本发明的聚合的修饰基团可以包括水溶性的聚合物，例如聚(乙二醇)和其衍生物(PEG, m-PEG)、聚(丙二醇)和其衍生物(PPG, m-PPG) 等。

术语“水溶性的”是指在水中具有一些可检测程度的溶解度的部分。检测和/或定量水溶性的方法是本领域众所周知的。根据本发明的示例性的水溶性的聚合物包括肽、糖、聚(醚)、聚(胺)、聚(羧酸)等。肽可以具有混合的序列，且由单个氨基酸组成，例如，聚(赖氨酸)。示例性的多糖是聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)，例如，m-PEG。聚(乙烯亚胺)是示例性的聚胺，聚(丙烯酸)是代表性的聚(羧酸)。

根据本发明的水溶性的聚合物的聚合物主链可以是聚(乙二醇) (即PEG)。与本发明有关的术语PEG包括任意形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG、双功能的PEG、多臂的PEG、叉状的（forked）PEG、分支的PEG、悬垂的(pendent)PEG(即具有一个或多个从聚合物主链悬垂的官能团的PEG或有关的聚合物)或具有可降解的键的PEG。

聚合物主链可以是线性的或分支的。分支的聚合物主链是本领域普遍已知的。一般地，分支的聚合物具有中心分支核心部分和连接到该中心分支核心的许多线性的聚合物链。PEG通常以分支形式使用，其可以通过将环氧乙烷添加到各种多元醇（例如丙三醇、季戊四醇和山梨糖醇）上来制备。中心分支部分也可以源自几个氨基酸，例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个实例中，分支的聚(乙二醇)可以表示为通式R(-PEG-OH)_m，其中R代表核心部分，例如丙三醇或季戊四醇，且m代表臂的数目。多臂的PEG分子，例如在本文中整体并入作为参考的美国专利号5,932,462中所述的那些，也可以用作聚合物主链。

许多其它的聚合物也适用于本发明。非肽的和水溶性的聚合物主链在本发明中特别有用。合适的聚合物的实例包括、但不限于，其它聚(亚烷基二醇)例如聚(丙二醇) ("PPG")、乙二醇和丙二醇的共聚物等，聚(氧乙基化的多元醇)，聚(烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(羟丙基甲基丙烯酰胺)，聚(α -羟酸)，聚( 乙烯醇)，聚磷腈（polyphosphazene），聚唑啉，聚(N-丙烯酰吗啉)，例如在本文中整体并入作为参考的美国专利号5,629,384中所述的那些，以及它们的共聚物、三元共聚物和混合物。

尽管聚合物主链的每条链的分子量可以变化，但它通常是在从约100 Da至约160,000 Da、例如从约5,000 Da至约100,000 Da的范围内。更具体地，根据本发明的每个缀合的亲水聚合物的大小可以从约500 Da至约80,000 Da变化，例如约1000 Da至约80,000 Da；约2000 Da至约70,000 Da；约5000至约70,000 Da；约5000至约60,000 Da；约10,000至约70,000 Da；约20,000至约60,000 Da；约30,000至约60,000 Da；约30,000至约50,000 Da;或约30,000至约40,000 Da。应当理解，这些大小代表估计值，而不是精确测量值。根据优选的实施方案，根据本发明的分子缀合亲水聚合物的异质群体，例如大小为例如10,000、40,000或80,000 Da±约5000、约4000、约3000、约2000或约1000 Da的PEG。

白蛋白结合物缀合物/侧基

已知通过使用结合白蛋白的侧链，可以提高这样的蛋白的体内性质。可以在施用之前，将这样的侧链或白蛋白结合物连接到蛋白上，且可以例如在体内稳定化蛋白，或提高或延长蛋白的体内半衰期。

白蛋白结合物因此可以促进衍生物在血流中的循环。由于肽衍生物和白蛋白的复合物仅仅缓慢地分解以释放出活性药物成分的事实，白蛋白结合物可能具有延长或拖长它结合的蛋白的作用时间的作用。因而，优选的取代基或侧链作为整体可以称作结合白蛋白的部分。

白蛋白结合物(结合白蛋白的部分)可以包括与白蛋白结合、并因而与在血流中的循环的延长特别相关的部分，该部分因此可以称作延长部分。相对于它和肽的连接点，延长部分优选地在结合白蛋白的部分的相对末端处或附近。

在一个优选的实施方案中，白蛋白结合物是或包括能够与白蛋白形成非共价复合物的侧链。白蛋白结合物可以非共价地和/或可逆地结合白蛋白。白蛋白结合物可以特异性地结合白蛋白。从下面描述的方法显而易见，白蛋白结合物可以结合环糊精。白蛋白结合物可以非共价地和/或可逆地结合环糊精。白蛋白结合物可以特异性地结合环糊精。

结合白蛋白的部分的其它部分（即在延长部分和肽连接点之间的部分）可以称作连接物部分、连接物、隔离物等。但是，这样的连接物的存在是任选的，因此结合白蛋白的部分可以与延长部分相同。在具体实施方案中，结合白蛋白的部分和/或延长部分是亲脂的和/或在生理pH (7.4)带负电荷的。

结合白蛋白的部分和/或延长部分可以通过缀合化学共价地连接到肽的氨基上，诸如通过烷基化、酰化或酰胺形成；或连接到羟基上，诸如通过酯化、烷基化、肟化。在一个优选的实施方案中，在酰胺键形成下(该过程称作酰化)，将结合白蛋白的部分和/或延长部分的活性酯共价地连接到唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基上。除非另有说明，当提及蛋白的酰化时，是指将氨基连接到糖蛋白的唾液酸残基上。

为了本发明的目的，术语“结合白蛋白的部分”、“延长部分”和“连接物”包括这些分子的未反应的和反应的形式。从该术语使用的上下文中，可以清楚是否表示一种形式或另一种形式。结合白蛋白的部分可以是或可以包括脂肪酸或脂肪二酸或其中任一种的衍生物。术语“脂肪酸”表示具有4-28个碳原子（诸如16个碳原子）的脂族单羧酸。它优选地是直链的和/或偶数的，且它可以是饱和的或不饱和的。术语“脂肪二酸”表示上面定义的脂肪酸，但是具有在ω 位置的一个额外羧酸基团。因而，脂肪二酸是二羧酸。命名法与本领域常用的一样，例如-COOH以及HOOC-表示羧基；-C₆H₄-表示亚苯基；-CO-以及-OC-表示羰基(O=C<)；且C₆H₅-O-表示苯氧基。在一个优选的实施方案中，连接物部分如果存在，则具有2-80个C原子、优选5-70个C原子。在其它优选的实施方案中，连接物部分如果存在，则具有4-20个杂原子、优选2-40个杂原子、更优选3-30个杂原子。杂原子的特别优选的实例是N-和O-原子。H-原子不是杂原子。

在另一个实施方案中，所述连接物包含至少一个OEG分子和/或至少一个谷氨酸残基或其它对应的基团 (OEG 指示8-氨基-3,6-二氧杂辛酸，即该基团: -NH-(CH₂)₂-O-(CH₂)₂-O-CH₂-CO-)。在一个优选的实施方案中，所述连接物部分包含通过酰胺键连接到唾液酸残基上的二羧基残基。在优选的实施例中，所述二羧基残基具有2-30个C原子、优选4-20个C原子、更优选4-10个C原子。在其它优选的实施例中，所述二羧基残基具有0-10个杂原子、优选0-5个杂原子。

在另一个优选的实施例中，所述连接物部分包含含有氨基和远端羧基的基团，所述基团通过它的远端羧基经由酰胺键连接到唾液酸残基上。在一个优选的实施方案中，该基团是OEG基团。

氨基酸谷氨酸(Glu)包含2个羧酸基团。它的γ-羧基优选地用于与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基、或与OEG分子的氨基（如果存在的话）、或与另一个Glu残基的氨基（如果存在的话）形成酰胺键。Glu的氨基又与延长部分的羧基、或与OEG分子的羧基（如果存在的话）、或与另一个Glu的γ-羧基（如果存在的话）形成酰胺键。Glu的这种包含方式有时简称为“γ-Glu”。

N-和O-连接的寡糖: 通过生产蛋白的细胞，使N-聚糖和O-聚糖连接到蛋白上。随着新生的蛋白从核糖体转运到内质网，细胞的N-糖基化机构识别和糖基化氨基酸链中的N-糖基化信号(N-X-S/T基序) (Kiely 等人 1976；Glabe 等人 1980)。同样地，将O-聚糖连接到氨基酸链中的特定O-糖基化位点上，但是触发O-糖基化的基序比N-糖基化信号的异质性高得多，我们仍然不能预测氨基酸序列中的O-糖基化位点(Julenius 等人 2004)。给多肽缀合不同的聚合侧基的方法描述在例如WO0331464中。

“糖蛋白IIb/IIIa”或“GPIIb/IIIa”是在血小板中发现的整联蛋白。它是纤维蛋白原的受体，并辅助血小板活化。通过GPIIb和GPIIIa的钙-依赖性的结合，形成复合物，这是正常的血小板聚集和内皮粘附必需的步骤。血小板活化导致血小板GPIIb/IIIa受体的构象变化，其诱导与纤维蛋白原的结合。根据本发明的非抑制性的GPIIb/IIIa抗体不应当指向纤维蛋白原识别部分，该部分包含在整联蛋白的球形头中的配体结合袋。没有完全理解GPIIb/IIIa的哪个部分直接参与RGD识别并因此参与纤维蛋白原结合。但是，在GPIIIa中，据称氨基酸109-171参与相互作用 (D’Souza 等人, Science 242; 91-93, 1988)，而在GPIIb中，认为重要的氨基酸包括氨基酸294-314 (D’Souza 等人, JBC 265:6 ;3440-46, 1990)或氨基酸145-224 (Kamata 等人, JBC 271:18610-15, 1996, Tozer 等人, Blood 93:918-24 1999, Basani 等人, Blood 95.180-88, 2000)。认为根据本发明的非抑制性的AP3抗体具有结合位于GPIIIa的氨基酸348-421内的表位的能力，因此不会干扰纤维蛋白原结合(Kouns 等人 Blood 15;78(12):3215-23, 1991)。

本文使用的术语“GPIIb/IIIa抗体”、“靶向因子”意在表示具有特异性地结合GPIIb/IIIa 整联蛋白的能力的免疫球蛋白分子和其片段。所述GPIIb/IIIa抗体此外可以以基本上非抑制性的方式结合GPIIb/IIIa受体，这意味着，在结合GPIIb/IIIa抗体以后，血小板的结合纤维蛋白原并聚集形成初级血块的能力没有显著减少(例如与加入参照抗体相比，减少了小于20%、15%、10%、5%或1%)。通过监测穿过分离的血小板的悬浮液的光透过变化，测量血小板聚集。该方法基本上由Gustav von Born在二十世纪六十年代首次描述(Born, Nature 1962)，现在是最常用的评价血小板功能的方法之一。简而言之，该方法测量光透过血小板悬浮液的能力。该血小板悬浮液可以是富含血小板的血浆或分离的血小板。照射样品，并测量透过样品的光的量。在活化后，GPIIb/IIIa改变它的构象为纤维蛋白原高结合状态，且在有纤维蛋白原存在下，血小板会开始形成聚集体。这反映为光透过的增加，因为更多的光会穿过具有少量大聚集体（与许多单个的血小板相比）的样品。

全长抗体包含4个多肽链，即通过二硫键相互连接的2个重(H)链和2个轻(L)链。每个重链包含一个重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含一个轻链可变区 (在本文中缩写为LCVR或VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成高变异性区域，称作互补性决定区(CDR)，其中含有更保守的区域，称作框架区(FR)。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，它们从氨基端向羧基端以下述次序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。因而，保留特异性地结合GPIIb/IIIa的能力的抗体的一个或多个片段，也在抗体的定义内。

已经证实，抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。被包括在术语“抗体”内的结合片段的实例包括：(i) Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab)₂和F(ab')₂片段，即包含通过铰链区中的二硫键相连的2个Fab片段的二价片段；(iii) 由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv) 由抗体的单个臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v) dAb片段 (Ward 等人, (1989) Nature 341:544-546 )，其由VH结构域组成；和(vi) 分离的互补性决定区 (CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由单独的基因编码，使用重组方法，通过能够使它们成为单个蛋白链的合成的连接物，可以将它们连接到一起，在所述链中，VL和VH区配对，形成单价分子(称作单链Fv (scFv); 参见例如，Bird 等人 (1988) Science 242:423-426:和Huston 等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意图包括在术语“抗体”内。

也包括其它形式的单链抗体，诸如双特异抗体。双特异抗体是二价的双特异性的抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但是使用太短不足以允许在相同链上的2个结构域之间配对的连接物，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对，并建立2个抗原结合位点(参见例如，Hol-liger, P., 等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., 等人 (1994) 结构 2:1121-1123)。应当理解，蛋白X可以具有1个或多个抗原决定簇，其包括：(1) 由蛋白X内的单条肽链组成的肽抗原决定簇，(2) 由超过超过1个空间上邻近的肽链组成的构象抗原决定簇，所述肽链各自的氨基酸序列沿着蛋白X 多肽序列不连续分布；和(3) 翻译后抗原决定簇，其全部或部分地由在翻译后共价地连接到蛋白X上的分子结构组成，诸如碳水化合物基团等。

在另一个优选的实施方案中，非抑制性的GPIIb/IIIa抗体是AP3、Tb或SZ22抗体或其片段。

本文使用的术语“人抗体”是指，具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过随机的或位点特异性的体外诱变或体内体细胞突变而导入的突变)，例如在CDR中，尤其是在CDR3中。

本文使用的术语“表位”是指抗体结合的抗原上的任何抗原决定簇。表位决定簇通常由分子（诸如氨基酸或糖侧链）的化学活性的表面分型（grouping）组成，且通常具有特异性的三维结构特征以及特异性的电荷特征。

一般而言，GPIIb/IIIa抗体可以以任何合适的方式结合FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列。因而，例如，所述抗体可以表达为含有FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列的“融合蛋白”的一部分，或通过化学和/或酶促方法，分别连接。在该后一个方面，通过分选酶-或羧肽酶-介导的转酰基作用，可以使抗体结合到FVIII或FVIII 类似物序列上(关于有关方法和原理的描述，参见，例如，Stennicke, 国际专利公开 WO2006/013202 A2; Hoess 等人, 国际专利申请 WO206/015879 A1; Zhang 等人, Protein Exp. Purif. (2004) 36, 292-299)。

在一个方面，使GPIIb/IIIa抗体结合到FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列上(即，“工程化”)，使得它在例如插入B-结构域下，可以从FVIII或FVIII 类似物序列切割掉。

在一个方面，本发明提供了FVIII分子，其包含2个或更多个GPIIb/IIIa抗体，或其包含特异性地结合2种或更多种靶物的单个抗体。例如，在一个方面，本发明提供了FVIII分子，其包含双特异性的或多特异性的抗体或抗体片段。在一个方面，所述抗体是多特异性的抗体分子(全长抗体或抗体片段)，其中抗体的一个靶物(诸如双特异性抗体的1个“臂”)特异性地结合在FVIII分子中包含的B-结构域的一部分，且其它部分结合与血小板和/或巨核细胞有关的靶物。B-结构域-特异性的抗体的实例是本领域已知的(参见，例如，Lavigne-Lissalde 等人, THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS, Volume: 98, Issue: 1, 第138-147页, 2007)。

从前述段落的方面显而易见的是：通过除了共价键合以外的其它合适的方式，包括通过非共价蛋白-蛋白、蛋白-部分或部分-部分相互作用，GPIIb/IIIa抗体可以结合FVIII分子的含有FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列的部分。在其它方面，如本文别处所述，GPIIb/IIIa抗体通过至少一个共价键结合到FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列上。在一个方面，GPIIb/IIIa抗体通过酰胺键结合到FVIII或FVIII 类似物氨基酸序列上(例如，在FVIII氨基酸序列和GPIIb/IIIa抗体的“融合蛋白”的情况下)。还显而易见的是与氨基酸序列的连接可以是直接的或间接的。例如，所述连接可以包含合适的连接物，其可以是化学部分(在例如美国专利公开号20030236190中描述的实施例)或氨基酸序列，诸如柔性的Gly(X)Ser(Y)连接物。在另一个方面，所述连接是通过与氨基酸序列的氨基酸结合的聚糖。甚至这样的聚糖连接可以包含额外的连接元件，例如，在用结合靶向分子的元件衍生化聚糖本身的情况下。

更一般地理解，可以以任何合适的方式组合本发明的不同方面。因而，例如，在一个方面，本发明提供了FVIII分子，其包含双特异性的 GPIIb/IIIa抗体分子部分（其结合FVIII分子的B-结构域）和允许从FVIII分子去除B-结构域（从而从有活性的FVIII分子释放靶向抗体分子部分）的切割位点(其可以是天然的凝血酶切割位点)。

使用常规的和已知的方法，也可以容易地测试本发明的FVIII分子的生物活性。例如，可以用静止血小板（resting platelet）温育FVIII分子，通过例如凝胶过滤或差速离心纯化结合的血小板，并用凝血酶活化FVIII分子；此后，通过标准的产色测定(例如COATEST)或凝结测定，可以观察催化效率和活性证实。使用标准的方法，可以类似地评估体内半衰期的延长。例如，通过几种不同的方法，包括凝结测定(FVIII^空/空小鼠)或FX活性测定，可以监测A型血友病小鼠(FVIII^空/空)的特定FVIII活性。应当指出，尽管参照人因子VIII予以描述，本发明的方法可以适用于来自其它哺乳动物（诸如狗、小鼠等）的因子VIII蛋白。这样的蛋白是本领域已知的，且本发明的方法对于FVIII的这种同系物和其它物种的应用不需要过多常规试验。

可以以类似于或稍微小于为了有关的希望的生理学作用而通常施用给受试者或患者的FVIII的量的剂量，提供本发明的FVIII分子。一般而言，本领域已知的FVIII制剂也可以用于制备包含本发明的FVIII分子的药物组合物。

本发明也提供了核酸，其编码根据本发明的融合蛋白FVIII分子。所述核酸可以是编码这种分子的任意合适类型的核酸 (例如，ssDNA、dsDNA或RNA，其可以包含本领域技术人员已知的不同的合适的修饰，诸如硫代磷酸酯主链)。核酸可以另外包括表达元件，诸如启动子、增强子、多聚腺核苷酸序列等。这样的核酸也可以整合进合适的载体中，所述载体甚至包含其它元件（诸如抗性基因等），其可以是任意合适类型的载体(例如，病毒载体，诸如腺病毒、痘病毒或腺相关病毒载体或质粒载体)。这样的核酸和载体可以进一步整合进合适的用于表达或维持的宿主细胞中，其通常是哺乳动物细胞，诸如COS或HEK细胞。在该方面和其它方面，本发明提供了生产本发明的FVIII分子和本发明的潜在FVIII分子的方法。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的FVIII分子另外具有受调节的、优选降低的vWF结合能力，优选地通过包含在位置1680中的氨基酸置换，例如下述置换之一：Y1680F、Y1680R、Y1680N或Y1680C而引起。在其它优选的实施方案中，根据本发明的FVIII分子包含这样的氨基酸突变，其可以导致例如受调节的与例如LPR、不同受体、其它凝血因子、细胞表面等的结合。

在另一个实施方案中，根据本发明的因子VIII分子通过连接物共价地连接到非抑制性的GPIIb/IIIa抗体上。优选地，所述连接物包含在FVIII分子上的N-连接的或O-连接的聚糖。根据一个特别优选的实施方案，所述聚糖被放在根据本发明的因子VIII分子的B结构域中。所述B-结构域优选地是截短的B-结构域。

在一个特别优选实施方案中，通过连接FVIII的B-结构域的O-连接的聚糖和非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的N-连接的聚糖的连接物，连接非抑制性的GPIIb/IIIa抗体和FVIII。在另一个优选的实施方案中，所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体是全长抗体。在一个优选的实施方案中，该全长抗体是AP3-抗体、SEQ 1和2、或SEQ 1和3。

在另一个优选的实施方案中，非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的N-连接的聚糖是该抗体的恒定区的一部分。在另一个优选的实施方案中，非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的N-连接的聚糖是该抗体的轻链的一部分。所述连接物可以包含聚乙二醇聚合物。

在另一个优选的实施方案中，通过连接FVIII的B-结构域的完整O-连接的聚糖和非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的完整N-连接的聚糖的连接物，连接非抑制性的GPIIb/IIIa抗体和FVIII。

在不同的优选的实施方案中，通过连接FVIII的B-结构域的O-连接的聚糖和非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的N-端的连接物，连接非抑制性的GPIIb/IIIa抗体和FVIII。在一个优选的实施方案中，所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体是AP3 Fab-片段。

在另一个优选的实施方案中，通过连接FVIII的B-结构域的O-连接的聚糖和非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的 Cys残基的连接物，连接非抑制性的GPIIb/IIIa抗体和FVIII。在一个优选的实施方案中，所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体是AP3 ScFv。

在另一个优选的实施方案中，通过连接FVIII的B-结构域的O-连接的聚糖和非抑制性的GPIIb/IIIa抗体的一个或多个Lys残基的连接物，连接非抑制性的GPIIb/IIIa抗体和FVIII。在一个优选的实施方案中，所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体是AP3 全长抗体(SEQ 1和2，或SEQ 1和3)。

在另一个优选的实施方案中，使非抑制性的GPIIb/IIIa抗体融合到根据本发明的B结构域截短的因子VIII分子的B-结构域上。本发明因此也包含编码这样的分子的核酸和载体，以及包含这样的核酸和/或载体的宿主细胞。

在另一个优选的实施方案中，用非抑制性的GPIIb/IIIa抗体替换根据本发明的VIII分子的A3结构域。

根据一个特别优选的实施方案，根据本发明的FVIII分子包含如在SEQ ID NO 3中所述的序列，且所述连接物包含置于B结构域中的O-连接的聚糖。

本发明的另一个方面涉及生产根据本发明的FVIII分子的方法，所述方法包括：表达根据本发明的核酸。或者，根据本发明的方法包含用GPIIb/IIIa抗体缀合FVIII分子。

另一个方面涉及药物组合物，其包含根据本发明的FVIII分子。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的FVIII分子用于生产药剂的应用，所述药剂用于治疗A型血友病。

在最后一个方面，本发明涉及治疗哺乳动物宿主中的A型血友病的方法，所述方法包括：给所述宿主施用治疗有效量的根据本发明的分子。

构建

在本文中引用的所有参考文献（包括出版物、专利申请和专利）以其全部内容引入作为参考，其程度如同将每篇参考文献分别且特别地指出引入作为参考和在本文中全部阐述（达到法律许可的最大程度），不考虑在本文中别处说明的特定文件的任意分别提供的引入。

在描述本发明的上下文中使用的术语“一个”、 “一种”和“所述的”和类似的指示物应当解释为包括单数和复数，除非本文中另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，本文提供的所有精确值代表相应的近似值（例如，关于特定因子或测量所提供的所有精确示例值可被认为也提供相应的近似测量，在适当时，用“约”修饰）。

关于元件使用“包含”、“具有”、“包括” 或“含有”等术语对本发明的任何方面或实施方案的描述，意在提供对于本发明的“基本上包含”那些特定元件或“基本上由其组成”、“由其组成”的类似方面或实施方案的支持，除非另有说明或与上下文明显矛盾（例如，本文描述为包括一种特定组分的组合物应当理解为也描述了由所述组分组成的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾）。

所有标题和小标题都在本文中仅仅为了方便而使用，不应当解释为以任何方式限制本发明。本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用，仅仅意图更好地阐释本发明，不构成对本发明范围的限制，除非另有声明。在说明书中的语言不应解释为，指示任何没有声明的元件是实践本发明所必需的。

在本文中对专利文件的引用和并入，仅仅为了方便而进行，不反映这样的专利文件的有效性、可专利性和/或强制许可的任何观点。本发明包括在权利要求书和/或本文包括的适用法律准许的方面中列举的主题的所有修饰和等同方案。

实施例

实施例1

FVIII框架和融合配偶体

本发明的融合蛋白由连接到来自另一种蛋白的多肽 (融合配偶体)上的FVIII蛋白(FVIII部分)组成。

融合蛋白的FVIII部分可以是具有FVIII活性的任意蛋白。FVIII部分可以是B结构域缺失/截短的(BDD) FVIII蛋白，其中FVIII B结构域的部分已经从蛋白去除。F8-500是BDD 人FVIII蛋白。从N-端开始，F8-500由以下组成：FVIII 信号肽 (氨基酸-19至-1)、随后的没有B结构域的FVIII HC (氨基酸1-740)、21个氨基酸的连接物(SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR) (SEQ ID NO 4)和FVIII LC (野生型人FVIII的氨基酸1649-2332)。21个氨基酸的连接物的序列源自FVIII的B结构域，且由全长野生型人FVIII的氨基酸741-750和1638-1648组成。

F8-500-Δa3由没有a3区域的F8-500组成。在F8-500-Δa3中，从F8-500中消除了野生型人FVIII的氨基酸1647-1687。因此，在氨基酸1645-1648处的弗林蛋白酶位点被破坏。但是，通过F8-500-Δa3中的R1645-H1646-P1688-R1689氨基酸段，建立组合的弗林蛋白酶和凝血酶位点。a3区域对于FVIII与vWF的结合而言是重要的，因此，与野生型FVIII 相比，F8-500-Δa3对vWF的亲和力降低。

F8-500-His由具有His标签的F8-500组成，所述His标签插入F8-500的接头中。因而，F8-500-His的接头序列是SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 5)。

F8-500-Δa3-His由没有a3区域、但是具有插入F8-500的接头中His标签的F8-500组成。因而，在F8-500-Δa3-His中，已经从F8-500中消除了野生型人FVIII的氨基酸1647-1687，且接头序列是SFSQNSRHPSHHHHHHSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 6)。

F8-500-Y1680F和F8-500-Y1680C由F8-500组成，其中全长野生型人FVIII的氨基酸1680已经分别从酪氨酸变为苯丙氨酸和半胱氨酸。这两种氨基酸替换都会减少FVIII对vWF因子的亲和力。此外，Y1680C氨基酸替换会导入游离的半胱氨酸，其可以用作将延长部分缀合到融合蛋白上的柄。

可以将融合配偶体连接到融合蛋白的FVIII部分上的几个位置。在FVIII上用于连接融合配偶体的位置的非限制性实例是在B结构域中或在FVIII HC和LC之间的B-结构域-衍生的连接物中，在a3的位置，和在FVIII LC的C-端。

实施例2

编码FVIII框架和融合蛋白的表达载体的构建

在FVIII和融合配偶体之间的融合都包含用于扩增融合配偶体的PCR。将限制位点添加到使用的PCR引物的末端。将限制性酶用于克隆融合配偶体cDNA或从DNA合成FVIII cDNA。

在F8-500的B-结构域中的融合发生在氨基酸750和氨基酸1638之间。在B-结构域内或在B-结构域两侧的限制位点AvrII、NruI、AgeI和MluI被用于插入编码融合配偶体的DNA。

为了在FVIII轻链的羧基端处融合，修饰编码F8-500的构建体。通过定点诱变，消除内部的BamHI位点(氨基酸604-606)，并将编码柔性的(GGGS)₆ 连接物的DNA插入编码区的3’端。将一个新的BamHI位点导入编码连接物的DNA的3’末端，以便容易地克隆BamHI和NotI位点之间的C-端融合配偶体。随后，插入融合配偶体DNA。

为了在a3 位置处插入编码融合配偶体的DNA、从而在编码的蛋白中用融合配偶体替换a3，将SacII限制位点导入a3的编码区的3’端。因而，通过在AgeI和SacII位点之间或在AvrII和SacII位点之间的插入，可以导入编码融合配偶体的DNA。

实施例3

全长AP3 mIgG1抗体

使用SMART^? RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech, Ca, USA)，从分离自表达AP3抗体的杂交瘤细胞的RNA，扩增抗-GPIIa/IIIB抗体AP3的重链和轻链的可变区。用于扩增2个AP3链的可变区的引物是：

重链:

通用引物Mix A (Clontech, CA):

长(0.4 μM):

5'–ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT–3' (SEQ ID NO 7)

短(2 μM):

5'–ctaatacgactcactatagggc–3' (SEQ ID NO 8)

引物 69 (10 μM)

5'–gctctagactaacactcattcctgttgaagctcttg-3’ (SEQ ID NO 9)

轻链

通用引物Mix A (Clontech:

长(0.4 μM):

5'–ctaatacgactcactatagggcAAGCAGTGGTATCACGCAGAGT–3' (SEQ ID NO 10)

短(2 μM):

5'–ctaatacgactcactatagggc–3' (SEQ ID NO 11)

引物 312 (10 μM)

5'–gtctaccacaacacacgtgac-3’ (SEQ ID NO 12)。

使用用于测序的Zero Blunt? TOPO? PCR克隆试剂盒(目录号K287520, Invitrogen, CA, USA)，将可变区克隆进pCR4 载体中。随后，将重链可变区亚克隆进基于pTT5的含有鼠IgG1框架的表达载体的EcoRI/BamHI位点中，以产生AP3 mIgG1重链。AP3 mIgG1重链的氨基酸序列如下所示。使用有义引物 AP-3 LC kl1 (5’-GACTTTTTG-TATGAATTCCTCACCATGAGGTGC-3’; SEQ ID NO 13)和M13 反向引物，从pCR4 载体扩增AP3 IgΚ轻链。将PCR片段亚克隆进基于空pTT5的表达载体的EcoRI位点。AP3 mIgΚ轻链蛋白的氨基酸序列如下所示。在Hek293 6E细胞中，短暂地表达编码全长AP3抗体的2个载体。按照生产商提供的说明书，使用293fectin作为转染剂(目录号12347-019, Invitrogen, Ca, USA)，进行转染。在收获之前，将转染放置5天。

在AP3抗体的轻链中，鉴别出在位置 39 (根据Kabat编号系统，则位置 34)处的潜在有问题的半胱氨酸。使用QuikChange定位诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene, CA, USA)和下述两种引物，通过定位诱变，成功地将半胱氨酸残基突变为丝氨酸：

AP3 LC C39S S

5’-caacacttacttgtcctggttcctgcag-3’ (SEQ ID NO 14)

AP3 LC C39S AS

5’-ctgcaggaaccaggacaagtaagtgttg-3’ (SEQ ID NO 15)

得到的蛋白的序列如下所示。通过组合表达SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 19的2种载体构建体，可以表达含有C39S 突变的全长AP3 mIgG1抗体。

实施例4

AP3 FL mIgG1野生型和AP3 FL mIgG1野生型HC LC C39S的纯化。

通过使用蛋白A MabSelect SuRe树脂 (GE Healthcare, 目录号17-5438-01)的亲和色谱法组成的1步法，进行AP3 FL mIgG1野生型和AP3 FL mIgG1野生型HC LC C39S蛋白(实施例3)的纯化。使用?ktaExplorer色谱系统 (GE Healthcare, 目录号18-1112-41)，进行纯化。用于纯化步骤的缓冲液系统是由Tris、3 M NaCl、pH 8.5组成的平衡缓冲液和由10 mM 甲酸pH 3.5组成的洗脱缓冲液。将上清液调节至3 M NaCl和pH 8.5，然后应用于MabSelect SuRe柱。用15倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱，并用约1倍柱体积的洗脱缓冲液等度（isocratically）洗脱蛋白。使用SDS-PAGE/考马斯和SEC-HPLC，分析AP3 FL mIgG1野生型HC LC C39S，证实纯化得到纯的且均质的约150 kDa (约50 kDa重链组分和约25 kDa轻链组分)的蛋白，通过SEC-HPLC测得纯度>98%。为了测量最终的蛋白浓度，一起使用NanoDrop 分光光度计 (Thermo Scientific)，消光系数为1.56。

通过减少的完整mAb的LC-MS 分析，进行抗体的表征。经证实，重链含有G0F和G1F聚糖。经证实，轻链被双触角的聚糖糖基化，所述聚糖具有1个唾液酸(G2FS)作为主要结构。用唾液酸酶处理，得到预期的291原子质量单位（amu）的质量值迁移，证实唾液酸的存在。

通过FACS分析，证实全长AP3 FL mIgG1野生型抗体与静止血小板的结合。

SEQ ID NO 17: AP3 mIgG1 HC

QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

SEQ ID NO 18: AP3 mIgΚ LC

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNNYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC

SEQ ID NO 19: AP3 IgΚ LC C39S

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLSWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNNYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC。

实施例5

AP3 scFV 构建体

基于编码AP3抗体的轻链和重链的可变区的DNA序列，从德国MWG biotech订购AP3抗体的2种单链抗体形式(AP3 LC-HC scFV和AP3 HC-LC scFV)。在SEQ ID NO 22和SEQ ID NO 23中指示了2种scFV蛋白的氨基酸序列。构建包括导入在2个可变区之间的15氨基酸(G₄S)₃)接头区，以便允许V_H和V_L片段的正确配对。为了纯化目的，在两种蛋白的C-端中包括Flag标签。

随后，将编码AP3抗体的2种单链形式的基因亚克隆进基于pTT5的表达载体的HindIII位点。按照生产商提供的说明书，使用293fectin作为转染剂 (目录号12347-019, Invitrogen, Ca, USA)，在Hek293 6E细胞中短暂地表达编码2种单链AP3抗体的2种构建体。在收获之前，将转染放置5天。

通过FACS 分析，证实两种单链AP3抗体AP3-LC-HC scFV-FLAG、AP3-HC-LC scFV-FLAG与静止血小板的GPIIa/IIIB的结合。

在AP3 LC-HC scFV构建体中，在AP3抗体的轻链中鉴别出的在位置 39 (根据Kabat编号系统，则位置 34)处的潜在有问题的半胱氨酸被突变成丝氨酸。这使用QuikChge定位诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene, CA, USA)并按照生产商提供的说明书，并使用下述两种引物来进行：

AP3 LC C39S S

5’-caacacttacttgtcctggttcctgcag-3’ (SEQ ID NO 20)

AP3 LC C39S AS

5’-ctgcaggaaccaggacaagtaagtgttg-3’ (SEQ ID NO 21)

得到的AP3 LC-HC scFV-FLAG C39S蛋白的序列如SEQ ID NO 24所示。

SEQ ID NO 22: AP3-LC-HC scFV-FLAG

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSDYKDDDDK*

SEQ ID NO 23: AP3-HC-LC scFV-FLAG

QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRDYKDDDDK*

SEQ ID NO 24: AP3-LC-HC scFV-FLAG C39S

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLSWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSDYKDDDDK*

通过FACS 分析，证实单链抗体AP3 LC-HC scFV-FLAG C39S与静止血小板的结合。

实施例6

AP3 scFV-Cys 构建体

为了促进AP3 LC-HC scFV C39S向FVIII的缀合，通过定位诱变，将游离的Cys残基导入scFV中。制备2种构建体。在一种构建体中，使用QuikChange定位诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene, CA, USA)并按照生产商提供的说明书，并使用下述两种引物，通过定位诱变，将未配对的半胱氨酸残基导入AP3 LC-HC scFV蛋白的C-端：

AP3 scFV Cys S

5'–cgacgacgacaagtgctgaaagcttcgtacg-3’ (SEQ ID NO 25)

AP3 scFV Cys AS

5'–cgtacgaagctttcagcacttgtcgtcgtcg-3’ (SEQ ID NO 26)。

在另一种构建体中，通过将在AP3 LC-HC scFV的位置 248处的丝氨酸突变成半胱氨酸，导入未配对的半胱氨酸。随后，使用QuikChange定位诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene, CA, USA)，按照生产商提供的说明书，并使用下述两个引物集合（primer set），将在AP3抗体的轻链中鉴别出的在位置 39 (根据Kabat编号系统，则位置 34)处的潜在有问题的半胱氨酸突变成丝氨酸：

引物集合A

AP3 scFV LC-HC S248C S

5'–gtgaccgtgagctgcgactacaaggac-3’ (SEQ ID NO 27)

AP3 scFV LC-HC S248C AS

5'–gtccttgtagtcgcagctcacggtcac-3’ (SEQ ID NO 28)

引物集合B

AP3 LC C39S S

5’-caacacttacttgtcctggttcctgcag-3’ (SEQ ID NO 29)

AP3 LC C39S AS

5’-ctgcaggaaccaggacaagtaagtgttg-3’ (SEQ ID NO 30)。

在Hek293 6E细胞中暂时表达所有AP3 scFV 构建体。使用293fectin 作为转染剂 (目录号12347-019, Invitrogen, Ca, USA)，按照生产商提供的说明书，进行转染。在收获之前，将转染放置5天。

根据下述方法，纯化所有scFV片段。

实施例7

AP3 LC-HC scFV蛋白的纯化和表征

使用2步法，纯化AP3 LC-HC scFV蛋白(实施例5和6)，所述2步法由使用抗-FLAG M2 亲和凝胶(Sigma, 目录号A2220)的亲和色谱法和随后的Superdex 75pg凝胶过滤柱组成，以去除聚集体和其它高分子量污染物（如果观察到这些的话）(GE Healthcare, 目录号17-1068-01)。使用?ktaExplorer色谱系统 (GE Healthcare, 目录号18-1112-41)，进行纯化。用于该第一个纯化步骤的缓冲液系统是：由20 mM Hepes、150 mM NaCl、0.01%吐温-80 (v/v)、pH 7.5组成的平衡缓冲液，和由100 mM 甘氨酸pH 3.5/NaOH组成的洗脱缓冲液。首先，用0.5 M Hepes pH 10.5，将上清液调至pH 6.7，或直接施加于预平衡的抗-FLAG M2 亲和柱上。用10倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱，并在约2倍柱体积的洗脱缓冲液中等度洗脱蛋白。在100 mM Hepes、150 mM NaCl、pH 7.5中，以1:1稀释洗脱的蛋白，并使用SDS-PAGE/考马斯和SEC-HPLC进行分析。如果从第一个纯化步骤得到约28 kDa的纯的(>75%)且均质的蛋白，不进行进一步纯化。否则，使用20mM Tris、1M NaCl、pH 7.5，进行第二个凝胶过滤步骤。施加2-3.5%负载，并使用SDS-PAGE/考马斯和SEC-HPLC，分析含有洗脱的蛋白的级分。基于该分析，制备含有纯的(>80%)且均质的蛋白的库。为了测量最终的蛋白浓度，一起使用NanoDrop 分光光度计 (Thermo Scientific)，消光系数为1.79。

SEQ ID NO 31: AP3 LC-HC scFV INS257C FLAG

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLCWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSDYKDDDDKC

SEQ ID NO 32: AP3 LC-HC scFV C39S S248C FLAG

DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSSRSLLHSNGNTYLSWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSCDYKDDDDK。

实施例8

AP3 Fab构建体

使用QuikChange定位诱变试剂盒(目录号200518, Stratagene, CA, USA)和下述两种引物，通过在编码SEQ ID NO 17的构建体中导入终止密码子，制备AP3重链的截短形式：

JP433 AP3 HC Fab S

Cagggattgtggttgaaagccttgcatatg (SEQ ID NO 33)

JP434 AP3 HC Fab S

Catatgcaaggctttcaaccacaatccctg (SEQ ID NO 34)

得到的蛋白的序列如SEQ ID NO 22所示。

通过组合表达SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 35的两种构建体，表达AP3抗体的功能Fab片段。在Hek293 6E细胞中，暂时表达2条链。使用293fectin作为转染剂 (目录号12347-019, Invitrogen, Ca, USA)，按照生产商提供的说明书，进行转染。在收获之前，将转染放置5天。

AP3 Fab LC C39S蛋白的纯化和表征

使用2步法，纯化AP3 Fab LC C39S蛋白，所述2步法由使用Source 30S (GE Healhcare, 目录号17-1273-01)的阳离子交换和随后的Superdex 75pg凝胶过滤柱 (GE Healthcare, 目录号17-1068-01)组成。使用?ktaExplorer色谱系统 (GE Healthcare, 目录号17-1068-01)，进行纯化。用于第一个纯化步骤的缓冲液系统是：由10 mM乙酸钠pH 5.0组成的平衡缓冲液，和由10 mM乙酸钠、1 M NaCl组成的洗脱缓冲液pH 5.0。通过加入milliQ，将收获物调至< 3 mS/cm，然后用0.5 M HCl调节pH至pH 5.0，并施加于预平衡的Source 30S柱。用15倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱。通过平衡缓冲液和洗脱缓冲液的线性梯度，洗脱蛋白20倍柱体积。蛋白洗脱在大约8倍柱体积中。使用20 mM磷酸钠、150 mM NaCl、pH 7.2，进行第二个凝胶过滤纯化步骤。施加2-3.5%负载，将蛋白收集在5-7%的柱体积中。使用SDS-PAGE/考马斯和SEC-HPLC，分析AP3 Fab LC C39S蛋白，证实纯化得到约50 kDa的纯的且均质的蛋白，通过SEC-HPLC测得91.9%的近似纯度。为了测量最终的蛋白浓度，一起使用NanoDrop 分光光度计 (Thermo Scientific)，消光系数为1.67。

SEQ ID NO 35: AP3 Fab HC

QVQLQQSGAELVRPGTSVKISCKASGYTFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIYPGGGYNKYNENFKGKATLTADTSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCAREYGNYDYAMDSWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCG。

实施例9

FVIII- AP3 scFV 融合物

使用AgeI和SacII 限制性酶，将AP3 LC-HC scFV或AP3 HC-LC scFV融合到B-结构域缺失的和a3-结构域缺失的FVIII 变体上。B-结构域缺失的和a3-结构域缺失的 FVIII缺少氨基酸751-1637和氨基酸1649-1685。将AP3 LC-HC scFV或AP3 HC-LC scFV插入氨基酸R1648和Q1686之间。使用具有各种限制性酶AgeI和SacII可识别的位点的引物，通过PCR，扩增AP3编码序列。进行PCR产物的部分限制酶切消化，因为DNA具有内源AgeI位点。

由于弗林蛋白酶位点(RHQR)位于AP3 scFV的N-端，AP3 scFV在加工后将构成FVIII轻链的N-端。凝血酶位点R1688-R1689也是保守的，且在这些FVIII变体的凝血酶活化以后，从FVIII 考虑（deliberate）AP3 scFV。

引物:

AP3-HC-LC-Da3-AgeI

Aacccaccggtcttgaaacgccatcaacggcaggtccagctgcagcagagc (SEQ ID NO 36)

AP3-HC-LC-Da3-SacII

Gaaagctccgcgggctctgccgcttgatttccagcttgg (SEQ ID NO 37)

AP3-LC-HC-Da3-AgeI

Aacccaccggtcttgaaacgccatcaacgggacatcgtgatgacccaggct (SEQ ID NO 38)

AP3-LC-HC-Da3-SacII

Gaaagctccgcgggctctggctgctcacggtcacggagg (SEQ ID NO 39)。

实施例10

FVIII框架和融合蛋白的暂时表达

用0.7 mg/l质粒和1.4 ml/l转染剂293Fectin (Invitrogen)的复合物，转染0.9 – 1.1 x 10⁶密度的HKB11细胞。如下制备转染复合物：分别在OPTIMEM (Invitrogen)中稀释质粒和转染剂，混合两种溶液，并在室温温育混合物20分钟。将复合物混合物加入细胞悬浮液中，并在摇床培养箱中在36.5℃和5%CO₂下温育悬浮液5天。在0.22 μm膜过滤器上，过滤细胞培养收获物。

实施例11

纯化FVIII框架和融合蛋白的一般程序

给柱装填树脂VIIISelect (GE Healthcare)，其具有1.6cm直径和4cm床高度的尺寸，达到8mL，并在500cm/h，用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80+250mM NaCl、pH7.3平衡。将如实施例3所述制备的培养物滤液施加于柱，随后用第一种平衡缓冲液洗涤柱，然后用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80+1.5M NaCl、pH7.3洗涤柱。在90cm/h，用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 2.5 M NaCl + 6.5M 丙二醇、pH7.3等度洗脱结合的FVIII。合并含有FVIII的级分，并用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80、pH7.3进行1:10稀释，并施加于用F25-琼脂糖填充的柱上 (Thim 等人, Haemophilia, 2009)。柱尺寸是，1.6cm直径和2cm床高度，得到4mL柱体积。在180cm/h，用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 150mM NaCl + 1M 甘油、pH7.3平衡柱，然后上样。上样后，首先用平衡缓冲液、然后用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 650mM NaCl、pH7.3，洗涤柱。在30cm/h，用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 2.5M NaCl + 50%(v/v) 乙二醇、pH7.3，等度洗脱结合的FVIII。合并含有FVIII的级分，并用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80、pH7.3进行1:15稀释，例外是，在相同的缓冲液中，对具有a3结构域缺失的FVIII-变体进行1:45稀释。将稀释的库施加于用Poros 50HQ填充的柱(PerSeptive Biosystem)，柱尺寸是0.5cm直径和5cm床高度，得到1mL柱体积。在300cm/h，用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 50mM NaCl + 1M 甘油、pH7.3平衡柱，然后上样。用平衡缓冲液洗涤柱，然后经5倍柱体积使用从平衡缓冲液至20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 1M NaCl + 1M 甘油、pH7.3的线性梯度洗脱。合并含有FVIII的级分，并将合并物在-80℃储存备用。

基本上如上所述，纯化具有HIS-标签的FVIII-变体，但是将第二个纯化步骤(F25-琼脂糖)更换为装有2倍柱体积的1M NiSO₄的螯合琼脂糖FF (GE Healtcare)。柱尺寸是0.5cm直径和5cm 床高度，得到1mL柱体积。在180cm/h，用30mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 1.5M NaCl、pH7.3平衡柱，然后上样。上样后，用30倍柱体积的平衡缓冲液洗涤柱，然后经5倍柱体积使用至250mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80 + 1.5M NaCl、pH7.3的线性梯度，进行洗脱。合并含有FVIII的级分，并用20mM 咪唑+ 10mM CaCl₂ + 0.01%吐温80、pH7.3进行1:30稀释。如上所述进行最终的纯化步骤(Poros 50HQ)。

实施例12

FVIII- AP3 scFV融合物的纯化和表征

使用3步法，纯化所述AP3 F8 融合蛋白(实施例9)，所述3步法由基于VIIISelect树脂 (GE Healhcare, 目录号17-5455-02)的免疫亲和色谱步骤、随后的基于与CNBr-琼脂糖FF偶联的抗体F25的第二个免疫亲和色谱步骤(Thim L, Vandahl B, Karlsson J, Klausen NK, Pedersen J, Krogh TN, Kjalke M, Petersen JM, Johnsen LB, Bolt G, N?rby PL, Steenstrup TD (2009) Purification and characterization of a new recombinant因子 VIII (N8) Haemophilia 16: 349-59)和最后的基于树脂 Poros 50HQ (Applied Biosystems 目录号1-2559-07)的阴离子交换色谱步骤组成。使用?ktaExplorer色谱系统 (GE Health-care, 目录号17-1068-01)，进行纯化。用于第一个纯化步骤的缓冲液系统是：由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、250mM NaCl、pH 7.3组成的平衡缓冲液，由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1.5M NaCl、pH 7.3组成的洗涤缓冲液，和由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 乙酸铵、6.5M 1, 2-丙二醇、pH 7.3组成的洗脱缓冲液。用由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、pH 7.3组成的稀释缓冲液，将收获物稀释2倍，并施加于预平衡的VIIISelect柱上。用6倍柱体积的平衡缓冲液和6倍柱体积的洗涤缓冲液，洗涤柱。以约3倍柱体积，等度洗脱蛋白。在进行第二个免疫亲和纯化步骤之前，使用上述的稀释缓冲液，将来自第一个纯化步骤的洗脱合并物稀释10倍。用于第二个纯化步骤的缓冲液系统是：由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、150 mM NaCl、pH 7.3组成的平衡缓冲液，由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1.5M NaCl、pH 7.3组成的洗涤缓冲液，和由0.5 M 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、150 mM NaCl、pH 7.3组成的洗脱缓冲液。将样品施加于预平衡的F25-琼脂糖FF柱以后，用6倍柱体积的平衡缓冲液和6倍柱体积的洗涤缓冲液，洗涤柱。以约1.5倍柱体积，等度洗脱蛋白。在第三个阴离子交换纯化步骤之前，使用上述的稀释缓冲液，将来自第二个纯化步骤的洗脱合并物稀释15x。用于第三个纯化步骤的缓冲液系统是：由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、50mM NaCl、1M 甘油、pH 7.2组成的平衡缓冲液，和由20mM 咪唑、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M NaCl、1M 甘油、pH 7.3组成的洗脱缓冲液。将样品施加于预平衡的Poros HQ50柱以后，用8倍柱体积的平衡缓冲液，洗涤柱。使用0 – 100%的线性梯度经5倍柱体积、随后用10倍柱体积的100%洗脱缓冲液，从柱洗脱蛋白。蛋白在梯度早期洗脱，通常在10 - 30%的洗脱缓冲液中。使用产色的FVIII试验COATEST? 因子VIII (Chromogenix, COATEST SP FVIII 目录号82 4086 63)和SpectraMax 分光光度计 (Molecular Devices, 目录号M3)，跟踪产率。使用SDS-PAGE/SilverStain和RP-HPLC，分析蛋白质量，证实纯的且均质的蛋白制品由轻链、重链和单链组成。基于RP-HPLC分析，测定最终的蛋白浓度。

实施例13

步骤1:

可以使下述通式的试剂

其中反应基团的非排它实例是包括马来酰亚胺、叠氮化物、炔烃、醛在内的基团，隔离物的非排它实例是平均分子量为例如3kDa、5 kDa、10 kDa或20 kDa的PEG部分，

与结合血小板的蛋白（例如阿昔单抗或AP3）或源自阿昔单抗或AP3的蛋白（诸如但不排除例如单链变体或FAB-片段）反应，生成具有中间体B1的通式的化合物

。

隔离物在结合血小板的蛋白处的连接点可以取决于已经用于装配中间体B1的通式的化合物的反应基团的类型。例如，如果反应基团已经是醛，一种可能性是所述隔离物已经通过在NaCNBH₃存在下的还原烷基化连接在结合血小板的蛋白的N-末端之一上。例如，如果反应基团已经是马来酰亚胺，一种可能性是所述隔离物已经连接在结合血小板的蛋白的游离半胱氨酸上。通过用合适的试剂（诸如但不排除例如酶或三(羧乙基)膦氢氯化物）处理，可以在反应之前释放出半胱氨酸。

步骤2:

通过用唾液酸酶反应，可以从FVIII的聚糖去除唾液酸。在有合适的酶存在下，可以使具有中间体B1的通式的化合物反应，所述酶例如ST3-Gal-I（当与FVIII的O-聚糖反应时）或ST3-GAlIII（当与FVIII的N-聚糖反应时），得到下述产物一般结构的化合物:

。

中间体

中间体实施例1

N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸:

步骤1:

N-((3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸:

将N-(氨基乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (18 mg, 0.029 mmol) 溶解于已经调节至pH 8.9的、由50 mM TRIS组成的缓冲液中(4 ml)。检查当前的pH，并通过加入0.1 N 盐酸，调节至pH 8.9。加入THF (16 ml)。加入大约一半最终量的3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯 (可商业得到，例如在Rapp Polymere GmbH，共200 mg，0.019 mmol)。在室温搅拌反应混合物。1 h后，加入另一半3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯。将反应混合物在室温搅拌16 h。在25℃的浴温，在真空中去除THF。过滤剩余的混合物，并进行尺寸排阻色谱法，使用G25凝胶，床尺寸为26 mm直径和10 cm长度，流速为7 ml/min，使用25 mM碳酸氢铵的缓冲液。合并含有希望的化合物的级分并冻干，得到 453 mg含有N-((3-(ω-(9H-芴-9基甲氧基羰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸的物质。

在DMSO-d₆中进行的¹H-NMR-谱证实胞苷酰基部分以及芴基-9-基甲氧基羰基部分的存在。在冰箱中储存该物质。

使用1 g 3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺基酯和90 mg O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸，重复该反应。使用由5 mM碳酸氢铵在乙腈中的水性溶液和50 mM碳酸氢铵水溶液组成的混合物的30-50%梯度，在具有2 cm直径的HPLC C4-柱上进行纯化。收集含有希望的化合物的级分，并冻干，得到 288 mg希望的化合物。¹H-NMR 谱对应着在上述实验中发现的¹H-NMR谱。

步骤2:

N-((3-(ω-氨基10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸

将N-((3-(ω-(9H-芴-9-基甲氧基羰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (453 mg)溶解于N,N-二甲基甲酰胺 (12 ml)中。加入哌啶 (1.25 ml)。将澄清的溶液在室温搅拌20 min。加入醚(200 ml)。将混合物在室温放置1.5 h，从而使形成的沉淀物变老（grow old）。通过过滤，分离沉淀物。将它溶解于二氯甲烷 (4 ml)中。加入乙基二异丙胺 (1 ml)。加入醚(250 ml)。将混合物在室温放置16 h，从而使形成的沉淀物变老。通过过滤，分离沉淀物，并在真空中干燥。在DMSO-d₆中的¹H-NMR 谱没有表现出9H-芴-9-基甲氧基羰基的信号，然而发现了针对胞苷酰基部分的信号。在冰箱中储存该物质。

步骤3:

4-甲酰基苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯

将三乙胺 (2.04 ml, 14.65 mmol)和2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲

四氟硼酸盐(TSTU, 4.44 g, 14.65 mmol)依次加入4-甲酰基苯甲酸(2.0 g, 13.3 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺 (30 ml)中的溶液中。在室温下搅拌反应混合物16 h。用乙酸乙酯(150 ml)稀释，用10%硫酸氢钠水溶液(100 ml)洗涤。用乙酸乙酯(2 x 30 ml)萃取水相。合并有机层，用盐水(50 ml)和水(50 ml)的混合物洗涤。合并的有机层经硫酸镁干燥。在真空中去除溶剂。使粗产物从乙酸乙酯重结晶，得到 1.89 g 4-甲酰基苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。

¹H-NMR (CDCl₃)。δ 2.95 (s, 4 H); 8.04 (d, 2 H), 8.32 (d, 2 H); 10.15 (s, 1 H)。

步骤4:

将N-((3-(ω-氨基10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (42 mg, 0.004 mmol)溶解于二氯甲烷 (2 ml)中。将乙基二异丙胺 (0.002 ml, 0.012 mmol) 加入该溶液中。加入4-甲酰基苯甲酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯 (19.32 mg, 0.078 mmol)在二氯甲烷 (0.5 ml)中的溶液。将反应混合物在室温搅拌16 h。在25℃的浴温，在真空中去除溶剂。将残余物悬浮于25 mM碳酸氢铵水溶液(15 ml)中。通过过滤，去除不溶物。将它分成5个部分。对它们中的每一个进行尺寸排阻色谱法，其中使用在26 mm直径和10 cm长度的柱上的G25，流速为7 ml/min，使用25 mM碳酸氢铵的缓冲液。合并含有希望的物质的所有级分，并冻干。在DMSO-d6中的¹H-NMR 谱证实醛部分和胞苷酰基部分的存在。在冰箱中保存得到的物质。

中间体实施例2:

N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸

步骤1:

3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷基-1-基酯

将3-马来酰亚胺基丙酸(1.0 g, 5.9 mmol)溶解于四氢呋喃 (20 ml)中。随后加入2-琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐 (TSTU, 2.14 g, 7.1 mmol)和乙基二异丙胺 (1.24 ml, 7.1 mmol)。加入N,N-二甲基甲酰胺 (5 ml)。在室温搅拌反应混合物，同时它缓慢转动。将混合物搅拌2 min。加入N,N-二甲基甲酰胺 (5 ml)。将混合物在室温搅拌2.5 h。用二氯甲烷 (150 ml)稀释它，随后用10%硫酸氢钠水溶液(150 ml)、饱和碳酸氢钠水溶液(150 ml)和水 (150 ml)洗涤。经硫酸镁干燥它。在真空中去除溶剂。使粗产物从乙酸乙酯重结晶，得到 1.20 g 3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯。

MS: m/z = 289，要求[M+Na]⁺: 289

¹H-NMR (CDCl₃) δ 2.82 (m, 4 H); 3.02 (t, 2 H); 3.94 (t, 2 H), 6.73 (s, 2 H)。

步骤2:

将N-((3-(ω-氨基10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (100 mg, 0.009 mmol)溶解于四氢呋喃 (2 ml)和二氯甲烷 (10 ml)的混合物中。加入3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷基-1-基酯 (50 mg, 0.18 mmol)在二氯甲烷 (3 ml)中的溶液。加入乙基二异丙胺 (0.005 ml, 0.028 mmol)。将反应混合物在室温搅拌16 h。加入二氯甲烷 (2 ml)和乙基二异丙胺 (0.5 ml)。加入氨基甲基化的聚苯乙烯树脂 (例如从Novabiochem可商业得到，装载0.85 mmol/g, 438 mg, 0.372 mmol)。将混合物在室温缓慢地搅拌1 h。通过过滤，去除树脂。在25℃的浴温，在真空中去除溶剂。将残余物溶解于二氯甲烷 (4 ml)中。加入醚(200 ml)。将混合物在室温放置2 h，以便使形成的沉淀物变老。通过过滤，分离沉淀物，并在真空中干燥，得到 38 mg 标题化合物。在DMSO-d₆中的¹H-NMR 谱证实马来酰亚胺基团的存在。

中间体实施例3

N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)-丙酰基氨基)-乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸与AP3 scFV C34S S248C的Cys 248的连接

将三(2-羧乙基)膦氢氯化物 (0.40 mg)在由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M 甘油组成的缓冲液(0.40 ml)中的溶液（其已经被调至pH 7.35），加入含有0.53 mg/ml浓度的AP3 scFv LC-HC C39S S248C的溶液中，所述scFv LC-HC C39S S248C具有在它的C-端处的Flag标签和通过S-S桥连接到在位置 248处的半胱氨酸上的额外Cys，且在已经被调节至pH 7.5的、100 mM HEPES和150 mM NaCl的溶液(4 ml, 2.12 mg, 76 nmol)中。在20℃轻轻摇动反应混合物。将它分成2部分。使用已经被调节至pH 7.0的25 mM HEPES的缓冲液，将它们中的每一份加入PD-10柱 (GE-Healthcare)。合并柱的洗脱液(它们各自3.5 ml)。

将N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基-氨基)-乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (3.3 mg, 305 nmol)在25 mM HEPES缓冲液（其已经被调节至pH 7.0，0.43 ml）中的溶液，加入蛋白溶液中。将反应混合物在20℃轻轻摇动4 h。将它放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。在4000 rpm、10℃，将它超速离心10 min。在冰箱中保存混合物，直到纯化。

为了纯化，融化混合物。对它进行尺寸排阻色谱法，其中使用Superdex 200凝胶，床尺寸为16 mm直径和60 cm长度，流速为1 ml/min，并使用25 mM TRIS和150 mM NaCl的缓冲液，其已经被调节至pH 8.0。合并含有希望的产物的级分，得到 1.61 mg希望的蛋白。SDS-PAGE凝胶与预期一致。发现该物质含有大量聚集的蛋白。

中间体实施例4

N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸与阿昔单抗（Abxicimab）的一个N-端的缀合

将可商业得到的阿昔单抗溶液(ReoPro, 10 mg, 215 nmol，在2 mg/ml溶液中，商业缓冲液)放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。加入已经被调节至pH 7.4的、由25 mM HEPES组成的缓冲液(5 ml)。在4000 rpm在10℃进行超速离心10 min。加入已经被调节至pH 7.4的、由25 mM HEPES组成的缓冲液(10 ml)。在4000 rpm在10℃进行超速离心10 min。加入已经被调节至pH 7.4的、由25 mM HEPES组成的缓冲液(10 ml)。在4000 rpm在10℃进行超速离心10 min。将剩余的0.65 ml溶液放入塑料反应器中。加入已经被调节至pH 7.4的、由25 mM HEPES组成的缓冲液(3.85 ml)。加入N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (14 mg, 1290 nmol)在已经被调节至pH 7.0的、由25 mM HEPES组成的缓冲液(1.5 ml)中的溶液。在300 rpm在20℃轻轻摇动反应混合物3 min。加入新鲜制备的1.0 M氰基硼氢化钠在水中的溶液(0.025 ml)。在300 rpm在20℃轻轻摇动反应混合物。1 h后，加入另一部分氰基硼氢化钠溶液(0.025 ml)。1 h后，加入另一部分氰基硼氢化钠溶液(0.025 ml)。1 h后，加入另一部分氰基硼氢化钠溶液(0.025 ml)。在300 rpm在20℃轻轻摇动溶液16 h。将反应混合物放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它进行在4000 rpm、在18℃的超速离心10 min。过滤剩余的0.360 ml溶液，并在Superdex200凝胶上进行尺寸排阻色谱法，床尺寸为?16 mm X 60 cm，流速为1 ml/min，使用已经被调节至pH 8.0的25 mM TRIS、150 mM NaCl的缓冲液作为洗脱液。将含有希望的产物的级分合并成2批。将那些批中的每批放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它们进行在4000 rpm、在10℃的超速离心10 min，分别得到2.67 mg和3.27 mg。为了定量，在Nanodrop ? 分光光度计上使用10.94的摩尔吸光度。根据N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸与阿昔单抗的一个N-端的缀合物的预期，通过SDS-PAGE分析产物。

中间体实施例5

N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸与AP3-FAB-片段在它的N-末端之一处的反应

将0.34 mg/ml的AP3 C39S FAB片段在PGS缓冲液pH 7.2中的溶液(1.7 mg, 35 nmol)，放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。加入由25 mM HEPES、25 mM NaCl组成的缓冲液pH 7.0 (7 ml)。对混合物进行在4000 rpm在20℃的超速离心15 min。加入pH 7.0的由25 mM HEPES、25 mM NaCl组成的缓冲液(10 ml)。对混合物进行在4000 rpm在20℃的超速离心15 min。加入pH 7.0的由25 mM HEPES、25 mM NaCl组成的缓冲液 (10 ml)。对混合物进行在4000 rpm在20℃的超速离心15 min。保留大约0.480 ml 溶液。加入N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸 (2.31 mg, 212 nmol)在由25 mM HEPES、25 mM NaCl组成的缓冲液pH 7.0 (0.37 ml)中的溶液。在20℃轻轻将混合物振荡 5 min。加入1 M 氰基硼氢化钠在水中的溶液(0.0045 ml)。在20℃摇动反应混合物1 h。加入1 M 氰基硼氢化钠在水中的溶液(0.0045 ml)。在20℃摇动反应混合物1 h。加入1 M 氰基硼氢化钠在水中的溶液(0.0045 ml)。在20℃摇动反应混合物18 h。将反应混合物放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。加入pH 8.00的由25 mM TRIS、25 mM NaCl组成的缓冲液(2.5 ml)。对混合物进行在4000 rpm在20℃的超速离心4 min。加入pH 8.00的由25 mM TRIS、25 mM NaCl组成的缓冲液 (2.2 ml)。对混合物进行在4000 rpm在20℃的超速离心22 min。加入pH 8.00的由25 mM TRIS、25 mM NaCl组成的缓冲液(3.2 ml)。对混合物进行在4000 rpm在20℃的超速离心12 min。向大约0.120 ml的混合物中，加入由25 mM TRIS、25 mM NaCl组成的缓冲液pH 8.00 (2.2 ml)。将该混合物分成2等份。将其中的每一份加入旋转Q柱 (VIVAPURE Q MINI M, Sartorius, 产品号: VS-1X01QM24)，所述柱已经用pH 8.00的由25 mM TRIS、25 mM NaCl组成的缓冲液平衡。对每个柱进行在2000 rpm 在室温的超速离心5 min。将pH 8.00的由25 mM TRIS、25 mM NaCl组成的缓冲液(0.400 ml)加入每个旋转柱。对每个柱进行在2000 rpm在室温的超速离心5 min。将pH 8.00的由25 mM TRIS、500 mM NaCl组成的缓冲液(0.400 ml)加入每个旋转柱。对每个柱进行在2000 rpm在室温的超速离心5 min。合并滤液，并置于截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它们进行在4000 rpm在18℃的超速离心8 min。将得到的溶液在-80℃保存，直到纯化。

融化溶液，并在Superdex 75柱上进行尺寸排阻色谱法，床尺寸为 ?16 mm x 600 mm，流速为0.80 ml/min，使用pH 8.00的25 mM TRIS、150 mM NaCl的缓冲液。合并含有希望的产物的级分（通过SDS-PAGE判断），并放入截止值为10 kDa的Amicoun超速离心装置中。对它们进行在4000 rpm在18℃的超速离心18 min。尽可能快地将0.280 ml溶液冷冻至-80℃。使用13.05的摩尔吸光度，在Nanodrop? 仪器上定量，证实0.23 mg/ml的浓度。通过银染色，产物在SDS-PAGE中表现出预期的带。使用在Kurfürst, M. M. Analytical Biochemistry 200, 244-248. 1992中描述的染色规程，在SDS-PAGE中没有鉴别出未反应的PEG。

实施例14

AP3 scFv LC-HC C39S S248C与FVIII的缀合

将在重链的C-端处具有SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 4)的残余B-结构域序列的B-结构域缺失的 FVIII(1 mg, 5.64 mmol) 在缓冲液（由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、150 mM NaCl、0.02%吐温80和1 M 甘油组成，其已经被调节至pH 7.35，0.018 ml）中的溶液放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。加入N-((3-(ω-(3-(2,5-二氧代-2,5-二氢吡咯-1-基)丙酰基氨基)10 kDa聚乙二醇基)-丙酰基氨基)-乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸与AP3 scFV C34S S248C的Cys 248的连接产物(中间体实施例3/实施例13, 1.29 mg, 34 nmol)在25 mM TRIS和150 mM NaCl的溶液(其已经被调节至pH 8.0，0.680 ml)中的溶液，随后加入由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、10%甘油、0.02%吐温80、500 mM NaCl组成的缓冲液，其已经被调节至pH 6.07 (3 ml)。对混合物进行在4000 rpm在10℃的超速离心20 min。剩余的体积是0.800 ml或1.25 mg/ml的FVIII。随后加入来自产脲节杆菌（A. urifaciens）的唾液酸酶的溶液(0.43 mg/ml, 302 U/mg, 0.0049 ml, 0.645 U)和ST3-Gal-I溶液(2.5 mg/ml, 0.105 mg, 0.042 ml)。在32℃轻轻摇动反应混合物1 min，然后在32℃放置18 h。将它保存在冰箱中，直到纯化。

融化反应混合物。将它分成2部分，对其中的每部分进行尺寸排阻色谱法，使用Superose 6凝胶，床尺寸为10 mm直径和300 mm长度，流速为0.30 ml/min。并使用由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、150 mM NaCl和1 M 甘油组成的缓冲液（其已经被调节至pH 7.35）作为洗脱液。合并含有希望的产物的两批的所有级分。将它们放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中，并进行在4000 rpm在10℃的超速离心18 min。

随后加入CMP-N-乙酰基神经氨酸 (CMP NeuNac, 1.5 mg, 2597 nmol)在由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、150 mM NaCl和1 M 甘油组成的缓冲液(其已经被调节至pH 7.35，0.100 ml)中的溶液和0.33 mg/ml ST3Gal-III溶液(0.10 ml, 0.033 mg)。在300 rpm轻轻摇动反应混合物，此后保存在冰箱中，直到纯化。

将反应混合物分成2份。通过0.00045 mm过滤器，过滤它们中的每一份。将它们施加于琼脂糖柱上，床尺寸为5 mm直径和5 cm长度，所述柱在用CNBr活化后，已经连接上F25抗体。F25是FVIII的一种已知抗体。上样后，用3倍柱体积的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、150 mM NaCl和1 M 甘油组成的缓冲液（其已经被调节至pH 7.35）洗涤柱，流速为0.6 ml/min。此后，用3倍柱体积的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80和650 mM NaCl组成的缓冲液（其已经被调节至pH 7.35）洗涤柱，流速为0.6 ml/min。最后，用6倍柱体积的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、2.5 M NaCl组成的缓冲液（在50%v/v乙二醇/水溶液中，其已经被调节至pH 7.35）洗脱化合物，流速为0.1 ml/min。合并含有希望的产物的两批的级分。将它们放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它们进行在4000 rpm在10℃的超速离心14 min。对剩余的溶液进行在Superose 6材料上的尺寸排阻色谱，床尺寸为10 mm直径和30 cm长度，流速为0.50 ml/min，使用由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl₂、0.01%吐温80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液，其已经被调节至pH 7。合并合适纯度的含有希望的化合物的级分，并放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它们进行在4000 rpm在9℃的超速离心12 min。使用14.46的摩尔吸光度，发现产量为0.0176 mg的AP3 scFv LC-HC C39S S248C与FVIII的缀合物。通过在非还原条件下的SDS-PAGE凝胶分析符合预期。从色谱图中峰的形式得出结论：该物质含有大量聚集的蛋白。

实施例15

阿昔单抗（Abciximab）与FVIII在O-聚糖处的缀合

将由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、150 mM NaCl、0.02%吐温80和1 M 甘油组成的缓冲液(其已经被调节至pH 7.35，2.5 ml)，加入在重链C-端处具有SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 4) 残余B-结构域序列的B-结构域缺失的 FVIII (5.7 mg/ml, 1 mg, 5.6 nmol) 在缓冲液（由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、150 mM NaCl、0.02%吐温80和1 M 甘油组成，其已经被调节至pH 7.35）中的溶液。加入N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸与阿昔单抗的一个N-端的缀合物(中间体实施例4, 实施例13, 2.3 mg, 39.5 nmol) 在缓冲液(由25 mM TRIS、150 mM NaCl组成，其已经被调节至pH 8.0，0.323 ml)中的溶液。将该溶液放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它进行在4000 rpm在10℃的超速离心20 min。加入已经被调节至pH 7.35的、由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、150 mM NaCl、0.02%吐温80和1 M 甘油组成的缓冲液(2 ml)。对该溶液进行在4000 rpm在10℃的超速离心30 min，剩下体积为1.4 ml的溶液。随后加入来自产脲节杆菌的唾液酸酶的溶液(0.4 mg/ml, 242 U/mg, 0.0066 ml)和ST3Gal-I溶液(2.5 mg/ml, 0.042 ml)。在32℃轻轻摇动反应混合物15 min。然后在32℃静置反应混合物20.5 h。将反应混合物放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它进行在4000 rpm在10℃的超速离心15 min。对剩余的0.300 ml溶液进行尺寸排阻色谱，其中使用Superose 6材料，床尺寸为?10 mm x 300 mm，流速为0.5 ml/min，并使用由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl₂、0.01%吐温80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液（其已经被调节至pH 7）作为洗脱液。合并含有希望的产物的级分，并放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。加入由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、10%甘油、0.02%吐温80、500 mM NaCl组成的缓冲液(其已经被调节至pH 6.07，2.5 ml)。对该溶液进行在4000 rpm在10℃的超速离心15 min。加入由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、10%甘油、0.02%吐温80、500 mM NaCl组成的缓冲液(其已经被调节至pH 6.07，1.5 ml)。对该溶液进行在4000 rpm在10℃的超速离心15 min。将剩余的0.220 ml溶液放入塑料反应器中。加入可商业得到的CMP NeuNAc (1.73 mg, 2800 nmol)在缓冲液中的溶液(0.173 ml)，所述缓冲液由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、10%甘油、0.02%吐温80、500 mM NaCl组成，其已经被调节至pH 6.07。在300 rpm在32℃轻轻摇动反应混合物1 h。对它进行尺寸排阻色谱，其中使用Superose 6材料，床尺寸为?10 mm x 300 mm，流速为0.5 ml/min，并使用由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl₂、0.01%吐温80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液（其已经被调节至pH 7）作为洗脱液。合并含有希望的产物的级分，并放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对合并物进行在4000 rpm在10℃的超速离心5 min，得到0.275 ml 0.0358 mg阿昔单抗与FVIII在O-聚糖处的缀合产物的溶液。为了定量，在Nanodrop ? 分光光度计上使用13.15的摩尔吸光度。SDS-PAGE分析与关于阿昔单抗与FVIII在O-聚糖处的缀合产物的SDS-PAGE的预期一致。

实施例16

AP3-FAB片段与BDD-FVIII的缀合

将中间体实施例5的反应产物放入截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。加入pH 6.07的由20 mM 组氨酸、10 mM CaCl₂、10%甘油、0.02%吐温80、500 mM NaCl组成的缓冲液(4 ml)。对该溶液进行在4000 rpm、在20℃的超速离心12 min。将在重链C-端处具有SFSQNSRHPSQNPPVLKRHQR (SEQ ID NO 4) 残余B-结构域序列的B-结构域缺失的 FVIII (0.5 mg, 2.8 nmol) 在缓冲液(由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、150 mM NaCl、0.02%吐温80和1 M 甘油组成，其已经被调节至pH 7.35，0.088 ml)中的溶液，加入剩余的0.600 ml中。对该溶液进行在4000 rpm在20℃的超速离心30 min。将剩余的0.125 ml放入Eppendorf瓶中。随后加入来自产脲节杆菌的具有His6 TAG的唾液酸酶的溶液(0.4 mg/ml, 0.0033 ml)和ST3Gal-I溶液(2.5 mg/ml, 0.021 ml)。在300 rpm在32℃轻轻摇动反应混合物。20 min后，停止摇动，将反应混合物在32℃放置19 h。过滤它，并进行尺寸排阻色谱，其中使用Superose 6材料，床尺寸为?10 mm x 300 mm，使用由10 mM 组氨酸、1.7 mM CaCl₂、0.01%吐温80、0.3 M NaCl、8.8 mM 蔗糖组成的缓冲液（其已经被调节至pH 7）作为洗脱液，流速为0.500 ml/min。合并含有希望的化合物的级分（通过SDS-PAGE判断）。将合并物转移进截止值为10 kDa的Amicon超速离心装置中。对它进行在4000 rpm在20℃的超速离心。使用13.61的摩尔吸光度，在Nanodrop 仪器上，测得希望的产物在剩余的0.270 ml中的浓度是0.29 mg/ml。在还原和非还原条件下对分离的产物进行SDS-PAGE的结果，与AP3的FAB-片段和FVIII的缀合物的存在相一致。

实施例17

将N8-(O)-PEG10kD-CHO偶联到AP3-ONH₂上以得到AP3-N8缀合物，化合物MZ1

中间体实施例A：在AP3抗体的N-聚糖上导入羟胺柄

第1步: AP3抗体N-聚糖的半乳糖苷化:

AP3 FL mIgG的N-聚糖大部分是复合的双触角类型。大部分双触角的 N-聚糖携带2个N-乙酰基葡糖胺部分或1个N-乙酰基葡糖胺部分和1个半乳糖部分作为最终的单糖部分 (G0F, G1F)。轻链具有双触角的聚糖，具有1个唾液酸和1个半乳糖部分作为最终的单糖。

通过(牛) β1,4-半乳糖基转移酶催化的半乳糖从半乳糖–UDP的转移，GOF和G1F聚糖被转化成G2F形式。简而言之，向AP3 FL mIgG抗体在pH6.4的50mM MES缓冲液中的溶液(3mg, 800μl)中，加入pH6.4的50mM MES缓冲液 (500μl)、半乳糖-UDP (500μl 12.2mg/ml 溶液，在pH7.4的含有140mM NaCl、3mM KCl 的10mM 磷酸盐缓冲液中)和氯化锰 (100μl 12.6mg/ml水溶液)。通过加入β1,4-半乳糖基转移酶 (100μl 10U/ml 酶溶液，在100mM HEPES pH7.5缓冲液中)，开始反应。在25℃温育反应混合物过夜。

第2步: 在AP3抗体的N-聚糖上导入羟胺柄

向在第一步中得到的半乳糖基化的抗体(3mg, 2ml)中，加入GSC-ONH₂ (5.8mg，在190μl含有140mM NaCl、3mM KCl的pH7.4的10mM磷酸盐缓冲液中)。通过加入ST3Gal III (80μl, 0.4mg, 480mU)，开始反应。

在32℃温育反应混合物21h。

GSC-ONH₂: 5’-(2-(12-((氨氧基甲基羰基)氨基)-4-7-10-三氧杂十二烷酰基)-氨基乙酰基)-神经氨酸胞苷单磷酸酯

随后，通过加入NAN-CMP在PBS缓冲液中的溶液 (4.5mg, 100μl)，给任何未修饰的半乳糖部分加帽。将反应混合物在25℃温育1h。

然后过滤(0.45μ过滤器, Gelman GHP) 反应混合物，并将缓冲液更换为含有150mM NaCl的20mM 磷酸盐缓冲液pH7.2 (通过超滤, Millipore 离心过滤器单元Amicon Ultra, 0.5ml 装置, 10kD截止)。

使用?kta纯化器10系统 (GE Healthcare)，在HiTrap蛋白A HP柱 (1ml)上进行纯化。装载和洗涤缓冲液是含有150mM NaCl的20mM 磷酸盐缓冲液pH7.2，洗脱缓冲液是用10M 氢氧化钠调节至pH3.5的10mM 甲酸。流速是0.5ml/min，级分体积为0.5ml (在深孔微孔滴定板中分级)。分级之前，将0.1M Tris缓冲液pH9 (15μl) 加入微孔滴定板的孔中，以避免产物保持在酸性pH中。合并有关的级分，浓缩，并将缓冲液更换为缓冲液A (通过超滤，Millipore 离心过滤器单元Amicon Ultra, 0.5ml 装置, 10kD截止)，得到产物(“AP3-ONH₂”)，总蛋白回收率为50%(1.5mg, 0.91mg/ml)。

为了发现羟胺部分是否已经成功地导入，使用PEG20kD-CHO (60摩尔当量的PEG20kD-CHO在缓冲液A中的溶液)，将产物的等分试样聚乙二醇化。使用NuPage 4-12%Bis-Tris凝胶(Invitrogen)，在还原条件(200V, 40min)下，进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。使用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)，对凝胶进行考马斯蓝染色。标准蛋白来自Invitrogen (Novex Sharp未染色的标准品(3.5-260kD))。凝胶证实轻链消失(未聚乙二醇化的、N-聚糖修饰的AP3的轻链出现在约32kD)，仅存在在约55kD处与剩余的重链相对应的模糊带。4条新带已经出现在约70、100、130、170kD，认为分别与聚乙二醇化的LC聚糖、单聚乙二醇化的Fc聚糖、二-聚乙二醇化的Fc聚糖和不确定的产物相对应。

因而，羟胺部分已经导入在AP3上。

中间体实施例B: 在N8 O-聚糖上导入醛柄:

第1步: N8的去唾液酸化和ST3Gal1催化的GSC–PEG10kD-CHO 在O-聚糖上的转移 (1pot):

GSC-PEG10kD-CHO: N-((3-(ω-(4-甲酰基苯甲酰氨基)10 kDa聚乙二醇基)丙酰基氨基)乙酰基)-O ²-[5’]胞苷酰基-ξ-神经氨酸。

向N8在pH7.3的20mM 咪唑缓冲液、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 甘油、0.5M NaCl 中的溶液(263μl, 1.5mg)中，加入唾液酸酶 (来自产脲节杆菌的唾液酸酶)的溶液(7μl, 680mU)，随后加入GSC-PEG10kD-CHO在PBS缓冲液中的溶液(68μl, 1.85mg)和His-ST3Gal I在50mM Tris、100mM NaCl、pH8中的溶液 (108μl, 0.27mg)。将反应混合物在23℃温育24h。

在pH7.3的20mM 咪唑缓冲液、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 甘油中稀释至更低的离子浓度以后，使用?kta纯化器10系统 (GE Healthcare)，通过阴离子交换 (MonoQ 5/50GL柱, GE Healthcare)，纯化混合物：将混合物装载到用20 mM 咪唑pH7.3、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M 甘油平衡的MonoQ 5/50 GL柱上。洗脱缓冲液B是20 mM 咪唑pH7.3、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1.5M NaCl、1 M 甘油。洗脱程序是：5倍柱体积的0-20%B，10倍柱体积的20%B，10倍柱体积的100%B，流速为0.5ml/min。用100%洗脱缓冲液洗脱产物。合并有关的级分。产量1.2 mg，80%蛋白回收率。

第2步: 加帽:

浓缩在第一步中得到的产物的溶液(1.13mg蛋白, 400μl)，加入NAN-CMP在PBS缓冲液中的溶液(40μl, 1.05mg)。通过加入ST3Gal III (110μl, 110μg, 0.13U)，开始反应。将反应混合物在32℃温育1h。

然后使用稍微改进的洗脱程序(与在步骤1中的纯化方法相比)，在MonoQ上纯化反应混合物。洗脱程序是: 5倍柱体积的0-13%B，10倍柱体积的13%B，10倍柱体积的100%B，流速为0.5ml/min。用100%洗脱缓冲液洗脱产物(“N8-(O)-PEG10kD-CHO”) (NB: 该产物是des-O-聚糖和(O)-PEG-CHO-N8的混合物)。合并有关的级分。产量0.96mg，80%蛋白回收率，即来自N8的总蛋白回收率: 64%。

使用NuPage 7%Tris 乙酸盐凝胶(Invitrogen)，在还原条件(150V, 70min)下，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。使用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)，对凝胶进行考马斯蓝染色。标准蛋白来自Invitrogen (HiMark Unstained HMW)。如预期地，得到图谱：分子量为约 84kD、93kD和120kD的3条带，分别对应着轻链、重链和聚乙二醇化的重链。在93和120kD处的带具有大致相同的强度：这是被预见到的，因为仅约50%的N8在它的B结构域上携带O-聚糖。

因而，醛柄已经成功地导入到N8上。

将N8-(O)-PEG10kD-CHO偶联到AP3-ONH₂上

将根据中间体实施例B制备的N8-(O)-PEG10kD-CHO的缓冲液转换为含有10mM CaCl₂、0.02%吐温80、0.5M NaCl的pH6.2的50mM 咪唑缓冲液，并通过超滤 (Millipore 离心过滤器单元Amicon Ultra, 0.5ml 装置, 50kD截止)，浓缩至约16mg/ml的浓度。同样地，将根据中间体实施例A制备的AP3-ONH₂的缓冲液转换为含有10mM CaCl₂、0.02%吐温80、0.5M NaCl的pH6.2的50mM 咪唑缓冲液，并通过超滤 (Millipore 离心过滤器单元Amicon Ultra, 0.5ml 装置, 10kD截止)，浓缩至约34.7mg/ml的浓度。

向上面的浓缩的AP3-ONH₂ 溶液(45μl, 1.56mg)中，加入浓缩的N8-(O)-PEG10kD-CHO溶液(21.5μl, 244μg)，然后加入苯胺水溶液(5μl, 180μg)。在25℃温育混合物过夜。通过加入丙酮 (1.8μl, 1.4mg, 约600摩尔当量)，猝灭未反应的羟胺部分。在25℃温育反应混合物30min。

用pH7.3的20mM 咪唑缓冲液、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 甘油、25mM NaCl，将反应混合物稀释至3ml，并过滤 (0.45μGelman GHP过滤器)，并通过在MonoQ柱 5/50 GL(GE Healthcare)上的离子交换进行纯化。上样和洗涤缓冲液(缓冲液A)是pH7.3的20mM咪唑缓冲液、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 甘油、25mM NaCl，洗脱缓冲液(缓冲液B)是pH7.3的20mM 咪唑缓冲液、10mM CaCl₂、0.02%吐温80、1M 甘油、1M NaCl。洗脱程序由4步组成：4倍柱体积的0-20%B，10倍柱体积的20%B，16倍柱体积的20-100%B，5倍柱体积的100%B。流速是0.5ml/min，温度是15℃。在前两步中回收了1ml级分，在后两步中回收了0.5ml 级分。

AP3-ONH₂ 首先在大约20%B洗脱，剩余的物质在30和65%B之间洗脱为一个主峰和几个小的、没有完全分离的峰。浓缩(通过超滤, 50kD截止)后，使用NuPage 7%Tris 乙酸盐凝胶(Invitrogen)，通过凝胶电泳(150V, 70min)，分析级分。使用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen)，对凝胶进行考马斯蓝染色。标准蛋白来自Invitrogen (HiMark Unstained HMW)。来自在30和65%B之间洗脱的物质的主峰(峰顶在52%B洗脱)对应着缀合的物质。

未还原的缀合的物质在凝胶上显示出在分子量84kD、285kD和>500kD处的3条带(非常模糊的带)。认为它们分别对应着N8-(O)-PEG10kD-AP3的(N8)轻链、N8-(O)-PEG10kD-AP3的(N8)重链(对于未还原的N8-(O)-PEG10kD-CHO的对照样品：重链出现在约110kD，未还原的 AP3-ONH₂的对照样品出现在约176kD)和未鉴别出的化合物。

还原的缀合的物质在凝胶上显示出在分子量84kD、145kD和170kD处的3条带，认为分别对应着N8-(O)-PEG10kD-AP3 的(N8)轻链和缀合到AP3的轻链上的N8聚乙二醇化的重链以及缀合到AP3的重链上的N8聚乙二醇化的重链。回收的缀合的物质的量是129μg，从N8-PEG10kD-CHO算起是53%产率。

实施例18

(5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙酰基]氨基]-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠, 化合物1M

在四氢呋喃 (2 ml)中混合S,S’-2,2'-二硫代二吡啶 (1.59 mmol, 350 mg)和3-巯基丙酸(0.477 mmol, 50.1 mg, 41.5 微升)。将混合物搅拌45分钟。将N-羟基琥珀酰亚胺 (0.477 mmol, 54.9 mg)和N,N’-二异丙基碳二亚胺 (0.954 mmol, 148 微升)加入混合物中，随后将其搅拌3 h。

将(5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[2-氨基乙酰基氨基]-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠 (0.159 mmol, 100 mg)溶解于水 (500 微升)中。通过加入500 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄水溶液(饱和水溶液)，将pH调节至8.5。通过加入水，将最终的体积调节至2 ml。

混合2种溶液(在四氢呋喃中的NHS酯和在水中的核苷酸)。将得到的混合物轻轻搅拌3 h。通过加入水，将体积调节至20 ml。使用反相HPLC (0-30 体积%乙腈在水中，10%500 mM NH₄HCO₃水溶液, C₁₈柱)，纯化粗化合物。合并选择的级分。加入氢氧化钠 (1 M, 156 微升)。冻干得到的混合物。

通过分析型HPLC和LCMS，测定纯度和同一性([M+H]⁺: 827.4)。

实施例19

2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酸, 化合物2M

将6-羟基-9-[2-(哌嗪-1-羰基)苯基]氧杂蒽-3-酮氢氯化物 (5.72 mmol, 2.5 g) (如在J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 8400-8401中所述制备)悬浮于饱和碳酸氢钠水溶液 (50 ml)和四氢呋喃 (50 ml)的混合物中。将混合物搅拌10分钟。加入二乙醇酸酐 (8.58 mmol, 1.0 g)。3 h后，加入额外的二乙醇酸酐 (500 mg)。将混合物搅拌20 h。用发烟盐酸，将混合物酸化至pH 1。加入二氯甲烷 (100 ml)和盐酸(1 M, 100 ml)。加入盐水(100 ml)和固体氯化钠。在两相之间观察到固体。分离各相。用DCM (3x100 ml)萃取水相。干燥(Na₂SO₄) 合并的有机相，过滤，并在真空中浓缩。

通过过滤，分离在两相之间形成的固体。

在过滤器上将固体悬浮于盐酸(1 M)中。用盐酸(1 M)连续萃取固体。将过滤的萃取物与水萃取物相组合，并使用反相HPLC (C₁₈柱, 在水中10-35 体积%乙腈，0.1%三氟乙酸)，纯化得到的溶液。合并选择的级分，并冻干。LCMS: 517.2776 [M+H]⁺。

实施例20

2-[[2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酰基]-[2-[2-[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙基]氨基]乙酸, 化合物3M

将三苯甲基聚苯乙烯树脂 (200 mg, 1.5 mmol/g, Pepchem)放入烧结的（fritted）注射器中。加入亚硫酰氯/二氯甲烷 (1:1, 5 ml)。将混合物振荡? h。用二氯甲烷洗涤树脂。

加入溴乙酸(0.9 mmol, 125 mg)和N,N’-二异丙基-乙胺 (0.9 mmol, 156 微升)在二氯甲烷 (3 ml)中的混合物。5分钟后，加入更多的N,N’-二异丙基-乙胺 (0.9 mmol, 156 微升)。将混合物振荡? h。排出树脂，并将相同的溴乙酸和N,N’-二异丙基-乙胺在二氯甲烷中的混合物加入树脂。将混合物振荡1? h。用二氯甲烷 (5x)、甲醇和N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂。在甲醇洗涤过程中，进行剧烈摇动，以便抑制任何团块形成。

加入1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷 (7.5 mmol, 1100 微升)在N-甲基吡咯烷酮 (3.75 ml)中的溶液。将混合物振荡3 h。洗涤树脂。将2-乙酰基双甲酮 (3.0 mmol, 546 mg)在N-甲基吡咯烷酮 (3 ml)中的溶液加入树脂。将混合物振荡过夜。用N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂。将2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酸、化合物2M (155 mg, 0.3 mmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑 (0.9 mmol)和N,N’-二异丙基碳二亚胺 (0.9 mmol, 140 微升)在N-甲基吡咯烷酮 (1.8 ml)中的混合物加入树脂。将混合物振荡过夜。用N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂(3-4次)。在肼和N-甲基吡咯烷酮 (5 体积%肼单水合物)的混合物中摇动树脂2x5分钟。排空注射器。用N-甲基吡咯烷酮洗涤树脂。

将S,S’-2,2'-二硫代二吡啶 (7.5 mmol, 1650 mg)和3-巯基丙酸(3.0 mmol, 261 微升)在N-甲基吡咯烷酮 (3 ml)中的混合物温育? h。加入N,N’-二异丙基碳二亚胺 (1.5 mmol, 233 微升)。将得到的混合物加入树脂。将混合物振荡1? h。用N-甲基吡咯烷酮和二氯甲烷洗涤树脂。

用三氟乙酸和水(95:5)的混合物处理树脂15 min。与二乙醚/正庚烷一起研磨滤液。将粗化合物溶解于乙酸(2? ml)中。加入水(15 ml)和小量乙腈。过滤该混合物，并使用反相HPLC (C₁₈柱, 在水中20-50%乙腈，0.1%TFA)进行纯化。LCMS: 902.2807 [M+H]⁺。

实施例21

(4S,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[[2-[[2-[[2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酰基]-[2-[2-[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二铵, 化合物4M

将2-[[2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酰基]-[2-[2-[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙基]氨基]乙酸即化合物3M (0.3 mmol, 270 mg)溶解于四氢呋喃 (2 ml)中。将N-羟基琥珀酰亚胺 (0.9 mmol, 104 mg)和N,N’-二异丙基碳二亚胺 (1.5 mmol, 233 微升)加入该混合物中，随后将其搅拌1? h。

将(5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[2-氨基乙酰基氨基]-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠(0.45 mmol, 303 mg)溶解于水 (500 微升)中。通过加入500 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄水溶液(饱和水溶液)，将pH调节至8.5。通过加入水，将最终的体积调节至2 ml。

混合2种溶液。得到的pH是7.5-8.0。将得到的混合物搅拌20 h。用水将混合物稀释至15 ml，过滤，并使用反相HPLC (在水中0-35%乙腈，10%500 mM NH₄HCO₃水溶液)，进行纯化。合并选择的级分，并冻干。LCMS: 1513.9 [M+H]⁺, 757.5 [M+H]²⁺。

实施例22

经由N-聚糖用俄勒冈绿488标记F8-500 AP3-LC-HC scFv –Δa3，化合物5M

将在水性缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 500 mM NaCl, pH 7.3; 1.2 ml)中的融合蛋白(F8-500 AP3-LC-HC scFv –Δa3 (SEQ ID NO 40), 11 微克)与来自产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的重组唾液酸酶(0.1 U)相混合。最终的体积是1.2 ml。将混合物在25℃放置30分钟。用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, pH 7.3)将混合物稀释至10 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序进行洗脱：10倍柱体积当量0%缓冲液B、2倍柱体积洗出未结合的样品 (0%缓冲液B)、10倍柱体积0 - 100%(缓冲液B)、5倍柱体积100%缓冲液B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

合并选择的级分，并与(2R,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-5-[6-[[4-羧基-3-(2,7-二氟-3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]氨基]己酰基氨基]-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠和唾液酸转移酶 (rat rec。ST3GalIII)相混合。终浓度是：因子VIII：0.026 微摩尔，荧光标记试剂：39 微摩尔，ST3GalIII：177 U/l。终体积：2.1 ml。将混合物在32℃温育4小时。将(2R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠加入混合物(终浓度: 54 微摩尔)中。将混合物在32℃温育3小时。用缓冲液(20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M 甘油、没有NaCl、pH 7.3)，将混合物稀释至25 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：10倍柱体积当量、5倍柱体积洗出未结合的样品、10倍柱体积0 - 25%缓冲液B、10倍柱体积25-28%(缓冲液B)、25倍柱体积28 - 100%缓冲液B和10倍柱体积100%缓冲液B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

SDS-PAGE 分析 (还原的，7%NuPAGE Tris 乙酸盐, 1.0 mm, Invitrogen, 150 V, 70 min)证实荧光团在蛋白中的掺入。

实施例23

N,O-聚糖-无唾液酸-BDD 因子VIII，化合物6M

将在水性缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 500 mM NaCl, pH 7.3)中的BDD 因子VIII (1 mg)与来自产脲节杆菌的重组唾液酸酶 (Biotechnol. Appl. Biochem., 2005, 41, 225–231)相混合。终浓度是：因子VIII: 5.7 mg/ml和唾液酸酶: 1.5 U/ml。将混合物在25℃放置30分钟。用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 25 mM NaCl, pH 7.3)将混合物稀释至20 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：0.1倍柱体积当量5%缓冲液B、2倍柱体积洗出未结合的样品 (5%缓冲液B)、10倍柱体积5 - 100%(缓冲液B)、5倍柱体积100%缓冲液B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

实施例24

经由O-聚糖将3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基柄缀合到BDD FVIII上，化合物7M

将在缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 500 mM NaCl, pH 7.3)中的无唾液酸BDD 因子VIII化合物6 (3.95 mg)与(5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基) 丙酰基氨基]乙酰基]氨基]-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠和唾液酸转移酶 (ST3GalI)相混合。终浓度是：因子VIII：1.16 mg/ml，唾液酸转移酶：0.22 mg/ml，核苷酸：250 微摩尔。终体积：3.4 ml。将混合物在32℃放置20小时。将(2R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠加入该混合物中(终浓度: 54 微摩尔)。将混合物在32℃温育30分钟。用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 25 mM NaCl, pH 7.3)将混合物稀释至25 ml。

将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：1倍柱体积当量0%缓冲液B、2倍柱体积洗出未结合的样品 (0%缓冲液B)、10倍柱体积0 - 20%缓冲液B、10倍柱体积20%缓冲液B、10倍柱体积100%缓冲液B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

将分离的蛋白与唾液酸转移酶 (ST3GalIII)和(2R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠相混合。终浓度是：因子VIII：1.12 mg/ml，唾液酸转移酶：0.13 mg/ml，核苷酸：54 微摩尔。终体积：3.2 ml。将混合物在32℃放置1小时。

用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 25 mM NaCl, pH 7.3)，将混合物稀释至40 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：5倍柱体积洗出未结合的样品 (0%缓冲液B)、5倍柱体积0 - 20%缓冲液B、15倍柱体积20%缓冲液B、10倍柱体积100%缓冲液B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

用PEG 30 kDa 硫醇温育产物，然后进行SDS-PAGE 分析，证实在非还原条件下存在具有比FVIII更高分子量的带，但是在还原条件下不存在。

实施例25

经由N-聚糖将荧光的2-吡啶基二硫烷基柄缀合到AP3 全长抗体上，化合物8M

将在水性缓冲液(50%100 mM HEPES.HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, 33%100 mM 甘氨酸.HCl, pH 3.5, 17%20 mM HEPES.HCl, 150 mM NaCl, 0,01%吐温80, pH 7.5 – 最终pH 7.2)中的AP3 mlgG1野生型HC LC C39S 全长抗体(1.5 mg)与(4S,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[[2-[[2-[[2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酰基]-[2-[2-[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙氧基] 乙氧基] 乙基]氨基]乙酰基]氨基]乙酰基]氨基]-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙基] 四氢吡喃-2-甲酸二铵化合物4M和唾液酸转移酶 (ST3GalIII)相混合。

终浓度是：抗体：1.4 mg/ml，唾液酸转移酶：0.12 mg/ml，核苷酸：190 微摩尔。终体积：650 微升。将混合物在32℃放置19小时。

将样品转移至Millipore Amicon Ultra离心装置, MWCO 10.000 Da。用缓冲液(组氨酸, 1.5 mg/ml, CaCl₂, 0.25 mg/ml,吐温80, 0.1 mg/ml, NaCl, 18 mg/ml, 蔗糖 3 mg/ml, pH 7.0)洗涤蛋白几次。在所述缓冲液中，将溶液浓缩至100 微升。在280 nm和500 nm测定吸光度，然后进行SDS-PAGE 分析 (还原的和非还原的，7%NuPAGE Tris 乙酸盐, 1.0 mm, Invitrogen, 150 V, 70 min)，证实荧光团掺入抗体轻链中。

实施例26

经由O-聚糖将荧光的2-吡啶基二硫烷基柄缀合到BDD FVIII上，化合物9M

将在缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 500 mM NaCl, pH 7.3)中的无唾液酸BDD 因子VIII化合物6M (1.86 mg)与(4S,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[[2-[[2-[[2-[2-[4-[2-(3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]哌嗪-1-基]-2-氧代-乙氧基]乙酰基]-[2-[2-[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙氧基]乙氧基]乙基] 氨基]乙酰基]氨基] 乙酰基]氨基]-6-[(1R,2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二铵化合物4M和唾液酸转移酶 (ST3GalI)相混合。终浓度是：因子VIII：1.5 mg/ml，唾液酸转移酶：0.3 mg/ml，核苷酸：95 微摩尔。终体积：1.25 ml。将混合物在32℃放置15小时。将(2R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠(终浓度: 2.5 mM)和ST3GalIII加入混合物中。将混合物在32℃温育30分钟。用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 150 mM NaCl, pH 7.3)，将混合物稀释至25 ml。

SDS-PAGE 分析 (还原的和非还原的，7%NuPAGE Tris 乙酸盐, 1.0 mm, Invitrogen, 150 V, 70 min)证实荧光团在BDD FVIII重链中的掺入。

实施例27

将3-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酰基柄缀合到AP3 全长抗体的随机位置上，化合物10 M

将在缓冲液(50%100 mM HEPES.HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, 33%100 mM 甘氨酸.HCl, pH 3.5, 17%20 mM HEPES.HCl, 150 mM NaCl, 0,01%吐温80, pH 7.5 –最终的pH 7.2)中的AP3 mlgG1野生型Hc Lc C39S 全长抗体(1.3 mg)放入Millipore Amicon Ultra离心装置, MWCO 10.000 Da。用缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.3)洗涤蛋白数次。在所述缓冲液中浓缩溶液至65 微升。

将(2,5-二氧代吡咯烷-1-基) 3-[2-[2-[2-(2-乙酰基硫烷基乙氧基)乙氧基]乙氧基] 乙氧基]丙酸酯 (Pierce/Thermo Scientific, 2.2 mg, 5.2 微摩尔) 溶解于缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.3, 100 微升)中。将4微升该溶液(209 nmol)加入蛋白溶液中。将得到的混合物温育1小时。将该溶液放入Millipore Amicon Ultra离心装置, MWCO 10.000 Da。用缓冲液(20 mM HEPES, pH 7.3)洗涤蛋白数次。

实施例28

N -聚糖-无唾液酸-BDD 因子VIII，化合物11M

将在水性缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 500 mM NaCl, pH 7.3)中的BDD 因子VIII (7 mg)与来自产气荚膜梭菌的重组唾液酸酶(4 U)相混合。最终的体积是4 ml。将混合物在25℃放置30分钟。用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 25 mM NaCl, pH 7.3)，将混合物稀释至5 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：5倍柱体积当量0%缓冲液B、2倍柱体积洗出未结合的样品 (0%缓冲液B)、25倍柱体积0 - 70%(缓冲液B)、10倍柱体积70-100%(缓冲液B)、5倍柱体积100%缓冲液B。缓冲液A：组氨酸(1.5 mg/ml)、CaCl₂ (0.25 mg/ml)、吐温80 (0.1 mg/ml)、NaCl (2.9 mg/ml)和蔗糖 (3 mg/ml)、pH 7.0。缓冲液B：组氨酸(1.5 mg/ml)、CaCl₂ (0.25 mg/ml)、吐温80 (0.1 mg/ml)、NaCl (58 mg/ml)和蔗糖 (3 mg/ml)、pH 7.0。

实施例29

经由N-聚糖将3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基柄缀合到荧光标记的BDD FVIII上，化合物12M

将在缓冲液(组氨酸(1.5 mg/ml), CaCl₂ (0.25 mg/ml),吐温80 (0.1 mg/ml), NaCl (30 mg/ml),和蔗糖 (3 mg/ml), pH 7.0)中的N-聚糖-无唾液酸-BDD 因子VIII化合物11M (3 mg)与 (5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-5-[[2-[3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基]乙酰基]氨基]-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠化合物1M、(2R,5R,6R)-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-5-[6-[[4-羧基-3-(2,7-二氟-3-羟基-6-氧代-氧杂蒽-9-基)苯甲酰基]氨基]己酰基氨基]-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠和唾液酸转移酶 (rat rec. ST3GalIII)相混合。终浓度是：因子VIII：0.85 mg/ml，唾液酸转移酶：271 U/l，俄勒冈绿488 核苷酸：14 微摩尔，化合物1M：15 微摩尔。终体积：3.5 ml。将混合物在32℃放置18小时。将(2R,5R,6R)-5-乙酰氨基-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代-嘧啶-1-基)-3,4-二羟基-四氢呋喃-2-基]甲氧基-氧桥-磷酰基]氧基-4-羟基-6-[(2R)-1,2,3-三羟基丙基]四氢吡喃-2-甲酸二钠加入混合物中(终浓度: 54 微摩尔)。将混合物在32℃温育30分钟。

用缓冲液(组氨酸(1.5 mg/ml), CaCl₂ (0.25 mg/ml),吐温80 (0.1 mg/ml), NaCl (2.9 mg/ml),和蔗糖 (3 mg/ml), pH 7.0)，将混合物稀释至14 ml。

将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：5倍柱体积当量、2倍柱体积洗出未结合的样品、25倍柱体积0 - 70%、10倍柱体积70-100%缓冲液B和5倍柱体积100%B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

SDS-PAGE 分析 (还原的和非还原的，7%NuPAGE Tris 乙酸盐, 1.0 mm, Invitrogen, 150 V, 70 min)证实荧光团在BDD FVIII重链和轻链中的掺入。用PEG 30 kDa 硫醇温育产物，然后进行SDS-PAGE 分析，证实在非还原条件下存在具有比FVIII更高分子量的带，但是在还原条件下不存在。

实施例30

经由N-聚糖缀合到荧光标记的BDD FVIII上的3-(2-吡啶基二硫烷基) 丙酰基氨基柄（化合物12M）和AP3 scFv LC-HC之间的缀合物，化合物13M

将在甘氨酸缓冲液(100 mM, pH 3.5)和HEPES缓冲液(100 mM, pH 7.5)的1:1 混合物中的AP3 scFv与在水性缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 500 mM NaCl, pH 7.3)中的经由N-聚糖缀合到荧光标记的BDD FVIII上的3-(2-吡啶基二硫烷基) 丙酰基氨基柄（化合物12M）相混合。终浓度是：化合物12M：0.25 mg/ml，ScFv：2 微摩尔，0.06 mg/ml。终体积：2.1 ml。将混合物在23℃放置3小时。加入半胱氨酸(1 mg/ml)在缓冲液(2.3 微升)中的溶液和胱氨酸 (1 mg/ml)在缓冲液(3.5 微升) 中的溶液。将混合物在23℃放置15分钟。

用缓冲液(20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M 甘油, 25 mM NaCl, pH 7.3)，将混合物稀释至40 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液A) MonoQ 5/50 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述程序洗脱：5倍柱体积当量0%缓冲液B、2倍柱体积洗出未结合的样品 (0%缓冲液B)、25倍柱体积0 - 70%(缓冲液B)、50倍柱体积70-100%(缓冲液B)、5倍柱体积100%缓冲液B。咪唑缓冲液A：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。咪唑缓冲液B：20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油、pH 7.3。

将选择的级分转移至Millipore Amicon Ultra离心装置, MWCO 50.000 Da，将总体积减小至0.5 ml。将混合物装载到预调节的(用缓冲液) Superose 6 10/300 GL柱 (GE Healthcare)上，并使用下述缓冲液进行洗脱：组氨酸(1.5 mg/ml)、CaCl₂ (0.25 mg/ml)、吐温80 (0.1 mg/ml)、NaCl (18 mg/ml)和蔗糖 (3 mg/ml)、pH 7.0。

SDS-PAGE 分析 (非还原的，以及凝血酶消化的/非还原的，7%NuPAGE Tris 乙酸盐, 1.0 mm, Invitrogen, 150 V, 70 min)证实存在具有比起始物质更高分子量的荧光带。经证实，所述蛋白不结合血小板，这可以用Cys-34存在于CDR区中、因此影响结合亲和力的事实来解释。

实施例31

经由N-聚糖缀合了荧光3-(2-吡啶基二硫烷基)柄的AP3 mlgG1野生型HC LC C39S 全长抗体上的（化合物8M）与经由O-聚糖缀合了柄的BDD-FVIII（化合物7M）之间的缀合物

将在缓冲液中的缀合到柄上的AP3 mlgG1野生型Hc Lc C39S 全长抗体（例如，化合物8M）与三(羧乙基)膦在缓冲液中的溶液相混合。在选择性地还原二硫键以后，更换缓冲液，以便去除多余的三烷基膦。加入二-马来酰亚胺（例如，来自Rapp Polymere Gmbh的二-马来酰亚胺 PEG 6000, 目录号: 11 6000-45）在缓冲液中的溶液。在反应结束后，更换缓冲液。

将在缓冲液中的缀合到3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基柄上的FVIII（例如，化合物7M）与三(羧乙基)膦在缓冲液中的溶液相混合。在选择性地还原二硫键以后，更换缓冲液，以便去除多余的三烷基膦。

混合两种修饰的蛋白(FVIII和AP3 Ab)的溶液。通过SDS-PAGE 分析，监测希望的缀合物的形成。使用适当类型的色谱法，例如，离子交换或抗-FVIII 亲和色谱法，进行纯化。

实施例32

经由N-聚糖缀合了荧光3-(2-吡啶基二硫烷基)柄的AP3 mlgG1野生型HC LC C39S 全长抗体（化合物8M）与经由O-聚糖缀合了柄的BDD-FVIII（化合物7M）之间的缀合物

将在缓冲液中的缀合到柄上的AP3 mlgG1野生型Hc Lc C39S 全长抗体（例如，化合物8M）与二硫醇（例如，3,6-二氧杂-1,8-辛烷二硫醇）在缓冲液中的溶液相混合。在反应结束后，更换缓冲液。加入缀合到FVIII上的3-(2-吡啶基二硫烷基)丙酰基氨基柄（例如，化合物7M）的溶液。通过SDS-PAGE 分析，监测希望的缀合物的形成。使用适当类型的色谱法，例如，离子交换或抗-FVIII 亲和色谱法，进行纯化。

实施例33

经由N-聚糖缀合了荧光3-(2-吡啶基二硫烷基)柄的AP3 mlgG1野生型HC LC C39S 全长抗体（化合物8M）与FVIII的Cys突变体之间的缀合物

使用与上述相同的方法，将FVIII的表面可接近的Cys突变体缀合到AP3抗体或类似物 (或其片段)上。如果必要，用还原剂处理FVIII的Cys-突变体，以便去除共价地结合到突变的半胱氨酸上的取代基，从而产生硫醇/确保硫醇的存在。将形成的蛋白缀合到所述类型的合适的试剂上，例如，经由N-聚糖缀合到AP3 全长抗体上的荧光的2-吡啶基二硫烷基柄（化合物8M）。通过SDS-PAGE 分析，监测希望的缀合物的形成。使用适当类型的色谱法，例如，离子交换或抗-FVIII 亲和色谱法，进行纯化。

实施例34

在N-聚糖上用俄勒冈绿488修饰的且在O-聚糖上用dPEG12-SH修饰的FVIII的制备

步骤1: PySS-dPEG₁₂-GSC (化合物J1)的制备

将甘氨酰唾液酸胞嘧啶5’-单磷酸酯 (GSC, 二甲胺盐, 分子量673, 85%纯度, 96 mg, 153 μmol)溶解于100 mM TRIS缓冲液pH 8.4 (650 μL)中，然后加入乙腈 (650μL)，并搅拌，观察到两相系统。将SPDP-dPEG₁₂-NHS-酯 (Quanta Biodesign, 产品号10378, 1.2当量, 183 μmol, 170 mg)溶解于650 μL THF中，随后加入100 mM TRIS pH 8.4 (650 μL)，观察到淡白色浑浊沉淀物，将该NHS-酯溶液加入到GSC溶液中。在pH 8.4，溶液稍微浑浊。在室温搅拌该溶液7 h，将得到的混合物冷冻，并冻干，得到粗化合物。通过制备型 HPLC，纯化冷冻干燥后得到的白色粉末，其中使用纯水作为平衡缓冲液，并使用纯乙腈的线性梯度进行洗脱。合并含有希望的产物的级分，并冻干，得到100 mg目标化合物，通过分析型HPLC，证实它是均质的，并通过质谱法进行鉴别。

步骤2: 将PySS-dPEG₁₂-GSC偶联到野生型BDD FVIII的O-聚糖上(化合物J2)

向野生型BDD FVIII (“N8”, 5.7 mg/ml; 5 mg, 875μl)中加入来自产脲节杆菌的唾液酸酶 (0.44 mg/ml, 50 μl)和PySS-dPEG₁₂-GSC (J1)（1 mg/ml，在pH 7.3的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、200 mM NaCl、1 M 甘油组成的缓冲液中，使用100 ul）和His-ST3Gal-I (2.5 mg/ml, 375 μl)。将反应混合物在32℃温育过夜17 h的时间段。然后用25 ml缓冲液（20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 25 mM NaCl, 1 M 甘油, pH 7.3）稀释它，以降低电导率。然后将混合物装载到MonoQ 5/50 GL柱上，该柱用20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3平衡过。使用洗脱缓冲液（20 mM 咪唑, 10 mM CaCl₂, 0.02%吐温80, 1 M NaCl, 1 M 甘油, pH 7.3），使用两步梯度法洗脱产物。使用20%洗脱缓冲液洗脱FVIII-无关的物质，而使用100%洗脱缓冲液洗脱产物。合并含有希望的产物(J2)的级分。产量4.1 mg, 1.17 mg/ml。

步骤3: 用俄勒冈绿进行标记和用N-聚糖进行加帽(J3)

将根据步骤2制备的修饰的蛋白(J2)与MBP-ST3Gal-III (1.2 U/ml , 300 μl)和俄勒冈绿488-GSC (将2 mg溶解于800 μl pH 7.3的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、200 mM NaCl、1 M 甘油组成的缓冲液中；使用200 μl、0.5 mg、20当量)相混合，并在暗处在32℃温育过夜。随后，将CMP-NAN (9 mg在250 μl pH 7.3的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、200 mM NaCl、1 M 甘油组成的缓冲液中)加入反应混合物中，并在32℃温育另外1小时。然后用30 ml 20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3稀释它，以降低电导率。如步骤2所述，通过AIEX进行纯化。产量：1.54 mg，0.51 mg/ml。

步骤4: 用TCEP还原

将根据步骤3制备的修饰的蛋白(J3)与三羧基乙基膦 (TCEP，700当量、1.69 mg；将6 mg TCEP溶解于1 ml pH 7.3的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、200 mM NaCl、1 M 甘油组成的缓冲液中，使用282 μl)相混合，并在5℃在暗处温育30 min。然后用30 ml 的20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3稀释它，以降低电导率。如步骤2所述，通过AIEX进行纯化。产量：610 μg，610 μg/ml。使用由组氨酸(1.5 mg/ml)、CaCl₂ (0.25 mg/ml)、吐温80 (0.1 mg/ml)、NaCl (18 mg/ml)、蔗糖 (3 mg/ml)组成的缓冲液作为流动相，通过SEC (柱: Superdex 200 10/300 GL)进一步纯化产物。合并含有希望的产物(J4) 的级分。产量：420 μg，120 μg/ml。来自产物的SDS PAGE凝胶分析的数据与N8基本上相同，凝胶荧光成像证实HC和LC都含有荧光标记。使用30 kDa PEG-马来酰亚胺，对产物进行测试反应。该反应的SDS PAGE分析显示出分子量增加的带，以及FVIII HC带消失，因而指示存在游离的硫醇基团。

该实施例证实可以用硫醇基团在O-聚糖上修饰FVIII。

实施例35

用-SSPy基团修饰的全长AP3 mIgG抗体(J5)的制备

如下将全长AP3 mlgG1野生型LC C39S (3.0 mg/ml、400 μl、1200 μg、8 nmol、pH 7.2，在缓冲液（50%100 mM HEPES HCl, 150 mM NaCl, pH 7.5, 33%100 mM 甘氨酸HCl, pH 3.5）和缓冲液（17% 20 mM HEPES HCl, 150 mM NaCl, 0,01%吐温80, pH 7.5）的混合物中)的缓冲液更换为HEPES 100 mM、pH 7.5：浓缩至100 μl (15 min, 12.000 g, Millipore Amicon Ultra 10 kDa)，稀释至900 μl，然后浓缩至100 ul (12 min, 12.000 g) x 6。终体积是约80 μl。然后使用HEPES 100 mM pH 7.5，将它稀释至约260 μl。随后，将SPDP-dPEG₁₂-NHS-酯 (Quanta Biodesign, 产品号10378，将1.8 mg溶解于400 μl HEPES 100 mM、pH 7.5中；使用其中的20当量、144 μg、32 μl)加入到缓冲液更换的AP3 FL mIgG中。在室温温育反应混合物过夜。还原的和非还原的SDS PAGE凝胶分析证实，与FL抗体和单个的重链和轻链相对应的带的分子量增加，且外观更宽，因而证实，希望的修饰已经发生。如上所述，将蛋白的缓冲液更换为HEPES 100 mM、pH 7.5。产量765 μg，8.5 mg/ml。

该实施例证实：用含有硫醇敏感的–SSPy缀合基团的酰化剂可以修饰AP3 FL mIgG。

实施例36

FVIII和AP3 FL mIgG之间的缀合物的制备

将AP3 mIgG1 dPEG₁₂-SSPy (J5, 8.5 μg/μl, 0.057 nmol/μl, 31 μl, 1.76 nmol)与2500 μl FVIII 衍生物J4 (300 μg, 1.76 nmol, 120 μg/ml)相混合。无菌过滤混合物，包裹在铝箔中，在室温放置过夜，然后进行的SDS PAGE凝胶分析证实，已经形成了具有与野生型BDD FVIII和AP3 FL mIgG之间的希望的加合物相对应的分子量的产物。凝胶荧光成像证实这些带含有荧光标记，表明源自FVIII HC或LC链。还在有过量N-乙基马来酰亚胺存在下，进行凝胶分析，以证实在SDS 样品制备过程中没有发生所述缀合。使混合物反应另外3天，然后用30 ml的20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3稀释它，并装载到MonoQ 5/50 GL柱上，该柱用20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、25 mM NaCl、1 M 甘油、pH 7.3平衡过。使用pH 7.3的由20 mM 咪唑、10 mM CaCl₂、0.02%吐温80、1 M NaCl、1 M 甘油组成的洗脱缓冲液，使用线性梯度，洗脱该产物。以此方式，使游离的AP3 FL mIgG 与游离的BDD FVIII和缀合物分离。还原的和非还原的 SDS PAGE 分析证实小量级分含有希望的产物。非还原的凝胶指示FVIII HC带的消失，同时显示出与AP3 FL mIgG和FVIII之间的缀合物相对应的高分子量带。使用mIgG特异性的抗体的蛋白印迹证实这些带含有AP3 FL抗体。还原的凝胶证实存在FVIII和AP3重链和轻链。

该实施例证实：经由通过AP3 FL mIgG上的硫醇基团和BDD FVIII上的–SSPy基团之间的反应形成的二硫键可以缀合AP3 FL mIgG和BDD FVIII。

实施例37

通过产色试验测量细胞培养收获物中的FVIII:C

如下使用Coatest SP试剂(Chromogenix)，在产色FVIII试验中评价rFVIII 化合物在细胞培养收获物(上清液级分)中的FVIII活性 (FVIII:C)：在Coatest试验缓冲液(50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1%BSA, pH 7.3, 具有防腐剂)中稀释rFVIII样品和FVIII标准品 (凝结参照, Technoclone)。将50 μl 样品、标准品和缓冲液阴性对照加入96-孔微孔滴定板 (Spectraplates MB, Perkin Elmer)。以1:100、1:400、1:1600和1:6400稀释所有样品。以5:1:3 (体积:体积:体积)混合来自Coatest SP 试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl₂，且将75 μl加入孔中。在室温温育15分钟后，加入50 μl因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物，且在室温温育反应物5 min，然后加入25 μl 1 M 柠檬酸pH 3。在Envision微孔滴定板读数器 (Perkin Elmer)上测量在405 nm的吸光度，在620 nm的吸光度用作参照波长。从所有样品减去阴性对照的值，且通过相对于FVIII浓度绘制的吸光度值的线性回归，制备校准曲线。如下计算比活：将样品的活性除以通过ELISA测得的蛋白浓度。

实施例38

AP3-FVIII 融合-蛋白在临床上有关的FVIII活性测定中的比活

在标准的FVIII:C测定、产色测定或单级凝结测定中，评价纯化的蛋白和缀合物(N8对照, F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (SEQ ID NO 40)、F8-500 AP3-LC-HC scFV (SEQ ID NO 43)和 F8-500 AP3-HC-LC scFV (SEQ ID NO 42))的FVIII活性。

使用Coatest SP试验(Chromogenix, Lexington, MA, USA)，评估纯化的蛋白的产色FVIII活性。根据生产商的说明书，进行少许次要修改，进行试验，并以96-孔板形式运行。简而言之，用来自Coatest SP试剂盒的因子IXa/因子X试剂、磷脂试剂和CaCl₂的混合物，温育稀释的FVIII样品和FVIII参照物。在室温温育15分钟后，加入因子Xa底物S-2765/凝血酶抑制剂I-2581混合物，且在室温温育反应物10 min，然后用20%柠檬酸终止反应。在Spectramax微孔滴定板读数器 (Molecular Devices)上测量在415 nm的吸光度，在620 nm的吸光度用作参照波长。相对于7th WHO/NIBSC重组FVIII标准品校准的重组FVIII用作参照物。参见表4。

实施例39

通过单级凝结测定测得的纯化的样品中的FVIII:C

根据SSC推荐，通过首先在缓冲液中、然后在含有von Willebrand 因子的FVIII-缺陷型血浆(Siemens, Deerfield, IL, USA)中稀释浓缩的FVIII样品和参照物，测定FVIII 化合物的FVIII凝结活性。在4 个不同的浓度，测量每种FVIII 样品。使用单因子程序(FVIII:Cd)，在ACL 9000仪器上，测量FVIII凝结活性，其中将FVIII样品与APTT 试剂(Synthasil, ILS, Bedford, MA, USA)、25 mM CaCl₂和FVIII-缺陷型血浆相混合。相对于7th WHO/NIBSC重组FVIII标准品校准的重组FVIII用作参照物。

表4

如表4所示，在FVIII 产色-和凝结活性测定中具有类似FVIII活性的AP3-FVIII融合蛋白和缀合物作为N8 起始物质。

实施例40

由特异性地结合到血小板上的AP3-N8 融合-蛋白支持的凝血酶产生

已经提示，总凝结试验诸如凝血酶产生试验(TGT)是相对于凝结和产色测定而言在生理学上更相关的因子VIII (FVIII)活性测量方法，特别当在测定中包含血小板时。为了评估AP3-N8对血小板的影响，在模拟人A型血友病的系统中，测试FVIII 化合物 (F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3和N8对照)。通过用洗过的来自单个正常供血者的血小板替换FVIII-缺陷型血浆 (>1%FVIII活性)，制备A型血友病的模拟物。用组织因子和钙启动凝结过程，进行凝血酶产生后，在试验中包含发荧光的凝血酶底物，其甚至可以以纤维蛋白凝块形式检测到。因而，在A型血友病的模拟物中，产生的凝血酶的量和凝血酶产生速度取决于在TGT中存在的FVIII的量。这里使用的TGT方法从Hemker (1)描述的富含血小板的血浆(PRP)试验改进而来。简而言之，从由单个正常健康供体收集的柠檬酸盐化的血液中，分离出血小板，并根据Mustard (2)的规程，通过一系列洗涤步骤，进行纯化。* 将洗过的血小板加入FVIII-缺陷型血浆 (George King, Overland Park, KA, USA)中，至150,000 血小板/μl的浓度。在微孔滴定板中将80μL该FVIII-缺陷型 PRP (最终100,000 血小板/μl)与10μl Innovin (最终稀释度1:200,000)相混合，并在37℃预温育10 min，然后加入与CaCl₂ (终浓度 16.7 mM)相混合的10 μl FVIII 化合物或缓冲液和20 μl 发荧光的底物 (Z-Gly-Gly-Arg-AMC, Bachem, 终浓度 417 nM)。在Fluoroskan Ascent 平板读数器 (Thermo Electron Corporation)中，在390nm的激发以后，连续测量在460 nm的发射2小时。使用校准器和Trombinoscope 软件 (Synapse BV)，校正α2-巨球蛋白结合的凝血酶活性的荧光信号，并转换为凝血酶浓度。

为了证实AP3会将特异性的血小板结合传递给N8，所述N8会允许FVIII分子在活化时被在循环中的血小板负载，而不是仅仅定位于血小板，使用下述额外步骤，进行上述TGT试验：* 已经得到洗过的血小板以后，马上用AP3-N8-融合蛋白或N8 (20 U/ml)在室温温育血小板30 min，以便允许N8 化合物结合血小板。该温育之后进行2个额外的洗涤步骤，以去除所有未特异性地结合到静止血小板上的N8。在这2个额外的洗涤步骤之后，将血小板加入FVIII缺陷型血浆，如上所述测量钙和发荧光的底物和凝血酶产生形式的FVIII活性。将从软件得到的参数记录为：描述开始凝血酶产生的时间的“延迟时间”，描述凝血酶产生的最大速率（nM）的“峰”和“达到峰的时间”。通过快速的早期开始和高凝血酶形成速率，表征强凝结。

表5

结果表明：在用AP3-N8-融合蛋白温育血小板的实验中存在强烈的凝血酶产生，而用N8温育的血小板表现出勉强超过背景(A型血友病)水平的凝血酶产生。因而，尽管可以从血小板洗出N8对照，保持与血小板结合的AP3-N8-融合蛋白由此直接证实由血小板负载的FVIII活性。

实施例41

融合蛋白结合纯化的GPIIIa的分析

在Biacore T-100仪器上，通过表面等离子体共振，得到结合相互作用分析。通过在10 mM 乙酸钠 pH 4.5-5.0中直接固定化到CM5芯片上，达到1000-4000 RU的水平，捕获固定浓度的纯化的GPIIbIIIa (Enzyme Research Laboratories)。测试5-0.31 nM的FVIII衍生物的2倍稀释液与固定化的GPIIbIIIa的结合。运行和稀释缓冲液：10 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM CaCl₂、0.005%p20、pH 7.4。在运行缓冲液中透析和稀释所有FVIII衍生物。通过10 mM 甘氨酸、pH 1.7，得到再生。使用Biacore T100评价软件，假定FVIII 衍生物和GPIIbIIIa的1:1 相互作用，测定动力学和结合常数(k_on, k_off)。结果如下表所示。

表6: 表面等离子体共振(SPR)分析。结合GPIIbIIIa。动力学常数

n.d. 观察到的离解速率太低，难以准确测定k_off。

实施例42

FVIII 融合/缀合物结合血小板的分析

通过流式细胞术，可以测试融合蛋白的血小板结合。可以纯化末梢血血小板，或可以使用全血。血小板可以是活化的或静止的。用融合蛋白温育血小板15-30 min。可以用荧光团直接地标记融合蛋白，或使用荧光标记的第二抗体进行检测。可以加入不干扰融合蛋白的结合的、荧光标记的血小板特异性的抗体，以评估结合融合蛋白的颗粒是否确实是血小板。温育后，洗涤细胞，以去除融合蛋白，并在流式细胞计上分析样品。流式细胞计检测未标记的细胞和荧光标记的结合细胞的分子，因而可以用于特异性地分析融合蛋白结合血小板(或其它细胞)的程度。

例如，通过加入过量的未标记的抗体(当使用直接标记的融合蛋白时)，可以评估结合特异性。例如，通过加入过量的膜联蛋白V或FVIII，可以评估FVIII部分与血小板的结合。例如，可以如下评估静止血小板对融合蛋白的内化：用直接标记的融合蛋白温育血小板，随后用抗体温育，所述抗体猝灭来自表面-结合的(即未内化的)融合蛋白的信号。然后通过流式细胞术，仅检测到内化的融合蛋白。可以假设，活化的血小板会在凝块形成部位释放内化的融合-蛋白。

实施例43

FVIII-AP3 融合物和缀合物结合血小板的测试

通过流式细胞术，测试F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (SEQ ID NO 40) (AP3-N8 2097)和化学偶联到N8上的全长AP3 IgG (实施例18中的MZ1)的血小板结合。制备来自人末梢血的洗过的血小板，并与AP3-N8一起在暗处在室温温育30 min (~ 300.000 血小板/样品)。作为血小板标志物，将多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)-标记的抗CD42a与AP3-N8 构建体一起加入样品中。温育后，用缓冲液(20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 1 mg/ml BSA, 5 mM CaCl₂)洗涤细胞，以去除未结合的抗体，并加入藻红蛋白-Cy7 (PE-Cy7) 抗-FVIII 单克隆抗体(10 μg/ml)。温育30 min后，用缓冲液洗涤细胞，并在BD LSRFortessa^TM 流式细胞计上分析样品，其中使用对数模式的正向和侧向散射检测器(分析至少5.000事件/样品)。分析~ 0.025 - 51.2 nM (对于MZ1，25.6 nM)的AP3-N8剂量，以评估结合的剂量-依赖性。在单个实验中测试3个供体（对于AP3-N8 2097）和1个供体（对于MZ1构建体）。通过向样品中加入过量的未标记的 AP3-LC-HC scFV-FLAG (SEQ ID NO 22) (多达50倍过量)，评估AP3-N8结合的特异性。因而，数据证实构建体与血小板上的GPIIb/IIIa受体的AP3-特异性的结合。使用类似的AP3-N8构建体的实验（其中用俄勒冈绿直接标记N8部分）得到相当的结果，这支持了AP3-N8构建体与血小板的特异性结合(n = 5)。

可以如下评估AP3-N8的内化：首先用荧光标记的 AP3-N8温育血小板，并通过流式细胞术测量荧光，然后加入抗体，所述抗体猝灭来自表面-结合的(即未内化的) AP3-N8的信号。当通过流式细胞术重新分析样品时，仅检测到内化的AP3-N8。

实施例44

测试F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (SEQ ID NO 40)对血小板的抗凝集作用

通过监测穿过分离的血小板的悬浮液的光透过变化，测量F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (SEQ ID NO 40)的可能的抗凝集作用。该方法基本上由Gustav von Born在二十世纪六十年代首次描述(Born, Nature, 194:927-29 1962)，现在是最常用的评价血小板功能的方法之一。简而言之，该方法测量光透过血小板悬浮液的能力。该血小板悬浮液可以是富含血小板的血浆或分离的血小板。在活化后，GPIIb/IIIa改变它的构象为纤维蛋白原高结合状态，且在有纤维蛋白原存在下，血小板会开始形成聚集体。这反映为光透过的增加，因为更多的光会穿过具有少量大聚集体（与许多单个的血小板相比）的样品。通常，通过抗体的减少血小板对活化剂(例如ADP或凝血酶) 的血小板凝集响应的能力，检查抗体的抑制作用，所述能力例如通过光透过的变化来测量 (Coller 等人 JCI 72(1):325-38, 1983)。

术语“分离的人血小板”在本实施例中表示从保持在等渗缓冲液中的人全血衍生出的血小板。从来自健康志愿者的肝素化的人静脉人血分离出血小板，将其与含有85 mM柠檬酸钠、71 mM 柠檬酸和111 mM 葡萄糖的酸性柠檬酸盐-葡萄糖(ACD) 溶液(6:1, v/v)相混合。在220g离心血液20分钟，得到富含血小板的血浆(PRP)。加入乙酰水杨酸(100 μM)和腺苷三磷酸双磷酸酶0.5 U/ml，防止在制备过程中类花生酸和腺嘌呤核苷酸对血小板的活化。通过在480g离心20分钟，沉淀出PRP中的血小板，并去除上清液。将血小板轻轻地重新悬浮于不含钙的Hepes 溶液(pH 7.4)中，该溶液由145 mM NaCl、5 mM KCl、1 mM MgSO₄、10 mM 葡萄糖、10 mM Hepes和1 U/ml 腺苷三磷酸双磷酸酶组成。将血小板悬浮液在室温保持在塑料试管中，并在每个实验中，将[Ca²⁺]调节至1 mM，将温度调节至37℃。

在37℃，在连续搅拌(1200 rpm)下，将血小板样品保持在硅化的玻璃比色皿中，同时使用Platelet Aggregation Profiler? (PAP)-8E仪器(Bio/Data Corporation, Horsham, PA)，测量光透过。用F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (SEQ ID NO 40) (30 nM)、AP3-LC-HC scFV-FLAG (SEQ ID NO 22) (30 nM)或阿昔单抗 (ReoPro?) (30 nM) 温育样品3分钟，然后用蛋白酶活化的受体-1 (PAR-1)活化肽(氨基酸序列 SFLLRN) (10 μM)活化。结果表明，与对照相比，用AP3-N8 处理过的血小板的血小板凝集没有显著差异(表7)。此外，测试了30 nM AP3-LC-HC scFV-FLAG的抗凝集性质，没有表现出抑制作用的指征。但是，抗凝集的阿昔单抗 (ReoPro?) (30 nM)有效地抑制了SFLLRN活化的血小板的血小板聚集大约40% (表7)。当增加浓度时，F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3和ReoPro?之间在血小板聚集抑制方面的差异甚至更显著。图2显示了当使用F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3 (100 nM)或ReoPro? (100 nM)时的血小板聚集。该更高的浓度导致ReoPro?的增强的抑制，而增加的F8-500 AP3-LC-HC scFV–Δa3浓度对血小板聚集没有影响。

表7. 血小板聚集

数据显示为对照的百分比(SFLLRN 10 μM) ±SD，且在所有组中，n=3。

实施例45

含有人源化的IgB3受体的小鼠品系的制备和应用

通过将人ITGB3内含子 5 (647碱基对)插入与人外显子5和6相对应的序列之间，工程化含有人ITGB3 cDNA {从外显子2 (G26)至外显子15 (包括来自提供的cDNA的部分3'UTR)}的载体。将转录STOP盒插入人部分3'UTR的下游紧邻处。将工程化的人ITGB3 cDNA插入在小鼠外显子1中的对应位置处。为了优化小鼠细胞中对人ITGB3蛋白的加工，人源化的等位基因将表达小鼠 Itgb3 信号肽 (在外显子1内编码)和人ITGB3 成熟的蛋白之间的融合蛋白。给选择标志物 (Puro)侧接F3位点，并插入在人ITGB3 3'UTR的下游。人源化的等位基因在Flp-介导的选择标志物去除以后。在小鼠 Itgb3 启动子的控制下，表达人Itgb3蛋白。工程化的人ITGB3 cDNA（包括它的3'UTR区）向小鼠外显子1中的插入，会导致小鼠 Itgb3基因的失活。经证实的最终的靶向载体的序列如图3所示。

杂合的靶向的C57BL/6 ES细胞的制备

在含有20%FBS和1200 u/mL 白血病抑制因子的DMEM高葡萄糖培养基中，在由小鼠胚胎成纤维细胞组成的有丝分裂失活的饲养层上，培养C57BL/6N ES细胞系。在240 V和500 μF，电穿孔1x10⁷细胞和30 μg线性化的DNA载体。克隆选择是基于在电穿孔后第2天开始的嘌呤霉素选择(1 μg/mL)和在电穿孔后第5天开始的丙氧鸟苷(2 μM)反选择。在第8天，分离ES克隆，并在扩增后，通过DNA印迹法进行分析。

杂合动物的制备:

在施用激素以后，使超排卵的Balb/c雌性动物与Balb/c雄性动物交配。在交配后3.5天，从子宫分离出胚泡。为了显微注射，在矿物油下，将胚泡放入一滴含有15%FCS的DMEM中。使用具有12 - 15 微米内径的平尖的、压力推动的显微注射-吸管，注射10-15个靶向的C57BL/6 N.tac ES细胞到每个胚泡中。恢复后，在交配后2.5天，将8个注射的胚泡转移至假孕的NMRI雌性动物每个子宫角。通过ES细胞对Balb/c 宿主的毛色贡献(黑/白)，在嵌合体(G0)中测量嵌合现象。将高度嵌合的小鼠繁殖成C57BL/6雌性动物品系。通过黑色品系C57BL/6后代(G1)的存在，鉴别种系传递。

纯合的动物的制备

通过交配杂合小鼠，或通过体外受精，繁殖后代G1。从交配和体外受精（IVF）的初步尝试，测得表8所示的基因型分布。

表8. 人源化的GPIIIb小鼠的基因分型。

实施例46

GPIIIa-靶向的融合蛋白在GPIIIa 转基因小鼠中的药代动力学

AP3抗体结合血小板上的人GPIIb/IIIa (整联蛋白αIIβ3)受体，但是它不识别鼠GPIIb/IIIa，这阻止了野生型小鼠用于药代动力学(PK)分析的应用。在表达人GPIIIa的转基因小鼠(在Taconic M&B繁殖)中，可以分析AP3-FVIII 融合物或缀合物的PK特性，所述人GPIIIa结合鼠GPIIb，使得AP3结合受体。GPIIIa 转基因小鼠接受AP3-FVIII融合物或缀合物的单次静脉内注射，并在注射后多达288小时的时间点，从眶前网状组织收集血液。在研究过程中，从每只小鼠收集约3个样品，并在每个时间点收集2-4个样品。在适当的缓冲液中，稳定化和稀释血液。借助于ELISA或流式细胞术，使用针对N8或直接标记的AP3-FVIII融合物或缀合物的抗体，可以定量注射的AP3-FVIII 融合物或缀合物(游离的和/或平板结合的)。

实施例47

GPIIIa-靶向的融合蛋白在GPIIIa 转基因小鼠中的作用的持续时间

为了评价GPIIIa-靶向的融合蛋白在动物疾病模型中的效能和作用的持续时间，制备了具有人源化的IgB3受体的小鼠品系。可以使制备的小鼠品系与其它(转基因的)小鼠品系杂交，后者包括但不限于缺少凝血因子VIII或IX的小鼠。通过天然交配，或使用体外受精转移(例如G.Vergara Theriogenology 1997; 47, 1245-1252)，可以繁殖小鼠。或者，借助于骨髓移植，可以将人源化的血小板转移给其它小鼠。通过例如Shi 等人所述的方法 (Blood. 2008;112, 2713-2721)，从人源化的小鼠分离骨髓细胞，并注射进适当的制备的受体小鼠（即缺少因子VIII或IX的小鼠）中。可以如下在上述动物模型中测试效能：通过测量在尾部采血试验中减少出血的能力(Holmberg 等人, J Thromb Haemost 2009; 7: 1517–22)或在FeCl₃损伤模型中形成凝块的能力 (Moller & Tranholm, Haemophilia 2010; 16, e216–e222)。通过在上述模型中延长以后药物的效能，可以测试作用的持续时间。

Claims

1. 一种FVIII分子，其包括与选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 3的氨基酸序列的成熟部分具有至少约95%同一性的氨基酸序列，所述分子共价地结合到血小板-特异性的分子上，其中所述血小板-特异性的分子是非抑制性的GPIIb/IIIa抗体。

2. 根据权利要求1所述的FVIII分子，其中所述分子具有降低的vWF结合能力。

3. 根据权利要求1-2中任一项所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体选自：AP3抗体、Tab抗体或SZ22抗体。

4. 根据权利要求1-3中任一项所述的FVIII分子，其中所述分子是融合蛋白。

5. 根据权利要求1-3中任一项所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体通过连接物共价地连接到FVIII上。

6. 根据权利要求5所述的FVIII分子，其中所述连接物包含在FVIII分子上的N-连接的或O-连接的聚糖。

7. 根据权利要求6所述的FVIII分子，其中所述聚糖位于B结构域中。

8. 根据权利要求4所述的FVIII分子，其中所述非抑制性的GPIIb/IIIa抗体融合到B结构域截短的因子VIII分子的B-结构域上。

9. 根据权利要求4所述的FVIII分子，其中FVIII分子的a3结构域被非抑制性的GPIIb/IIIa抗体替换。

10. 根据权利要求7所述的因子FVIII分子，其中所述FVIII分子包含如在SEQ ID NO 3中所述的序列，且其中所述连接物包含位于B结构域中的O-连接的聚糖。

11. 一种核酸，其编码根据权利要求8或9中任一项所述的FVIII分子。

12. 一种宿主细胞，其包含根据权利要求11所述的核酸。

13. 一种生产FVIII分子的方法，所述方法包括：在根据权利要求12所述的宿主细胞中，表达根据权利要求11所述的核酸。

14. 一种生产根据权利要求5、6、7和10中任一项所述的FVIII分子的方法，其中所述方法包括将FVIII分子与非抑制性的GPIIb/IIIa抗体缀合。

15. 一种药物组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的FVIII分子。

16. 根据权利要求1-10中任一项所述的FVIII分子作为用于治疗A型血友病的药物的用途。

17. 一种治疗哺乳动物宿主中的A型血友病的方法，所述方法包括给所述宿主施用治疗有效量的根据权利要求1-10中任一项所述的分子。