CN102482320A - 丝氨酸和苏氨酸位的天然化学连接 - Google Patents

丝氨酸和苏氨酸位的天然化学连接 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化学选择性化学连接方法。该方法通过在连接位生成天然肽键(Xaa-Ser和Xaa-Thr)(Xaa表示任意氨基酸)而使两个肽片段有效结合，以产生较大的多肽或蛋白。该方法需要两步：a)将一个或多个初始肽反应以形成在连接位具有缩醛基团的缩醛中间体；b)将所述缩醛中间体转化为具有所述天然肽键的所需肽或蛋白。

Description

丝氨酸和苏氨酸位的天然化学连接
技术领域
本发明涉及利用天然肽键端对端化学连接两个肽片段的方法和缩醛中间体。更具体而言，本发明涉及用于化学连接的方法和缩醛中间体，其中第一初始肽的N端丝氨酸或苏氨酸与具有C端芳基醛酯的第二初始肽迅速缩合从而形成缩醛中间体，所述缩醛中间体可以迅速转化为在连接位具有Xaa-Ser/Thr形式的天然肽键的连接产物(Xaa表示任意氨基酸)。
背景技术
除提供蛋白的重组DNA技术之外，蛋白的化学合成已明显地有助于研究蛋白结构与功能的关系。此外，随着作为治疗剂的中等大小(20～100个氨基酸)的多肽类药物的迅速出现，合成肽化学已经前所未有地活跃起来。梅里菲尔德的线性固相肽合成(SPPS)为制备多肽提供了通用工具。然而，利用线性固相肽合成来化学合成大的多肽(＞50个氨基酸)成本非常高，有时还不能实现。因此，实现多肽的汇集合成的方法变得很关键。利用较少或者不利用保护基团以及偶联步骤的效率是汇集合成开发中的关键问题。将未受保护的肽用于化学操作避开了经典肽偶联反应因有限溶解性所造成的固有的困难，因此增加了偶联收率，并使得易于纯化和表征。开发使用未受保护的肽片段的肽偶联方法的关键问题在于下述化学选择性反应的可行性，所述反应可特异性地并明确地通过一种肽的C端和另一种肽的N端使这两种肽结合。利用化学选择性反应通过在连接位形成非天然(即，非肽)骨架结构使两个肽片段结合使得可以容易地制备各种各样的骨架修饰的人造肽和蛋白。然而，为实现天然化学连接(通过天然肽键连接两个肽片段)，化学方法是非常受限的。使用未受保护的肽、在连接位形成天然肽键和不导致或几乎不导致所形成的肽键差向异构化是实际天然化学连接的特征。
很明显，由Kent及合作者开发的基于半胱氨酸的天然化学连接(NCL)满足这些标准，并且其无疑已成为合成肽化学中的最有力的方法(Dawson P.E.；Muir，T.R.；Clarklewis，I.；Kent，S.B.H.Science，1994，266，776-779，“synthesis of proteins by nativechemical ligation”)。该方法使得能够汇集合成较大尺寸的肽、甚至蛋白。NCL的应用在过去15年间已被广泛地扩展到化学和生物的各个方面。基于半胱氨酸的NCL的特征在于在N端半胱氨酸和C端硫酯之间的硫捕捉，作为转硫酯化步骤其具有高度化学选择性，随后发生迅速的S→N酰基转移，从而提供天然的Xaa-Cys肽键合(Xaa表示任意氨基酸)。其高效性、易操作性和化学选择性(在任何未受保护的氨基酸的存在下)对于其用户/实践者非常富有吸引力，因此基于半胱氨酸的NCL已经广泛用于化学合成许多蛋白(＞100个氨基酸)。基于半胱氨酸的NCL实现了化学选择性的原因在于，N端半胱氨酸可以将其自身的双官能度(即，1，2-巯基-胺)和其他内部未受保护的氨基酸官能团区分开来。此外，捕捉-重排化学连接不涉及活化羧基，因此天然化学连接克服了常规片段缩合方法的外消旋化问题。
然而，半胱氨酸残基的极少存在(在蛋白中的丰度为1.4％)限制了上述NCL的效用。为解决此问题，人们广泛地寻求着在其他氨基酸位的其他天然化学连接方法。到目前为止，近来开发的所有替代方法都遵循基于半胱氨酸的天然化学连接原理，其依赖硫-捕捉-重排策略。许多努力集中于将硫基引入天然氨基酸的β或γ-位。在类似半胱氨酸-天然化学连接之后，连接产物的硫基被除去，从而实现了在相应氨基酸处的连接。其他努力针对的是开发新的化学条件，以将半胱氨酸-NCL产物转化为其他形式的氨基酸，如半胱氨酸的脱硫，以提供丙氨酸。所有这些方法提供了肽/蛋白连接的新方法，并已用于制备结构非常复杂的各种(糖)肽/蛋白(Offer，J.；Boddy，C.N.C.；Dawson，P.E.J.Am.Chem.Soc.，2002，124，4642-4646，“Extending synthetic accessto proteins with a removable acyl transfer auxiliary”)。然而，这些方法的实施需要复杂的化学或者非天然氨基酸的合成，因此，它们不像基于半胱氨酸的NCL那样普遍使用。此外，这些方法除了对连接位处的半胱氨酸残基之外还会影响其它未受保护的半胱氨酸残基。尚未发现利用在其他氨基酸位用户友好条件的化学选择性连接。
发明内容
本发明涉及作为另一种天然化学连接(NCL)的通过产生天然肽连接来连接两个肽的方法。公知的基于半胱氨酸的NCL依赖于使用在肽片段的N端的半胱氨酸残基和作为另一肽片段的C端的硫酯来产生Xaa-Cys连接的肽。不同的是，本发明的方法使用在肽片段的N端的丝氨酸或苏氨酸和作为另一肽片段的C端的芳基醛酯(例如水杨醛酯)来产生Xaa-Ser或Xaa-Thr连接产物(Xaa表示任意氨基酸)，从而实现基于丝氨酸和苏氨酸的天然化学连接。
本发明的一个实施方式提供一种基于丝氨酸和苏氨酸的天然化学连接的方法，所述方法的特征在于其使用未受保护的肽片段，不导致差向异构化、易于操作、转化迅速和在连接位形成Xaa-Ser和Xaa-Thr形式的天然肽键。图1说明的是通过使用C端水杨醛酯所示例的该Ser/Thr天然化学连接的原理。第一步是在C端具有水杨醛酯的肽与具有N端丝氨酸或苏氨酸残基的另一肽片段的化学选择性反应，以提供在连接位具有N，O-亚苄基缩醛部分的可分离中间体。无需纯化，N，O-亚苄基缩醛中间体可以转化为在连接位具有天然肽键的目标全长多肽产物。这两步在同一烧瓶中进行，无需纯化中间体。除水杨醛酯之外，在C端的芳基酯可以扩展至其他芳香族或杂芳族系统，其中杂芳族系统中的杂原子是选自N、O和S的至少一种原子。例如，水杨醛的苯环也可以由选自吡啶、嘧啶、哒嗪、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑和噻唑的六元或五元(杂)芳环替换。当这些芳基酯被用在C端时，偶联产物在连接位具有相应的缩醛基团。
本发明提供了一种将第一寡肽末端与第二寡肽末端或者将同一寡肽的两端连接的适当方法，用于合成在连接位具有天然肽键的寡肽产物或环肽。第一寡肽包含C端水杨醛酯。第二寡肽包含N端丝氨酸或苏氨酸。将第一和第二寡肽在反应溶液中混合，而不使用任何外部催化剂/试剂。在完成反应(在任何测试情况下为2～10小时)之后，除去溶剂，并处理残基以进行最后的转化(少于10分钟)，从而提供天然目标全长多肽。
本发明的另一个方面针对的是一种寡肽中间体，所述寡肽中间体包含具有C端水杨醛酯的第一初始肽片段、具有丝氨酸或苏氨酸的第二初始肽片段，和具有连接C片段和N片段的N，O-亚苄基缩醛单元的加合物。N，O-亚苄基缩醛加合物迅速转化为端对端连接第一和第二初始肽片段的肽键。
此处所述的本发明具有高化学选择性，无需保护用于偶联两个肽片段的任何氨基酸。本发明的另一个特征在于迅速偶联两个肽片段，甚至对于在C端位阻较大的氨基酸，如缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸和苏氨酸而言亦如此，如图3所示。这些β-支化的氨基酸在C端使用时显著地妨碍了偶联过程，因此大部分已知的连接方法在这些氨基酸位点反应需要较长时间(＞48小时)或者限于在C端位阻较小的氨基酸。在本发明的条件下，涉及这些受阻氨基酸的连接仍然有效而迅速，对于非常受阻的氨基酸也可以在小于5小时内获得100％的转化。
本发明的又一个方面针对的是一种使两个肽片段结合从而以无差向异构化的方式在连接位产生天然肽键的方法。在常规肽偶联条件下避免差向异构化是一项很大的挑战。利用由丝氨酸和苏氨酸的1，2-羟基-胺双官能度形成酰胺键的亚胺-捕捉-酰基转移不涉及活化C端末端的羧基，因此使外消旋化的倾向降至最低。
本发明的一个突出方面在于提供一种天然化学连接方法，所述方法使用用户友好的条件，无需任何复杂的化学反应条件和特别化学操作。本发明的方法易于操作，并且反应条件非常适于肽化学。
Tam等公开了一种用于将C端乙醇醛肽与在N端含有半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸残基的另一肽连接以修饰假脯氨酸结构的方法(Liu，C.F.；Tam，J.P.J.Am.Chem.Soc.，1994，116，4149-4153，“Chemical ligation approach to form a peptide-bond betweenunprotected segments-concept and model studies”)。利用该方法，通过连接两个肽片段可制备具有假脯氨酸结构(噻唑烷或噁唑烷)的人造蛋白，以模仿在相应位置的含脯氨酸蛋白结构。然而，Tam法的局限性在于反应速率。该方法的确实现了很强的化学选择性，但是当在N端使用苏氨酸或丝氨酸时连接极其缓慢(对于甘氨酸与丝氨酸之间的模型系统，45小时时的转化率低于84％)。更重要的是，Tam法的局限性在于，由假脯氨酸向天然肽键的转化尚未实现。这样，连接产物含有非天然肽键。因此，Tam法不是天然化学连接，不适合用来合成纯天然肽序列的蛋白或多肽。
本发明的方法促进了蛋白和长肽的化学合成。丝氨酸和苏氨酸在蛋白中丰度共占据12.7％的含量，几乎是半胱氨酸的10倍，因此，基于丝氨酸和苏氨酸的化学选择性连接方法应该在合成肽化学和生物共轭化学中发现更多应用。其可以显著降低中等大小(20～100个氨基酸)的多肽药物的生产成本。许多肽药物含有内部丝氨酸和苏氨酸残基。使用线性SPPS制备小肽片段(＜20个氨基酸)，然后将本发明的基于丝氨酸和苏氨酸的化学连接应用于汇集合成一起，将潜在地促进这些肽药物以较低成本的方式大规模生产。通过在同一初始肽上引入C端芳基醛酯和N端丝氨酸或苏氨酸，本发明的方法也可用于制备环肽。另外，本申请中所开发的方法将使N-连接糖蛋白易于用于化学合成，因为所有N-连接糖蛋白都具有丝氨酸或苏氨酸残基。此外，N端丝氨酸或苏氨酸残基可以通过标准recDNA手段表达为所关注的蛋白。利用此处所述的天然化学连接，其可与含有水杨醛酯的合成小分子或肽反应，以达到标记所关注的蛋白的目的，或产生“杂”蛋白络合物。
附图说明
图1(A)说明的是基于Ser/Thr的天然化学连接的总体原理。
图1(B)是本发明的方法的酰基转移反应步骤的机理的化学式表达。
图2(A)说明的是本发明的方法的化学选择性。
图2(B)是说明图2(A)所示的化学选择性的LCMS谱图。
图3说明的是使用位阻较大的氨基酸的基于丝氨酸/苏氨酸的化学连接的范围。
图4说明的是无差向异构化的连接进程。
图5是丝氨酸连接过程的LCMS图。
图6是苏氨酸连接过程的LCMS图。
图7说明的是在一个烧瓶中的三组分连接，其用于由C至N端组装多个片段。
具体实施方式
本发明提供一种将第一初始肽片段化学连接至第二初始肽片段的方法。该方法使用作为C端配偶体的芳基醛酯(例如水杨醛酯)和作为N端配偶体的丝氨酸或苏氨酸以产生在连接位具有Xaa-Ser/Thr肽连接的较大的肽(Xaa表示任意氨基酸)。
在该方法中，C端肽的芳基醛酯(例如水杨醛酯)在基于丝氨酸和苏氨酸的天然化学连接的开发中至关重要。已有报道可使用C端乙醇醛酯肽与丝氨酸或苏氨酸肽反应，但是反应速率极低(如，对于甘氨酸与丝氨酸之间的模型系统在45小时后转化率低于84％)。然而，在C端的如水杨醛酯等芳基醛酯显著促进了偶联步骤的反应速率，例如对于所有测试的氨基酸在少于5小时内实现了定量转化。更重要的是，偶联后生成的N，O-亚苄基缩醛在温和条件(即，酸性条件)下很容易除去，从而在连接位提供天然肽键，如天然化学连接所实现的那样。芳基醛酯可为O-酯、S-酯或Se-酯。偶联步骤和除去步骤的反应性可以通过在水杨醛酯的苯环上引入如卤素、烷基、烷氧基、酰胺、叠氮基和硝基等取代基而进一步调节。硝基的引入使得能够在紫外光下除去N，O-亚苄基缩醛基团。C端水杨醛酯的苯环也可以被其他(杂)芳族系统替代，其中杂芳族系统中的杂原子是选自N、O和S中的至少一种原子，所述杂芳族系统如为吡啶、嘧啶、哒嗪、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑和噻唑等。
在该方法中，N端肽具有丝氨酸或苏氨酸残基。它们可以以盐的形式使用。丝氨酸和苏氨酸在蛋白中的丰度一共占据12.7％，因此很容易在所关注的合成目标蛋白或肽中发现它们。
本发明的方法实际上具有两步。第一步涉及将具有丝氨酸和苏氨酸的N端肽和具有水杨醛酯的C端肽在反应溶剂中混合。吡啶和乙酸(1∶1，摩尔/摩尔)的混合物会提供最高收率。此处，N端丝氨酸或苏氨酸的氨基与水杨醛酯的醛基可逆地反应从而形成亚胺，之后发生来自N端丝氨酸或苏氨酸的α-羟基的环化。接下来，1，5 O→N酰基转移提供了稳定的N，O-亚苄基缩醛中间体(当在C端使用其他类型的芳基酯时，生成相应的缩醛中间体)。第二步涉及使用酸条件除去N，O-亚苄基缩醛基以形成天然肽键。此处，在通过冻干除去溶剂(吡啶/乙酸)之后，使用TFA/H2O/iPr3SiH溶液混合物处理未经纯化的N，O-亚苄基缩醛中间体，以在少于5分钟内提供天然肽键。该酸性条件常用在肽化学中。将如硝基等光反应性基团引至水杨醛酯的苯环上可以潜在地实现在紫外光下N，O-亚苄基缩醛的除去。
该方法具有高度化学选择性。连接反应在任何未受保护的氨基酸和如苯硫酚酯等其他反应性酰基供体的存在下进行。该方法具有两步(图1)。第一步涉及N端丝氨酸或苏氨酸的氨基与C端水杨醛酯的醛基反应。如赖氨酸等其他亲核试剂也可以与醛基反应，但是该反应是可逆的并无法提供稳定产物。该方法的偶联步骤是经济的，并且易于操作，而不使用任何外部试剂，并且在短时间内导致完全转化。第二步的特征在于反应迅速、操作简单并使用用户友好的条件。这两种反应条件都在肽化学中常用，因此与多肽和糖肽的大多数官能度是非常相容的。
本发明的方法的特征在于，尽管是需要两步反应序列，两个肽片段的偶联仍迅速并且有效，甚至对于在C端非常受阻的氨基酸，如缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸和苏氨酸而言亦如此，如图3所示。这些β-支化的氨基酸在C端使用时可显著地妨碍其他已知连接条件下的偶联过程(例如，基于半胱氨酸的NCL需要48小时)，而在本发明的条件下，涉及这些受阻氨基酸的连接可以在少于5小时内完成。
本发明的方法的另一特征在于基于Ser/Thr的天然化学连接与基于Cys的天然化学连接之间的正交性。用于基于半胱氨酸的天然化学连接法(Cys-NCL)的硫酯在本发明的条件下是稳定的。因此，可以将Ser/Thr-NCL与Cys-NCL一起使用，以由N至C端的方向实现一罐三片段连接。
实施例1
作为模型研究，通过在标准酯形成条件下使用二环己基碳二亚胺将FmocAla-OH与水杨醛偶联来制备在C端具有水杨醛酯的FmocAla。用于Ser/Thr NCL的典型程序如下：将FmocAla-水杨醛酯(3.8mg，9.15μmol)和丝氨酸苄基酯(2.5mg，10.8μmol)以0.05M的浓度在溶液(183μl，吡啶/乙酸，1∶1，摩尔/1摩尔)中混合。将该反应混合物在室温搅拌并通过LCMS监控。30分钟后，观察到转化率为80％的单一新产物，其对应于N，O-亚苄基缩醛加合物。反应在2小时内完成，提供了中间具有N，O-亚苄基缩醛的偶联产物。N，O-亚苄基缩醛加合物可以被分离。N，O-亚苄基加合物的NMR谱显示为两种化合物，其来自新生成的手性中心。(Fmoc＝芴基甲氧基羰基，LCMS＝液相色谱-质谱，NMR＝核磁共振)
在另一条路径上，使来自以上偶联的粗反应产物在通过冻干除去溶剂(吡啶/乙酸)之后直接进行下一步。在酸性条件(TFA/H2O/Pr3SiH，94/5/1，体积/体积/体积，1.0ml)下的处理于4分钟内以定量转化的方式平稳地将N，O-亚苄基缩醛加合物转化为“天然”Ala-Ser二肽。通过HPLC(C18，50-90％，MeCN(具有0.04％TFA)/H2O(具有0.05％TFA)，30分钟，流速为16ml/分钟)纯化获得Fmoc-Ala-Ser-OBn二肽(4.2mg，95％)。该酸性条件在糖肽/糖蛋白合成中常用。两步都迅速且干净地进行，未检测到任何明显的副产物或水解产物。(TFA＝三氟乙酸)
实施例2
本方法的显著特征在于其化学选择性。为证明化学选择性，利用与上述相同的条件，将Ala-水杨醛酯与丝氨酸衍生物和未受保护的β-丙氨酸同时反应。此外，将Ala-水杨醛酯与丝氨酸衍生物和Ala-苯硫酚酯同时反应。反应通过LCMS监控并且反应产物通过ESI(电喷雾质谱)确定。在这两种情况中，都观察到了作为N，O-亚苄基加合物的预期的单一产物(图2)。苯硫醇酯是具有高反应性的酰基的供体。据报道其可直接与胺缩合从而提供酰胺键，并且苯硫醇酯易于水解。在本发明的条件下，苯硫醇酯在反应时间内是稳定的，并且不直接酰化氨基。这些结果也证明了亲核的胺不妨碍连接过程。
实施例3
β-支化氨基酸，如缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸和异亮氨酸等，在化学连接中用在C端时被认作是很难处理的位点。本发明的基于丝氨酸的连接的范围用偶联有丝氨酸苄基酯衍生物的Fmoc-Val-水杨醛酯、Fmoc-Pro-水杨醛酯、Fmoc-Ile-水杨醛酯、Fmoc-Val-Thr-水杨醛酯进行研究。所有连接反应都以0.05M的浓度进行，如实施例1中所述。反应在室温搅拌并通过LCMS监控。所有连接都迅速、有效地进行，结果对于缬氨酸、脯氨酸和苏氨酸，在少于5小时内实现了完全的定量转化。例外的是，异亮氨酸与丝氨酸之间的连接非常缓慢(图5)。在除去上述反应中的溶剂后，接下来使残余物经受TFA/H2O/iPr3SiH条件处理。在5分钟内，获得天然肽形式的连接产物(即，Val-Ser、Pro-Ser和Val-Thr-Ser)(＞95％)。
实施例4
使用与H-Thr-Phe-OEt二肽偶联的Fmoc-Val-水杨醛酯、Fmoc-Pro-水杨醛酯、Fmoc-Ile-水杨醛酯、Fmoc-Val-Thr-水杨醛酯在基于苏氨酸的化学连接中测试所有β-支化氨基酸(缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸和异亮氨酸)。所有连接反应都通过两步顺序迅速、有效地进行，从而以高收率(＞92％)提供了天然肽形式的三肽或四肽(图6)。
实施例5
利用二肽Fmoc-Val-Thr-水杨醛酯和H-Ser-OBn之间偶联生成三肽Fmoc-Val-Thr-Ser-OBn来研究外消旋化问题。利用常规肽偶联程序单独制备标准差向异构体Fmoc-Val-Thr(D)-Ser-OBn作为参比化合物。如图4所示，将获自粗两步连接反应混合物的产物(即，Fmoc-Val-Thr-Ser-OBn)与Fmoc-Val-Thr(D)-Ser-OBn比较。如LCMS(图4)所示，粗偶联反应不含可检测到的Fmoc-Val-Thr(D)-Ser-OBn的形成。因此，基于丝氨酸的化学连接不导致在连接位的差向异构化。
实施例6
该化学连接的能力还通过在单烧瓶同时进行Ser-NCL和Cys-NCL的有次序的反应来证实。该方案涉及利用含水杨醛酯的未受保护的肽、具有在N端的丝氨酸和在C端的苯硫酚酯的未受保护的肽，和具有N端半胱氨酸的未受保护的肽。
如下制备具有C端水杨醛酯的模型未受保护的肽：使用
Figure BDA0000133307810000091
TGT树脂和标准Fmoc氨基酸，利用自动固相肽合成器制备Fmoc-Arg(Phf)-Ala-Ser(t-Bu)-Ile-Thr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Ala-Asp(t-Bu)-Gly-OH。在完成该合成后，使用TFE/CH2Cl2/AcOH(1/8/1，体积/体积/体积)的混合物处理该树脂，以获得侧链保护的肽的粗品。将该肽粗品(12mg，7.5μmol)和水杨醛(3.9μl，37μmol)和DCC(3.1mg，15μmol)在无水氯仿(1.0ml)中混合。在室温搅拌该反应混合物2小时，并通过空气气流吹除溶剂。然后使用去保护混合物(TFA/H2O/PhOH，3.3ml/136μl/160mg)处理残余物。在室温搅拌2小时后，通过空气气流吹除溶剂，然后通过乙醚沉淀出肽，之后通过HPLC纯化获得产物Fmoc-Arg-Ala-Ser-Ile-Thr-Thr-Ala-Asp-Gly-O-水杨醛酯(5.0mg，54％)。
如下制备具有在N端的丝氨酸和在C端的苯硫酚酯的模型未受保护的肽：利用TGT树脂和标准Fmoc氨基酸，使用自动固相肽合成器制备Boc-Ser-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-His(Trt)-Phe-Gly-COOH。在完成该合成后，使用TFE/CH2Cl2/AcOH(1/8/1，体积/体积/体积)的混合物处理该树脂，以获得侧链保护的肽的粗品。将肽的粗品(23mg，12μmol)、丙氨酸苯硫酚酯(3.9mg，18μmol)、EDC(3.4μl，19μmol)和HOOBt(1.0mg，6.1μmol)在无水TFE/氯仿(0.3ml/0.6ml)中混合。在室温搅拌该反应混合物2小时，并通过空气气流吹除溶剂。然后使用去保护混合物(TFA/H2O/PhOH/iPr3SiH，3.3ml/136μl/160mg/60μl)处理残余物。在室温搅拌2小时后，通过空气气流吹除溶剂，然后通过乙醚沉淀出肽，之后通过HPLC纯化获得产物H-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-SPh(7.0mg，53％)。
如下制备具有N端半胱氨酸的模型未受保护的肽：利用
Figure BDA0000133307810000093
TGT树脂和标准Fmoc氨基酸，使用自动固相肽合成器制备Boc-Cys(S-t-Bu)-His(Trt)-Cys(Acm)-Ser(t-Bu)-Thr-(t-Bu)-Cys(Acm)-Tyr(t-Bu)-Tyr(t-Bu)-His(Trt)-Lys(Boc)-Ser-OH。完成合成后，使用TFA/H2O(3.3ml/136μl)的混合物处理该树脂。然后通过空气气流吹除溶剂，并通过乙醚沉淀出肽，之后通过HPLC纯化以70％的收率获得产物H-Cys(S-t-Bu)-His-Cys(Acm)-Ser-Thr-Cys(Acm)-Tyr-Tyr-His-Lys-Ser-OH。
为实现单罐三片段连接，首先将Fmoc-Arg-Ala-Ser-Ile-Thr-Thr-Ala-Asp-Gly-O-水杨醛酯(0.6mg，0.50μmol)和H-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-SPh(0.5mg，0.45μmol)在吡啶/乙酸(50μl，1∶1，摩尔/摩尔)中混合。反应在室温搅拌4小时。然后通过冻干除去溶剂。接下来，在室温使用(TFA/H2O/Pr3SiH，94/5/1，体积/体积/体积，0.5ml)处理残余物4分钟。在通过冻干除去溶剂后，将H-Cys(S-t-Bu)-His-Cys(Acm)-Ser-Thr-Cys(Acm)-Tyr-Tyr-His-Lys-Ser-OH(1.1mg，0.70μmol)添加至容纳有来自以上Ser-NCL反应的粗产物的同一烧瓶中，然后添加Cys-NCL缓冲剂(pH＝7.02，50μl)。将反应混合物在室温搅拌2小时。通过HPLC(C4，20-30％，MeCN(具有0.04％TFA)/H2O(具有0.05％TFA)，30分钟，流速为16ml/分钟)纯化粗反应混合物，以获得三片段偶联产物Fmoc-Arg-Ala-Ser-Ile-Thr-Thr-Ala-Asp-Gly-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-Cys-His-Cys(Acm)-Ser-Thr-Cys(Acm)-Tyr-Tyr-His-Lys-Ser-OH(1.0mg，60％)(图7)。
未受保护的赖氨酸、羧酸、精氨酸、组氨酸与芳基苯硫酚酯在Ser-NCL条件下的相容性为该连接方案增加了很高的价值。Ser/Thr-NCL与Cys-NCL之间的正交性提供了一种指向由N至C端的多片段连接的新合成策略。
实施例7
本连接的方法也可以用于制备环肽。以与上述相似的方式由Boc-Ser-Ala-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-His(Trt)-Phe-Gly-COOH和丙氨酸水杨醛酯制备模型肽H-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-O-水杨醛酯。将H-Ser-Ala-Gln-Lys-Arg-His-Phe-Gly-Ala-O-水杨醛酯(0.5mg，0.45μmol)溶解在吡啶/乙酸(5.0ml，1∶1，摩尔/摩尔)中。将反应在室温搅拌10小时。然后通过冻干除去溶剂。接下来，在室温使用(TFA/H2O/Pr3SiH，94/5/1，体积/体积/体积，0.5ml，4分钟)处理残余物4分钟。然后通过HPLC纯化粗反应混合物，以获得环化的肽(0.3mg，67％)。
实施例8
评价在C端的芳基酯的其他形式。在标准酯形成条件下使用二环己基碳二亚胺将Fmoc-Ala-OH与4-羟基吡啶-3-甲醛、2-羟基-3-苯并呋喃甲醛、2-甲酰-3-羟基噻吩或3-羟基-1H-吲哚-2-甲醛反应，以获得相应的芳基酯。在与实施例1所述的相同条件下，这些Fmoc-Ala-芳基酯与丝氨酸苄基酯和苏氨酸甲基酯反应，以较高产率(75％～90％)获得相应的在连接位具有缩醛基团的偶联产物。
实施例9
除了在C端使用水杨醛酯外，还在丝氨酸/苏氨酸天然化学连接的条件下研究了Fmoc-Ala-水杨醛硫酯和Fmoc-Ala-水杨醛硒酯。它们与丝氨酸苄基酯反应，分别以50％和60％的收率获得相应的偶联N，S-亚苄基缩醛产物(50％)和N，Se-亚苄基缩醛产物。

Claims (20)

1.一种连接C端芳基醛酯和N端丝氨酸或苏氨酸以产生天然肽键的方法，所述C端芳基醛酯和N端丝氨酸或苏氨酸在同一初始肽上或者分别在不同的初始肽上，所述方法包括：
a)使初始肽反应以形成在连接位具有缩醛基团的缩醛中间体；
b)将所述缩醛中间体转化为具有所述天然肽键的所需肽或蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述初始肽是未受保护的初始肽。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元芳香环。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元杂芳环，所述杂芳环中的杂原子为选自N、O和S的至少一种原子。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯是不具有取代基或具有至少一个取代基的水杨醛酯，所述缩醛基团是亚苄基缩醛基团。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述缩醛中间体是可分离的并且是稳定的。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述芳基醛酯是O-酯、S-酯或Se-酯。
8.一种缩醛中间体，所述缩醛中间体通过利用第一初始肽的C端芳基醛酯与第二初始肽的N端丝氨酸或苏氨酸的反应形成缩醛基团而获得，所述第一初始肽和所述第二初始肽为同一初始肽或不同初始肽。
9.如权利要求8所述的缩醛中间体，其中所述初始肽是未受保护的初始肽。
10.如权利要求8所述的缩醛中间体，其中所述芳基醛酯具有六元或五元芳香环。
11.如权利要求8所述的缩醛中间体，其中所述芳基醛酯具有六元或五元杂芳环，所述杂芳环中的杂原子为选自N、O和S的至少一种原子。
12.如权利要求8所述的缩醛中间体，其中所述芳基醛酯是不具有取代基或具有至少一个取代基的水杨醛酯，所述缩醛基团是亚苄基缩醛基团。
13.如权利要求8所述的缩醛中间体，其中所述缩醛中间体是可分离的并且是稳定的。
14.如权利要求8所述的缩醛中间体，其中所述芳基醛酯是O-酯、S-酯或Se-酯。
15.一种用于多片段肽连接的方法，其中第一初始肽、第二初始肽和第三初始肽在同一罐中依次反应以产生三片段偶联肽，所述第一初始肽具有C端芳基醛酯，所述第二初始肽具有N端丝氨酸或苏氨酸和C端硫酯，所述第三初始肽具有N端半胱氨酸。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元芳香环。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述芳基醛酯具有六元或五元杂芳环，所述杂芳环中的杂原子为选自N、O和S的至少一种原子。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述芳基醛酯是不具有取代基或具有至少一个取代基的水杨醛酯。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述方法不具有中间纯化步骤。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述方法生成Xaa-Ser/Thr和Xaa-Cys形式的两种内酰胺键，Xaa是任意氨基酸。
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