CN102438580A

CN102438580A - 钙结合剂诱导毛发生长和/或甲生长

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Publication number: CN102438580A
Application number: CN2010800159060A
Authority: CN
Inventors: D·K·亚伯勒; X·吴; W·史; M·安德森
Original assignee: University of California; C3 Jian Inc
Current assignee: University of California; C3J Therapeutics Inc
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2012-05-02
Anticipated expiration: 2030-02-04
Also published as: CN102438580B; AU2010210600A1; EP2393470A4; CA2751612A1; US20100239503A1; ES2626327T3; CN104922655A; IL214474A0; US20150139907A1; EP2393470A1; WO2010091199A2; WO2010091199A9; US8889156B2; AU2010210600B2; EP2393470B1

Abstract

本发明提供在哺乳动物中诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的新方法。在各种实施方式中，该方法包括给予(例如)有此需要的哺乳动物足以诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落的量的钙结合肽和/或肽样部分。在某些实施方式中，所述试剂局部和/或经皮给予。

Description

钙结合剂诱导毛发生长和/或甲生长

相关申请的交叉引用

本申请要求2009年2月6日提交的USSN 61/150,623的权益和优先权，该申请出于所有目的通过引用全文纳入本文。

对于联邦政府资助引发下所作发明的权利的声明

不适用。

对以光盘提交的“序列表”、表格或计算机程序列表附件的引用

不适用。

发明领域

本发明总体上涉及促进哺乳动物的毛发和/或甲生长的方法，更具体地说，涉及钙结合肽对于促进毛发生长和/或减少毛发脱落和/或诱导或增加甲生长速度的新型应用。

发明背景

目前，治疗雄激素性脱发的有效方法包括非那雄胺(PROPECIA

)或米诺地尔(6-(1-哌啶基)-2，4-嘧啶二胺，3-氧化物的口服和局部制剂(参见，例如美国专利号第3,382,247和3,644,363号)，和自体移植未受毛发脱落影响区域的毛囊或使得受毛发脱落影响区域内毛囊再分配的各种外科手术技术。在很大程度上由于这些治疗方法的成本和/或侵袭性，效力未经证实的毛发脱落疗法也很有市场(参见，例如Sawaya和Shapiro(2000)，Dermatologic Clinics 18：47-61，和其中的参考文献)。此外，可用抗雄激素治疗、醋酸环丙氯地孕酮、螺内酯、氟他胺治疗女性模式毛发脱落，但成功率极低(参见，例如Ross和Shapiro(2005)，Dermatologic Clinics 23：227-243)。除此之外，常通过遮蔽或化妆品处理来对付毛发脱落。斑秃是一种自身免疫疾病，可用免疫调节剂和免疫调节治疗，例如补骨脂素/UVA疗法来治疗。也利用了非那雄胺，但结果差别很大。

发明概述

在各种实施方式中，本发明涉及发现钙结合肽和/或其它钙结合剂(例如，本文所述的)可诱导哺乳动物的毛发再生长，据信，其可用于诱导男性或女性的毛发生长和/或防止毛发脱落(例如，男子头皮的脱发(雄激素性脱发)、药物诱导的脱发等)。

在某些实施方式中，提供钙结合部分，其中所述钙结合部分是本文显示的包含至少两个、三个或四个式I所示亚单位的聚合物或多联体(concatamer)(直接或经接头相连)，其中至少两个所述亚单位彼此毗连，而由非亚单位的部分彼此隔开的亚单位由持久长度(persistence length)大于或等于至少约

或

的连接键隔开，其中式I中的E、G、L、M、T和X独立选自：碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼和硒，它们采取化学上相容的构型；式I中的R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀、R₁₀’视需要存在或不存在以满足相关主链原子的化合价，存在时，它们是与E、G、L、M、T和X化学相容的非空间位阻部分；R₂和R₂′至少一个独立选自：H、Cl、I、F、Br或CH₃，当R₂或R₂′不是H、Cl、I、F、Br或CH₃时，它们如本文的式XIX所示，其中式XIX的原子Q选自：碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼和硒，它们是任何化学上合理的构型，其中R₂ ^d视需要存在或不存在以满足原子Q的化合价；其中R₂ ^a和R₂ ^b是小的、非空间位阻基团；R₂ ^d和/或R₂ ^c之一为负电荷基团，当R₂ ^c由负电荷部分构成且R₂ ^d存在时，R₂ ^d由小的空间位阻基团，例如羰基氧或H、Cl、I、F、Br或CH₃构成，反之亦然；R₅和R₅’中的至少一个被位于远离主链的一个中心的羟基占据，而另一个是小的非空间位阻基团。在某些实施方式中，该部分排除包含氨基酸序列(X-Y-Z)_n的肽，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)；Y和Z是独立选自下组的氨基酸：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、磷酸丝氨酸(pSer)、磷酸苏氨酸(pThr)和它们的衍生物；n是1到100。在某些实施方式中，所述钙结合部分具有其中所示式XXXVII结构，其中R₁和R₁₁独立为存在或不存在，存在时，其选自固体基片(solid substrate)或效应物；n为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20到60、70、80、90或100。在某些实施方式中，当R₁和/或R₁₁存在时，其包含独立选自下组的效应物：可检测标记物、亲和标签、药物、药物载体和抗微生物肽。在某些实施方式中，所述可检测标记物选自下组：放射性标记物、荧光标记物、比色标记物、不透射线的标记物、发光标记物、生物发光标记物和自旋标记物。在某些实施方式中，当R₁和/或R₁₁存在时，其包含选自下组的效应物：肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、有机化合物、无机化合物和有机金属化合物。在某些实施方式中，当R₁和/或R₁₁存在时，其包含的效应物是抗癌的或抗微生物的化合物。在某些实施方式中，所述效应物包含通过氨基酸接头序列连接于钙结合部分的抗微生物肽。在某些实施方式中，存在至少2、3、4、6、7、8、9、10、11或12个亚单位。

在某些实施方式中，所述部分由某结构域构成或包含该结构域，所述结构域的特征在于选自下组的分子式：S¹-S²-L¹-S³-S⁴和S¹-S²-L¹-S³-L²-S⁴，其中S¹、S²、S³和S⁴独立选自式I所示亚单位；L¹和L²是独立选择的接头(例如，表3所示)。在某些实施方式中，所述部分是肽，当L¹和/或L²存在时，其是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸长的独立选择肽接头。在某些实施方式中，所述部分是肽，当L¹和/或L²存在时，其是长约2个氨基酸到约50个氨基酸的独立选择肽接头。在某些实施方式中，当L¹和/或L²存在时，其包含独立选自表3所示肽接头的肽接头。在某些实施方式中，当L¹和/或L²存在时，其包含独立选自表3所示非肽接头的非肽接头。

在某些实施方式中，当R₂ ^a和/或R₂ ^b存在时，其独立选自下组：H、Cl、I、F、Br和CH₃。在某些实施方式中，R₂ ^c或R₂ ^d选自下组：SO₄ ^2-、PO₄ ^2-和羧酸酯基氧。在某些实施方式中，R₂ ^c是负电荷的部分，R₂ ^d存在且选自下组：H、Cl、I、F、Br和CH₃，或者R₂ ^d是负电荷的部分，R₂ ^d存在且选自下组：H、Cl、I、F、Br和CH₃。在某些实施方式中，R₂和/或R₂’独立选自本文所示式XX-XXIV所示结构构成的组。在各种实施方式中，R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀和R₁₀’中的一个或多个独立选自下组：-OH、-CH₃、-NH₂、-SiH₃、-SH、-SH、-BH₂、H、I、Cl、Br、F、乙基、羰基和仲胺基团。在某些实施方式中，R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀和R₁₀’中的一个或多个独立选自本文所示式XXV-XXVII所示结构构成的组。在某些实施方式中，R⁵具有本文所示式XVIII所示结构，其中R₅’选自下组：碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼和硒，它们是化学上相容的构型；R₅ ^a、R₅ ^b独立选自小的非空间位阻基团。在某些实施方式中，R₅ ^a和R₅ ^b独立选自下组：H、Cl、Br、I、F、CH3和OH。

在某些实施方式中，式I或XXXVII的E-G、L-M和T-X键具有明显的双键特征，作为直接双键或作为扩展的共轭轨道体系的一部分(例如，E-G、L-M和/或T-X键选自本文所示式II-XII所示结构)。在某些实施方式中，E-G、L-M和/或T-X键是结构上受约束的或芳族连接键，例如E-G、L-M和/或T-X键独立选自本文所示式XIII-XVIII所示结构。在某些实施方式中，所述部分包含选自下组的主链：包含肽键的主链、聚乙二醇(PEG)主链、烷烃主链、亚乙基桥连主链(ethylene bridged backbone)和酯主链。在各种实施方式中，所述部分未作磷酸化。在某些实施方式中，所述部分是药学上可接受的赋形剂(任选配制成单位剂量制剂)。在某些实施方式中，为选自下组的施用方式配制所述部分：口服给药、局部给药、鼻部给药、肺部给药、吸入、皮下给药、全身性给药、外科手术给药、皮下长效给药和直肠给药。

还提供在哺乳动物中诱导毛发生长或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的方法。这些方法通常涉及给予所述哺乳动物上述(和本文下述)的钙结合部分和/或钙结合肽(本文所述的)，例如包含一个或多个肽结构域，所述结构域包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸或其保守性取代，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20到30、40、50、60、70、80、90或100的数值；其中当存在多于一个结构域时，所述结构域可以相同或不同；其中所述钙结合肽部分结合磷酸钙；其中所述钙结合部分和/或钙结合肽部分的给予量足以在哺乳动物中诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长。在某些实施方式中，所述哺乳动物是非人哺乳动物(例如，猫、犬、马、牛、猪(urcine)、兔类、非人灵长类)或人。在某些实施方式中，局部给予所述钙结合部分和/或所述钙结合肽。

在某些实施方式中，所述方法包括诱导毛发生长或抑制毛发脱落(例如，在诊断具有选自下组的疾病的人中：斑秃、雄激素性脱发、药物诱导脱发和射线诱导脱发)。在某些实施方式中，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽给予头皮、眉毛、髭(上嘴唇)、胸部等区域(即，给予需要毛发生长的区域)。在某些实施方式中，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分给予：香波、毛发调理剂、毛发顺理剂(detangler)、毛发染色剂、毛发生长滋补剂、乳膏、凝胶或油膏。

在某些实施方式中，所述方法包括诱导甲生长。在某些实施方式中，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽给予选自下组的区域：甲、甲床、表皮、蹄的冠区域、角的基底。在某些实施方式中，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分给予：指甲膏、甲增强剂、蹄香膏(hoof balm)、指甲油、蹄或甲胶、密封剂、乳膏、洗液、足浴剂(foot bath)、蹄浴剂(hoof bath)等。

在这些方法的各种实施方式中，所述钙结合部分或钙结合肽是钙结合肽。在某些实施方式中，所述钙结合肽部分包含通过非肽接头相连的两个或更多个结构域。在某些实施方式中，肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸和/或其保守性取代，n是1到100的数值。在某些实施方式中，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在各种实施方式中，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，n是1到100，或2到50，或3到30，或4到20、15、12、11、10、9、8、6、或6的数值。在各种实施方式中，所述肽或肽结构域是D肽或β肽或具有PEG或其它非肽主链。在各种实施方式中，所述肽或肽结构域包含两个或更多个拷贝的表2所列肽亚单位的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽或肽结构域长约3、6、9、12、15、18、21、24、27或30到约100个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽或肽结构域长3、6、9、12、15、18、21、24、27或30个氨基酸。在某些实施方式中，n是2-8的数值(例如，2、3、4、5、6、7或8)。在某些实施方式中，X是天冬氨酸或其保守性取代。在某些实施方式中，Y和Z是丝氨酸或其保守性取代。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽包含选自下组的“L”肽、“D”肽或β肽：4DSS、5DSS、6DSS、7DSS、8DSS、9DSS和10DSS。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽未磷酸化。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽具有保护基团。

提供在哺乳动物中诱导毛发生长或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的制剂。制剂通常包含本文所述的钙-结合部分和/或本文所述的钙结合肽，例如包含一个或多个肽结构域，所述结构域包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸或其保守性取代，n是1到100的数值；其中当存在多于一个结构域时，所述结构域可以相同或不同；其中所述钙结合肽部分结合磷酸钙；所述制剂还包含载体，从而在所述钙结合部分和/或钙结合肽局部给予哺乳动物时能诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长。在某些实施方式中，所述运载体包含乳液(例如，油包水乳液、水包油乳液等)。在某些实施方式中，所述钙结合部分和/或所述钙结合肽连接于磷酸钙纳米颗粒或微粒。在某些实施方式中，所述纳米颗粒或微粒包含选自下组的磷酸钙：羟基磷灰石、β磷酸三钙、磷酸八钙和磷酸二钙二水合物。在各种实施方式中，所述纳米颗粒或微粒的大小范围是约1nm到约1μm。在各种实施方式中，提供的所述制剂可作为选自下组的产品的组分：香波、毛发调理剂、毛发顺理剂、毛发染色剂、洗发剂、毛发生长强壮剂、乳膏、凝胶和油膏。在各种实施方式中，提供的所述制剂可作为选自下组的产品的组分：甲油、甲增强剂、蹄香膏。

在制剂的各种实施方式中，所述钙结合部分或钙结合肽是钙结合肽。在某些实施方式中，所述钙结合肽部分包含通过非肽接头相连的两个或更多个结构域。在某些实施方式中，肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸和/或其保守性取代，n是1到100的数值。在某些实施方式中，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在各种实施方式中，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，n是1到100，或2到50，或3到30，或4到20、15、12、11、10、9、8、6、或6的数值。在各种实施方式中，所述肽或肽结构域是D肽或β肽或具有PEG或其它非肽主链。在各种实施方式中，所述肽或肽结构域包含两个或更多个拷贝的表2所列肽亚单位的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽或肽结构域长约3、6、9、12、15、18、21、24、27或30到约100个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽或肽结构域长3、6、9、12、15、18、21、24、27或30个氨基酸。在某些实施方式中，n是2-8的数值(例如，2、3、4、5、6、7或8)。在某些实施方式中，X是天冬氨酸或其保守性取代。在某些实施方式中，Y和Z是丝氨酸或其保守性取代。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽包含选自下组的“L”肽、“D”肽或β肽：4DSS、5DSS、6DSS、7DSS、8DSS、9DSS和10DSS。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽未磷酸化。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽具有保护基团。

还提供了本文所述钙结合部分和/或钙结合肽在制备诱导哺乳动物毛发生长或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的药物中的应用，例如包含一个或多个肽结构域的肽，所述结构域包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸或其保守性取代，n是1到100的数值；其中当存在多于一个结构域时，所述结构域可以相同或不同；其中所述钙结合肽部分结合磷酸钙；在各种实施方式中，所述哺乳动物是人或非人哺乳动物。在各种实施方式中，为局部给药配制所述钙结合部分和/或钙结合肽。在各种实施方式中，所述药物用于诱导毛发生长或抑制毛发脱落(例如，治疗诊断具有选自下组疾病的人：斑秃、雄激素性脱发、药物诱导脱发和射线诱导脱发等)。在各种实施方式中，所述药物包含所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分：香波、毛发调理剂、毛发顺理剂、毛发染色剂、毛发生长强壮剂、乳膏、凝胶或油膏。在各种实施方式中，所述应用包括诱导甲生长。在某些实施方式中，所述药物包含为应用于选自下组的区域而配制的所述钙结合部分和/或所述钙结合肽：甲、甲床、表皮、蹄的冠区域、角的基底。在某些实施方式中，所述药物包含所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分：甲油、甲增强剂和蹄香膏。在某些实施方式中，所述钙结合部分或钙结合肽是钙结合肽。在某些实施方式中，所述钙结合肽部分包含通过非肽接头相连的两个或更多个结构域。在某些实施方式中，肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸和/或其保守性取代，n是1到100的数值。在某些实施方式中，n是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在各种实施方式中，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，n是1到100，或2到50，或3到30，或4到20、15、12、11、10、9、8、6、或6的数值。在各种实施方式中，所述肽或肽结构域是D肽或β肽或具有PEG或其它非肽主链。在各种实施方式中，所述肽或肽结构域包含两个或更多个拷贝的表2所列肽亚单位的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述肽或肽结构域长约3、6、9、12、15、18、21、24、27或30到约100个氨基酸。在某些实施方式中，所述肽或肽结构域长3、6、9、12、15、18、21、24、27或30个氨基酸。在某些实施方式中，n是2-8的数值(例如，2、3、4、5、6、7或8)。在某些实施方式中，X是天冬氨酸或其保守性取代。在某些实施方式中，Y和Z是丝氨酸或其保守性取代。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽包含选自下组的“L”肽、“D”肽或β肽：4DSS、5DSS、6DSS、7DSS、8DSS、9DSS和10DSS。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽未磷酸化。在某些实施方式中，所述钙-结合部分或钙-结合肽具有保护基团。

本发明提供治疗对象中特征在于牙齿去矿化的牙齿缺陷和/或敏感性的方法。所述方法通常包括给予对象包含本文所述钙结合部分和/或钙结合肽的组合物，其中所述给药导致牙齿再矿化。在某些实施方式中，所述钙结合部分和/或钙结合肽与脱敏/再矿化剂共同给予。

本发明提供治疗对象中特征在于骨密度降低的骨缺陷的方法。所述方法通常包括给予对象包含本文所述钙结合部分和/或钙结合肽的组合物，其中所述给药导致骨密度升高。

本发明提供鉴定对象中特征在于牙齿去矿化的牙齿缺陷的方法。所述方法通常包括给予包含本文所述钙结合部分和/或钙结合肽的组合物，其中所述组合物中的钙结合部分和/或钙结合肽连接于(例如，偶联于)可检测标记物，其中所述钙结合部分优先结合去矿化的牙齿表面。该方法还可包括检测可检测标记物，从而鉴定和/或定位缺陷。

在某些实施方式中，提供了鉴定对象中特征在于骨去矿化的骨缺陷的方法。所述方法通常包括给予对象包含本文所述钙结合部分和/或钙结合肽的组合物，其中所述组合物中的钙结合部分连接于(例如，偶联于)可检测标记物，其中所述钙结合部分优先结合去矿化的骨表面。该方法还可包括检测可检测标记物，从而鉴定和/或定位缺陷。

定义

术语“钙-结合部分”包括本文所述的钙-结合肽以及非肽钙结合分子。

本文所用的术语“肽”指长度为2到约50、80或约100个残基的氨基酸残基聚合物。在某些实施方式中，所述肽长约2、3、4、5、7、9、10、或11个残基到约50、45、40、45、30、25、20、或15个残基。在某些实施方式中，所述肽长约8、9、10、、11或12个残基到约15、20或25个残基。在某些实施方式中，构成所述肽的氨基酸残基是“L-型”氨基酸残基，然而，应该知道，在各种实施方式中，“D”氨基酸可掺入肽。肽还包括其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物。此外，该术语适用于通过肽连接键或其它连接“修饰的连接键”(例如，肽键被α-酯、β-酯、硫代酰胺、膦酰胺(phosphonamide)、氨基甲酸酯、羟基化物等替代(参见，例如Spatola，(1983)Chem.Biochem.Amino Acids and Proteins 7：267-357)，酰胺被饱和的胺替代(参见，例如Skiles等.，美国专利第4,496,542号；和Kaltenbronn等，(1990)第969-970页刊于“第11届美国肽论坛纪要”(Proc.11th American PeptideSymposium)，ESCOM科学出版社，荷兰，等))相连的氨基酸。

本文所用的术语“残基”指天然的、合成的或修饰的氨基酸。各种氨基酸类似物包括但不限于：2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸(β-氨基丙酸)、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌啶酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、2，4二氨基丁酸、锁链素、2，2‘-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、n-乙基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、羟基赖氨酸、别(allo)-羟基赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、n-甲基甘氨酸、肌氨酸、n-甲基异亮氨酸、6-n-甲基赖氨酸、n-甲基缬氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸等。这些修饰的氨基酸是示范性而非限制性的。

本文所用的“DSS肽”包括的钙结合肽含有Asp-Ser-Ser基序(例如，PCT公布WO 2007/038683中所述的)和/或其改变形式的重复，例如本文所述的。在某些实施方式中，“DSS肽”包括具有多个结构域的钙结合肽/蛋白，所述结构域包含Asp-Ser-Ser基序和其改变形式的重复。“DSS”肽还可包含偶联物，其中包含Asp-Ser-Ser基序和其改变形式的重复的两个或更多个结构域通过非肽接头相连，从而形成多结构域偶联物，

″β-肽″由″β氨基酸″构成，所述氨基酸的氨基结合于β碳，而非如20种标准的生物学氨基酸那样结合于α-碳。唯一天然存在的β氨基酸是β-丙氨酸。

拟肽或N-取代的甘氨酸是肽模拟物的具体亚类。它们与其相应的天然肽密切相关，但在化学上的不同之处在于它们的侧链沿着分子的主链连接于氮原子，而非α-碳(它们在天然氨基酸中那样)。

应用于本文的肽的术语“常规”和“天然”指仅由以下天然氨基酸构成的肽：Ala、Cys、Asp、Glu、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp和Tyr。如果本发明化合物引发类似于天然肽的生物学活性(例如，Ca结合活性)，其“对应于”天然肽。引发的活性可相同、高于或低于天然肽的活性。通常，如果N-取代的甘氨酸衍生物的亲水性、疏水性、极性等类似于原氨基酸，则其中天然氨基酸被N-取代的甘氨酸衍生物替代的拟肽具有基本上相应的单体序列。以下是示范性而非限制性N-取代的甘氨酸替代：N-(1-甲基丙-1-基)甘氨酸取代异亮氨酸(Ile)、N-(丙-2-基)甘氨酸取代缬氨酸(Val)、N-苄基甘氨酸取代苯丙氨酸(Phe)、N-(2-羟乙基)甘氨酸取代丝氨酸(Ser)，等等。在某些实施方式中，取代无需“精确的”。因此，例如，在一些实施方式中，N-(2-羟乙基)甘氨酸可取代Ser、Thr、Cys和/或Met；N-(2-甲基丙-1-基)甘氨酸可取代Val、Leu和/或Ile。在某些实施方式中，虽然结构上有差异，但N-(2-羟乙基)甘氨酸可用于取代Thr和Ser：N-(2-羟乙基)甘氨酸中的侧链比Ser的长一个亚甲基，而与Thr的区别在于羟基取代的位点。通常可利用N-羟基烷基-取代的甘氨酸取代任何极性氨基酸，N-丙基或N-芳烷基-取代的甘氨酸替代任何芳族氨基酸(例如，Phe、Trp等)，利用N-烷基-取代的甘氨酸，例如N-(氨基烷基)甘氨酸衍生物替代任何碱性氨基酸(例如，Lys和Arg)。

在本文提供氨基酸序列之处，还包括该序列的L-、D-或β氨基酸形式以及反向、倒位和反向-倒位同种型。此外，还包括保守性取代。还包括非蛋白主链，例如PEG、烷烃、亚乙基桥连的、酯主链和其它主链。还包括长度约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸到最多肽的全长减一个氨基酸的片段，其中所述片段保留相应的未取代肽的至少60％、70％或80％，更优选至少90％、95％、98％、99％，或至少100％活性(例如，结合特异性和/或亲合力)。

在某些实施方式中，考虑了构成本文所述任何序列的氨基酸的保守性取代。在各种实施方式中，取代1、2、3、4或5个不同残基。术语“保守性取代”用于反映不实质性改变分子活性(例如，抗微生物活性和/或特异性)的氨基酸取代。保守性氨基酸取代通常涉及用一种氨基酸取代具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的另一种氨基酸。某些保守性取代包括“类似物取代”，其中标准氨基酸被与亲代残基区别极小的非标准氨基酸(例如，含有、合成的，等等)替代。氨基酸类似物视作合成衍生自标准氨基酸而不显著改变亲代的结构，其是异构体，或代谢前体。此类“类似物取代”的例子包括但不限于：1)Lys-Orn、2)Leu-正亮氨酸、3)Lys-Lys[TFA]、4)Phe-Phe[Gly]和5)δ-氨基丁基甘氨酸-ξ-氨基己基甘氨酸，其中Phe[gly]指苯基甘氨酸(在R基团中含H而非CH₃组分的Phe衍生物)，Lys[TFA]指其中带负电荷的离子(例如，TFA)连接于胺R基团的Lys。其它保守性取代包括“功能取代”，其中两个残基的通用化学性质类似，并且足以模拟或部分覆盖天然肽的功能。强功能取代包括但不限于：1)Gly/Ala、2)Arg/Lys、3)Ser/Tyr/Thr、4)Leu/Ile/Val、5)Asp/Glu、6)Gln/Asn和7)Phe/Trp/Tyr，而其它功能取代包括但不限于：8)Gly/Ala/Pro、9)Tyr/His、10)Arg/Lys/His、11)Ser/Thr/Cys、12)Leu/Ile/Val/Met和13)Met/Lys(疏水性条件下的特例)。各种“广泛保守性取代”包括同一生物化学或生物物理分组中的氨基酸替代其它氨基酸的取代。这是基础水平的相似性，源自对原始20种天然氨基酸的区分。此类取代包括1)非极性侧链：Gly/Ala/Val/Leu/Ile/Met/Pro/Phe/Trp，和/或2)不带电荷的极性侧链Ser/Thr/Asn/Gln/Tyr/Cys。在某些实施方式中，广义水平的取代还可成对发生。例如，任何亲水性中性配对[Ser、Thr、Gln、Asn、Tyr、Cys]+[Ser、Thr、Gln、Asn、Tyr、Cys]可被电中性带电荷配对[Arg、Lys、His]+[Asp、Glu]替代。以下六组各自包含在某些实施方式中，通常彼此是保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。在本文公开氨基酸序列之处，还包括含有一个或多个以上鉴定的保守性取代的氨基酸序列。

在某些实施方式中，还包括与本文所述任何序列有至少80％，优选至少85％或90％，更优选至少95％或98％序列相同性(优选保留未修饰肽的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％或更多的结合特异性和/或亲合力)的肽。术语“相同”或“相同性百分比”指采用以下序列比较算法之一或通过目测观察检测来比较和比对最大相应性时，两条或更多条序列相同，或具有一定百分比的氨基酸残基相同。对于本发明的肽，在该肽的全长测定序列相同性。为作序列比较，通常将一条序列用作参比序列，将测试序列与之相比。采用序列比较算法时，将测试和参比序列均输入计算机，如有必要指定子序列坐标，指定序列算法程序参数。然后，根据指定的程序参数，该序列比较算法计算出测试序列相对于参比序列的序列相同性百分比。为作比较，可进行最佳序列比对，例如通过Smith和Waterman的局部同源性算法((1981)Adv.Appl.Math.2：482)，Needleman和Wunsch的同源性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)，Pearson和Lipman的相似性检索方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：2444)，这些算法的计算机化实施(威斯康星遗传软件包(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，)或目测观察。

本文所用的“治疗”或“处理”疾病可指预防该疾病、减缓该疾病的发作或发展速度、降低产生该疾病的风险、阻止或延缓该疾病相关症状的产生、减轻或终止该疾病的相关症状、使得该疾病完全或部分复原，或它们的一些组合。

用于本文所述钙结合肽或其它部分时，术语“基本上由…组成”表示其变体、类似物或衍生物所包含的肽或其它部分与参比部分基本上相同或更高的结合活性和/或特异性和/或亲合力。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指某种物质基本上或实质性不含天然状态下通常与其相伴的组分。以肽为例，分离的(天然产生的)肽通常基本不含其在细胞、组织或机体中相关的组分。术语分离的还表示该肽不存在于噬菌体展示、酵母菌展示或其它肽文库中。

当术语“共同给予”或“组合给予”用于指钙结合肽或钙结合部分和另一试剂(例如，脱敏和/或再矿化剂)时，其表明钙结合肽或钙结合部分和其它试剂的给予使得该两种试剂的活性至少有一定的时间重叠。在顺序给药中，两种试剂的给药之间有一定的实质性延迟(例如，数分钟，甚至数小时)，只要各活性的存在方式提供增加/增强的结果。

在各种实施方式中，本文采用表1所示的氨基酸缩写。

表1.氨基酸缩写

附图简述

图1显示DSS-处理的(下图)和模拟-处理的(上图)小鼠，显示头皮剃毛后13天的毛发再生。

图2显示钙-结合化合物对小鼠的毛发生长的作用。各组中最左侧的图显示准备后和处理前第0天的小鼠。右侧的图显示第23天(终点日期)的小鼠。上图显示每日接受局部盐水处理的阴性对照。下图显示DSS化合物局部制剂应用于标出区域的每日接受处理的小鼠，与对照相比，显示明显的毛发生长。

图3显示羟基磷灰石在牙釉质(上图)和牙本质(下图)表面的成核作用。制备表面并如所示用标记物处理，然后采用扫描电子显微术成像。上组(上两行)代表了牙釉质样品，而下组(下两行)代表牙本质样品。在各组中，上行代表处理前未作去矿化的样品，而下行代表用磷酸去矿化的样品。显示了扫描电子图像，标尺＝10pM。左列：成核与晶体生长前不接触任何处理的样品。中间列：成核与晶体生长前仅接触缓冲液的样品。右列：成核与晶体生长前接触12.5pM8DSS肽的样品。晶体生长表明早期成核作用。

图4提供显示DDS肽和变体结合的组织特异性的荧光显微图像。成年人牙齿接触12.5pM 5(6)-羧基荧光素-标记肽而不作去矿化，彻底清洗，通过CLSM成像。对于各切片，收集多次扫描结果并以自动模式组合以产生代表13x13mm区域的图像，在大多数情况中这足以包括整个切片。各切片所用的肽标注在各图之下，在各图中，牙齿的定向是根部对着图像的顶部，而冠部对着底部。组织层作如下标记：RTD＝根尖牙本质；CPD＝髓周牙本质；MD＝罩牙本质；P＝牙髓腔壁；DEJ＝牙本质-牙釉质结合；E＝牙釉质；BE＝基础牙釉质；CE＝皮层牙釉质；CL＝龋齿病损；PB＝牙周骨。

图5提供显示DDS肽和变体特异性结合牙齿中龋齿病损的荧光显微图像。成年人牙齿接触12.5μM 5(6)-羧基荧光素-标记肽而不作去矿化，彻底清洗，通过CLSM成像。为各样品分别优化显微镜和照相机设置。各图显示包括龋齿病损在内的牙齿切片的区域。各图右侧的痕迹曲线标出牙齿表面的位置，而箭头表明染色病损的位置。

图6显示本文所述钙结合部分实质性增加临界直径大鼠颅盖缺陷(criticaldiameter rat calvarial defects)的治愈率。显微CT显示第3周时的骨沉积(头皮嵌在CT照片中)。

图7A、7B和7C显示所选的含(DSS)_n的肽和变体结合HA的平衡等温线。图7A：各种长度的含(DSS)_n的肽的结合情况。图7B和7C：序列变体的结合情况。

图8，图A-D显示荧光标记的6DSS肽与矿化骨髓结(bone marrow nodules)的结合。如实施例6所述培养MBM培养物并取像。图A：用6DSS处理的培养物的矿化小鼠骨髓结(MBMN)的亮视野图像。图B：图A所示视野的荧光图像。图C：用掺混对着肽处理的培养物的MBMN的亮视野图像。图D：图C所示视野的荧光图像。棒＝600μm。

图9，图A-D显示固定化8DSS肽与CaHPO₄的相互作用。链霉亲和素包被的聚苯乙烯珠(4μm平均直径)与生物素偶联的8DSS肽(图A、C)或未偶联的生物素(图B、D)温育。图A：DSS包被珠周围累积的无定形磷酸钙聚集物的亮视野显微图像。棒＝4μm。图B：代表性生物素封闭珠(无DSS肽)的亮视野显微图像。棒＝12μm。图C：外部其围绕有更多磷酸钙有序沉积的DSS包被珠的相差显微图像。棒＝4μm。图D：对着样品(生物素封闭的，无DSS肽)。棒＝4μm。

图10显示标记的DSS与人牙齿的牙本质结合。上图：荧光标记(DSS)₈肽结合切片人牙齿的共焦图像，显示牙釉质(E)和牙本质(D)。箭头标出DEJ。下图：同一牙齿在罩牙本质(右)和牙髓腔(左)之间区域的共焦图像，显示相对于髓周牙本质和牙釉质，该肽对罩牙本质有优先性。棒＝50μm。

图11，图A-D显示如所示处理的矢形牙齿切片的扫描电子显微图像：图A：未处理对照；图B：用8DSS预处理1小时，清洗并用Quell脱敏剂再矿化；图C：与缓冲液(50mM HEPES，pH 7.0)预温育，然后如图B所示再矿化；图D：未作预温育，如图B所示再矿化。棒＝50μm。

图12：在实验的第19天比较肽-处理的(左侧两个数字，标记为“A”)和模拟处理的(右侧两个数字，标记为“P”)甲。数字1和2是用AOT/异丙醇纳米乳液配制的(D)-DSS每三天处理一次，共19天。与用PBS作模拟处理的数字3和4相比，在这些甲中观察到的明显更多的生长。

图13比较各种处理相关的甲生长。处理19天后，检测甲，测定各种处理的新生长量。用含(D)-DSS的制剂处理的甲中新生长明显较高。

发明详述

在某些实施方式中，本发明涉及以下发现：本文和PCT公布号WO/2007/038683中描述的钙结合剂(例如，肽)诱导毛发生长和/或甲生长。据信，本文所述的钙结合肽和其它钙结合部分可用在哺乳动物中以恢复毛发和/或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长和/或修复。

在某些实施方式中，所述方法包括给予有此需要的对象一种或多种钙结合肽(例如，本文和/或PCT公布号WO/2007/038683所述)和/或本文所述的一种或多种其它钙结合部分。在各种实施方式中，提供不可降解形式的钙结合肽和/或其它部分。示范性的不可降解肽可由，例如所有组成氨基酸为(D)立体异构体的肽、含修饰主链的肽、肽模拟物或衍生聚合物，例如肽偶联的线形聚合物、共聚物或枝状聚合物构成。

将这些肽给予毛发脱落的部位导致毛发生长速度显著高于正常情况下观察到的那些。在某些实施方式中，可通过局部给药、皮肤给药、真皮内给药、经皮给药、皮下给药、经皮注射、经皮离子电渗(参见美国专利6,526,316)、外科手术植入或其它方式实现该给药方式。在某些实施方式中，用可接受的载体，例如聚合物逆胶束、二甲基亚砜(DMSO)等配制化合物以便局部给药，或用普通盐水溶液配制以供注射或外科手术植入。此外，枝状聚合物形式本身可能显示局部应用的经皮穿透提高而无需利用外来载体。

该方法的优点包括但不限于其效力，而目前现有的方法仅提供有限的毛发再生。迄今为止，在小鼠模型中利用钙结合肽观察到的生长情况比利用其它实验体系的其它化合物所报道的明显。这些方法已在动物模型(小鼠)中检验过，在该体系中显示是安全而有效的。

此外，本文所述的各种钙结合部分能以组织特异性方式结合表面。在某些实施方式中，变体经鉴定能特异性结合牙本质或牙釉质(参见，例如图3)、牙周骨(人)、长骨(大鼠)、降解的矿物质表面(龋齿，牙齿模型中)和钛(具有结合界面)。毒性检验未显示急性毒性、器官破坏和抗原性反应。

在各种实施方式中，这些构建物可定向1)募集磷酸钙层以预处理牙齿表面(参见图3)；2)在牙釉质、牙本质和非生命表面形成成核羟基磷灰石晶体；3)将抗微生物化合物靶向递送至含钙的微生物生物膜；4)实质性增加致命缺陷(critical defect)的治愈率；5)结合草酸钾晶体；和6)区分磷酸钙和磷酸锶晶体。这些应用是示范性而非限制性的。

在各种实施方式中，本文所述的钙结合肽和/或钙结合部分和/或包含这些的嵌合构建物可用于再矿化牙齿缺陷；诊断骨和牙齿缺陷，早期牙齿和其它骨质植入物中的骨整合；增强骨治愈；治疗骨髓炎和骨质疏松症；抑制不适当的矿化；和靶向治疗以矿化不适当矿化的组织缺陷或部位。这些应用是示范性而非限制性的。

钙结合剂

钙结合肽(“DSS”肽)

在某些实施方式中，钙结合剂包括但不限于钙结合肽。钙结合肽是包含一个或多个钙结合肽结构域(例如，DSS肽结构域，如本文所述的钙结合肽可见PCT公布WO 2007/038683所述的那些，该出版物通过引用纳入本文)或由它们构成的部分。如果存在多个钙结合肽结构域，它们可化学偶联在一起或可通过，例如肽键直接相连，或通过，例如肽接头相连以形成多结构域钙结合肽。

在某些实施方式中，提供由Asp-Ser-Ser基序(″DSS″肽)的改变形式构成的一系列钙结合肽以及包含多个钙结合肽的部分。这些“DSS”肽显示紧密和特异性地结合磷酸钙表面。此外，这些肽显示募集磷酸钙至此类表面和用作荧光标记物与钙化表面相连的结合部分，而无论它们的磷酸化状态。

本文所述的肽/肽结构域通常至DSS肽，其可由各种数量和/或组合的亚单位构成；DPP的三氨基酸Asp-Ser-Ser基序或其改变形式。可利用的三氨基酸重复的例子包括但不限于：Asp-Ser-Ser(DSS)、Glu-Ser-Ser(ESS)、Asp-Thr-Thr(DTT)、Glu-Thr-Thr(ETT)、Asn-Ser-Ser(NSS)、Asn-Thr-Thr(NTT)、Gln-Ser-Ser(QSS)、Gln-Thr-Thr(QTT)及其改变形式。或者，或除这些重复序列外，本文公开的肽可包含这些重复的次要改变，包括但不限于：Asp-Ser-Thr(DST)、Asp-Ala-Ala(DAA)或Ala-Ser-Thr(AST)等。在各种实施方式中，可化学修饰三氨基酸重复内的一个或多个氨基酸残基。例如，在某些实施方式中，所述肽可含有通过加入磷酸基团修饰了羟基(pSer，pThr)的一个或多个Ser或Thr残基，等等。在各种实施方式中，所述肽的长度从3到大于50或100个氨基酸不等。在某些实施方式中，其它修饰的残基包括但不限于磷酸化、硫酸化、磺化或酰化的Ser、Thr、Gly或Ala。

可通过改变重复的组成和数量来控制本文公开的肽对钙化表面的结合亲和力。例如，包含一个或多个Asp-Ser-Ser重复会增加该肽的结合亲和力，因为该序列显示所测试任何重复的最高亲和力。还可通过增加三氨基酸重复的数量来增加肽的结合亲和力。含有多于6个重复的肽通常显示结合亲和力大于含有较少重复的。在某些实施方式中，本文公开的肽对羟基磷灰石的结合亲和力(KA)大于15,000M^-1。在某些实施方式中，该结合亲和力可大于50,000M^-1，在其它实施方式中可大于100,000M^-1，在其它实施方式中可大于200,000M^-1，在其它实施方式中可大于300,000M^-1。

在某些实施方式中，所述肽可含有一个或多个并非三氨基酸重复序列一部分的附加氨基酸。例如，在某些实施方式中，所述肽的重复部分可与具有附加功能的氨基酸序列稠合，例如抗微生物肽序列，如2c-4(RWRWRWF，SEQ IDNO：1)、PL135(FHFHLHF，SEQ ID NO：2)、b-34(LKRF LKWF KRF，SEQ IDNO：3)，等等。在这些实施方式的某些中，所述肽的重复部分可通过接头序列，例如三甘氨酸序列与附加氨基酸序列稠合。

在某些实施方式中，本文公开的肽包含亚单位序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自以下的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、磷酸丝氨酸(pSer)、磷酸苏氨酸(pThr)和它们的衍生物，n是1到100，优选约2到约50或100，更优选约4到约20的数值。在某些实施方式中，n是1到15，在其它实施方式中，n是1到10，在某些实施方式中，n是3到4、6或8。在某些实施方式中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。示范性的三氨基酸“DSS”(“XYZ”)亚单位示于表2。

表2.示范性的“DSS”(XYZ)亚单位

在各种实施方式中，包括各位置(X、和/或Y、和/或Z)的保守性氨基酸取代。

亚单位可连续重复(例如，8DSS：DSS DSS DSS DSS DSS DSS DSSDSS，SEQ ID NO：4)，或者，在某些实施方式中，一个或多个亚单位可散布有一个或多个其它亚单位(例如，DSS NSS DSS NSS(SEQ ID NO：5)，等等)和/或散布有非亚单位序列。在某些实施方式中，包含一个或多个亚单位的结构域(例如，n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25，等)可彼此相连以形成包含多个钙结合结构域的钙结合剂。这些结构域可彼此直接相连，或经化学接头相连形成偶联物。或者它们可经肽接头相连形成多结构域肽/蛋白质。

在某些实施方式中，多结合结构域部分包含至少2个结构域、至少3个结构域、至少4个结构域、至少5个结构域、至少6个结构域或更多结构域。构成此类构建物的Ca结合结构域可以相同或不同。如上所示，构成此类构建物的各种Ca-结合结构域可彼此直接相连，或者两个或更多个此类结构域可经接头彼此相连。合适接头的示范性但非限制性清单见表3。

表3.连接Ca结合结构域和/或连接Ca结合部分(例如，肽)与一个或多个效应物(例如，AMP，可检测标记物等)的示范性肽和非肽接头。

(所有基于氨基酸的接头可以是L、D、β、PEG主链，或其它形式)

DSS-样化合物

在某些实施方式中，提供了更多通用的DSS-样钙结合部分。此类DSS-样化合物通常由本身至少9个原子长的单体构成，其中乙酸部分或其理化等价物连接于第二个原子，而甲醇或羟甲基部分或其理化等价物连接于第五和第八个原子。该单体可重复任何次数，可连接于任何其它部分。

甚至更常见的是，这代表了以下式I所示形式的亚单位的聚合物或多联体：

位置E、G、L、M、T和X通常各自可由任何化学上相容组合或构型的碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼或硒构成，R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀、R₁₀’视需要存在或不存在以满足相关主链原子的化合价。

在各种实施方式中，E-G和/或L-M和/或T-X键优选具有明显的双键特征，作为直接双键或作为扩展的共轭轨道体系的一部分。该性质的体系的例子包括但不限于式II-XII：

在某些实施方式中，结构上受约束的或芳族连接键可能填充这些位置。此类连接键包括但不限于式XIII-XVIII：

等。

如果R₂由除H、Cl、I、F、Br或CH₃以外的任何部分构成，R₂’优选为H、Cl、I、F、Br或CH₃，反之亦然。在各种实施方式中，该位置中除H、Cl、I、F、Br或CH₃以外的部分采取式XIX的形式：

其中原子Q是任何化学上相容构型的碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼或硒，其中R₂ ^d视需要存在或不存在以满足原子Q的化合价；其中R₂ ^a和R₂ ^b各自由小的、非空间位阻基团构成，例如H、Cl、I、F、Br或CH₃等，R₂ ^d或R₂ ^c各自由负电荷基团构成，例如硫酸根(SO₄ ^2-)、磷酸根(PO₄ ^2-)或羧酸氧等。在某些实施方式中，如果R₂ ^c是带负电荷部分，R₂ ^d存在，则R₂ ^d是小的非空间位阻基团，例如羰基氧或H、Cl、I、F、Br或CH₃等，反之亦然。

R₂或R₂’的部分的例子包括但不限于式XX-XXIV所示结构：

在各种实施方式中，R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀、R₁₀’可以是任何相对无阻的部分，它们对于给定的E、G、L、M、T和X身份在化学上是合适的。例子包括但不限于：-OH、-CH₃、-NH₂、-SiH₃、-SH、-SH、-BH₂、H、I、Cl、Br、F或乙基、羰基或仲胺基团，包括但不限于式XXV-XXVII所示结构：

在某些实施方式中，在位置R₅和R₅’中，一个位置可被位于远离主链的一个中心的羟基占据，而另一个被小的非空间位阻基团占据，优选H，但Cl、I、Br、F、-OH、-CH₃、-NH₂、-SiH₃、-SH、-SH、-BH₂等也可以。

位于远离主链的一个中心的羟基的例子是式XVIII所示结构：

此处，在各种实施方式中，R₅’是任何化学上合理构型的碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼或硒，R₅ ^a、R₅ ^b独立选自小的非空间位阻基团(例如，H、Cl、Br、I、F、CH₃、OH，等)。

具有合适活性的特定化合物包括但不限于：具有聚乙二醇(PEG)主链的化合物，包括但不限于式XXIX和XXX所示结构：

这些结构是等价的，除了R₁和R₂赋予方向性之处。

含烷烃主链的化合物包括但不限于式XXXI和XXXII所示结构：

这些结构是等价的，除了R₁和R₂赋予方向性之处。

含亚乙基桥连主链的化合物包括但不限于式XXXIII和XXXIV所示结构：

这些结构是等价的，除了R₁和R₂赋予方向性之处。

含酯主链的化合物包括但不限于式XXXV和XXXVI所示结构：

这些结构是等价的，除了R₁和R₂赋予方向性之处。还应该知道，包括含有这些亚单位(和/或本文所述其它亚单位)并含有或不含中间接头的多联体。如果一个或多个接头隔开亚单位，在某些实施方式中，所述多联体包含至少2、优选至少3个、更优选至少4个、还要更优选至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个亚单位。在一个或多个接头隔开亚单位的各种实施方式中，亚单位中的至少两个由接头隔开，该接头提供的持久长度等于或大于约4个氨基酸(例如，约

或更高)。

其它化合物包括具有肽主链的化合物。

在各种实施方式中，本文所述化合物的亚单位彼此毗连，所述化合物是这些亚单位的聚合物。在某些实施方式中，一个或多个接头可隔开亚单位。然而，钙结合部分中通常至少两个亚单位彼此毗连。因此，例如，在某些示范性实施方式中，所述钙结合部分可包含形式S¹ _w-S² _x-L¹ _y-S³ _z-S⁴ _m，orS¹ _w-S² _x-L¹-S³ _z-L²-S⁴ _m所示结构，其中″S″表示本文所述的亚单位，″L″表示接头(例如，表3所示)，w、x、y、z和m为0到100，更优选约4到约100(例如，以上″n″所述的)，最优选4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25。当亚单位不毗连时，它们通常由持久长度大于或等于至少1、2或3个氨基酸，优选大于或等于4个氨基酸的连接物隔开。

在某些实施方式中，本文所述的部分可包含式XXXVII所示区域：

其中R₁和R₁₁独立为存在或不存在，存在时，其选白固体基片(例如，表面、颗粒、纳米颗粒等)和/或效应物(例如，本文所述的)，且n为约2、3或4到最多约100(例如，上述的)。各种示范性效应物包括但不限于：可检测标记物、药物、药物载体、抗微生物肽等。

在各种实施方式中，本文所述试剂(例如，DSS-样部分)专门排除PCT公布WO 2007/038683中所述的一种或多种试剂。因此，在某些实施方式中，本文所述的分子式专门排除包含氨基酸序列(X-Y-Z)_n或由其构成的肽，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)，Y和Z是独立选自下组的氨基酸：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、磷酸丝氨酸(pSer)、磷酸苏氨酸(pThr)和它们的衍生物；n为1到100。在某些实施方式中，本文所述分子式专门排除表2所示亚单位中的一个或多个。

保护基团

虽然本文所述各种肽可能显示不含保护基团，但在某些实施方式中，它们可具有1、2、3、4或更多的保护基团。在各种实施方式中，保护基团可偶联于肽的C和/或N末端和/或构成该肽的一个或多个内部残基(例如，可阻断组成型氨基酸上的一个或多个R基团)。因此，例如，在某些实施方式中，本文所述的任何肽可具有例如保护氨基末端的酰基和/或保护羧基末端的酰氨基。

在各种实施方式中，加入保护基团，特别是在羧基末端，在某些实施方式中是在氨基末端加入保护基团能提高肽的稳定性和/或效率。

各种保护基团适用于该目的。此类基团包括但不限于：乙酰基、酰胺和烷基，其中N末端保护尤其优选乙酰基和烷基，羧基末端保护优选酰胺基。在某些特别优选的实施方式中，保护基团包括但不限于：脂肪酸中的烷基链、丙酰基、甲酰基和其它基团。特别优选的羧基保护基团包括酰胺、酯和醚-形成保护基团。在一个优选的实施方式中，乙酰基用于保护氨基末端，酰胺基用于保护羧基末端。这些封闭基团增强肽形成螺旋的可能性。某些特别优选的封闭基团包括各种长度的烷基，例如式CH₃-(CH₂)_n-CO-所示的基团，其中n为约1到约20，优选约1到约16或18，更优选约3到约13，最优选约3到约10。

在某些实施方式中，保护基团包括但不限于：脂肪酸中的烷基链、丙酰基、甲酰基和其它基团。尤其优选的羧基保护基团包括酰胺、酯和醚-形成保护基团。在一个实施方式中，乙酰基用于保护氨基末端和/或氨基用于保护羧基末端(即酰胺化的羧基末端)。在某些实施方式中，封闭基团包括各种长度的烷基，例如式CH₃-(CH₂)_n-CO-所示的基团，其中n为约3到约20，优选约3到约16，更优选约3到约13，最优选约3到约10。

在某些实施方式中，C末端上的酸性基团可被醇、醛或酮基封闭和/或N末端残基可具有天然酰胺基团，或被酰基、羧酸、醇、醛或酮基封闭。

其它保护基团包括但不限于：Fmoc、叔丁氧基羰基(t-BOC)、9-芴乙酰基、1-芴羧基、9-芴羧基、9-芴酮-1-羧基、苄氧基羰基、呫吨基(Xan)、三苯甲基(Trt)、4-甲基三苯甲基(Mtt)、4-甲氧基三苯甲基(Mmt)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基-苯磺酰基(Mtr)、均三甲基苯-2-磺酰基(Mts)、4，4-二甲氧基二苯甲基(Mbh)、甲苯磺酰基(Tos)、2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺酰基(Pmc)、4-甲基苄基(MeBzl)、4-甲氧基苄基(MeOBzl)、苄氧基(BzlO)、苄基(Bzl)、苯甲酰基(Bz)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys)、1-(4，4-二甲基-2，6-二氧代亚环己基)乙基(Dde)、2，6-二氯苄基(2，6-DiCl-Bzl)、2-氯苄氧基羰基(2-Cl-Z)、2-溴苄氧基羰基(2-Br-Z)、苄氧基甲基(Bom)、环己氧基(cHxO)、叔丁氧基甲基(Bum)、叔丁氧基(tBuO)、叔丁基(tBu)、乙酰基(Ac)和三氟乙酰基(TFA)。

本领域技术人员熟知保护/封闭基团和将此类基团偶联于构成本发明肽的合适残基的方法(参见，例如Greene等.，(1991)《有机合成中的保护基团》(Protective Groups in Organic Synthesis)，第2版.，约翰韦利父子公司，萨默塞特，新泽西州)。在示范性的实施方式中，例如，利用乙酸酐在合成期间实现乙酰化，此时肽在树脂上。可通过选择用于合成的合适树脂来实现酰胺保护。例如，可利用林克(rink)酰胺树脂。合成完成后，酸性双功能氨基酸如Asp和Glu和碱性氨基酸Lys上的半永久式保护基团或Tyr的羟基均同时除去。采用酸性处理从此类树脂上释放的肽最终是n-末端保护为乙酰基，羧基末端保护为NH₂，所有其它保护基团同时除去。

本文公开氨基酸序列之处，还包括含有一个或多个保护基团，例如上述保护基团(或用于例如boc或fmoc肽合成的任何其它市售可得的氨基酸保护基团)的氨基酸序列。

肽环化

在某些实施方式中，本文所述部分(例如，钙结合肽、包含钙结合部分的嵌合构建物等)经圈化/环化以产生环状肽。本文考虑的环状肽包括头/尾、头/侧链、尾/侧链和侧链/侧链的环化肽。此外，本文考虑的肽包括仅含有肽键的纯环肽(homodet)，和另外含有二硫键、酯键、硫酯键或其它键的杂环肽(heterodet)。

实际上可采用本领域已知制备环状肽的任何技术来制备环状肽。例如，可采用常规液相或固相肽合成制备线形或非环化形式的肽，并采用标准化学方法环化。用于环化肽的化学方法优选足够温和，从而避免实质性降解肽。合成本文所述肽的合适方法以及环化该肽的合适化学方法是本领域熟知的。

在各种实施方式中，可通过直接偶联N和C末端以形成肽键(或其它键)来实现环化，还可通过氨基酸侧链进行环化。此外，可基于利用其它官能团，包括但不限于氨基、羟基、巯基、卤素、磺酰基、羧基和硫代羧基。这些基团可位于氨基酸侧链或连接于其N或C末端。

因此，应该理解用于共价环化本发明肽的化学连接键不一定是酰胺键。在许多实例中，需要修饰线形或非环化肽的N和C末端以提供，例如可在温和反应条件下环化的反应性基团。此类连接键包括例如但不限于：酰胺、酯、硫酯、CH₂--NH等。本领域熟知合成具有修饰末端的肽的技术和试剂以及适合环化此类修饰肽的化学方法。

或者，在肽的末端被构象局限或以其它方式局限从而难于环化的情况中，需要将接头连接于N和/或C末端以促进肽环化。当然，应该知道此类接头具有能与肽的末端形成共价键的反应性基团。本领域熟知合适的接头和化学反应，包括以上所述那些。

已充分鉴定了环状肽和缩肽(包含酯(缩酚酸)键作为主链一部分的杂环(heterodetic)肽)，其显示多种生物学活性。环化导致构象自由度降低常造成受体结合亲和力更高。还常在这些环状化合物中产生额外的构象局限性，例如利用D-和N-烷化氨基酸，α，β-脱氢氨基酸或α，α-二取代的氨基酸残基。

本领域技术人员熟知在肽中形成二硫键的方法(参见，例如Eichler和Houghten(1997)Protein Pept.Lett.4：157-164)。

还可参考以下文献：Marlowe(1993)Biorg.Med.Chem.Lett.3：437-44，其描述了利用三甲基硅烷基(TMSE)酯作为正交保护基团在TFA树脂上的肽环化；Pallin和Tam(1995)J.Chem.Soc.Chem.Comm.2021-2022)，其描述了通过肟形成在水溶液中环化未保护的肽；Algin等.(1994)TetrahedronLett.35：9633-9636，其公开了通过赖氨酸侧链锚定进行头-尾环状肽固相合成；Kates等.(1993)Tetrahedron Lett.34：1549-1552，其描述了通过三维固相方案产生头-尾环状肽；Tumelty等.(1994)J.Chem.Soc.Chem.Comm.1067-1068，其描述了从固定化的活化中间体合成环状肽，其中活化固定化肽，维持N-保护基团完整并随后除去，进而引起环化；McMurray等.(1994)Peptide Res.7：195-206)，其公开了经天冬氨酸和谷氨酸的侧链来头-尾环化连接于不可溶支持物的肽；Hruby等.(1994)Reactive Polymers 22：231-241)，其教授了通过固相支持物环化肽的另外方法；Schmidt和Langer(1997)J.Peptide Res.49：67-73，其公开了合成环四肽和环五肽的方法。

肽环化的这些方法是说明性而非限制性的。利用本文提供的教导，本领域技术人员可采用其它环化方法。

钙结合剂的应用

毛发生长

令人吃惊且出乎意料地发现本文所述钙结合肽和其它钙结合部分在应用于哺乳动物皮肤时能诱导毛发生长(图1和2)。据信，可利用这些试剂在受诱导毛发脱落的状况(例如，脱发、化疗等)之苦的哺乳动物中诱导毛发生长、毛发再生长和/或抑制毛发脱落。应用于有此需要的对象的试剂量通常足以诱导毛发生长和/或减轻毛发脱落。

可通过许多途径，包括，例如局部给药、皮肤/真皮内给药、经皮给药、皮下给药、经皮离子电渗、经皮递送枝状聚合物、利用聚合物逆胶束、利用脂质逆胶束等给予试剂。

在各种实施方式中，毛发生长或抑制毛发脱落包括抑制需要毛发生长/维持的一个或多个区域的毛发脱落(例如，一个或多个区域，如头部、眉毛、髭区域(上嘴唇)、胸部等)。

在某些实施方式中，配制本文所述的钙结合肽和/或其它钙结合部分以供局部、皮肤、真皮内、经皮或皮下给药(例如，配制成清洗剂、滋补品、溶液、乳液、泡沫、乳膏、凝胶、软膏、扑粉、搽剂或香油、洗液、油膏等)。

在某些实施方式中，提供本文所述的钙结合肽和/或其它钙结合部分和/或其制剂作为用于毛发的治疗、维持、清洁或上色的组分。因此，例如，在某些实施方式中，提供本文所述钙结合肽和/或钙结合部分和/或其制剂作为以下产品的组分：香波、毛发调理剂、毛发染色剂、毛发顺理剂、毛发清洗剂等。

甲生长

令人吃惊且出乎意料地发现本文所述钙结合肽和其它钙结合部分在应用于哺乳动物的甲、甲床、表皮等时能诱导甲生长(参见，图12和13)。还可利用肽和其它钙结合部分来改善手指甲、脚甲、动物蹄、爪和角的生长和健康。

在某些实施方式中，本文所述钙结合肽和其它钙结合部分应用于甲床(表皮)、蹄的冠区域或角的基底以增强甲、爪、蹄和角的生长。为皮肤、真皮内、皮下和经皮递送开发的制剂对此目的也有效。

在某些实施方式中，提供的本文所述钙结合肽和/或其它钙结合部分和/或其制剂作为用于甲、蹄或角的治疗、维持、清洁或上色的组分。因此，例如，在某些实施方式中，提供的本文所述钙结合肽和/或其它钙结合部分和/或其制剂作为选自下组的制剂的组分：指甲膏、甲增强剂、蹄香膏、指甲油、蹄或甲胶、密封剂、乳膏、洗液、足浴剂、蹄浴剂(hoof bath)等。

在某些实施方式中，本文所述钙结合肽和其它钙结合部分每日应用或频率较低地应用直至获得所需效果。

再矿化

根据治疗条件，本文所述钙结合肽和其它钙结合部分诱导去矿化牙釉质上和去矿化及非去矿化牙本质上的磷酸钙晶体生长。类似地，这些试剂可诱导骨再矿化。因此，在某些实施方式中，包含本文公开的钙结合剂的组合物可通过将自由漂浮磷酸钙颗粒募集至钙化表面而用于增强矿化。这些试剂可结合钙化表面和/或自由漂浮的磷酸钙聚集体。同时结合钙化表面和自由漂浮的聚集体导致钙化表面附近的磷酸钙浓度升高，从而导致该表面再矿化增强。通过调节这些试剂的大小和结合亲和力，可能改变与该表面结合的钙量。在某些实施方式中，牙齿的再矿化导致牙质小管的完全或部分阻塞。

因此，包含本文公开的钙结合肽和其它部分的组合物可用于使牙齿再矿化，防止或减缓牙齿去矿化、治疗牙齿破坏、在牙齿表面或其下形成矿物质层、改变牙齿的矿物质密度，例如增加或降低矿物质密度或密封牙齿部位。类似地，这些组合物可用于治疗骨缺陷、损伤、肿瘤、异常生长、疾病或骨损失，导致骨表面或其下的矿物质层形成，或改变骨的密度，例如通过增加或降低密度。在这些实施方式中，将包含上述一种或多种钙结合剂的组合物应用于受影响的骨部位或附近。在某些实施方式中，包含本文公开的钙结合剂的组合物可用于治疗除骨以外的组织和器官中的钙化、石灰质病损或矿化缺陷，包括动脉斑块。

如实施例6所述，当本文所述的钙结合肽和其它钙结合部分与牙齿脱敏剂/再矿化剂(例如，QUELL

脱敏剂)联用时，可增强去矿化。因此，考虑了其中钙结合肽和其它钙结合部分彼此联用来增强牙齿再矿化和/或脱敏的方法。类似地，考虑了包含一种或多种本文所述钙结合肽和其它钙结合部分及一种或多种脱敏剂/再矿化剂的组合物。在某些实施方式中，所述脱敏剂/再矿化剂包括钙(例如，氯化钙和/或磷酸钾)，但不限于此。示范性的脱敏剂/再矿化剂示于表4。

表4.与本文所述一种或多种钙结合肽和/或钙结合部分联用的示范性而非限制性的脱敏剂/再矿化剂

在某些实施方式中，在诸如牙膏、漱口水、脱敏乳膏、凝胶、糊剂等产品中提供钙结合肽/部分和脱敏剂/再矿化剂。

目前再矿化牙齿表面的方法依赖于用游离或蛋白质结合的钙(例如，游离钙、蛋白质结合钙、氟化钠、氟化亚锡等的制剂)制剂溢满口腔，与之不同的是，这些化合物导致磷酸钙聚集体专门粘附于牙齿表面，因而增加钙和磷的局部浓度并提高该磷酸钙掺入牙齿的去矿化区域的可能性。对钙化组织的损伤或疾病的当前药物治疗依赖于直接(局部)或通过全身性给药，使得感兴趣的治疗性药物的游离溶液围绕所需表面的区域，希望一些部分会与钙化表面相互作用。

与钙化表面/基片相连

在某些实施方式中，包含本文所述钙结合肽和其它钙结合部分的组合物可用作将所需化学部分或颗粒特异性结合于钙化表面，例如骨和牙齿的那些表面的手段。可给钙结合肽和其它钙结合部分提供连接的接头和/或反应活性位点或连接的部分(例如，抗生素、可检测标记物等)，该肽或其它钙结合部分与含钙基片结合提供定位于该位点的反应活性基团，接头以便随后连接于所需效应物，或者感兴趣的效应物连接于钙结合肽或其它部分，藉此将效应物递送至含钙基片。

钙化功能障碍试验

在某些实施方式中，包含本文所述钙结合肽和其它钙结合部分的组合物可用于不适当钙化的原位和体内试验。例如，这些组合物可用于诊断、鉴定、定位或治疗除骨以外的组织和器官中的钙化、石灰质病损或矿化缺陷，包括，例如动脉斑块、肾结石或籽骨。目前用于测定钙化是否存在的试验包括染料结合方法、放射性同位素的掺入、X-射线透射分析和定量化学分析。这些方法各自具有某些缺点。在染料结合方法中，样品接触钙螯合性荧光染料，例如四环素、钙黄绿素或茜素，并目测观察该染料掺入感兴趣组织。虽然染料可在体内引入，但目测观察信号需要切除感兴趣组织。还可采用银离子处理固定组织(von Kossa染色)来鉴定钙化部位，但该方法不能体内应用，且背景染色水平明显。掺入放射性同位素，例如⁴⁵Ca提供关于体内钙化的定位和速度的精确和定量信息，但其缺点在于实验对象接触高水平的电离辐射。X-射线透射分析的空间分辨率高，可在活动物中实现，但不能在X-射线图像中可见的各种其它特征中独特地鉴定钙沉积。钙沉积的体外定量测定化学分析可靠地测定所存在矿物质的类型和量，但这些方法费力，并且丧失关于所涉及组织的定位和结构的许多信息。

钙化组织或区域的目测观察/检测

在某些实施方式中，可荧光标记或以其它方式标记包含本文公开的钙结合肽和其它部分的组合物，将其用作目测观察感兴趣组织中钙化区域的改善方式。与目前可用的方法相比，不难高得率地合成这些试剂，它们的安全性、毒性得到改善且易于使用。可改变这些试剂的序列或组成以改变该试剂对特定组织或表面类型的相对亲和力(例如，如本文实施例中所述)。如此该试剂能区分牙本质、牙釉质、骨和其它钙化组织或表面，以及健康和患病的组织。该特性使得这些化合物可用作钙化组织中损伤或病理损害的探针。这些试剂可单独使用或与其它已知方法联用以便检测钙化。目前可用的钙结合荧光团局限于能螯合钙离子，同时保留它们的荧光的那些，与之相反，本文所述的肽和其它钙结合剂可连接于任何荧光团。如此极大扩充了可用于标记钙化表面的颜色范围，能为各实验精确设计发射波长和检测技术。将这些试剂与荧光、比色、放射性、NMR-活性或其它染料或指示剂偶联并用这些偶联物处理生物学样品，可能在原位和体内定量观察钙化程度而无需固定或在很大程度上扰乱样品。由于它们的特异性高和结合速度快，此类偶联物提供的背景染色低于von Kossa银离子染色方法。可连接于这些钙结合剂的各种标记物为结合条件和检测方法提供了极大的灵活性，从而极大增加可进行的生物学、生物医学、生物技术、环境和其它研究的便利性和质量。

诊断剂

本文所述的肽和其它钙结合部分有很大可能用作诊断剂，因为目前鉴定钙化组织的损伤、感染、肿瘤或其它病损的方法主要依赖于目测或放射性观察，与之不同的是，本文公开的肽可用于检测此类事件而不依赖人眼。本文所述的各种试剂已显示特异性靶向去矿化牙釉质和非去矿化牙本质。具体地说，这些试剂已显示出优先结合龋齿病损的能力。此外，各种变体已显示靶向牙齿结构的精确子部分，例如根尖牙本质、基础牙釉质、罩牙本质、皮层牙釉质和牙釉质表面的能力。可将包含偶联于各种可检测部分，例如荧光、病损、放射性、NMR-活性或其它染料或指示剂的钙结合剂的组合物给予对象以便靶向牙齿的特定部分并鉴定牙齿中表现出去矿化或其它损伤的那些部分。可选择这些试剂的组成，从而可靶向特定类型的组织或组织损伤。利用这些试剂能特异性鉴定受损区域，包括太小从而难以看到或模糊的那些区域，从而极大增加诊断这些病损的便利性和精确性。类似地，在某些实施方式中，包含本文公开的钙结合剂的组合物可用作X-射线、计算机断层摄影术或磁共振成像的造影剂。

靶向部分

在某些实施方式中，包含本文公开的钙结合肽和其它部分的组合物可用于将治疗性化合物靶向骨、牙齿或其它钙化组织的表面。例如，钙结合部分可偶联于抗微生物化合物、骨和牙齿发育调节剂或可连接于该部分的任何其它化合物。可利用治疗性化合物与这些部分之一的偶联将该治疗性化合物定位于钙化表面，从而增加该化合物的局部浓度和增强效力。将化合物定位于感兴趣组织，这些部分降低实现理想效果的所需化合物的浓度。除了改进效力，治疗性化合物特异性靶向感兴趣组织使得非靶向组织免遭该化合物可能的破坏性作用。可调节钙结合部分的组成或长度以特异性靶向组织中受损或患病的区域。

治疗微生物感染

在某些实施方式中，包含本文公开的钙结合部分的组合物可用于治疗微生物感染，例如细菌感染。在这些实施方式中，肽可连接于抗微生物肽，例如2c-4、b-34或PL-135肽(分别见SEQ ID NO：26、30和32，WO2007/038683)或连接于另一抗微生物部分。

根据本文公开的钙结合剂选择性结合钙或磷酸钙的能力，包含这些试剂的组合物可掺入传感器以便检测饮用水、废水、工业溶液、食物、饮料、科研用品或需要测定钙是否存在的任何溶液中的钙。类似地，这些组合物可用于控制，例如工业、制造、医学、科研、家用或个人用品的钙矿物质沉积。此外，这些组合物可用于测定，例如细胞培养物、组织、实验动物、实验人对象或其它科研用品中的各种钙矿物质是否存在或含量。

嵌合构建物

本文公开的钙结合肽和/或肽样钙结合部分可直接或共价或非共价地间接连接于一个或多个偶联物或部分。此类偶联物或部分包括但不限于：其它肽、多肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、有机化合物、无机化合物、有机金属化合物、治疗性部分，例如抗癌或抗微生物剂。可连接于本文公开的钙结合肽的偶联物或部分的其它例子包括可检测标记，例如荧光团、生色团、亲和力标签、放射性标记物或自旋标记物。此外，可用，例如放射性或NMR-活性同位素替代钙结合肽或连接的偶联物或部分中的一个或多个原子。

钙结合剂和偶联物或部分之间的连接可发生在肽的氨基末端、肽的羧基末端或通过肽的内部位点或通过非肽钙结合剂上的便利基团。在某些实施方式中，所述试剂可经氨基酸接头，例如三甘氨酸接头序列或非氨基酸接头连接于偶联物或部分。示范性的合适接头示于表3。

化学偶联

通过将一个或多个本文所述钙结合肽或其它部分连接于一个或多个效应物来形成嵌合部分。在某些实施方式中，所述Ca结合部分通过天然产生的反应性基团直接连接于效应物，或者可功能化靶向部分和/或效应物以提供此类反应性基团。

在各种实施方式中，Ca结合部分通过一种或多种连接剂连于效应物。因此，在各种实施方式中，Ca结合部分和效应物经一种连接试剂或多种连接试剂偶联。例如，Ca结合部分和效应物可经一种多功能(例如，二、三或四-)连接剂或一对互补的连接试剂偶联。在另一实施方式中，Ca结合部分和效应物经两种、三种或更多连接剂偶联。合适的连接剂包括但不限于，例如官能团、亲和试剂、稳定基团和它们的组合。

在某些实施方式中，连接剂是或包含官能团。官能团包括含有反应性基团的单功能接头和含有两个或更多个能与两个或更多个不同功能靶标(例如，标记物、蛋白、大分子、半导体纳米晶体或基材)形成键的反应性基团的多功能交联剂。在一些优选的实施方式中，所述多功能交联剂是包含两种或更多种不同反应性基团的异质双功能交联剂。

合适的反应性基团包括但不限于：硫醇(-SH)、羧酸酯基(COOH)、羧基(-COOH)、羰基、胺(NH₂)、羟基(-OH)、醛(-CHO)、醇(ROH)、酮(R₂CO)、活性氢、酯、巯基(SH)、磷酸酯基(-PO₃)或光反应性部分。胺反应性基团包括但不限于：例如，异硫氰酸酯、异氰酸酯、酰基、叠氮化物、NHS酯、磺酰氯、醛和乙二醛、环氧化物和环氧乙烷、碳酸酯、芳基化试剂、亚胺酯、碳二亚胺和酐。硫醇反应性基团包括但不限于：例如卤代乙酰基和烷基卤衍生物、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基衍生物、芳基化试剂和硫醇-二硫键交换试剂。羧酸酯反应性基团包括但不限于：例如，重氮烷和重氮乙酰基化合物，例如羰二咪唑和碳二亚胺。羟基反应性基团包括但不限于：例如环氧化物和环氧乙烷、羰二咪唑、用高碘酸盐氧化、N，N′-二琥珀酰亚胺碳酸酯或N-羟基琥珀酰亚胺氯甲酸酯、酶促氧化、烷基卤和异氰酸酯。醛和酮反应性基团包括但不限于：例如，用于希夫碱形成或还原胺化的肼衍生物。活性氢反应性基团包括但不限于：例如用于曼尼希缩合和碘化反应的重氮衍生物。光反应性基团包括但不限于：例如芳基叠氮化物和卤化芳基叠氮化物、二苯甲酮、重氮化合物和重氮甲烷衍生物。

可用于形成嵌合部分的其它合适反应性基团和反应类别包括生物偶联物化学领域熟知的反应性基团和反应类别。目前可用反应性螯合剂的优选反应类别是在相对温和条件下进行。这些包括但不限于：亲核取代(例如，胺和醇与酰基卤化物、活性酯的反应)、亲电取代(例如，烯胺反应)和碳-碳和碳-杂原子多键加成(例如，迈克尔反应(Michael reaction)、狄尔斯-阿德尔加成(Diels-Alder addition))。这些和其它可用的反应讨论于，例如March(1985)《高级有机化学》(Advanced Organic Chemistry)，第三版.，约翰韦利父子公司(John Wiley & Sons)，纽约；Hermanson(1996)《生物偶联技术》(Bioconjugate Techniques)，学术出版社(Academic Press)，圣迭戈；和Feeney等.(1982)《蛋白质修饰；化学进展丛书》(Modification of Proteins；Advances inChemistry Series)，第198卷，美国化学协会(American Chemical Society)，华盛顿，哥伦比亚特区。

在某些实施方式中，连接剂包括螯合剂。例如，包含分子DOTA(DOTA＝1，4，7，10-四(羧基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷)的螯合剂易用放射性标记物，例如Gd³⁺和⁶⁴Cu作标记，从而分别得到连接于Ca结合部分的Gd³⁺-DOTA和⁶⁴Cu-DOTA。本领域技术人员已知其它合适的螯合剂，例如最常用的1，4，7-三氮杂环壬烷-N，N′，N″-三乙酸(NOTA)衍生物(参见，例如Lee等.(1997)NuclMed Biol.24：2225-23019)。

本文所用的“接头”或“连接剂”是用于连接两个或更多个分子的分子。在某些实施方式中，接头通常能形成连接两个分子(例如，Ca结合部分和效应物)的共价键。本领域技术人员熟知合适的接头，包括但不限于直链或支链碳接头、杂环碳接头或肽接头。在某些实施方式中，接头可通过它们的侧链连接于组成氨基酸(例如，通过二硫键连接于半胱氨酸)。然而，在某些实施方式中，接头连接于末端氨基酸的α碳氨基和羧基。

双功能接头具有与一种分子(例如，Ca结合肽)上某基团和另一分子(例如，抗微生物肽)上的另一基团具有反应性的官能团，此类接头可用于形成所需偶联物。或者，可进行衍生以提供官能团。因此，例如，还知道在肽上产生游离巯基的方法(参见美国专利号4,659,839)。

在某些实施方式中，连接剂是包含两个或更多个不同反应性基团的异双功能交联剂，所述基团形成能与肽相互作用的杂环。例如，异双功能交联剂，例如半胱氨酸可包含胺反应性基团且硫醇反应性基团可与衍生肽上的醛相互作用。适合异双功能交联剂的其它反应性基团组合包括，例如胺-和巯基反应性基团；羰基和巯基反应性基团；胺和光反应性基团；巯基和光反应性基团；羰基和光反应性基团；羧酸酯和光反应性基团；精氨酸和光反应性基团。在一个实施方式中，异双功能交联剂是SMCC。

已知将各种分子连接于肽或蛋白质的许多方法和接头分子(参见，例如欧洲专利申请号188,256；美国专利号4,671,958；4,659,839；4,414,148；4,699,784；4,680,338；4,569,789；和4,589,071；和Borlinghaus等.(1987)Cancer Res.47：4071-4075)。示范性连接方案见本文的实施例2和3。示范性的合适接头包括但不限于表3所示那些。

融合蛋白

在某些实施方式中，如果Ca结合部分和效应物均是肽或均包含肽，嵌合部分可以化学合成或重组表达为融合蛋白(即，嵌合融合蛋白)。

在某些实施方式中，采用重组DNA方法合成嵌合融合蛋白。这通常涉及产生编码该融合蛋白的DNA序列，将该DNA置于表达盒中特定启动子的控制下，在宿主中表达该蛋白，分离表达的蛋白，如需要，使该蛋白复性。

可通过任何合适的方法制备编码融合蛋白的DNA，包括例如合适序列的克隆和限制性(酶切)，或通过例如以下所述的方法直接化学合成：Narang等.(1979)Meth.Enzymol.68：90-99磷酸三酯方法；Brown等.(1979)Meth.Enzymol.68：109-151的磷酸二酯方法；Beaucage等.(1981)Tetra.Lett.，22：1859-1862的二乙基亚磷酰胺方法；和美国专利号4,458,066的固体支持物方法。

化学合成产生单链寡核苷酸。可通过与互补序列杂交或用该单链作为模板通过DNA聚合酶聚合将其转化成双链DNA。技术人员应知道虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，可通过连接较短序列得到较长序列。

或者，可克隆子序列，利用合适的限制性酶切割适当子序列。然后可连接所述片段以产生所需DNA序列。

在某些实施方式中，可采用DNA扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)克隆编码本发明融合蛋白的DNA。因此，例如编码Ca结合部分的核酸可利用含有NdeI的限制性位点的有义引物和含有HindIII的限制性位点的反义引物作PCR扩增。如此产生编码Ca结合序列并具有末端限制性位点的核酸。类似地，可提供具有互补限制性位点的一种和/或几种效应物/接头/间隔区。将序列连接和插入载体产生编码融合蛋白的载体。

虽然Ca结合部分和效应物可直接连接在一起，技术人员应理解可通过一个或多个氨基酸构成的肽间隔区/接头将其分开。除了连接蛋白质或保留它们之间的一定最短距离或其它空间关系外，间隔区通常不具有特定的生物学活性。然而，可选择间隔区的组成氨基酸以影响该分子的某些特性，例如折叠、净电荷或疏水性。

可在各种宿主细胞中表达编码融合蛋白的核酸序列，所述宿主细胞包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母菌和各种高级真核细胞，如COS、CHO和HeLa细胞系及骨髓瘤细胞系。重组蛋白基因可操作性连接于各宿主的合适表达控制序列。对于大肠杆菌，这包括启动子，例如T7、trp或λ启动子，核糖体结合位点，优选转录终止信号。对于真核细胞，控制序列包括启动子，优选包括衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨细胞病毒等的增强子和聚腺苷酸序列，还可包括剪接供体和受体序列。

可通过熟知方法，例如用于大肠杆菌的氯化钙转化和磷酸钙处理或用于哺乳动物细胞的电穿孔将质粒转移入选择的宿主细胞。可通过质粒所含基因，例如amp、gpt、neo和hyg基因赋予的抗生素耐受性来选择质粒转化的细胞。

一旦表达，可按照本领域的标准方法纯化重组融合蛋白，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(通常参见，R.Scopes(1982)《蛋白质纯化》(Protein Purification)，S-V公司，纽约；Deutscher(1990)《酶学方法》(Methods in Enzymology)第182卷：蛋白质纯化指南(Guide to ProteinPurification).，学术出版社.纽约)。优选具有至少约90到95％均质的基本纯的组合物，98到99％或更高的均质对于药物应用是最优选的。一旦纯化(视需要部分纯化或纯化至均质)，可治疗性使用多肽。

本领域技术人员知道在化学合成、生物学表达或纯化后，融合蛋白具有的构象可能基本上不同于组成型多肽的天然构象。在此情况中，可能需要使多肽变性和还原，然后使得该多肽重折叠成优选的构象。本领域技术人员熟知使蛋白还原和变性以及诱导重折叠的方法(参见，Debinski等.(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；和Buchner等，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。

技术人员知道可对融合蛋白进行修饰而不损害其生物学活性。可作出某些修饰以促进Ca结合分子的克隆、表达或掺入融合蛋白。本领域技术人员熟知此类修饰，包括例如在氨基末端添加甲硫氨酸以提供起始位点，或在任一末端放置附加氨基酸以产生方便定位的限制性位点或终止密码子。

如上所述，在各种实施方式中，肽接头/间隔区用于连接一个或多个Ca结合部分与一个或多个效应物。在各种实施方式中，所述肽接头较短，通常短于约10氨基酸，优选至少约8个氨基酸和更优选约3-约5个氨基酸。合适的示范性接头包括但不限于上表3所示的各种肽接头。

给药和制剂

在某些实施方式中，将本文所述的钙结合剂和/或包含此类部分的嵌合构建物(例如，连接于抗微生物肽、可检测标记物的钙结合部分，等等)给予需要其的哺乳动物、细胞、组织、组合物(例如，食物)等。在各种实施方式中，可给予组合物以检测和/或定位和/或定量异常钙化和/或去矿化等是否存在。在各种实施方式中，可给予所述组合物以抑制毛发脱落和/或诱导毛发生长和/或增加甲生长或修复、蹄生长或修复、角生长或修复，等等。

可以“天然”形式，或者如果需要，以盐、酯、酰胺、前药、衍生物等形式给予这些活性试剂(钙结合部分和/或钙结合肽和/或包含连接于一个或多个效应物(例如，可检测标记物、抗微生物剂，等)的钙结合部分和/或钙结合肽的嵌合构建物)，只要所述盐、酯、酰胺、前药或衍生物在药学上合适，即，在本发明方法中有效。可采用合成有机化学领域技术人员已知和例如March(1992)高级有机化学；反应、机理和结构(Advanced OrganicChemistry；Reactions，Mechanisms and Structure)，第4版.纽约.WI公司(Wiley-Interscience)所述的标准方法制备活性剂的盐、酯、酰胺、前药和其它衍生物。

本领域技术人员已知配制此类衍生物的方法。例如，许多递送试剂的二硫化物盐描述于PCT公布WO 2000/059863。类似地，可采用通常涉及与合适酸反应的常规方法从游离碱制备治疗肽、拟肽或其它模拟物的酸性盐。通常将碱性形式的药物溶解于极性有机溶剂，例如甲醇或乙醇，并向其中加入酸。通过加入较低极性溶剂使得到的盐从溶液沉淀或析出。制备酸加成盐的合适酸包括但不限于：有机酸，例如乙酸、丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对-甲苯磺酸、水杨酸等，以及无机酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可用合适的碱处理将酸加成盐再转化成游离碱。本文活性剂的某些特别优选的酸加成盐包括卤化物盐，例如可利用盐酸或氢溴酸制备。相反，可利用药学上可接受的碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、三甲胺等，以相似方式制备本发明活性剂的碱性盐制品。在某些实施方式中，碱性盐包括碱金属盐，例如钠盐和铜盐。

为制备盐形式的碱性药物，抗衡离子的pKa优选比该药物的pKa低至少约2pH。类似地，为制备盐形式的酸性药物，抗衡离子的pKa优选比该药物的pKa高至少约2pH。如此，抗衡离子使得溶液的pH水平低于实现盐高台(salt plateau)的pHmax，此时盐的溶解度超过游离酸或碱的溶解度。活性药物成分(API)和酸或碱中可电离基团的pKa单位差异的准则表示在能量上有利于质子转移。当API和抗衡离子的pKa没有显著差异时，可形成固体复合物，但在水环境中可快速丧失比例(即，分解成药物和抗衡离子的各实体)。

抗衡离子优选药学上可接受的抗衡离子。合适的阴离子盐形式包括但不限于：乙酸盐、苯甲酸盐、苄化盐、酒石酸氢盐、溴化物、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯月桂硫酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、碘化物、乳酸盐、乳糖醛酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、巴莫酸盐(双羟萘酸盐)、磷酸盐和二磷酸盐、水杨酸盐和双水杨酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、甲苯磺酸盐、三乙基碘化物、戊酸盐等，而合适的阳离子盐形式包括但不限于：铝、苄星青霉素、钙、乙二胺、赖氨酸、镁、葡甲胺、钾、普鲁卡因、钠、缓血酸胺、锌等。

在各种实施方式中，制备酯通常包括功能化存在于活性剂分子结构内的羟基和/或羧基。在某些实施方式中，酯通常是游离醇基的酰基取代衍生物，即，衍生自式RCOOH所示羧酸的部分，其中R是烷基，优选低级烷基。如果需要，可采用常规氢解或水解方法将酯再转化为游离酸。

还可采用本领域技术人员已知或相关文献描述的技术制备酰胺。例如，可利用合适的胺反应物从酯制备酰胺，或者可通过与铵或低级烷基胺反应从酸酐或酰氯制备酰胺。

在各种实施方式中，本文鉴定的活性剂可用于胃肠外、局部、皮肤、真皮内、皮下、口服、鼻部(或者其它方式吸入)、肺部、直肠或其它局部给药，例如通过气溶胶或经皮给药以便诱导钙化和/或甲生长和/或毛发生长和/或递送效应物至钙化或缺陷性钙化的部位。可根据给药方法给予各种单位剂型的组合物。合适的单位剂型包括但不限于：粉末、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂、贴剂、鼻喷雾剂、注射剂、可植入缓释制剂、脂质复合物等。

本文所述的活性剂(例如，钙结合剂和/或嵌合构建物)还可与药学上可接受的载体(赋形剂)组合以形成药物组合物。药学上可接受的载体可含有用于，例如稳定组合物或增加或降低活性剂吸收的一种或多种生理学上可接受的化合物。生理学上可接受的化合物可包括，例如碳水化合物如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖，抗氧化剂如抗坏血酸或谷胱甘肽，螯合剂，低分子量蛋白质，保护和摄取增强剂如脂质，表面活性剂，降低活性剂清除或水解的组合物，或赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。

其它生理学上可接受的，特别是用于制备片剂、胶囊、胶帽等的化合物包括但不限于粘合剂、稀释剂/填充剂、崩解剂、润滑剂、悬浮剂等。

在某些实施方式中，为制备口服剂型(例如，片剂)，可将例如赋形剂(例如，乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇等)、任选的崩解剂(例如，碳酸钙、羧甲基纤维素钙、淀粉乙醇酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮等)、粘合剂(例如，α-淀粉、阿拉伯胶、微晶纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、环糊精等)、和任选的润滑剂(例如，滑石粉、硬脂酸镁、聚乙二醇6000，等)加入一种或多种活性组分(例如，活性剂)，并压缩得到的组合物。如果需要，可包衣所压缩的产品，例如用于遮蔽味道或肠溶或缓释的已知方法。合适的包衣材料包括但不限于：乙基纤维素、羟甲基纤维素、聚乙二醇、乙酸邻苯二甲酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素和Eudragit(德国罗姆哈斯公司(Rohm & Haas)；甲基丙烯酸-丙烯酸共聚物)。

其它生理学上可接受的化合物包括湿润剂、乳化剂、分散剂或防腐剂，尤其是可用于防止微生物生长或作用。各种防腐剂是熟知的，包括例如苯酚和抗坏血酸。本领域技术人员应知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于，例如活性剂的给药途径和活性剂的具体理化性质。

在某些实施方式中，赋形剂是无菌的，通常没有不需要的物质。可通过常规的熟知灭菌技术消毒这些组合物。对于各种口服剂型赋形剂，例如片剂和胶囊，无需灭菌。USP/NF标准通常足矣。

在某些治疗性应用中，给予本发明组合物，例如局部给予、经皮给予(例如，以诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落)，给予量足以防止和/或治愈和/或至少部分防止或停止疾病和/或其并发症。足以实现该目的的用量定义为“治疗有效剂量”。该用途的有效量取决于该疾病的严重性和患者的总体健康状况。根据所需和患者耐受的剂量和频率，可一次或多次给予组合物。在任何情况中，组合物应提供充足量的本发明制剂的活性剂以有效治疗患者(缓解其中的一种或多种症状)。

活性剂的浓度可以极为不同，主要基于活性成分的活性、体重等，根据所选具体给药方式和患者的需要作出选择。然而，通常选择浓度以提供约0.1或1毫克/千克/天到约50毫克/千克/天的剂量，有时更高。典型的剂量范围是约3毫克/千克/天到约3.5毫克/千克/天，优选约3.5毫克/千克/天到约7.2毫克/千克/天，更优选约7.2毫克/千克/天到约11.0毫克/千克/天，最优选约11.0毫克/千克/天到约15.0毫克/千克/天。在某些优选的实施方式中，剂量为约10毫克/千克/天到约50毫克/千克/天。在某些实施方式中，剂量为约20毫克到约50毫克，每日口服给予两次。应该理解，可调节此类剂量以优化具体对象或对象组中的治疗和/或预防方案。

在某些实施方式中，将本发明活性剂给予至口腔。利用牙膏、漱口水、锭剂、气溶胶喷雾、粘附于牙齿的条带(例如，增白条带)、包被的拭子、凝胶、指甲油、快速溶解的条带(例如，减轻口腔疼痛的条带(如ORAFILM

)、呼吸清新条带、抗组胺条带)等不难实现该目的。

在某些实施方式中，将本发明活性剂局部给予至，例如皮肤表面、局部病损或伤口、外科手术部位、外科手术植入物等。

在某些实施方式中，根据本领域技术人员熟知的标准方法全身性给予(例如，口服或作为注射剂)本发明活性剂。在其它优选的实施方式中，还可利用常规经皮药物递送系统，即，经皮“贴剂”递送药剂，其中活性剂通常包含在用作药物递送装置的分层结构内以便贴合于皮肤。在此类构造中，药物组合物通常包含在上部背衬层下的某层或“储器”中。应该知道，此处的术语“储器”指最终可用于递送至皮肤表面的一定量“活性成分”。因此，例如，“储器”可包含贴剂背衬层上的粘合剂中，或在本领域技术人员已知的各种不同基质配方中的活性成分。贴剂可包含一个储器或可包含多个储器。

在一个实施方式中，储器包含药学上可接受接触粘合材料的聚合基质，所述材料用于在药物递送期间将该系统贴合于皮肤。合适的皮肤接触粘合材料的例子包括但不限于：聚乙烯、聚硅氧烷、聚异丁烯、聚丙烯酸酯、聚氨酯等。或者，含有药物的储器和皮肤接触粘合剂存在于隔开和不同的层，其中粘合剂在储器以下，在该情况中，其可以是上述聚合基质或可以是液体或水凝胶储器，或可采取某些其它形式。这些层中用作装置上表面的背衬层优选起到“贴剂”的主要结构元件的作用并为装置提供大量灵活性。选择的背衬层材料优选基本上不透过存在的活性剂和任何其它材料。

用于局部递送的其它制剂包括但不限于：软膏、凝胶、喷雾剂、液体和乳膏。软膏是通常基于矿脂或其它石油衍生物的半固体制品。含有所选活性剂的乳膏一般是各种粘液或半固体乳液，常是水包油或油包水。乳膏基料通常是水溶性的，含有油相、乳化剂和水相。油相有时也称为“内部”相，其通常由矿脂和脂肪醇，例如鲸蜡醇或硬脂醇构成；水相体积通常大于油相，但不一定，且通常含有润湿剂。乳膏制剂中的乳化剂通常是非离子型、阴离子型、阳离子型或两性表面活性剂。本领域技术人员应该知道，所用的特定软膏或乳膏基料能提供最佳药物递送。与其它载体或运载体一样，软膏基料应是惰性、稳定、无刺激性和非致敏的。

如上所示，还包括各种口腔含化和舌下制剂。

在某些实施方式中，提供的一种或多种本发明活性剂可以是“浓缩物”，例如在储存容器中(例如，预定体积)以便稀释，或在可溶胶囊中以便加入一定体积的水、醇、过氧化氢或其它稀释剂。

B)纳米乳液制剂

在某些实施方式中，本文所述的钙结合部分和/或钙结合肽和/或嵌合部分配制成纳米乳液。纳米乳液包括但不限于水包油(O/W)纳米乳液和油包水(W/O)纳米乳液。纳米乳液可定义为平均液滴直径为约20到约1000nm的乳液。平均液滴大小通常在约20nm或50nm和约500nm之间。术语亚微米乳液(SME)和迷你乳液作为同义词使用。

示范性水包油(O/W)纳米乳液包括但不限于：

表面活性剂胶束-由小分子表面活性剂或洗涤剂组成的胶束(例如，SDS/PBS/2-丙醇)，主要适合于疏水性肽。

聚合物胶束-由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂组成的胶束(例如，Pluronic L64/PBS/2-丙醇)，主要适合于疏水性肽；

混合胶束：其中有超过一种表面活性剂组分或其中液相之一(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束形成的胶束(例如，辛酸/PBS/EtOH)，主要适合于疏水性肽；

整体肽胶束-混合胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，从而形成胶束主要部分(例如，两性肽/PBS/矿物油)，主要适合于两性肽；和

皮克林(固相)乳液-其中肽与固体纳米颗粒的外部相连的乳液(例如，聚苯乙烯纳米颗粒/PBS/非油相)，主要适合于两性肽。

示范性水包油(W/O)纳米乳液包括但不限于：

表面活性剂胶束-由小分子表面活性剂或洗涤剂组成的胶束(例如，磺基琥珀酸二辛酯/PBS/2-丙醇)，主要适合于亲水性肽；

聚合物胶束-由聚合物、共聚物或嵌段共聚物表面活性剂组成的胶束(例如，PLURONIC

L121/PBS/2-丙醇)，主要适合于亲水性肽；

混合胶束--其中有超过一种表面活性剂组分或其中液相之一(通常是醇或脂肪酸化合物)参与胶束形成的胶束(例如，癸酸/辛酸甘油二酯/PBS/EtOH)，主要适合于亲水性肽；

整体肽胶束-混合胶束，其中肽用作辅助表面活性剂，从而形成胶束主要部分(例如，两性肽/PBS/聚丙二醇)，主要适合于两性肽；和

皮克林(固相)乳液-其中肽与固体纳米颗粒的外部相连的乳液(例如，壳聚糖纳米颗粒/非水相/矿物油)，主要适合于两性肽。

如上所述，在某些实施方式中，纳米乳液包含一种或多种表面活性剂或洗涤剂。在一些实施方式中，表面活性剂是非阴离子洗涤剂(例如，聚山梨醇酯表面活性剂、聚氧乙烯醚等)。可用于本发明的表面活性剂包括但不限于表面活性剂，例如TWEEN

TRITON

和TYLOXAPOL

家族化合物。

在某些实施方式中，乳液还包含一种或多种含阳离子卤素的化合物，包括但不限于氯化十六烷基吡啶。在进一步的实施方式中，所述组合物还包含增加组合物与微生物的相互作用(“相互作用增强剂”)的一种或多种化合物(例如，螯合剂，如缓冲液中的乙二胺四乙酸，或亚乙基双(氧亚乙基次氨基)四乙酸)。

在一些实施方式中，纳米乳液还包含乳化剂以促进乳液形成。乳化剂包括在油/水界面聚集的化合物，以形成防止毗邻的两液滴直接接触的一类连续膜。本发明的某些实施方式的特征在于水包油乳液组合物可用水稀释至所需浓度而不损害其它们的特性(例如，钙结合、毛发或甲生长诱导/加速，等等)。

除了分散在水相中的离散油滴外，某些水包油乳液还可含有其它脂质结构，例如小的脂质囊泡(例如，常由几个基本上同心的脂双层组成的脂质球，这些脂双层由水相层彼此隔开)、胶束(例如，两性分子，50-200个分子的小簇，它们排列成极性头对外朝向水相，而非极性尾朝内与水相隔绝)、或薄层相(其中各颗粒由平行两性双层组成的液体分散体，所述双层由水薄膜隔开)。

疏水作用力驱动非极性残基(例如，长烃链)远离水，从而形成这些脂质结构。通常将以上脂质制品描述成表面活性剂脂质制品(SLP)。SLP对粘膜的毒性极低，认为其在小肠内代谢(参见，例如Hamouda等.，(1998)J.Infect.Disease 180：1939)。

在某些实施方式中，乳液包含分布在水相中的不连续油相，包含醇和/或甘油的第一组分和包含表面活性剂或含卤素化合物的第二组分。水相可包含任何类型的水相，包括但不限于水(例如，去离子水、蒸馏水、自来水)和溶液(例如，磷酸缓冲盐水或其它缓冲液系统)。油相可包含任何类型的油，包括但不限于：植物油(例如，大豆油、鳄梨油、亚麻子油、椰油、棉籽油、角鲨烯油、橄榄油、芸苔油、玉米油、菜籽油、红花油和葵花子油)、动物油(例如，鱼油)、调味油、水不溶性维生素、矿物油和机油。在某些实施方式中，油相包含30-90体积％的水包油乳液(即，占最终乳液总体积的30-90％)，更优选50-80％。

在某些实施方式中，如果存在醇，其是乙醇。

虽然本发明不限于表面活性剂的性质，但在一些优选的实施方式中，表面活性剂是聚山梨醇酯表面活性剂(例如，TWEEN 20

TWEEN 40

TWEEN 60和TWEEN 80)、苯氧基聚乙氧基乙醇(例如，TRITON

X-100、X-301、X-165、X-102和X-200及TYLOXAPOL

)或十二烷基硫酸钠等。

在某些实施方式中，存在含卤素的组分。含卤素化合物的性质，在一些优选的实施方式中，含卤素的化合物包含氯化物盐(例如，NaCl、KCl等)、卤化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基卤化铵、十六烷基二甲基乙基卤化铵、十六烷基二甲基苄基卤化铵、十六烷基三丁基卤化鏻、十二烷基三甲基卤化铵、十四烷基三甲基卤化铵、氯化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基氯化铵、十六烷基苄基二甲基氯化铵、溴化十六烷基吡啶、十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基二甲基乙基溴化铵、十六烷基三丁基溴化鏻、十二烷基三甲基溴化铵、十四烷基三甲基溴化铵等。

在某些实施方式中，乳液包含季铵化合物。季铵化合物包括但不限于：N-烷基二甲基苄基糖精铵、1，3，5-三嗪-1，3，5(2H，4H，6H)-三乙醇；癸基磺基甜菜碱(1-Decanaminium)、N-癸基-N，N-二甲基-，氯化物(或)二癸基二甲基氯化铵；2-(2-(对-(二异丁基)甲苯氧基乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；2-(2-(对-(二异丁基)苯氧基)乙氧基)乙基二甲基苄基氯化铵；氯化烷基1或3苄基-1-(2-羟乙基)-2-咪唑啉；烷基二(2-羟乙基)苄基氯化铵；烷基脱甲基(demethyl)苄基氯化铵；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(100％C12)；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(50％C14、40％C12、10％C16)；烷基二甲基3，4-二氯苄基氯化铵(55％C14、23％C12、20％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(100％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(41％C14、28％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(47％C12、18％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(55％C16、20％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(58％C14、28％C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(60％C14、25％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C11、23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(61％C12、23％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(65％C12、25％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12、24％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(67％C12、25％C14)；烷基二甲基苄基氯化铵(90％C14、5％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(93％C14、4％C12)；烷基二甲基苄基氯化铵(95％C16、5％C18)；烷基二甲基苄基氯化铵(和)二癸基二甲基氯化铵；烷基二甲基苄基氯化铵(在脂肪酸中)；烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C16)；烷基二甲基苄基氯化铵(C12-C18)；烷基二甲基苄基和二烷基二甲基氯化铵；烷基二甲基二甲基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基溴化铵(90％C14、5％C16、5％C12)；烷基二甲基乙基溴化铵(在大豆油的脂肪酸中混合烷基和烯基)；烷基二甲基乙基苄基氯化铵；烷基二甲基乙基苄基氯化铵(60％C14)；烷基二甲基异丙基苄基氯化铵(50％C12、30％C14、17％C16、3％C18)；烷基三甲基氯化铵(58％C18、40％C16、1％C14、1％C12)；烷基三甲基氯化铵(90％C18、10％C16)；烷基二甲基(乙基苄基)氯化铵(C12-18)；二-(C8-10)-烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基二甲基氯化铵；二烷基甲基苄基氯化铵；二癸基二甲基氯化铵；二异癸基二甲基氯化铵；二辛基二甲基氯化铵；十二烷基二(2-羟乙基)辛基氢氯化铵；十二烷基二甲基苄基氯化铵；十二烷基氨甲酰基甲基二甲基苄基氯化铵；氯化十七烷基羟基乙基咪唑啉；六氢-1，3，5-三(2-羟乙基)-s-三嗪；肉豆蔻基苄基二甲基氯化铵(和)Quat RNIUM 14；N，N-二甲基-2-羟丙基氯化铵聚合物；n-烷基二甲基苄基氯化铵；n-烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵一水合物；辛基癸基二甲基氯化铵；辛基十二烷基二甲基氯化铵；辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵；氧基二亚乙基二(烷基二甲基氯化铵)；季铵化合物、二椰油基烷基二甲基、氯化物；三甲氧基甲硅烷基丙基二甲基十八烷基氯化铵；三甲氧基甲硅烷季铵化乙烯吡咯烷酮聚合物、三甲基十二烷基苄基氯化铵；n-十二烷基二甲基乙基苄基氯化铵；n-十六烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基苄基氯化铵；n-十四烷基二甲基乙基苄基氯化铵；和n-十八烷基二甲基苄基氯化铵。

本领域技术人员熟知纳米乳液制剂及其制备方法，其描述于例如美国专利号：7,476,393、7,468,402、7,314,624、6,998,426、6,902,737、6,689,371、6,541,018、6,464,990、6,461,625、6,419,946、6,413,527、6,375,960、6,335,022、6,274,150、6,120,778、6,039,936、5,925,341、5,753,241、5,698,219、d5,152,923和Fanun等.(2009)《微乳液：特性和应用(表面活性剂科学)》(Microemulsions：Properties and Applications(Surfactant Science))，CRC出版社，保拉拉屯，佛罗里达州。

C)优化活性的制剂

在某些实施方式中，选择制剂以优化本文所述钙结合部分、钙结合肽和/或嵌合部分的结合特异性和/或结合亲合力和/或稳定性/构象和/或递送/活性。在某些实施方式中，合适的制剂包括但不限于以下：

对于注射，将钙结合部分和/或钙结合肽(例如，4DSS、6DSS、8DSS、10DSS、(D)-4DSS、(D)-6DSS、(D)-8DSS、(D)-10DSS，等等)溶解/混合在无菌蒸馏水、盐水溶液或林格液中，将pH调节至约pH 4到约pH 8，或约pH 4.6到约pH 7.9，或大致中性的pH(例如，pH 7.3)。在某些实施方式中，所述钙结合肽和/或钙结合部分的存在浓度是约0.4或约1mg/mL到约500mg/mL，或约10mg/mL到约100mg/mL，或约25mg/mL到约75mg/mL，在某些实施方式中，约40-50mg/mL。在示范性的实施方式中，所述肽溶解/混合在无菌蒸馏水中，浓度为46.7mg/mL，用5M NaOH将pH调节为7.3。

示范性局部制剂包括但不限于：

1)DMSO配制的包含(或基本上由其构成)钙结合肽(例如，4DSS，6DSS，8DSS，10DSS，(D)-4DSS，(D)-6DSS，(D)-8DSS，(D)-10DSS，等)和/或钙结合部分的制剂的存在浓度是约0.4或约1mg/mL到约500mg/mL，或约10mg/mL到约100mg/mL，或约25mg/mL到约75mg/mL，或约40-50mg/mL，或约0.466mg/mL到约46.7mg/mL。

2)包含以下(或基本上由其构成)的乳液：

a)药学上可接受的缓冲溶液配制的约1％到约80％，或约1％到约50％，或约1％到约20％的钙结合部分和/或钙结合肽的溶液、悬液或混合物，pH为约pH 4到约pH 8，或约pH 4.6到约pH 7.9，或约pH 5或6到约pH 7.9；

b)约1％到约60％，约50％，或约40％Pluronic(普罗尼克)17R4，22R4，25R4，L62，L63，L64，P65，P75，P84，P85 F68，F77，F87，相当的嵌段共聚物；和

c)余量或实质性余量的醇(例如，2-丙醇、乙醇、丙醇或类似的醇)。通常分别制备肽溶液和普罗尼克溶液，然后混合。一种示范性制剂包含10％的46.7mg/mL(D)-8DSS的无菌蒸馏水溶液，用5M NaOH调节pH至7.0，悬浮在10％普罗尼克17R4(聚(丙二醇)-嵌段-聚(乙二醇)-嵌段-聚(丙二醇)；BASF，弗洛哈姆帕克(Florham Park)，新泽西州)的2-丙醇溶液中。

3)包含以下(或基本上由其构成)的乳液：

b)约1％到约60％，约50％，或约40％的磺基琥珀酸二辛酯、卵磷脂、肉豆蔻酸异丙酯或相当的能形成油包水乳液的表面活性剂；和

c)余量或实质性余量的醇(例如，2-丙醇、乙醇、丙醇或类似的醇)。通常分别制备肽溶液和表面活性剂溶液，然后混合。一种示范性制剂包含10％的46.7mg/mL(D)-8DSS的无菌蒸馏水溶液，用5M NaOH调节pH至7.0，悬浮在17.8％磺基琥珀酸二辛酯的2-丙醇溶液中。

4)乳液(2)和/或(3)，还掺入了1-50％、1-30％或1-20％软化剂(例如，一种或多种选自下组的软化剂：丙三醇、甘油、单油酸甘油酯、迪普罗贝斯(diprobase)、真芦荟、霍霍巴油、甘油、维生素A(例如，视黄基、视黄酸、棕榈酸盐、视黄醛、维甲酸和异维甲酸，等)、三乙醇胺、维生素E、大豆油、鳄梨油、椰油，等)。

5)包含0.00001-30％，或0.00001-20％，或0.00001-10％(w/v)钙结合部分和/或钙结合肽的组合物，所述钙结合部分和/或钙结合肽连接于磷酸钙(包括羟基磷灰石、β磷酸三钙、磷酸八钙或其它磷酸钙形式)纳米或微米颗粒(平均粒径为1nm-400nm、或1nm-1μm、或1nm-1,000μm)，悬浮在药学上可接受的载体中(包括但不限于异丙醇、缓冲盐水溶液、乳液等)。

虽然根据人中的应用描述了本文所述的方法和组合物，但它们还适合动物，例如兽医学应用。因此，某些合适的生物包括但不限于：人、非人灵长类、犬、马、猫、猪、有蹄类、兔类动物等。

前述制剂和给药方法应是说明性而非限制性的。应该知道，利用本文提供的教导，不难设计其它合适的制剂和给药方式。

试剂盒

在另一实施方式中，本发明提供用于诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落、检测异常钙化和/或去矿化、诱导再矿化等的试剂盒。所述试剂盒通常包括装有本文所述一种或多种活性剂(即，钙结合剂和/或嵌合部分)的容器。在某些实施方式中，可以单位剂量制剂(例如，栓剂、片剂、囊片、贴剂等)提供活性剂，和/或可任选与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。

此外，所述试剂盒任选包括标记和/或使用说明材料，为实施本发明方法或本发明“治疗剂”或“预防剂”或检测试剂的应用提供指导(即，操作方法)。某些使用说明材料描述了应用一种或多种本发明活性剂以诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落、检测异常钙化和/或去矿化、诱导再矿化等。使用说明材料还可任选教导优选的剂量/治疗方案、禁忌症等。

虽然使用说明材料通常包含书面或打印材料，但它们不限于此。本发明包括能保存此类使用说明并将它们告知最终用户的任何介质。此类介质包括但不限于：电子储存介质(例如，磁盘、磁带、盒式贮存器、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。此类介质可包括提供所述说明材料的因特网地址。

实施例

提供以下实施例是为了说明而非限制本发明。

实施例1

钙结合肽诱导毛发生长

图1显示DSS-处理(右侧)和模拟-处理(左侧)的小鼠，显示了头皮剃毛后13天的毛发再生情况。图2显示钙-结合化合物对小鼠的毛发生长的作用。各组中最左侧的图显示准备后和处理前第0天的小鼠。右侧的图显示第23天(终点日期)的小鼠。上图显示每日接受局部盐水处理的阴性对照。下图显示DSS化合物局部制剂应用于标出区域的每日接受处理的小鼠，与对照相比，显示明显的毛发生长。

实施例2

羟基磷灰石经由DSS肽在牙釉质和牙本质上的成核作用

为确定将DSS应用于各种组织制品是否促进HA成核作用，从而最终能导致组织再矿化，利用Streurs砂轮打磨矢状切片的成年人牙齿(从正常临床实践中提取后获得)，为成核实验作准备。一半切片用35％磷酸去矿化15分钟，然后用去离子水彻底清洗。另一半不作处理。然后超声波处理所有样品以除去切割和研磨和/或去矿化遗留的过量碎片。用溶解于50mM HEPES缓冲溶液(pH 7.0)的12.5μM 8DSS、单用缓冲溶液处理样品，或不作处理。然后将样品浸入刺激的体液(SBFn)4小时，即，加速羟基磷灰石(HA)晶体的成核作用。成核步骤后，将样品浸在镁和碳酸氢盐游离溶液(SBFg)中以使成核HA晶体生长。表5显示相比于血液血浆的SBFn和SBFg溶液组成。两种溶液均调节至pH 6.8。使晶体生长以扩增成核的晶体以便通过SEM方便地目测观察。

表4.SBFn和SBFg溶液组成

非去矿化、未处理和缓冲液处理的牙釉质表面在很大程度上维持无定形，表明晶体生长极少甚至没有(因此成核作用少或没有)(图3，上两行)。然而，在接触8DSS肽的去矿化牙釉质中观察到明显的晶体生长(表明早期和可靠的成核作用)(图3，上两行)。这表明DSS肽特异性识别去矿化的牙釉质并在去矿化牙釉质表面上使得羟基磷灰石晶核生长。

未处理和缓冲液处理的样品中，非去矿化牙本质的表面显示一定程度的晶体生长。然而，最显著的生长，由此最早和最强的成核作用还是发生在8DSS肽处理的样品中(图3，下两行)。我们已经证明DSS肽与已有的再矿化方案联用能导致磷酸钙厚层沉积足以阻塞去矿化牙本质上的牙质小管。这些结果表明采用略有不同的处理，晶体成核作用主要发生在非去矿化牙本质上。因此，根据采用的具体处理方案，DSS肽可用于将磷酸钙层沉积在去矿化牙本质上或导致完全矿化表面上羟基磷灰石晶体生长的强烈成核作用。这意味着DSS肽可用于，例如治疗牙质小管暴露导致的牙齿敏感性，再矿化涉及机械清除牙本质的龋齿，或修复断裂的牙本质表面。

实施例3

DSS肽在人牙齿中的组织特异性结合

为研究DSS肽结合牙齿组织的组织特异性，将人牙齿切片接触DSS肽和变体，然后通过CLSM成像。这些实验所用的肽是8DSS，8ASS，8DAA，8NAA，4DSS，4ESS，4NSS，4DTT，4ETT，4NTT和6DSS。打磨正常临床实践期间提取的人牙齿矢状切片，然后在pH 7.0的含10mM NaCl和50mM HEPES的合适5(6)羧基荧光素-标记肽(12.5pM)溶液中温育10分钟。制备不含肽的对照样品。处理后彻底清洗样品，利用蓝色激光照射(A＝488nm)和FITC发射滤光片通过CLSM成像，各样品利用相同的照相机和显微镜设置。对于各切片，收集多次扫描结果并以自动模式组合以产生代表13x13mm区域的图像，在大多数情况中这足以包括整个切片。如以前结合亲和力结果所提示的，含有序列(DSS)的肽与牙齿表面结合表现出最高水平，其中6DSS和8DSS显示染色水平最高。这些实验的结果示于图4。8DSS、6DSS和4DSS主要结合罩牙本质，牙本质-牙釉质结合有明确的轮廓，与根尖牙本质或基础牙釉质结合弱或不结合，皮层牙釉质或牙釉质表面未检测到结合。牙髓腔边缘也观察到显著结合。8ASS、4ESS和4NSS表现出类似模式，但结合水平较低。8DAA表现出与该结合模式相反的情况，主要结合于根尖牙本质和皮层牙釉质以及牙本质-牙釉质结合和牙髓腔壁。8DAA显示与罩牙本质、髓周牙本质或基础牙釉质结合弱或不结合。4DTT和4ETT显示结合模式类似于4DSS和4ESS的，但水平急剧降低。

8NAA显示几乎不结合任何健康组织，但确实稍微结合样品中存在的龋齿病损(见以下实施例)。4NTT显示强烈结合连接于样品的牙质骨片段，但结合健康牙齿组织的水平极低。这些结果提示可利用特定肽高特异性地靶向牙齿的特定层。

实施例4

DSS肽优先结合牙齿中的龋齿病损

打磨含有显著龋齿病损(由去矿化牙釉质构成)的人牙齿切片，接触5(6)-羧基荧光素-标记DSS肽和变体。彻底清洗切片，利用蓝色激光照射(A＝488nm)和FITC发射滤光片通过CLSM成像，为各样品调节显微镜和照相机设置以优化从各肽检测的信号。检查图像以鉴定健康与龋齿组织中肽结合的相对水平。4ESS，4NSS，8DAA，8NAA，4ETT，4DSS，8ASS，8DSS和6DSS显示高特异性地结合龋齿病损，与周围的健康牙釉质结合弱或不结合(图5；这些病损中的一些也可在图4中见到)。其它肽未测试，但根据这些结果，可以预计结合龋齿病损。在这些肽中，4ESS，4NAA，8DSS，6DSS，4DSS，8DAA和8ASS显示龋齿病损有出乎意料的强染色，而与周围牙釉质结合较弱(常完全不存在)。这些肽能结合龋齿病损，但对健康牙釉质的完全矿化表面显示结合较弱或不结合，表明这些肽可用于鉴定牙齿的龋齿或病损。由于它们能在牙釉质降解的位点进行再矿化，它们还可用于在牙釉质降解部位，例如龋齿或损伤部位启动再矿化而不导致健康组织表面的不合适成核作用。

实施例5

DSS肽-抗微生物化合物融合物的抗微生物活性

为测定钙结合肽是否合适用作靶向部分将治疗性化合物递送至矿化表面，合成含有N-末端(DSS)4，(DSS)5或(DSS)6肽、三甘氨酸(GGG)接头和2c-4抗微生物肽(RWRWRWF，SEQ ID NO：22(WO 2007/038683中的SEQ ID NO：26))的肽。这些融合蛋白的序列是DSS DSS DSS DSS GGGRWRWRWF(SEQ ID NO：23)、DSS DSS DSS DSS DSS GGG RWRWRWF(SEQ ID NO：24)和DSS DSS DSS DSS DSS DSS GGG RWRWRWF(SEQ IDNO：25)(参见SEQ ID NO：27-29，分别见WO 2007/038683)。通过改进以前描述的试验测定这些肽对厌氧浮游细菌的抗微生物活性。简言之，用Todd-Hewitt(TH)肉汤培养基将葡萄球菌突变菌株UA159细胞稀释至1x105cfu/mL，与悬浮的羟基磷灰石纳米晶体(BAB公司(Berkeley AdvancedBiomaterials，Inc.)，0.03％w/v)或等体积的去离子水(对照样品)混合。将等份试样转移入96-孔板(费希尔公司(Fisher))。然后制备肽的连续稀释液，加入细菌中。检测600nm波长的细胞悬液吸光度，通过鉴定温育约24小时后完全抑制细菌上的肽浓度来测定各肽的最低抑制浓度(MIC)。肽2c-4本身显示对浮游变形链球菌(S.mutans)的MIC是2pM。当偶联于(DSS)4部分以产生肽4DSS-2c4时，其MIC升高至52.5pM，加入0.03％(w/v)羟基磷灰石未受影响的效力显著损失。然而，如前所示，(DSS)₄部分显示对羟基磷灰石的亲和力低于含有更多DSS重复的肽，2c-4肽的高正电荷可能与(DSS)₄部分的高负电荷相互作用从而稍微抑制活性。然而，该肽保留了一定抗微生物活性。

或者，将(DSS)₆(SEQ ID NO：26)部分偶联于b-34抗微生物肽(DSSDSS DSS DSS DSS DSS GGG LKRF LKWF KRF(SEQ ID NO：27)(WO2007/038683中的SEQ ID NO：30)以产生肽6DSS-b-34(WO 2007/038683中的SEQ ID NO：31)导致抗微生物活性高于亲代肽的(6DSS-b-34的MIC＝3.1pM，b-34为5.6pM)。虽然加入0.03％HA稍微降低6DSS-b-34的抗微生物活性，得到的MIC为12.5pM依旧表明对变形链球菌(Streptococcus mutans)有显著活性。还有，单在培养基中时，肽PL-135(WO 2007/038683中的SEQID NO：32)显示对变形链球菌的MIC为21pM。单在培养基中时，将该肽偶联于(DSS)₅(SEQ ID NO：28)部分以产生肽5DSS-PL135(DSS DSS DSS DSSDSS GGG FHFHLHF(SEQ ID NO：29)((WO 2007/038683中的SEQ IDNO：33))降低其对变形链球菌的抗微生物活性至＞170pM。向培养基中加入0.03％羟基磷灰石悬液极大恢复该活性，将MIC降低至42.5pM。

这显示偶联于DSS肽时，其它化合物可保留它们的活性。此外，这证明不难产生仅在有DSS肽靶标存在下具有显著活性的化合物，提示有便利的方法开发仅在钙化(骨、牙齿等)表面有活性而在其它环境中是惰性的化合物。此类化合物代表了提高矿化组织疾病的治疗方法的安全性和效力中的主要进步。

实施例6

小肽特异性结合和矿化钙化表面

根据牙本质磷蛋白的序列设计了几种小(＜25aa)肽，据信主要的非胶原蛋白之一参与牙齿发育期间牙本质胞外基质的矿化。由三肽天冬氨酸-丝氨酸-丝氨酸(DSS)的多个重复构成的这些肽结合磷酸钙化合物的亲和力高，固定化时，其可将磷酸钙募集至肽衍生化聚苯乙烯珠或募集至去矿化人牙本质表面。结合羟基磷灰石表面的亲和力随(DSS)_n重复的数量而增加，虽然相似的重复序列--(NTT)_n、(DTT)_n、(ETT)_n、(NSS)_n、(ESS)_n、(DAA)_n、(ASS)_n和(NAA)_n--也显示HA结合活性，但通常与天然序列不在同一水平上。(DSS)_n肽与切片人牙齿的结合显示是组织特异性的，与罩牙本质结合水平高，与髓周牙本质结合水平较低，与健康牙釉质结合弱或不结合。发现这些肽的丝氨酸的磷酸化影响结合的亲合力(avidity)，但不影响结合亲和力(affinity)。讨论了这些肽在检测龋齿病损、将治疗性化合物递送至矿化组织和调节再矿化中可能的应用。

材料和方法

肽合成

合成以下肽序列：2DSS(DSS DSS，SEQ ID NO：30)，4DSS(DSS DSS DSSDSS，SEQ ID NO：31)，6DSS(DSS DSS DSS DSS DSS DSS，SEQ ID NO：32)，8DSS(DSS DSS DSSDSS DSS DSS DSS DSS，SEQ ID NO：33)，4ESS(ESS ESSESS ESS，SEQ ID NO：34)，4NSS(NSS NSS NSS NSS，SEQ ID NO：35)，4DTT(DTT DTT DTT DTT，SEQ ID NO：36)，4ETT(ETT ETT ETT ETT，SEQ IDNO：37)，4NTT(NTT NTT NTT NTT，SEQ ID NO：38)，8DAA(DAA DAA DAADAA DAA DAA DAA DAA，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40)，8NAA(NAA NAANAA NAA NAA NAA NAA NAA，SEQ ID NO：41)，8ASS(ASS ASS ASS ASSASS ASS ASS ASS，SEQ ID NO：42)，#3-1(LIKHILHRL，SEQ ID NO：43)。

采用标准Fmoc固相化学方法，利用Apex 396多肽合成仪(AAPPTec，路易斯维尔，肯塔基州)合成0.015mM规模的肽。用95％三氟乙酸和合适的清除剂将完成的肽从树脂上切下。采用反相高效液相层析(ACTA纯化仪；阿姆仙姆公司(Amersham)，阿灵顿山庄，伊利诺斯州)将粗制肽纯化至90-95％纯度，通过基体辅助激光解吸/电离(MALDI)质谱证实肽质量。先用5(6)-羧基荧光素标记结合分析所用的肽，再切割，切割步骤后立即用生物素对需要肽固定化的试验所用的肽作C末端标记。

HB结合试验

如下所示对各种长度的荧光素-标记含DSS肽进行下拉试验：制备含有各种浓度的荧光素标记肽(0-100μM)和固定量(0.3mg)HA纳米晶体的样品，所述晶体的比表面积为100m²/g(BAB公司，伯克利，加利福尼亚州)。检测接触HA前后，标记肽在488nm的吸光度(荧光素标记物的峰值吸光度)。通过比较最终(Af)和初始(A_i)吸光度与初始浓度(C₀)之比[C_bound＝(A_f/A_i)C₀]来计算肽的结合量。绘制平衡时，每平方米HA表面积的肽结合量与未结合肽浓度的曲线图。将得到的等温线拟合成朗格缪尔等温线，x/m＝(K_AN_maxC_eq)/(1+K_AC_eq)，其中x/m代表每单位HA表面积结合的肽的摩尔量，K_A是HA表面的肽亲和力常数(L/Mol)，N_max是最大表面浓度(mol/m²)，C_eq是平衡时未结合肽的摩尔浓度(Calis等.(1995)Pharm Res.，12：1072-1076)。

磷酸钙与固定化DSS肽的结合

将平均直径为4μm的链霉亲和素包被的聚苯乙烯珠(斯费罗技术公司(Spherotech)，莱克·福里斯特，伊利诺斯州)与生物素-偶联的8DSS肽或未偶联的生物素(对照珠)温育。用PBS洗涤珠以除去未结合的肽(或对照珠中未结合的生物素)，在PBS+1mM CaCl₂+1mM NaHPO₄的溶液中温育12天，然后成像。

小鼠骨髓培养物

用DMEM+10％FBS培养小鼠骨髓培养物至汇合，然后在α-MEM+10％FBS+50p.g/mL抗坏血酸？4mMβ-磷酸甘油中用2.5p.M 5(6)-羧基荧光素-标记的6DSS或2.5p.M 5(6)-羧基荧光素-标记肽#3-1(对照肽)连续处理3周。利用FITC激发/发射滤光片组，通过荧光显微术获取培养物的图像。

牙齿表面的结合和矿化

正常临床实践期间提取的成年人臼齿作矢状切片(Accutom-50，哥本哈根，丹麦；CA-231钻石刀片)，用19％乙二胺四乙酸(EDTA)凝胶去矿化1小时，然后浸渍在去离子水中并作超声波处理以去除碎片。用50mMHEPES合成仪(pH 7.0)配制的12.5p.M 8DSS肽或单用合成仪处理样品，或不作处理1小时，然后用Quell脱敏剂(PT公司(Pentron Technologies)，沃灵福德，康涅狄格州)再矿化15分钟，所述脱敏剂是由氯化钙和磷酸钾的水性溶液构成的再矿化溶液。先彻底清洗样品再通过扫描电子显微术成像。

对于结合实验，矢状切片的成年人臼齿在含10mM NaCl和50mMHEPES，pH 7.0的12.5p.M 5(6)-羧基荧光素-标记的6DSS肽溶液中温育10分钟。制备不含肽的对照样品。处理后清洗样品，利用蓝色Kr/Ar激光(λ＝488nm)照射和FITC发射滤光片，通过共焦激光扫描显微术(CLSM)成像。

结果

定量分析与HA表面结合的DSS-肽

为定量评估DSS-HA相互作用的强度以及测定肽长度和序列对结合的影响，如“材料与方法”所述对各种长度的荧光素标记含DSS肽作下拉试验。

将实验数据拟合成朗格缪尔等温线，其描述了分子与表面的结合情况，前提条件是(1)所有结合位点对肽具有相同亲和力和(2)肽在表面上形成单层但不能累积至较高水平(Atkins(1994)《物理化学》(Physicalchemistry).Freeman，纽约)。实验数据对朗格缪尔等温线的优良拟合验证了这些条件，从该分析所得的常数用于比较肽。如图7A所示和表6所总结的，各种肽的结合亲和力(K_A)和单层浓度(N_Max)随每个肽的DSS重复数量而增加。此外，检验了几种变体肽(图7B、7C，表6)：在第一位置含有较长侧链的肽(4ESS)、在第二和第三位置含有空间位阻更大的羟基的肽(4DTT、4NTT、4ETT)、在第一位置缺乏带电荷基团的肽(4NSS、8ASS)以及在第二和第三位置缺乏羟基的肽(DAA-8、8NAA)。通过比较这些变体与相同大小的含DSS肽的亲和力，确定了去除带负电荷的残基(4NSS、4NTT，图7B；8ASS，图7C)导致结合亲和力显著丧失，而用Thr或Ala替代Ser残基(4DTT、4ETT，图7B；DAA8，图7C)对该参数几乎没有可观察的影响(例如，DAA-8的KA在8DSS的KA的实验误差范围内)。其中第一位置的酸性残基以及2和3位的丝氨酸残基均被替代的肽(4NTT，图7B；8NAA，图7C)导致结合活性几乎完全丧失。

由于结合亲和力(K_A)和最高单层浓度(N_Max)决定结合活性，显示相似亲和力的肽可总体活性因N_Max的不同而极为不同。因此，虽然在重复的1位存在负电荷明显是决定结合亲和力的关键序列参数，但这些数据提示酸性残基和丝氨酸均参与这些肽与HA表面的结合：Asp-Ser-Ser是产生HA结合活性的最佳序列(丝氨酸对最高单层影响的作用所致)，而所有变体肽在体外显示与HA的结合显著降低。令人感兴趣的是，与相同大小的未磷酸化肽(肽4DSS)相比，DSS重复-肽4DS(P)S的第一位置的磷酸化不导致结合亲和力显著改变，但导致表面结合密度大大升高，提示结合模式有改变而非简单改变相互作用的亲和力(表6)。

表6.本项研究所述肽的朗格缪尔参数，根据原始数据的朗格缪尔方程拟合

	K_A(M^-1)	Nmax(mol/m²)	r
				2DSS	57,000±24,000	2x10^-8±5x10^-9	0.94
4DSS	94,000±26,000	5.8x10^-8±6x10^-9	0.98
				5DSS	148,000±14,000	9.2x10^-8±2x10^-9	0.99
6DSS	272,000±26,000	1.3x10^-7±3x10^-9	0.99
				8DSS	290,000±70,000	8.2x10^-8±6x10^-9	0.99
4ESS	81,000±18,000	4.6x10^-8±4x10^-9	0.99

4NSS	16,000±4,000	3.0x10^-8±1x10^-9	0.99
				4DTT	161,000±79,000	1.3x10^-8±1x10^-9	0.92
4ETT	79,000±25,000	8.8x10^-8±9x10^-9	0.94
				4NTT	17,000±7,000	5.8x10^-8±2x10^-8	0.98
8DAA	310,000±74,000	6.0x10^-8±6x10^-9	0.99
				8ASS	ND	ND	ND
8NAA	ND	ND	ND
				4DS(P)S	83,000±9,000	1.2x10^-7±5x10^-9	0.99

含DSS的培养物与矿化组织培养物的结合

发现含(DSS)n的肽能积极结合HA后，我们想确定它们是否会结合生物学衍生组织中出现的矿化部位。用标记的6DSS肽或标记的肽#3-1(非钙结合对照肽)连续处理成骨条件下培养的小鼠骨髓(MBM)培养物3周。利用FITC激发/发射滤玻片组，通过荧光显微术使培养物成像。图8，B图显示DSS处理样品中矿化MBM节的亮染色，对照样品中未见结合(图8，D图)，表明不仅标记的6DSS肽结合MBM培养物中的矿化节，该结合还是DSS序列的特性之一，而非小肽的普遍特性。

含DSS的肽结合无定形磷酸钙

为测试含DSS的肽募集磷酸钙和成核晶体生长的能力，将25μM 6DSS肽与各种浓度的CaCl₂和NaHPO₄混合，如“材料与方法”所述温育。虽然预计存在含DSS的肽会增强亚临界CaHPO₄浓度下HA晶体的形成，但未观察到(数据未显示)。然后合成含有C-末端生物素标记物的含DSS肽，固定在链霉亲和素包被的珠上。清洗这些珠，在含有各种浓度CaHPO₄的溶液中温育，如前所述。与牙本质磷蛋白/磷蛋白以及其它磷蛋白的以前观察结果一致(Saito等.(1997)Bone 21：305-311；Saito等.(2000)J Bone MinerRes.，15：1615-1619)，这些固定化肽导致珠与无定形CaHPO₄颗粒共聚集，最终导致结晶物质在珠附近沉积。如图9，A图所示，几乎所有肽包被珠掺入沉淀无定形磷酸钙的大聚集体中。相比之下，在生物素封闭的对照样品中，几乎所有的珠未聚集，且未与沉淀物结合(图9，B图)。令人感兴趣的是，几种肽-包被珠在实验期间覆盖了有序的多层矿物质(代表性图示于图9，C图)，而所有未包被/生物素封闭的对照珠未能累积矿物质(图9，D图)。

DSS肽与牙齿表面的组织特异性结合

为测试含DSS的肽与生物学组织的结合，用6DSS温育处理矢状切片的人牙齿(对照样品不用肽制备)、清洗并通过CLSM成像。图10显示标记的肽对牙齿的荧光染色强烈。用掺混肽或游离5(6)-羧基荧光素染色的模拟处理对照切片显示无荧光(未显示)。令人感兴趣的是，该肽特异性结合牙本质，未见与牙釉质结合(图10中染色区域的最左边缘对应于牙本质-牙釉质结合处[DEJ])。检查标记6DSS结合牙本质的可见模式(图10)显示离DEJ最近的罩牙本质中染色最亮，在接近牙髓腔的髓周牙本质中可观察到较低水平的染色。

牙齿表面的体外DSS介导再矿化

发现含(DSS)n的肽能结合牙本质表面和固定化肽能导致磷酸钙累积后，我们想确定这些肽是否可用于将磷酸钙募集至牙本质表面。用8DSS肽处理提取的人牙齿的去矿化切片，然后用Quell脱敏剂(PT公司)再矿化，所述脱敏剂是由氯化钙和磷酸钾的水性溶液构成的市售可得再矿化产品。如图11中的电子显微照片所示，模拟-处理的(图11，C图)和未处理的样品(仅用脱敏剂处理，图11，D图)显示矿物质累积水平低，数个牙本质小管依然暴露。相反，有脱敏剂溶液存在下，DSS处理的牙本质样品(图1，B图)累积了连续的一层磷酸钙沉淀物，完全阻塞牙本质小管。

讨论

生物矿化是脊椎动物发育和进化的核心过程之一(Kawasaki等.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，101：11356-11361及其中的参考文献)，影响进食、运动、捕食、逃避、听力和平衡等各种过程。矿化或矿化组织蛋白中的缺陷涉及从遗传性耳聋(Xiao等.(2001)Nat Genet.，27：201-204)和动脉粥样硬化(Magne等.(2005)Bioessays 27：708-716)到龋齿和骨质疏松等人疾病。介导矿化过程的蛋白为我们提供理解如何操控钙化合物沉积，因而可能改善钙化组织缺陷治疗的模板。

哺乳动物中磷酸钙沉积位点普遍存在DPP提示该蛋白质在矿化过程中直接起作用(Hao等.(2004)Bone 34：921-932；Rahima等.(1988)J HistochemCytochem.，36：153-157；Begue-Kirn等.(1998)Eur J Oral Sci.，106：963-970；Bleicher等.(1999)Matrix Biol.，18：133-143；Baba等.(2004)Eur J Oral Sci.，112：163-170)。生物化学研究显示DPP实际上可通过导致成核作用(低浓度)或抑制(高浓度)晶体生长而影响生物学相关HA晶体的形成(Lussi等.(1988)Arch Oral Biol.，33：685-691；Saito等.(2000)J Bone Miner Res.，15：1615-1619)。参与脊椎动物中矿化过程的蛋白质(包括DPP)常含有带负电荷的富含Asp-或Glu-的结构域(Harris等.(2000)Bone 27：795-802，和其中的参考文献)。结合该观察结果与(DSS)_n重复区域的计算机和生物化学研究(Veis等.(1998)Eur J Oral Sci.，106(增刊1)：234-238；Lee和Veis(1980)Int JPept Protein Res.，16：231-240；George等.(1996)J Biol Chem.，271：32869-32873；Chang等.(2006)Calcif Tissue Int.，78：55-61)表明该短重复序列控制DPP的矿物质结合和成核活性。

由于已知DPP活性依赖于其磷酸化状态(Saito等.(1997)Bone 21：305-311；He等.(2005)J Biol Chem.，280：33109-33114)，未磷酸化的含DSS肽未能在游离溶液中使HA晶核形成是不奇怪的。然而，我们发现即使不存在磷酸化，这些肽仍紧密而特异性地结合磷酸钙化合物，提示(DSS)_n基序本身可用于鉴定、阐明和操控钙化表面。

表征这些分子的特性时，发现DSS肽检测到的结合亲和力不亚于其它已知HA结合蛋白质和肽检测到的亲和力。例如，由24个氨基酸构成的8DSS肽的HA结合亲和力(290,000M^-1)仅比完全组装的牙釉蛋白纳米球的(1,970,000M^-1)低7倍(Bouropoulos和Moradian-Oldak(2003)Calcif.TissueInt.，72：599-603)，后者由各约为25-kDa的最多40个亚单位构成。此外，据报道，牙釉蛋白的C-末端区域具有6,200M^-1的HA-结合亲和力(Aoba等.(1989)J Dent Res.，68：1331-1336)，而相比之下，大小类似的4DSS肽的亲和力为94,000M^-1。8DSS的结合亲和力不亚于大小相当的富组蛋白的检测值(K＝353,000-1,903,000M^-1，Yin等.(2003)Arch Oral Biol.，48：361-368)，后者是已知高亲和力地结合HA的一类抗微生物小肽。

含DSS的肽与指定HA底物的结合强烈依赖于肽的长度，亲和力随着肽大小成比例增加直至最多6重复的长度(18个氨基酸)，含8重复的肽观察到亲和力增加不大(表6)。因此，6个重复看来对于HA表面相互作用是最佳的，可能反映出在给定时间与该表面有效相互作用的肽的最大官能团数量。在该长度范围的另一端，仅含有2个DSS序列重复的2DSS肽显示HA结合亲和力远低于较长变体的(57,000M^-1)，但高于结合单个氨基酸观察到的数值，磷酸丝氨酸是5,000-13,200M^-1(Moreno等.(1984)Calcif Tissue Int.，36：48-59；Benaziz等.(2001)J Colloid Interface Sci.，238：48-53)，Asp是220M^-1(Moreno等.(1984)Calcif Tissue Int.，36：48-59)，谷氨酸是206M^-1(Kresak等.(1977)JColloid Interface Sci.，59：283-292)。

结合HA表面的肽还依赖于它们的序列，相比于亲代DSS序列，几乎所有变体肽显示结合亲和力显著降低(表6，图7B、7C)。我们的结果显示结合的一级序列决定因素是在重复的1位的负电荷。天冬氨酸的极大聚合物的研究显示非常高的HA结合亲和力(28.8-kDa聚合物为3,000,000M^-1(Tsortos和Nancollas(1999)J Colloid Interface Sci.，209：109-115))。取代DSS重复中的丝氨酸还导致结合亲和力降低，但不是很严重。在过去，根据所用的具体HA制品，丝氨酸与HA的结合亲和力的检测值从太低从而不能进行朗格缪尔分析(Benaziz等.(2001)J Colloid Interface Sci.，238：48-53)到太高的值(317,000M^-1，但每平方米HA的结合位点极少(Moreno等.(1984)CalcifTissue Int.，36：48-59))，提示丝氨酸与HA表面的不连续区域之间可能有复杂和可能高度特异性的相互作用。我们的初步实验表明含DSS的肽与HA结合主要是天冬氨酸残基所致，其中丝氨酸起的作用不大但仍很明显。

含有(DSS)_n的肽与确定HA表面的体外结合促使我们研究这些肽与钙化生物学组织的结合。荧光素标记的8DSS肽紧密结合提取的成年人臼齿的牙本质，组织特异性显著，主要结合牙本质，而几乎完全不结合牙釉质。应该知道，牙本质的HA晶体显示的形态与牙釉质的那些极为不同，由较小的、平板样晶体构成，其中取向基本上是随机的，而牙釉质表面的HA晶体是延长的、良好定向的(Paine等.(2005)J Biol Chem.，280：31991-31998；Bath-Balogh和Fehrenbach(2006)Dental embryology，histology，and anatomy.Elsevier Saunders，圣路易斯)。因此，含(DSS)_n的肽与牙本质诸区域的结合特异性可能是该特定HA晶型的选择性结合所致，或者(特别是鉴于观察到与无定形磷酸钙结合)可反映出这些肽对无序程度较低表面的简单偏好。还观察到与矿化小鼠骨髓节的结合，进一步表明这些肽可用于鉴定和操控各种矿化组织。

虽然在该项研究中检测的未磷酸化含DSS肽未能在游离溶液中形成HA晶核，但它们能有效结合无定形磷酸钙聚集体。将这些肽固定在固体支持物上，我们能利用该能力作为控制饱和溶液中磷酸钙沉积位点的手段。发现表面固定有8DSS肽的聚苯乙烯珠能从饱和CaHPO₄溶液中有效聚集无定形磷酸钙。然而，进一步温育后，发现一种珠上附着了多层更有序的结晶磷酸钙，即便肽未磷酸化。该出乎意料的特性与DPP蛋白所观察到的有偏差，提示全长蛋白质可能具有其它调控机制来帮助控制HA成核。该结果还提示含(DSS)_n的肽在控制磷酸钙沉积中是通用的。

我们对于含(DSS)_n的肽启动矿物质沉积在牙齿表面的能力的研究揭示用8DSS肽预处理显著增强市售可得再矿化产品导致矿物质聚集在部分去矿化牙本质表面的效力。利用理论上富含Asp/Ser和Asp/磷酸丝氨酸的肽进行分子动力学模拟显示这些肽可能采取延伸的构象，将官能团呈递在平行于相互作用表面的平面的任一侧(George等.(1996)J Biol Chem.，271：32869-32873；Dahlin等.(1998)Eur J Oral Sci.，106(增刊1)：239-248)。在依据Asp-Ser-Ser重复的肽的具体例子中，该肽具有提供两个等价矿物质结合表面的作用，从而表面固定化肽积极结合流过的无定形磷酸钙颗粒，因此观察到8DSS-预处理HA表面无定形磷酸钙累积增加。该活性使得这些肽作为增强牙齿再矿化的有希望备选方案。

能特异性结合钙化表面和募集磷酸钙为诊断和治疗发明提供了许多其它的独特机遇。虽然这些活性归于大蛋白，但它们的临床应用不实际；但不难合成的小肽显示类似特性可能为诊断和治疗钙化组织疾病提供有力的新工具。我们已提供了用含(DSS)_n的肽预处理表面来增强现有再矿化方案的有效性的例子，而其它可能性仍有待探索。诊断龋齿的现有方法，例如依赖于手工检测、比色染色或激光荧光测定发或干扰测定发来鉴定龋齿病损的部位(Audette等.(2004)Biochemistry 43：11427-11435；Tranaeus等.(2005)Community Dent Oral Epidemiol.，33：265-273)。由于(DSS)n肽对无定形磷酸钙有亲和力并且它们不结合健康的牙釉质，荧光标记的(DSS)n肽可能用于快速鉴定龋齿和牙齿中的龋前病损。该方法远比比色染料(依赖于除去健康的牙釉质(Yip等.(1994)Br Dent J.，176：417-421))精确，与依赖于天然组织荧光的放射照相术或荧光方法相比，灵敏度改善。

由于含(DSS)_n的肽不难结合于任何数量的标记物或附加化合物，它们在诊断领域的应用仅受限于它们的组织特异性。我们已在该项研究中大量利用荧光标记的肽，但也可能结合碘化化合物以便用作放射造影剂(Lee等.(2003)J Anat.，203：161-172)以及自旋标记的标签以增强磁共振成象中的对比度。Yokogawa等.(2001)Endocrinology 142：1228-1233显示可能将雌二醇结合于短链聚天冬氨酸而将其靶向钙化组织。类似地，可能将治疗性化合物，例如抗微生物剂或生长因子结合于含(DSS)_n的肽以便将它们高精确度地靶向递送至特定钙化表面。

目前，致力于鉴定这些肽的组织特异性范围和工程改造特异性扩大和缩小的变体，从而我们能更精确地利用它们的矿物质结合活性。DPP的很大部分由(DSS)_n重复构成，并对发育牙齿的矿化速度和类型施加强效影响(Paine等.(2005)J Biol Chem.，280：31991-31998)。通过应用工程改造成DPP-衍生(DSS)n-样肽的肽工具，我们揭示了该独特的矿物质结合基序的所有潜能。

实施例7

钙结合剂诱导甲生长

给新西兰白兔的爪子剃毛并修剪甲至可见甲内新生长的均匀长度，用磺基琥珀酸二辛酯(气溶胶OT或AOT)/异丙醇油包水(W/O)纳米乳液配制的(D)-8DSS肽(制剂A1D)、或二甲基亚砜配制的(D)-8DSS肽(DMSO，制剂D1D)或磷酸缓冲盐水溶液(PBS)每三天处理各趾，共19天，如上所述。

测试两种制剂，均掺入了D型8DSS：A1D(气溶胶OT/异丙醇)和D1D(DMSO溶液)。此外，包括由局部普通盐水溶液构成的阴性对照。利用两只动物，每只动物处理8个部位：在每只脚上，用样品化合物处理两趾的甲床，而用普通盐水溶液处理其余两趾的甲床。用活性化合物处理一只动物的第一和第二趾，而用对照溶液(普通盐水)处理第三和第四趾；对于另一只动物，逆转该模式以作为爪内位置特异性作用的对照。实验结束时，给动物的脚照相，对照片作图像分析以确定测试制剂对甲生长程度或速度的作用。配置细节见表7。

表7.处理配置

实验开始时，刮擦表皮处的甲以标出给药前甲生长的位置。

每隔一天将局部制剂给予甲床，每次给予

按照标准农业指南饲养动物，观察行为或总体健康中任何明显的缺陷。注意任何皮肤刺激。

实验结束时，视需要从多个角度对脚照相以显示甲的生长程度以及各趾的任何增厚或总体形态改变；对图像作定量分析进行检测。再次刮擦甲以标出实验结束时甲生长的位置。

在第19天记录图像并检测各甲。如图12所示，处理的甲显示生长明显高于未处理的甲。该项研究的聚集体检测显示D1D-处理甲的生长明显高于A1D处理的甲，两个处理组在19-天测试期间显示生长比未处理或模拟处理的甲高4-倍到5-倍(图13)。

为毛发生长应用开发的纳米乳液良好地起到递送化合物至甲甲床的作用，而发现对养育毛发生长仅边际有效的活性化合物的DMSO溶液看来提供最强壮的甲生长。这可能是因为纳米乳液的小泡倾向于累积在发囊中，而DMSO溶液将其溶质更分散地递送到其所应用的整个组织。

应理解，本文所述的实施例和实施方式只是为了说明，本领域技术人员应了解据此作出的各种改进或改变，它们包括在本申请的构思和范围以及所附权利要求书的范围内。出于所有目的，本文述及的所有出版物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文。

Claims

1.一种钙结合部分，所述钙结合部分是包含至少四个式I所示亚单位的多联体：

其中至少两个所述亚单位彼此毗连，而由非亚单位的部分彼此隔开的亚单位由持久长度大于或等于至少约

的连接键隔开；其中

E、G、L、M、T和X独立选自：碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼和硒，它们采取化学上相容的构型；

R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀、R₁₀’视需要存在或不存在以满足相关主链原子的化合价，存在时，它们是与E、G、L、M、T和X化学相容的非空间位阻部分；

R₂和R₂′至少一个独立选自H、Cl、I、F、Br或CH₃，当R₂或R₂′不是H、Cl、I、F、Br或CH₃时，它们如式XIX所示：

其中原子Q选自：碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼和硒，它们是任何化学上合理的构型，其中R₂ ^d视需要存在或不存在以满足原子Q的化合价；其中R₂ ^a和R₂ ^b是小的、非空间位阻基团；R₂ ^d和/或R₂ ^c之一为负电荷基团，当R₂ ^c由负电荷部分构成且R₂ ^d存在时，R₂ ^d由小的空间位阻基团，例如羰基氧或H、Cl、I、F、Br或CH₃构成，反之亦然；和

R₅和R₅’中的至少一个被位于远离主链的一个中心的羟基占据，而另一个是小的非空间位阻基团；

所述部分还排除包含氨基酸序列(X-Y-Z)_n的肽，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)和谷氨酰胺(Gln)；Y和Z是独立选自下组的氨基酸：丙氨酸(Ala)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、磷酸丝氨酸(pSer)、磷酸苏氨酸(pThr)和它们的衍生物；n是1到100。

2.如权利要求1所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分包含选自下组的主链：聚环氧乙烷(PEG/PEO)主链、聚环氧丙烷(PPO)主链、脂族主链、酯主链和醚主链。

3.如权利要求1或2所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分如下式所示：

其中：

R₁和R₁₁独立为存在或不存在，存在时，其选自固体基片或效应物；和

n为4到100。

4.如权利要求3所述的钙结合部分，其特征在于，当R₁和/或R₁₁存在时，其包含独立选自下组的效应物：可检测标记物、亲和标签、药物、药物载体和抗微生物肽。

5.如权利要求4所述的钙结合部分，其特征在于，所述可检测标记物选自下组：放射性标记物、荧光标记物、比色标记物、不透射线的标记物、发光标记物、生物发光标记物和自旋标记物。

6.如权利要求3所述的钙结合部分，其特征在于，当R₁和/或R₁₁存在时，其包含选自下组的效应物：肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、脂质、有机化合物、无机化合物和有机金属化合物。

7.如权利要求3所述的钙结合部分，其特征在于，当R₁和/或R₁₁存在时，其包含的效应物是抗癌的或抗微生物的化合物。

8.如权利要求4所述的钙结合部分，其特征在于，所述效应物包含通过氨基酸接头序列连接于钙结合部分的抗微生物肽。

9.如权利要求1或3所述的钙结合部分，其特征在于，存在至少4个亚单位。

10.如权利要求1或3所述的钙结合部分，其特征在于，存在至少6个亚单位。

11.如权利要求1或3所述的钙结合部分，其特征在于，存在至少8个亚单位。

12.如权利要求1所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分由某结构域构成或包含该结构域，所述结构域的特征在于选自下组的分子式：

S¹-S²-L¹-S³-S⁴和S¹-S²-L¹-S³-L²-S⁴

其中：

S¹、S²、S³和S⁴独立选自式I的亚单位；和

L¹和L²是独立选择的接头。

13.如权利要求12所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分是肽，当L¹和/或L²存在时，其是至少4个氨基酸长的独立选择的肽接头。

14.如权利要求12所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分是肽，当L¹和/或L²存在时，其是长约2个氨基酸到约50个氨基酸的独立选择的肽接头。

15.如权利要求12所述的钙结合部分，其特征在于，当L¹和/或L²存在时，其包含独立选自表3所示肽接头的肽接头。

16.如权利要求12所述的钙结合部分，其特征在于，当L¹和/或L²存在时，其包含独立选自表3所示非肽接头的非肽接头。

17.如权利要求1-12中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，当R₂ ^a和/或R₂ ^b存在时，其独立选自下组：H、Cl、I、F、Br和CH₃。

18.如权利要求1-17中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，R₂ ^c或R₂ ^d选自下组：SO₄ ^2-、PO₄ ^2-和羧酸酯基氧。

19.如权利要求1-18中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，R₂ ^c是负电荷的部分，R₂ ^d存在且选自下组：H、Cl、I、F、Br和CH₃，或者R₂ ^d是负电荷的部分，R₂ ^d存在且选自下组：H、Cl、I、F、Br和CH₃。

20.如权利要求1-19中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，R₂和/或R₂’独立选自下组：

21.如权利要求1-20中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀和R₁₀’中的一个或多个独立选自下组：-OH、-CH₃、-NH₂、-SiH₃、-SH、-SH、-BH₂、H、I、Cl、Br、F、乙基、羰基和仲胺基团。

22.如权利要求1-21中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，R₃、R₃’、R₄、R₄’、R₆、R₆’、R₇、R₇’、R₉、R₉’、R₁₀和R₁₀’中的一个或多个独立选自下组：

23.如权利要求1-22中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，R⁵如下式所示，

其中

R₅’选自下组：碳、氮、氧、硅、磷、硫、硼和硒，它们是化学上相容的构型；和

R₅ ^a、R₅ ^b独立选自小的非空间位阻基团。

24.如权利要求23所述的钙结合部分，其特征在于，R₅ ^a和R₅ ^b独立选自下组：H、Cl、Br、I、F、CH3和OH。

25.如权利要求1-23中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，所述E-G、L-M和T-X键具有明显的双键特征，作为直接双键或作为扩展的共轭轨道体系的一部分。

26.如权利要求25所述的钙结合部分，其特征在于，所述E-G、L-M和/或T-X键选自下组

27.如权利要求1-23中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，所述E-G、L-M和/或T-X键是结构上受约束的或芳族连接键。

28.如权利要求27所述的钙结合部分，其特征在于，所述E-G、L-M和/或T-X键独立选自下组：

29.如权利要求1-12中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分包含选自下组的主链：包含肽键的主链、聚乙二醇(PEG)主链、烷烃主链、乙烯桥接主链和酯主链。

30.如权利要求1-29中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分未作磷酸化。

31.如权利要求1-30中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分是药学上可接受的赋形剂。

32.如权利要求1-31中任一项所述的钙结合部分，其特征在于，所述部分配制成单位剂量制剂。

33.如权利要求31所述的钙结合部分，其特征在于，为选自下组的施用方式配制所述部分：口服给药、局部给药、鼻部给药、肺部给药、吸入、皮下给药、全身性给药、外科手术给药、皮下长效给药和直肠给药。

34.一种在哺乳动物中诱导毛发生长或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的方法，所述方法包括：

给予所述哺乳动物权利要求1、3和9-33中任一项所述的钙结合部分；和/或

包含一个或多个肽结构域的钙结合肽，所述结构域包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸或其保守性取代，n是1到100的数值；其中当存在多于一个所述结构域时，所述结构域可以相同或不同；其中所述钙结合肽部分结合磷酸钙；

其中所述钙结合部分和/或钙结合肽部分的给予量足以在所述哺乳动物中诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长。

35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是非人哺乳动物。

36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是人。

37.如权利要求34-36中任一项所述的方法，其特征在于，局部给予所述钙结合部分和/或所述钙结合肽。

38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括诱导毛发生长或抑制毛发脱落。

39.如权利要求38所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物是诊断为具有选自下组的疾病的人：斑秃、雄激素性脱发、药物诱导脱发和射线诱导脱发。

40.如权利要求34-39中任一项所述的方法，其特征在于，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽给予头皮、眉毛或髭(上嘴唇)的区域。

41.如权利要求34-40中任一项所述的方法，其特征在于，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分给予：香波、毛发调理剂、毛发顺理剂、毛发染色剂、毛发生长滋补剂、遮光剂、乳膏、凝胶或油膏、清洗剂、滋补剂、溶液、乳液、泡沫、乳膏、凝胶、软膏、扑粉、搽剂或香油、洗液和软膏。

42.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括诱导甲生长。

43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽给予选自下组的区域：甲、甲床、表皮、蹄的冠区域、角的基底。

44.如权利要求34、42和43中任一项所述的方法，其特征在于，所述给药包括将所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分给予：指甲膏、甲增强剂、蹄香膏、指甲油、蹄或甲胶、密封剂、乳膏、洗液、足浴剂、蹄浴剂。

45.如权利要求34-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙结合部分或钙结合肽是钙结合肽。

46.如权利要求34-44中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙结合肽部分包含通过非肽接头相连的两个或更多个所述结构域。

47.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸和/或其保守性取代，n是1到100的数值。

48.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，n是1到100的数值。

49.如权利要求34-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽或肽结构域是D肽或β肽。

50.如权利要求34-49中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽或肽结构域包含两个或更多个拷贝的表2所列肽亚单位的氨基酸序列。

51.如权利要求34-50中任一项所述的方法，其特征在于，所述肽或肽结构域长约3到约100个氨基酸。

52.如权利要求34-51中任一项所述的方法，其特征在于，n是2-8的数值。

53.如权利要求34-52中任一项所述的方法，其特征在于，X是天冬氨酸。

54.如权利要求34-53中任一项所述的方法，其特征在于，Y和Z是丝氨酸。

55.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽包含选自下组的“L”肽、“D”肽或β肽：4DSS、5DSS、6DSS、7DSS、8DSS、9DSS和10DSS。

56.如权利要求34-55中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽未磷酸化。

57.如权利要求34-56中任一项所述的方法，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽具有保护基团。

58.一种在哺乳动物中诱导毛发生长或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的制剂，所述制剂包含：

权利要求1、3和9-29中任一项所述的钙-结合部分；和/或

包含一个或多个肽结构域的钙结合肽，所述结构域包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸或其保守性取代，n是1到100的数值；

其中当存在多于一个所述结构域时，所述结构域可以相同或不同；其中所述钙结合肽部分结合磷酸钙；

所述制剂还包含载体，从而在所述钙结合部分和/或所述钙结合肽局部给予哺乳动物时诱导毛发生长和/或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长。

59.如权利要求58所述的制剂，其特征在于，所述载体包含乳液。

60.如权利要求59所述的制剂，其特征在于，所述制剂是油包水乳液。

61.如权利要求59所述的制剂，其特征在于，所述制剂是水包油乳液。

62.如权利要求58-61中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙结合部分和/或所述钙结合肽连接于磷酸钙纳米颗粒或微粒。

63.如权利要求62所述的制剂，其特征在于，所述纳米颗粒或微粒包含选自下组的磷酸钙：羟基磷灰石、β磷酸三钙、磷酸八钙和磷酸二钙二水合物。

64.如权利要求62-63中任一项所述的制剂，其特征在于，所述纳米颗粒或微粒的大小范围是约1nm到约1μm。

65.如权利要求58-64中任一项所述的制剂，其特征在于，提供的所述制剂可作为选自下组的产品的组分：香波、毛发调理剂、毛发顺理剂、毛发染色剂、毛发生长滋补剂、遮光剂、乳膏、凝胶或油膏、清洗剂、滋补剂、溶液、乳液、泡沫、乳膏、凝胶、软膏、扑粉、搽剂或香油、洗液和软膏。

66.如权利要求58-64中任一项所述的制剂，其特征在于，提供的所述制剂可作为选自下组的产品的组分：指甲膏、甲增强剂、蹄香膏、指甲油、蹄或甲胶、密封剂、乳膏、洗液、足浴剂和蹄浴剂。

67.如权利要求58-66中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙结合部分或钙结合肽是肽。

68.如权利要求58-66中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙结合肽部分或钙结合肽包含通过非肽接头相连的两个或更多个所述结构域。

69.如权利要求67所述的制剂，其特征在于，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，n是1到100的数值。

70.如权利要求58-69中任一项所述的制剂，其特征在于，所述肽或肽结构域是D肽或β肽。

71.如权利要求58-70中任一项所述的制剂，其特征在于，所述肽或肽结构域包含两个或更多个拷贝的表2所列肽亚单位的氨基酸序列。

72.如权利要求58-71中任一项所述的制剂，其特征在于，所述肽或肽结构域长约3到约100个氨基酸。

73.如权利要求58-72中任一项所述的制剂，其特征在于，n是2-8的数值。

74.如权利要求58-73中任一项所述的制剂，其特征在于，X是天冬氨酸。

75.如权利要求58-74中任一项所述的制剂，其特征在于，Y和Z是丝氨酸。

76.如权利要求58所述的制剂，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽包含选自下组的“L”肽、“D”肽或β肽：4DSS、5DSS、6DSS、7DSS、8DSS、9DSS和10DSS。

77.如权利要求58-76中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽未磷酸化。

78.如权利要求58-77中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽具有保护基团。

79.权利要求1、3和9-33中任一项所述钙结合部分和/或钙结合肽在制备诱导哺乳动物毛发生长或抑制毛发脱落和/或诱导甲生长的药物中的应用，

所述钙结合肽包含一个或多个肽结构域，所述结构域包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸或其保守性取代，n是1到100的数值；其中当存在多于一个所述结构域时，所述结构域可以相同或不同；其中所述钙结合肽部分结合磷酸钙。

80.如权利要求79所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物是非人哺乳动物。

81.如权利要求79所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物是人。

82.如权利要求79-81中任一项所述的应用，其特征在于，为局部给药配制所述钙结合部分和/或所述钙结合肽。

83.如权利要求79-82中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物用于诱导毛发生长或抑制毛发脱落。

84.如权利要求83所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗诊断为具有选自下组的疾病的人：斑秃、雄激素性脱发、药物诱导脱发和射线诱导脱发。

85.如权利要求79-84中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分：香波、毛发调理剂、毛发顺理剂、毛发染色剂、毛发生长滋补剂、遮光剂、乳膏、凝胶或油膏、清洗剂、滋补剂、溶液、乳液、泡沫、乳膏、凝胶、软膏、扑粉、搽剂或香油、洗液和软膏。

86.如权利要求79-82中任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括诱导甲生长。

87.如权利要求86所述的应用，其特征在于，所述药物包含为给予选自下组的区域而配制的所述钙结合部分和/或所述钙结合肽：甲、甲床、表皮、蹄的冠区域、角的基底。

88.如权利要求79、86和87中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含所述钙结合部分和/或所述钙结合肽作为选自下组的制剂的组分：指甲膏、甲增强剂、蹄香膏、指甲油、蹄或甲胶、密封剂、乳膏、洗液、足浴剂、蹄浴剂。

89.如权利要求79-88中任一项所述的应用，其特征在于，所述钙结合部分或钙结合肽是钙结合肽。

90.如权利要求79-88中任一项所述的应用，其特征在于，所述钙结合肽部分包含通过非肽接头相连的两个或更多个所述结构域。

91.如权利要求89所述的应用，其特征在于，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺或其保守性取代，Y和Z是独立选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸和/或其保守性取代，n是1到100的数值。

92.如权利要求89所述的应用，其特征在于，所述肽包含序列(X-Y-Z)_n，其中X是选自下组的氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和谷氨酰胺，Y和Z是选自以下的氨基酸：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸，n是1到100的数值。

93.如权利要求79-92中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽或肽结构域是D肽或β肽。

94.如权利要求79-93中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽或肽结构域包含两个或更多个拷贝的表2所列肽亚单位的氨基酸序列。

95.如权利要求79-94中任一项所述的应用，其特征在于，所述肽或肽结构域长约3到约100个氨基酸。

96.如权利要求79-95中任一项所述的应用，其特征在于，n是2-8的数值。

97.如权利要求79-96中任一项所述的应用，其特征在于，X是天冬氨酸。

98.如权利要求79-97中任一项所述的应用，其特征在于，Y和Z是丝氨酸。

99.如权利要求79所述的应用，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽包含选自下组的“L”肽、“D”肽或β肽：4DSS、5DSS、6DSS、7DSS、8DSS、9DSS和10DSS。

100.如权利要求79-99中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽未磷酸化。

101.如权利要求79-100中任一项所述的制剂，其特征在于，所述钙-结合部分或钙-结合肽具有保护基团。

102.一种治疗对象中特征在于牙齿去矿化的牙齿缺陷的方法，包括给予所述对象包含权利要求1-32中任一项所述钙结合部分的组合物，其中所述给药导致牙齿再矿化。

103.一种治疗对象中特征在于骨密度降低的骨缺陷的方法，包括给予所述对象包含权利要求1-32中任一项所述钙结合部分的组合物，其中所述给药导致骨密度升高。

104.一种鉴定对象中特征在于牙齿去矿化的牙齿缺陷的方法，包括给予包含权利要求1、3和9-33中任一项所述钙结合部分的组合物，其中所述组合物中的所述钙结合部分偶联于可检测标记物，其中所述钙结合部分优先结合去矿化的牙齿表面。

105.一种鉴定对象中特征在于骨去矿化的骨缺陷的方法，包括给予所述对象包含权利要求1、3和9-33中任一项所述钙结合部分的组合物，其中所述组合物中的所述钙结合部分偶联于可检测标记物，其中所述钙结合部分优先结合去矿化的骨表面。