CN102459632A

CN102459632A - 复杂核酸的扩增

Info

Publication number: CN102459632A
Application number: CN2010800251565A
Authority: CN
Inventors: C·科菲哈格; E·菲希
Original assignee: Qiagen GmbH
Current assignee: Qiagen GmbH
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2010-06-03
Publication date: 2012-05-16
Anticipated expiration: 2030-06-03
Also published as: WO2010139767A1; US9777316B2; EP2438192B1; JP5822824B2; EP2438192A1; JP2012528583A; US20120129182A1; CN102459632B

Abstract

描述了一种对待分析的复杂模板核酸进行定量和定性分析的方法。所述方法包括通过等温链置换反应使对照核酸与复杂模板核酸共同扩增。本发明的方法还包括测定扩增的对照核酸的量，作为测定所用复杂模板核酸的数量和/或质量的量度。本发明还涉及一种用于进行本发明方法的试剂盒。此外，还描述了本发明的方法或本发明的试剂盒在标准化全基因组、全转录物组和全亚硫酸氢盐组分析中的用途。

Description

复杂核酸的扩增

技术领域

本发明涉及生物学和化学领域，特别涉及分子生物学领域。本发明具体涉及复杂核酸如全基因组、转录物组和亚硫酸氢盐组(bisulfitome)的扩增。

发明背景

复杂模板核酸的扩增在许多分子生物学应用中起着重要的作用。因此对于一些应用而言，需要分别扩增全基因组(全基因组扩增，WGA)、全转录物组(全转录物组扩增，WTA)或全亚硫酸氢盐组(全亚硫酸氢盐组扩增，WBA)。

各种参数对于此类复杂核酸的成功扩增必不可少：

合适的反应条件为必然要求。这包括例如具有适合pH值和适合单价盐和二价盐组成的合适缓冲液。然而，其还包括至少一种合适的聚合酶，并且合适的扩增反应温度是成功扩增的必要因素。

决定性参数为所使用的复杂模板核酸的量。如果复杂模板核酸的量过小，则其将无法满足全基因组的要求。例如，6pg人基因组DNA的量大约相当于单倍体人类基因组。如果用于一个WGA反应的量小于6pg，则在WGA中不能对人类基因组进行完全扩增，因为其不能代表所有的片段。同时，小于100pg的量也可能过小，因为在此量下来自随机效应的特定片段不足或过多。

复杂模板核酸扩增的第三个决定性参数分别为样品或其中包含的复杂模板核酸的质量。术语“质量”可包括不同的方面：

含有复杂模板核酸待扩增样品可具有抑制因子，所述抑制因子以竞争或变构方式抑制所用聚合酶或可破坏聚合酶的活性构象。在下文中，这类物质将被称为反式抑制因子。此类反式抑制因子包括例如重金属离子(例如Ni离子、Fe离子、Mn离子、Zn离子等)、带负电的聚合物(例如肝素、硫酸葡聚糖等)或常常用于核酸制备的蛋白变性物质(例如SDS、酚等)。

然而，样品还可包含与核酸结合从而(例如)通过防止核酸变性或通过防止核酸被聚合酶识别来抑制扩增的物质。在下文中，这类物质将被称为顺式抑制因子。此类顺式抑制因子可为蛋白质(例如组蛋白等)、带正电的物质(例如带正电的聚合物、带正电的氨基酸等)。

核酸可表现出各种缺陷，使得在缺陷位点不再可能通过聚合酶进行延伸反应。这些缺陷位点可为例如单链或双链切口或脱碱基位点存在修饰碱基的位点(例如在DNA中修饰成氧鸟嘌呤或尿嘧啶)。

目前，在复杂模板核酸的扩增反应开始时，仅可在不足的程度上检测这些定量和定性特性。其中存在的待扩增复杂核酸的质量和数量通常并不明确。因此，在存在少量复杂模板核酸的情况下，不能通过OD260测量来进行浓度测量。如果DNA的量足以进行凝胶电泳，则仅可通过凝胶电泳测定DNA损伤。目前尚不能测定其它损伤，诸如脱碱基DNA片段。

例如经由定量PCR对复杂模板核酸的这些定性参数的控制不能令人满意，因为如果模板核酸的平均尺寸＞1kb，则定量PCR仅对部分降解DNA的尺寸差异的检测效果较差。然而，此类尺寸差异对于复杂核酸的扩增而言至关重要。

发明内容

因此，本发明涉及一种对样品中的一种或多种待扩增的复杂模板核酸进行定量和定性分析的方法，其包括以下步骤：

提供反应混合物，其包含

-待扩增的复杂模板核酸；

-指定量的至少一种对照核酸，其中所述对照核酸与模板核酸具有小于50％的序列相同性，并且其中所述对照核酸具有至少一种已知的序列片段；

-用于模板核酸扩增的引物；

-用于对照核酸扩增的引物；

-适于核酸扩增的酶和试剂；

对模板核酸和对照核酸进行共同扩增，其中所述共同扩增等温进行，其中所述共同扩增包括链置换反应，并且其中模板和对照核酸基本上在所述扩增中完全扩增；

完成所述共同扩增后，对扩增的对照核酸进行定量。

因此，在本发明中，将一种或多种外源对照核酸添加到反应混合物中以扩增一种或多种复杂模板核酸。添加适于复杂模板核酸和/或对照核酸扩增的引物和试剂以及酶之后，进行复杂模板和对照核酸的共同扩增。因此，对照核酸与复杂模板核酸平行扩增。对照核酸的扩增程度取决于复杂模板核酸的存在、数量和质量。由于对照核酸和模板核酸竞争扩增反应源(如引物、dNTP、聚合酶)，因此对照为竞争性对照。完成共同扩增后，对扩增的对照核酸进行定量。以此方式测定的数量使得可分别对复杂模板核酸的起始量或质量得出结论。扩增后少量的对照核酸与足够数量和质量的所用复杂模板核酸相关。因此，由较大量的扩增对照核酸可推断所用复杂核酸的数量或质量不足。

此外，对扩增的核酸混合物中对照核酸的相对数量的测定可推断出关于pH值、缓冲液、盐浓度或聚合酶活性的反应条件。

在一个实施方案中，在完成共同扩增后，除了测定扩增的对照核酸的量之外还测定扩增的核酸的总量。如果以此方式测定的扩增的对照核酸的相对数量较高，则根据本发明，这与用于扩增的合适反应条件相关。如果扩增的核酸的总量较低并且扩增的对照核酸数量也较低，则这是扩增反应条件不适合的指示。

本发明的方法还可用于测试反应条件和/或聚合酶活性。在除了对照核酸之外不使用模板核酸的情况下尤其如此。

根据本发明使用的对照核酸具有与至少一种序列特异性探针和/或一种或多种引物杂交的指定序列的至少一个片段。根据本发明，在整个对照核酸的长度上，对照核酸与复杂模板核酸具有小于50％，优选地小于65％，特别优选地小于80％的序列相同性。根据本发明，采用Karlin和Altschul数学算法来测定两个序列之间的相同性(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877。

此外，在本发明的上下文中，线性对照核酸具有至少800个核苷酸，优选地大于1,000且小于80,000个核苷酸，特别优选地大于5,000且小于50,000个核苷酸的长度。对照核酸可为天然来源，即分离自诸如噬菌体、病毒、细菌或真核生物的生物体。然而，根据本发明，其还可具有并非天然存在的序列。对于本领域的技术人员而言明显的是，天然存在的序列和非天然存在的序列的组合也可用作对照核酸。对照核酸可由DNA或RNA组成，并且可为单链以及双链核酸。

在本发明的一个优选实施方案中，将λ-噬菌体基因组用作对照核酸。特别优选的是使用一个或多个λ-噬菌体基因组的片段。片段可例如通过使用核酸酶由核酸的消化来产生。本领域的技术人员知道此类核酸酶还可为序列特异性限制性核酸内切酶。

在本发明的另一个优选实施方案中，对照核酸以环状形式存在。本领域的技术人员知道此类环状对照核酸可具有不同的来源。因此，环状核酸可来源于病毒、噬菌体、微生物(单细胞生物)以及多细胞生物。本发明的环状对照核酸可包含小于800个核苷酸。然而，在本发明的一个优选实施方案中，环状对照核酸包含大于50个核苷酸，特别优选地大于100个核苷酸。

根据本发明，待分析的复杂模板核酸包含大于10,000个核苷酸，优选地介于100,000和1,000,000个之间的核苷酸，特别优选地大于1,000,000个核苷酸。

复杂模板核酸优选地为DNA或RNA。例如，其可为选自下组的核酸：cDNA(互补DNA)、LNA(锁核酸)、mRNA(信使RNA)、mtRNA(线粒体RNA)、rRNA(核糖体RNA)、tRNA(转运RNA)、nRNA(核RNA)、dsRNA(双链RNA)、核酶、核糖开关(riboswitch)、病毒RNA、dsDNA(双链DNA)、ssDNA(单链DNA)、质粒DNA、粘粒DNA、染色体DNA、病毒DNA、mtDNA(线粒体DNA)、nDNA(核DNA)。此外，复杂模板核酸还可分别为一种或多种生物体的一组核酸的整体，优选全部mRNA或cDNA(转录物组)，和/或全部DNA(基因组)。本领域的技术人员知道全部的RNA可代表生物体的基因组，这尤其适用于RNA病毒。复杂模板核酸可由一个或多个染色体组成。复杂模板核酸可以片段化或非片段化形式存在。其还可在进行扩增之前通过酶促法、物理或化学方法片段化。本发明的亚硫酸氢盐组为复杂DNA，其中非甲基化的胞嘧啶碱基由于用亚硫酸氢盐处理而转化成尿嘧啶。

在本发明的一个优选实施方案中，待分析的复杂模板核酸为WGA和/或WTA和/或WBA中的模板核酸。

待分析的复杂模板核酸可具有不同的来源。例如，其可能从选自下组的一种或多种生物体中分离得到：病毒、噬菌体、细菌、真核生物、植物、真菌和动物。此外，待分析的复杂模板核酸可为样品的一部分。此类样品也可具有不同的来源。因此，本发明的方法还涉及对环境样品中的复杂模板核酸进行分析。

本发明的方法可能还需要在扩增之前裂解含有复杂模板核酸的生物体。在本发明的上下文中，术语“裂解”是指导致来自样品物质的核酸和/或蛋白质释放到环境中的过程。样品物质的结构可能在此过程中受到破坏，例如样品物质的包层可能溶解。在本发明的上下文中，术语“裂解”还指这样的事实，即复杂模板核酸可经由小开口(例如样品物质的包层/包被中的孔等)从样品物质排出而不破坏样品物质的结构。例如，可使用裂解试剂形成孔。在本发明的上下文中，术语“裂解”还指这样的事实，即可使用添加剂洗去看上去其结构已受到破坏或具有小开口的样品物质中的核酸和/或蛋白质。裂解形成裂解物。裂解物可含有来自不同生物体或来自单个生物体的样品物质。

在本发明的上下文中，应将扩增理解为一种或多种核酸以因数2倍增。为此，核酸可以线性或指数方式倍增。通过指数式扩增方法，核酸倍增至高于以因数2倍增的程度。还可使用其它酶促法，这些方法可选自下组：“滚环扩增(rolling circle amplification)”(如Liu等，“Rolling circle DNAsynthesis：Small circular oligonucleotides as efficient templates for DNApolymerases”(滚环DNA合成：小环状寡核苷酸作为DNA聚合酶的有效模板)，J.Am.Chem.Soc.118：1587-1594(1996)中所述)、“等温扩增(isothermalamplification)”(如Walker等，“Strand displacement amplification-anisothermal，in vitro DNA amplification technique”(链置换扩增-一种等温体外DNA扩增技术)，Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992)中所述)、“连接酶链反应(ligase chain reaction)”(如Landegren等，“A Ligase-Mediated GeneDetection Technique”(连接酶介导的基因检测技术)Science 241：1077-1080，1988或Wiedmann等，“Ligase Chain Reaction(LCR)-Overview andApplications”(连接酶链反应(LCR)-概述和应用)，PCR Methods andApplications(PCR方法和应用)(纽约冷泉港实验室的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor Laboratory，NY.)，(1994)S.S51-S64)中所述)。

根据本发明，所述扩增可与不同的方法和反应联合进行。本领域的技术人员熟悉相关核酸修饰方法，例如逆转录、连接反应、核酸填补反应、末端非模板依赖性添加、用限制性核酸内切酶消化和/或用所谓的切口酶处理。此外，还可使用解旋酶和/或单链结合蛋白(例如SSB、T4gp32、recA等)。

线性扩增可例如在引物存在的情况下通过“滚环扩增”(RCA)实现，所述引物可在靶环上仅与一个特异性序列杂交。指数式扩增可例如通过引物经由RCA实现，其中所述引物与靶环上的至少两个结合位点杂交或与靶环上的至少一个结合位点杂交且与互补链上的至少一个结合位点杂交。适于本发明的其它线性和指数式扩增方法(如MDA或PCR)为本领域的技术人员所知。

本发明的上下文中所用的扩增反应优选地为等温链置换反应(如Walker等，“Strand displacement amplification-an isothermal，in vitro DNAamplification technique”(链置换扩增-一种等温体外DNA扩增技术)，Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992)中所述)，以对复杂模板核酸和对照核酸进行共同扩增。文中的链置换反应是指其中使用具有链置换活性的聚合酶或其中使用允许链置换的反应条件的任何反应。这些反应包括例如链置换扩增(SDA)以及多重置换扩增(MDA)或滚环扩增(RCA)以及此反应的所有亚类，例如使用巢式引物的限制辅助的RCA(RCA-RCA)或MDA、线性和指数式链置换反应或解旋酶依赖性扩增(EP20050112639；EP20050074804；EP 20050069939；EP20050069938；Wang G.等，(2004)，DNAamplification method tolerant to sample degradation(能耐受样品降解的DNA扩增方法)，Genome Res.Nov；14(11)：2357-2366；Mila M.A.等，(1998)，Use ofthe restriction enzyme AvaI and exo-Bst polymerase in strand displacementamplification(使用限制性酶AvaI和exo-Bst聚合酶进行链置换扩增)；Biotechniques Mar；24(3)：392-396；Nagamine K.等(2001)，Loop-mediatedisothermal amplification reaction using a nondenatured template(使用不变性模板进行环介导的等温扩增反应).Clin.Chem.47(9)：1742-1743；Notomi等，(2000)，Loop-mediated isothermal amplification of DNA(环介导的DNA等温扩增)，Nucleic Acids Res.28(12)：E63；Lage J.M.等，(2003)，Wholegenome analysis of genetic alterations in small DNA samples usinghyperbranched strand displacement amplification and array-CGH(利用过度分支的链置换扩增和阵列-CGH在小DNA样品中进行遗传改变的全基因组分析)，Genome Res.13(2)：294-307；和Vincent M.Xu Y.，Kong H.(2004)，Helicase-dependent isothermal DNA amplification(解旋酶依赖性等温DNA扩增)，EMBO Rep.5(8)：795-800)。

应将本发明的等温反应理解为仅在一种温度下进行的反应。如果反应温度在反应开始之前改变(例如在冰上)或在反应结束后改变(例如以使反应组分或酶失活)，则只要反应本质上是在恒温下进行的，就仍然称反应是等温的。如果温度变化不超过+/-10℃，则应将温度视为恒定。

根据本发明，聚合酶的链置换活性是指所用的酶能够将核酸的双链裂解成两条单链。在大多数情况下，RNA聚合酶具有链置换活性。一个已知的实例为T7RNA聚合酶。其它实例对于本领域的技术人员而言是已知的。可在例如RCA中使用的具有链置换活性的DNA聚合酶为例如来自病毒、原核生物、真核生物或古细菌的复制酶、Phi29样DNA聚合酶、来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的名称为Bst exo-的DNA聚合酶克列诺(exo-)的全酶或某部分。“exo-”是指相关酶不具有5’-3’核酸外切酶活性。已知的Phi29样DNA聚合酶的代表为来自噬菌体Phi29的DNA聚合酶。其它Phi29样DNA聚合酶存在于例如噬菌体Cp-1、PRD-1、Phi15、Phi21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、SF5、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722和L17中。具有链置换活性的DNA聚合酶的其它实例对于本领域的技术人员而言是已知的。或者，如果除了相关DNA聚合酶之外，使用使DNA双链裂解或使DNA单链稳定的催化剂如蛋白质或核酶，则还应将具有链置换活性的DNA聚合酶理解为包括不具有链置换活性的DNA聚合酶。这些蛋白质包括例如被包含作为较大酶复合体(如复制酶)的一部分的解旋酶、SSB蛋白和重组蛋白。在这种情况下，除了聚合酶之外的另外的组分导致形成具有链置换活性的聚合酶。具有链置换活性的聚合酶可以为热不稳定的或热稳定的。

在一个优选实施方案中，用于共同扩增的具有链置换活性的聚合酶为Ph 29样聚合酶，优选来自选自选自下组的噬菌体的聚合酶：Phi29、Cp-1、PRD-1、Phi15、Phi21、PZE、PZA、Nf、M2Y、B103、SF5、GA-1、Cp-5、Cp-7、PR4、PR5、PR722和L17。特别优选的是使用来自噬菌体Phi29的聚合酶。

对于本领域的技术人员显而易见的是可使用两种或更多种具有链置换活性的聚合酶的组合。此外，一种或多种具有链置换活性的聚合酶可与不具有链置换活性的一种或多种聚合酶组合。

在本发明的一个优选实施方案中，还将用于复杂模板核酸扩增的引物用于对照核酸的扩增。

应将本发明含义范围内的引物理解为用作具有核酸聚合酶活性的酶的起始位点的分子。此引物可为蛋白质、核酸或被本领域的技术人员视作合适的聚合酶起始位点的另外的分子。基于分子内以及分子间相互作用，该分子起到起始位点的作用。核酸引物未必但可以在其整个长度上与模板核酸杂交。

对于对照核酸和复杂模板核酸的共同扩增而言，特别优选地的是使用随机引物，即包含许多具有随机序列的不同引物的引物混合物。

除了随机引物之外，还可将其它引物分别用于模板核酸或对照核酸的扩增。因此，还可将简并引物和/或序列特异性引物用于对照核酸和/或模板核酸的扩增。

用于扩增的引物包含4至25个碱基，优选介于5和15之间的碱基，特别优选6至10个碱基。

在本发明的方法中，针对至少一个已知的序列片段对扩增的对照核酸进行定量。使用与至少一个已知序列片段杂交的序列特异性引物，扩增全部对照核酸或其一部分，以便通过定量(实时)PCR(qRT-PCR)进行定量。

在一个优选实施方案中，将λ-噬菌体DNA或其片段用作对照核酸。在本发明的方法的此实施方案中，优选地使用序列特异性引物、通过qRT-PCR来对对照核酸进行定量。在特别优选的实施方案中，引物分别为SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：2。

定量(实时)PCR期间使用的DNA聚合酶优选地为来自喜热生物的聚合酶或热稳定性聚合酶或选自下组的聚合酶：嗜热栖热菌(Thermusthermophilus(Tth))DNA聚合酶、水生栖热菌(Thermus acquaticus(Taq))DNA聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima(Tma))DNA聚合酶、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis(Tli))DNA聚合酶、强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus(Pfu))DNA聚合酶、焦酚热球菌(Pyrococcus woesei(Pwo))DNA聚合酶、极端嗜热古菌(Pyrococcus kodakaraensis KOD)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis(Tfi))DNA聚合酶、硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus Dpo4)DNA聚合酶、太平洋栖热菌(Thermus pacificus(Tpac))DNA聚合酶、艾格托尼栖热菌(Thermus eggertsonii(Teg))DNA聚合酶、布氏栖热菌(Thermus brockianus(Tbr))和黄栖热菌(Thermus flavus(Tfl))DNA聚合酶。

就RNA如mRNA而言，RNA必须逆转录成DNA。这通过使用具有逆转录酶活性的酶来实现。此类酶可为例如来自病毒、细菌、古细菌和真核生物，特别是来自耐热性生物的逆转录酶。这些酶还包括例如来自内含子、反转录转座子或反转录病毒的酶。本发明的具有逆转录酶活性的酶为这样的酶，其在合适的缓冲条件下能够以互补的方式将脱氧核糖核苷酸结合到核糖核酸中与该核糖核酸杂交的脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸的3’末端处。这一方面包括具有此天然功能的酶，而另一方面包括只有通过对其基因序列进行修饰(诱变或适当的缓冲条件)才可获得此功能的酶。

具有逆转录酶活性的酶优选地为选自下组的酶：HIV逆转录酶、M-MLV逆转录酶、EAIV逆转录酶、AMV逆转录酶、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)DNA聚合酶I、M-MLV RNA酶H、SS(Superscript)、SS(Superscript)II、SS(Superscript)III、MS(Monsterscript)(艾比森得公司(Epicentre))、OS(Omniscript)、SES(SensiScript)逆转录酶(恰根公司(Qiagen))、TS(ThermoScript)和TX(Thermo-X)(均得自英杰公司(Invitrogen))。根据本发明，可使用只有在对基因序列进行修饰后才表现出逆转录酶活性的酶。可利用就误差率而言准确性提高的逆转录酶活性。AS(AccuScript)逆转录酶(司查塔基公司(Stratagene))为此类逆转录酶的一个实例。对于本领域的技术人员显而易见的是可使用两种或更多种具有逆转录酶活性的酶的混合物。

本领域的技术人员知道大多数具有逆转录酶活性的酶需要二价离子。因此，在一个优选实施方案中，需要二价离子的酶包括二价离子。优选的是Mg²⁺、Mn²⁺。

酶的优选组合为HIV逆转录酶或M-MLV逆转录酶或EAIV逆转录酶或AMV逆转录酶或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I或M-MLV RNA酶H^-、SS、SSII、SSIII或MS(艾比森得公司)或OS逆转录酶(恰根公司)或SES逆转录酶(恰根公司)、TS、TX(均得自英杰公司)或两种或更多种具有逆转酶活性的酶的混合物和来自大肠杆菌(Escherichia coli)的聚-(A)-聚合酶。此外，HIV逆转录酶或M-MLV逆转录酶或EAIV逆转录酶或AMV逆转录酶或嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)DNA聚合酶I或M-MLV RNA酶H^-、SS、SSII、SSIII或MS(艾比森得公司)或OS逆转录酶(恰根公司)或SES逆转录酶(恰根公司)、TS、TX(均得自英杰公司)或两种或更多种具有逆转酶活性的酶的混合物和来自酵母的聚-(A)-聚合酶。

在qRT-PCR中，可使用荧光标记的引物和/或探针，例如LC(LightCycler)探针(罗氏公司(Roche))、TaqMan探针(罗氏公司)、分子信标、蝎子(Scorpion)引物、日出(Sunrise)引物、LUX引物或放大荧光(amplifluor)引物。探针和/或引物可包含例如共价或非共价结合的荧光染料，如异硫氰酸酯荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)、呫吨、罗丹明、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素(JOE)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-羧基罗丹明-6G(R6G5)、6-羧基罗丹明-6G(RG6)、罗丹明110；香豆素诸如伞形酮、苯甲亚胺类如赫斯特(Hoechst 33258)；菲啶类染料，诸如得克萨斯红(Texas Red)、溴化乙锭；吖啶染料；咔唑染料；吩

嗪染料；紫菜碱染料；聚甲炔染料；花青染料，如Cy3、Cy5、Cy7；SYBR绿；BODIPY染料；喹啉染料和阿莱克萨(alexa)染料。

本领域的技术人员知道可在qRT-PCR中使用双链特异性荧光染料，如溴化乙锭、SYBR绿、皮可绿(PicoGreen)、力波绿(RiboGreen)等，而与引物和探针无关。

本领域的技术人员知道何种条件适于定量PCR或定量逆转录酶PCR。这适用于(例如)引物设计、合适加工温度(逆转录、变性、引物退火、延伸)的选择、PCR循环数、缓冲条件、逆转录酶和定量(实时)PCR的评估。

根据本发明，通过qRT-PCR测定的对照核酸的一种或多种扩增子的低Ct值(阈值循环数)与复杂模板核酸的低质量和/或低数量相关。因此，高Ct值指示高质量和/或数量的复杂模板核酸。

在本发明的一个优选实施方案中，通过ΔCt值确定待扩增的复杂模板核酸的质量和/或数量。根据与复杂模板核酸共同扩增后测定的对照核酸的Ct值与对照反应中对照核酸的Ct值之间的差值计算所述ΔCt值。对照反应的特征在于未添加复杂模板核酸。然而，其它要素以及反应条件保持不变。复杂核酸扩增后对照核酸的扩增子的ΔCt值越高，则用于扩增的复杂核酸的质量越高。

本发明还涉及一种用于进行上述方法的试剂盒，其包含

-用于对照核酸和复杂模板核酸扩增的随机引物或序列特异性引物；

-一种或多种对照核酸，其中所述对照核酸各具有至少一个已知序列片段；

-具有链置换活性的DNA聚合酶。

任选地，本发明的试剂盒可包含其它组分，例如

-缓冲溶液或缓冲液母液；

-dNTP(优选地为dCTP、cATP、dGTP和DTTP的混合物的溶液(例如每种5mM，“dNTP混合物”))；

-热稳定性聚合酶；

-至少一种双链特异性荧光染料；

-任选的缓冲溶液或缓冲液母液；

-用于进行qRT-PCR的酶和试剂和/或

-一个或多个引物对和/或序列特异性探针，其中所述引物和/或所述序列特异性探针能够与对照核酸的已知序列片段杂交且适于对对照核酸进行定量。

本发明的试剂盒还可包含用于进行上述方法的说明书。

除了复杂模板核酸的数量和/或质量之外，对照核酸的扩增子的Ct值水平在确定程度上取决于所用对照核酸的量和扩增的反应条件。为了能够比较未同时进行的WGA、WTA和/或WBA，期望提供标准化条件。然而，这在各个方面中并非总是可行。为了对在不同时间和/或不同地点以不同条件进行的反应进行比较，例如需要反应内标。对于本领域的技术人员而言显而易见的是本发明的方法和/或试剂盒适于在WGA和/或WTA和/或WBA中用作此类标准品。

因此，本发明还涉及上述方法或本发明的试剂盒之一在标准化WGA和/或WTA和/或WBA方面的用途。

根据本发明，特别优选的是使用测定的ΔCt值来标准化WGA和/或WTA和/或WBA。

序列

附图说明

图1：要求保护的方法的示意图。在步骤1中，提供对照核酸(A)、复杂模板核酸(B)和引物。在步骤2中，进行对照核酸和复杂模板核酸的共同扩增。在共同扩增结束后，在步骤3中针对已知序列片段(虚线)测定扩增的对照核酸的量。

图2：全基因组扩增结束后的总DNA产率：对于WGA，使用对照DNA(20pg)和不同量的模板核酸(0-100ng)的混合物。

图3：表示10ng WGA DNA中模板核酸标记物699和1004。在Y轴上，示出来自实时PCR分析的Ct值。Ct值与用于WGA反应的模板核酸的量之间无相关性。

图4：表示10ng WGA DNA中对照核酸标记标准品1。在Y轴上，示出来自实时PCR分析的Ct值。Ct值与用于WGA反应的模板核酸的量之间存在明显的相关性。

图5：表示10ng WGA DNA中模板核酸标记物699和1004。在Y轴上，示出来自实时PCR分析的Ct值。在X轴上，示出通过增加HaeIII与模板核酸的培育期而使模板核酸逐步降解。

图6：表示10ng WGA DNA中对照核酸标记标准品1。在Y轴上，示出来自实时PCR分析的Ct值。在X轴上，示出通过增加HaeIII与模板核酸的培育期而使模板核酸逐步降解。

图7：进行36个WGA反应，反应容器是否含有细胞(即模板核酸)未知。如果反应容器中无模板核酸(使用标记物HexA和HexG的Ct值为约40)，则实时PCR中代表对照核酸的标记标准品1往往较高(＜10的低Ct值)。然而，如果检测到Hex A和Hex G(Ct值为约22至30)，则标记物的Ct值为标准品1＞10。因此，可经由对照核酸和随后的PCR来检测模板核酸的存在。

实施例

实施例1：

在WGA反应中使用对照核酸检测用于WGA的模板核酸的量的方法。

背景：模板核酸和对照核酸的全基因组扩增后WGA DNA中对照核酸可表示模板核酸的初始用量。

将不同量的人基因组DNA(0；1.5；3.125；6.25；12.5；25；50或100ng)用于全基因组扩增(WGA)反应中。根据制造商的说明(恰根公司)用REPLI-g试剂进行WGA反应。将20pg λDNA作为对照核酸加入各WGA反应中，其中与模板核酸相反，对照核酸未变性。在WGA反应后，通过皮可绿试剂(参见REPLI-g手册)(图1)测定总GNA的浓度和产率。

通过定量实时PCR分析对照核酸和模板核酸的表达。为此，将10ng所得到的总DNA用于定量实时PCR(QT(QuantiTect)实时PCR SYBR绿；恰根公司)。就此而言，指定对照核酸的Ct值(阈值循环数)为复杂模板DNA的代表性扩增的量度。Ct值表示PCR循环数，通过该PCR循环数可首次检测基础荧光上方的荧光。标记物的低含量将导致高Ct值，高含量将导致低Ct值。如果使用不同溶液的含量保持相同，则观察不到Ct值的变化。大约40个循环的Ct值表明分析溶液中不存在要分析的标记物。

为了在WGA反应完成后分析复杂模板核酸，在定量实时PCR反应中对所用模板DNA中所含的标记物699和标记物1004进行定量。为了在WGA后分析对照核酸，使用包含于其中的标记标准品1。同样就此而言，每次使用10ng扩增的总DNA。根据制造商的说明，将QT(QuantiTect)实时PCR SYBR绿试剂(恰根公司)用作实时PCR试剂。将SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的寡核苷酸用作标记物699的引物。将SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6的寡核苷酸用作标记物1004的引物。将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的寡核苷酸用作对照核酸的标记标准品1的引物。

结果：对全基因组扩增反应结束后总DNA产率的测量显示根据所用模板核酸的量，扩增的总DNA仅略微降低(1.56ng至100ng；图2)。

为了分析扩增的总DNA中模板核酸标记物699和1004，对于各种WGA溶液，每次在qRT-PCR中使用10ng。分析表明Ct值与WGA中所用复杂模板核酸原料的量之间无相关性。尽管模板核酸的量不同，但在实时PCR分析分析期间，WGA中的Ct值保持相同(图3)。

然而，当在实时PCR使用10ng WGA总DNA来分析对照核酸时，测得Ct值与用于WGA反应的模板核酸初始量之间的强相关性：用于WGA的模板核酸的起始量越小，则表示对照核酸的标记标准品1的Ct值越低(图4)。

实施例2：

使用对照核酸测定用于WGA的复杂模板核酸的质量/完整性的方法。

背景：复杂模板核酸和对照核酸的WGA后总DNA中对照核酸的量可表示初始使用的复杂模板核酸的质量/完整性。

实验：通过限制性核酸内切酶HaeIII的部分消化使基因组DNA损伤。为此，在37℃下，将20μg人基因组DNA在具有1.9U HaeIII的200μl溶液中培育0、5、10、20、40和80分钟。通过HaeIII所得到的DNA的逐步裂解表示复杂模板核酸的不同降解程度，从而表示复杂模板核酸的不同质量/完整性水平。在WGA中，将这样获得的10ng具有不同降解程度的模板核酸与20pg对照DNA混合。根据REPLI-g制造商的说明(恰根公司)，用REPLI-g试剂进行WGA反应，其中与模板核酸相反，对照核酸未变性。在WAG结束后，通过皮可绿试剂(参见REPLI-g手册)测定DNA的浓度和产率。

在qRT PCR中分析对照DNA和复杂模板DNA。为此，将10ng在WGA中形成的总DNA用于实时PCR(QT(QuantiTect)实时PCR SYBR绿试剂，恰根公司)中。为了在WGA结束后分析复杂模板核酸，在qRT PCR中将标记物699和1004用于WGA扩增的DNA。为了在WGA结束后分析对照核酸，使用标记标准品1。同样出于此目的，每次使用10ng扩增的总DNA。将QT实时PCR SYBR绿试剂(恰根公司)用作qRT-PCR试剂。将SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：3的寡核苷酸用作标记物699的引物。将SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的寡核苷酸用作标记物1004的引物。将SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的寡核苷酸用作对照核酸的标记标准品1的引物。

结果：得知随着模板核酸质量的不断劣化，WGA结束后的模板核酸不断变少。还在此实验中观察到：随着模板核酸的降解(片段化)，显示由于HaeIII与模板核酸的培育时间(分钟)增加，Ct值在10ng WGA DNA的实时分析中增加(参见图5)。

关于在WGA结束后的对照核酸，与初始使用的复杂模板核酸的片段化增加存在明显的相关性(参见图5)。对照核酸的增加-通过标记标准品1的Ct值降低表明-与片段化(HaeIII培育期的增加)和模板核酸标记物(699和1004)较少相关(参见图4和6)。

实施例3：

在WGA反应中使用对照核酸检测模板核酸的存在的方法。

背景：复杂模板核酸和对照核酸的WGA完成后总DNA中对照核酸的量可表示初始使用的模板核酸的大致存在情况。

实验：稀释细胞培养物，使得大约仅每两个反应容器含有一个细胞。在每个反应容器中添加20pg对照核酸(λDNA)。在WGA之前，进行细胞裂解。所述裂解根据REPLI-g手册进行。随后，根据REPLI-g手册，用REPLI-g试剂(恰根公司)进行全基因组扩增。在WGA反应后，通过皮可绿试剂(参见REPLI-g手册)测定DNA的浓度和产率。

在qRT PCR中分析对照DNA和复杂模板核酸。为此，将10ng在WGA中形成的总DNA用于qRT-PCR(QT实时PCR SYBR绿试剂，恰根公司)中。为了在WGA后分析复杂模板核酸，在qRT PCR反应中分析WGA扩增的DNA中的两种己糖激酶等位基因HexA和HexG。为了在WGA后分析对照核酸，使用标记标准品1。同样就此而言，每次使用10ng扩增的总DNA。将QT实时PCR SYBR绿试剂(恰根公司)用作qRT PCT试剂。

结果：在任何情况下反应容器中均含有细胞因而含有复杂模板核酸，获得等位基因HexA和HexG的Ct值，其明显小于40。此类存在明显与标记标准品1的＞10的Ct值相关，所述Ct值表示对照核酸的扩增。平均来看，达到13.05(+/-0.95)的值。在不存在细胞(即，无模板核酸)的情况下，标记标准品1的平均Ct值达到7.5(+/-0.95)。因此，＞10的Ct值(标记标准品1)表明模板核酸的存在，而＜10的Ct值表明不存在模板核酸(图7)。

Claims

1.一种对样品中一种或多种待扩增的复杂模板核酸进行定量和定性分析的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供反应混合物，其包含

-所述待扩增的模板核酸；

-指定量的至少一种对照核酸，其中所述对照核酸与所述模板核酸具有小于50％的序列相同性，并且其中所述对照核酸具有至少一个已知的序列片段；

-用于所述模板核酸扩增的引物；

-用于所述对照核酸扩增的引物；

-适于核酸扩增的酶和试剂；

b)对所述模板核酸和所述对照核酸进行共同扩增，其中所述共同扩增等温进行，其中所述共同扩增包括链置换反应，并且其中所述模板和对照核酸通过所述扩增基本上完全扩增；

c)对所述扩增的对照核酸进行定量，其中所述定量在步骤b)的所述共同扩增结束后进行。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，另外在所述共同扩增结束后对核酸总量进行定量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述扩增的对照核酸的数量和总核酸的数量与所述复杂模板核酸的完全扩增相关。

4.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述对照核酸为线性核酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述线性对照核酸包含大于800个核苷酸。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述对照核酸为环状核酸。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述复杂模板核酸包含大于10,000个核苷酸。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述复杂模板核酸选自DNA和RNA。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述复杂模板核酸包含一个或多个基因组和/或一个或多个转录物组和/或一个或多个种亚硫酸氢盐组。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述用于共同扩增的聚合酶具有链置换活性。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述聚合酶为Phi 29样聚合酶。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其特征在于，用于所述复杂模板核酸和所述对照核酸共同扩增的所述引物是相同的。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，将随机引物用于共同扩增。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中针对所述至少一个已知序列片段定量测定扩增的对照核酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，使用所述至少一个已知序列片段、通过至少一种特异性探针和/或通过序列特异性引物扩增的方式对所述扩增的对照核酸进行定量。

16.一种用于进行权利要求1至15中任一项所述方法的试剂盒，其包含：

-随机引物

-具有链置换活性的聚合酶。

17.权利要求1至15中任一项所述的方法或权利要求16所述的试剂盒在标准化全基因组和/或全转录物组和/或全亚硫酸氢盐组扩增中的用途。