CN102435747A - 面向急性心肌梗死诊断的生物传感器及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种面向急性心肌梗死诊断的生物传感器及其制备方法。该传感器包括具有FET场效应管结构的传感器基体及微流道系统层，该传感器基体包括SOI硅片，所述硅片表面设有钝化层、表面偶联修饰有急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体的硅纳米线以及电极；所述硅纳米线的至少局部表面暴露于该微流道系统层内的微流道中，所述微流道分别与微流道系统层上的样本溶液入口和样本溶液出口连通；该传感器是采用微纳米加工方法制备的。藉由该传感器可以电学测量手段检测血清中的各种标志蛋白，进而获知心肌梗死发病的程度。本发明能够实现对心肌梗死的快速、灵敏的检测，响应速度快，确诊率高，适用于临床医学检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物传感器及其制备工艺，特别涉及一种对急性心肌梗死标志蛋白具有快速、灵敏响应的生物传感器及其制备方法，属于生物医学技术领域。
背景技术
心脏病是目前影响人们生活质量的重大疾病之一，根据《中国卫生统计年鉴2010》，在2009年，心脏病在中国城市居民中的发病死亡率仅次于恶性肿瘤。在心脏疾病中，心肌梗死是其中的一个重要分支，对其早期、快速、灵敏、准确的诊断是挽救众多患者生命的重要途径，具有极为重要的实用价值。
研究发现，心肌肌钙蛋白I（cTnI）、心肌肌钙蛋白T（cTnT）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）以及肌红蛋白（MYO）在血液中的水平能够反映出心肌梗死的程度，是目前常用的检测指标，具有重要的临床价值。对于cTnI（正常值<0.2ng/mL），在急性心肌梗死发作早期的3~6h内即可检出，其浓度在18~24h后达到高峰，持续时间可达7~10天，且具有较高的阳性率，被认为目前诊断心肌梗死灵敏度和特异性最好的标志物，成为检出心肌损伤，特别是急性心肌梗死的“金标准”。CTnT（正常值<0.1ng/mL）在心肌损伤初期3~6h内也可以被检出，12～24h内达到峰值，浓度相比正常值升高30～200倍。CK-MB（正常值<5ng/mL）特异性较高，其浓度在心肌损伤4～8h后开始升高，但仅能持续3～4天，相比于cTnI具有较短的检测时间窗。MYO（正常值<80ng/mL）在心肌损伤发生2h后可达正常值2倍，4h达到峰值，但由于很快被清除，且其在骨骼肌内也大量存在，相比于cTnI具有特异性较低，诊断时间窗较短。目前已经发展出了多种方法检测上述蛋白，如电化学方法、酶联免疫法（ELISA）、纳米金标记法和荧光法等，但其中仍存在一些关键问题无法解决，从而限制了这些技术的应用，例如耗时较长，检测灵敏度还未能适应对急性心肌梗死发病早期时的低浓度蛋白检测等。
发明内容
本发明的目的在于提出一种对急性心肌梗死标志蛋白具有快速、灵敏响应的生物传感器及其制备方法，从而克服现有技术中的不足。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案：
一种面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，它包括具有FET场效应管结构的传感器基体，该传感器基体包括作为栅极的SOI硅片，所述硅片表面设有钝化层、一根以上表面偶联修饰有急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体的硅纳米线以及电极，所述电极包括分别与硅纳米线两端连接的金属源极和漏极；
同时，所述硅片表面上还设有微流道系统层，所述硅纳米线的至少局部表面暴露于该微流道系统层内的微流道中，所述微流道分别与微流道系统层上的样本溶液入口和样本溶液出口连通；
所述急性心肌梗死标志蛋白为心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶以及肌红蛋白中的任意一种以上。
进一步的讲，所述微流道系统层覆设在所述硅纳米线上，且所述硅纳米线表面整体暴露于该微流道系统层内的微流道中。
优选的，所述硅片表面设有由平行分布的复数硅纳米线组成的硅纳米线阵列。
所述硅纳米线宽度优选为50nm-150nm。
所述微流道系统层内分布有两条以上微流道，每一微流道分别与一根以上硅纳米线配合。
所述钝化层由氮化硅/氧化硅双层薄膜组成。
所述微流道系统层由聚二甲基硅氧烷构建形成。
如上所述面向急性心肌梗死诊断的生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）采用自上而下的方式依次在SOI硅片表面加工形成硅纳米线，金属电极以及钝化层，制得硅纳米线FET场效应管基体结构；
（2）在硅片表面上覆设微流道系统层，并至少使所述硅纳米线的局部表面暴露于该微流道系统层内的微流道中；
（3）利用共价键结合的方式在硅纳米线表面修饰急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体，获得目标产品。
进一步的讲，步骤（3）的具体操作过程如下：
ⅰ）在所述钝化层表面修饰醛基，从而将钝化层表面封闭；
ⅱ）依次利用具有活性氨基的硅烷分子和戊二醛修饰硅纳米线，从而在硅纳米线表面连接醛基；
ⅲ）将急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体通过共价键固定到硅纳米线表面；
ⅳ）利用乙醇胺或乙胺等具有活性氨基的分子以及惰性蛋白质修饰纳米线，以钝化硅纳米线表面及钝化层表面的残余醛基，排除非特异性吸附位点。
更具体的，步骤（3）的操作过程为：
首先使用20%乙醛溶液修饰由氮化硅薄膜组成的钝化层表面0.5~1h；
继而，以浓度为1~5%带有活性氨基的硅烷分子修饰硅纳米线表面30~45min，从而在硅纳米线的表面引入-NH2，所述硅烷分子为3-氨丙基三乙氧基硅烷和/或3-氨丙基三甲氧基硅烷；
然后，以2.5％戊二醛作为交联剂修饰硅纳米线表面0.5~1h，从而在硅纳米线表面修饰醛基；
而后，以含0.1~100μg/mL急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体的1× pH 7.4 磷酸盐缓冲在常温下液浸渍硅纳米线表面4~6小时或者4℃过夜，从而将急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体固定到硅纳米线表面；
最后，利用乙醇胺及1mg/mL的惰性蛋白质修饰硅纳米线表面及钝化层表面的残余醛基，排除非特异性吸附位点，所述惰性蛋白质为牛血清白蛋白、亲和素和链霉亲和素中的任意一种以上。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用准一维硅纳米线及cTnI、cTnT、CK-MB及MYO等具有高度敏感性和特异性的急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体等共同构建了生物传感器，其电学输运性质对表面状态的改变非常敏感，响应范围涵盖正常水平、急性心肌梗死发病早期低浓度以及增高期等各病程时期的标志蛋白浓度，能够实现极低浓度的多种目标蛋白的联合检测，特别是能适应发病早期的痕量标志蛋白检测，同时，其检测时间可以控制在数分钟以内，比传统检测手段具有更快的响应速度和更高的确诊率，因此具有重要的临床实用价值。
附图说明
图1A和图1B分别是本发明一较佳实施例中面向急性心肌梗死诊断的生物传感器的横向和纵向剖面结构示意图，该图中各标记含义分别为：1- SOI衬底硅、2-SOI埋氧层、3-硅纳米线、4-金属电极、5-心肌梗死标志蛋白单克隆抗体、6-钝化层、7-流道系统、8-样本溶液入口、9-样本溶液出口；
图2是应用图1所示面向急性心肌梗死诊断的生物传感器进行检测时的标志蛋白浓度-响应电流强度曲线图，显然，从该图可以看到，当待测样本中的心肌梗死标志蛋白达到一定浓度时，传感器进入到线性响应区，这一区域同时也是生物传感器的有效工作区，而随着蛋白浓度增大，传感器响应逐渐过渡到饱和区。
具体实施方式
针对目前临床医学中采用的急性心肌梗死检测方法所普遍存在的耗时长、检测灵敏度不适用于发病早期等问题，本案发明人经长期研究和实践，提出了本发明的方案，即，利用 “自上而下”方法制备出一种准一维硅纳米线场效应管器件，并将此器件与液体通道系统和能够对急性心肌梗死标志蛋白进行单一检测或多种蛋白联合检测单克隆抗体的组合构建出一种生物传感器，从而实现了快速、灵敏的急性心肌梗死检测，其尤其适用于急性心肌梗死发病早期的检测。
（一）前述生物传感器的结构如图1A和图1B所示，其制备工艺包括如下步骤：
I：首先利用“自上而下”的器件加工策略构建基于准一维硅纳米线的场效应管器件，器件包括纳米线区域、电极区域以及钝化层区域，其加工过程为：
首先利用电子束光刻技术在SOI硅片表面加工光刻胶图形，其中纳米线区域的宽度可选50nm、100nm或150nm，可制备单根以实现单种心肌梗死标志蛋白的检测，或多根纳米线以实现多种心肌梗死标志蛋白的联合检测；
继而利用离子束刻蚀（IBE）或反应离子刻蚀（RIE）技术刻蚀未被光刻胶覆盖的Si；
然后利用紫外光刻制备金属电极图形，再使用电子束蒸发、磁控溅射或热蒸发设备沉积镍-金或钛-金电极；
最后利用等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术在器件表面沉积氮化硅/氧化硅双层薄膜，其中钝化层表面为氮化硅，厚度100nm～500nm，氧化硅薄膜处于底层，厚度为50nm～100nm；
器件加工完成后利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建单通道或多通道微流道系统，其方法为：首先用紫外光刻在普通硅片表面制备单通道或多通道图形；然后利用深硅刻蚀技术在硅片表面加工出通道系统凸模；最后将PDMS浇筑至硅片表面，固化后揭下备用；通道高度为200～500μm，宽度为100～200μm。
II：利用共价键结合的方式在硅纳米线表面修饰急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体：
首先使用20%乙醛溶液修饰器件表面0.5~1h用于封闭钝化层表面的氮化硅薄膜；
继而将带有氨基（-NH2）的硅烷分子，包括3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）等通过硅纳米线表面的羟基修饰到纳米线的表面，从而在纳米线的表面引入-NH2，其中硅烷分子浓度为1~5%，修饰时间为30~45min；
然后使用2.5％戊二醛作为交联剂修饰器件0.5~1h，再修饰急性心肌梗死标志蛋白到纳米线表面；
最后利用乙醇胺或乙胺及1mg/mL的牛血清白蛋白（BSA）、亲和素（Avidin）或链霉亲和素（Streptavidin）等惰性蛋白质修饰表面残余醛基以排除在测量过程中引入的非特异性蛋白吸附。
III：在修饰心肌梗死标志蛋白的过程中，蛋白质溶液由1× pH 7.4 磷酸盐缓冲液作为溶剂，配置心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、心肌肌钙蛋白T单克隆抗体以及肌酸激酶同工酶单克隆抗体的最终浓度为0.1~10μg/mL，肌红蛋白单克隆抗体浓度为10~100μg/mL；将器件与蛋白溶液共同孵育常温4~6小时或者4℃过夜。
（二）前述生物传感器的性能检测过程为：
以硅纳米线两端的金属电极分别作为漏极（Drain）和源极（Source，施加电压V ds ，通过电流为I ds ），衬底硅作为栅极（Gate，施加电压为V g ）；
该传感器工作时利用蠕动泵将待测样本通入液体通道（亦称，微流道），在固定的V ds 与V g 下测量I ds ，通过与标准线性范围对比，I ds 的大小可表现出待测样本内各种标志蛋白的含量，从而反映出急性心肌梗死的发病程度；
所述待测样本为血清样本，由全血样本经37℃孵育以及离心处理获得。
（三）前述生物传感器的线性范围测定方法为：
I：首先利用血清配置不同浓度的心肌梗死标志蛋白，测定传感器对各种浓度的电流响应（V ds 施加0.25~1V，V g 施加2~5V），采集不同蛋白质浓度下的传感器电流响应I ds ，再利用蛋白质浓度和相应的I ds 制定出生物传感器的响应曲线并进行线性拟合，当信噪比>3时的浓度即为线性范围的起始点，当线性拟合系数>0.995时的浓度范围即为线性范围，由此可制定出生物传感器的标准曲线并标定出工作线性范围。
经测定，传感器对心肌肌钙蛋白I的线性范围为0.05~50ng/mL；心肌肌钙蛋白T的线性范围为0.05~50ng/mL；肌酸激酶同工酶线性范围为1.0~100ng/mL；肌红蛋白线性范围为5~250ng/mL，其均适应心肌梗死发病早期、病情发展过程中标志蛋白浓度增高及恢复期的检测。
II：不同批次以及放置时间较长的器件需要利用标准样品进行标准曲线的校正。其中标准样品为：利用血清配置各种心肌梗死标志蛋白标准样品，分两种浓度，即：心肌肌钙蛋白I与心肌肌钙蛋白T的标准样品浓度分别为0.05ng/mL以及50ng/mL，肌酸激酶同工酶标准样品浓度分别为1.0ng/mL以及100ng/mL；肌红蛋白标准样品浓度为5ng/mL及250ng/mL。
利用标准样品进行测量标准曲线的校正方法采用两点法，首先采集空白血清溶液以校正背景电流，再分别加入上述两种浓度的标准样品，测量传感器的电流响应值，重绘响应曲线的线性范围段以校正传感器响应。
（四）临床样本的测定：临床采集的血液经37℃孵育及静置后吸取上层血清，通入蠕动泵并测量传感器产生的响应电流，与标准曲线直接比对即可得出样品中标志蛋白的浓度。
下面结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但不应以此限制本发明的保护范围：
实施例1
利用准一维硅纳米线场效应管生物传感器测定心肌肌钙蛋白I：
1. 利用“自上而下”的方法制备单根准一维硅纳米线的场效应管：
首先利用电子束光刻技术在SOI硅片表面加工光刻胶图形，其中纳米线区域的宽度50nm，；
继而利用离子束刻蚀（IBE）技术刻蚀未被光刻胶覆盖的Si；
然后利用紫外光刻制备金属电极图形，再使用电子束蒸发设备沉积镍-金电极；
最后利用等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术在器件表面沉积氮化硅/氧化硅双层薄膜，其中钝化层表面为氮化硅，厚度100nm，氧化硅薄膜处于底层，厚度50nm；
器件加工完成后利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建单通道微流道系统，其方法为：首先用紫外光刻在普通硅片表面制备通道图形；然后利用深硅刻蚀技术在硅片表面加工出通道系统凸模；最后将PDMS浇筑至硅片表面，固化后揭下备用；通道高度为200μm，宽度为100μm。
2. 将上述场效应管浸入到20%乙醛水溶液反应0.5h，反应结束后用去离子水充分冲洗；将场效应管器件置于1% APTES乙醇溶液30min，反应完成后用大量乙醇冲洗表面并置于110℃下烘60min去除未牢固结合的APTES分子；继而将器件置于2.5%戊二醛溶液中0.5h，反应结束后置于0.1μg/mL 心肌肌钙蛋白I单克隆抗体磷酸盐溶液（1× pH 7.4）中，常温修饰4h，使抗体表面的-NH2与器件表面的醛基充分结合。继而置于1mol/L乙醇胺溶液中30min，最后用0.5mg/mL BSA处理器件，使BSA与器件表面残余-NH2充分结合，降低在器件测量过程因非特异性蛋白结合而引入的信号干扰。器件修饰完成后置于4℃冰箱内保存。
3. 利用血清配置0.05ng/mL及50ng/mL心肌肌钙蛋白I标准样品以校正生物传感器。首先将空白血清溶液通入蠕动泵内，使用Agilent B1500A半导体参数测试仪测量传感器对空白样品的电流响应以校正背景电流，再分别通入0.05ng/mL及50ng/mL心肌肌钙蛋白I血清溶液，测量生物传感器的响应，分别记录响应电流并绘制生物传感器的标准线性范围，其线性关系为：I ds =k×C cTnI +I 0 ，其中k代表灵敏度，由实测曲线计算得出；C cTnI 为样本中的心肌肌钙蛋白I浓度，其适用范围0.05~50ng/mL；I 0 为样本通入前的背景电流。
4. 临床全血样本首先在37℃下孵育30min后离心，吸取上层血清并引入蠕动泵中，测量传感器对血清样本的电流响应，工作电压分别为V ds =0.25V，V g =2V，记录生物传感器响应电流，与标准线性范围比对得出临床样本中心肌肌钙蛋白I的含量。
实施例2：
利用准一维硅纳米线场效应管生物传感器测定心肌肌钙蛋白T：
1. 利用“自上而下”的方法制备单根准一维硅纳米线的场效应管：
首先利用电子束光刻技术在SOI硅片表面加工光刻胶图形，其中纳米线区域的宽度100nm，；
继而利用反应离子刻蚀（RIE）技术刻蚀未被光刻胶覆盖的Si；
然后利用紫外光刻制备金属电极图形，再使用磁控溅射沉积钛-金电极；
最后利用等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术在器件表面沉积氮化硅/氧化硅双层薄膜，其中钝化层表面为氮化硅，厚度500nm，氧化硅薄膜处于底层，厚度100nm；
器件加工完成后利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建单通道微流道系统，其方法为：首先用紫外光刻在普通硅片表面制备通道图形；然后利用深硅刻蚀技术在硅片表面加工出通道系统凸模；最后将PDMS浇筑至硅片表面，固化后揭下备用；通道高度为500μm，宽度为200μm。
2. 将上述场效应管浸入到20%乙醛水溶液反应0.5h，反应结束后用去离子水充分冲洗；将场效应管器件置于5% APTMS乙醇溶液45min，反应完成后用大量乙醇冲洗表面并置于110℃下烘60min去除未牢固结合的APTES分子；继而将器件置于2.5%戊二醛溶液中1h，反应结束后置于0.1μg/mL 心肌肌钙蛋白T单克隆抗体磷酸盐溶液（1× pH 7.4）中，常温修饰6h，使抗体表面的-NH2与器件表面的醛基充分结合。继而置于1mol/L乙胺溶液中30min，最后用0.5mg/mL Avidin处理器件，使Avidin与器件表面残余-NH2充分结合，降低在器件测量过程因非特异性蛋白结合而引入的信号干扰。器件修饰完成后置于4℃冰箱内保存。
3. 利用血清配置0.05ng/mL及50ng/mL心肌肌钙蛋白T标准样品以校正生物传感器。首先将空白血清溶液通入蠕动泵内，使用Agilent B1500A半导体参数测试仪测量传感器对空白样品的电流响应以校正背景电流，再分别通入0.05ng/mL及50ng/mL心肌肌钙蛋白T血清溶液，测量生物传感器的响应，分别记录响应电流并绘制生物传感器的标准线性范围，其线性关系为：I ds =k×C cTnT +I 0 ，其中k代表灵敏度，由实测曲线计算得出；C cTnT 为样本中的心肌肌钙蛋白T浓度，其适用范围0.05~50ng/mL；I 0 为样本通入前的背景电流。
4. 临床全血样本首先在37℃下孵育30min后离心，吸取上层血清并引入蠕动泵中，测量传感器对血清样本的电流响应，工作电压分别为V ds =0.5V，V g =5V，记录生物传感器响应电流，与标准线性范围比对得出临床样本中心肌肌钙蛋白T的含量。
实施例3：
利用准一维硅纳米线场效应管生物传感器测定肌酸激酶同工酶：
1. 利用“自上而下”的方法制备单根准一维硅纳米线的场效应管：
首先利用电子束光刻技术在SOI硅片表面加工光刻胶图形，其中纳米线区域的宽度150nm，；
继而利用离子束刻蚀（IBE）技术刻蚀未被光刻胶覆盖的Si；
然后利用紫外光刻制备金属电极图形，再使用热蒸发设备沉积镍-金电极；
最后利用等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术在器件表面沉积氮化硅/氧化硅双层薄膜，其中钝化层表面为氮化硅，厚度300nm，氧化硅薄膜处于底层，厚度75nm；
器件加工完成后利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建单通道微流道系统，其方法为：首先用紫外光刻在普通硅片表面制备通道图形；然后利用深硅刻蚀技术在硅片表面加工出通道系统凸模；最后将PDMS浇筑至硅片表面，固化后揭下备用；通道高度为300μm，宽度为150μm。
2. 将上述场效应管浸入到20%乙醛水溶液反应0.5h，反应结束后用去离子水充分冲洗；将场效应管器件置于1% APTES乙醇溶液45min，反应完成后用大量乙醇冲洗表面并置于110℃下烘60min去除未牢固结合的APTES分子；继而将器件置于2.5%戊二醛溶液中1h，反应结束后置于0.1μg/mL 肌酸激酶同工酶单克隆抗体磷酸盐溶液（1× pH 7.4）中，常温修饰4h，使抗体表面的-NH2与器件表面的醛基充分结合。继而置于1mol/L乙醇胺溶液中30min，最后用0.5mg/mL Streptavidin处理器件，使Streptavidin与器件表面残余-NH2充分结合，降低在器件测量过程因非特异性蛋白结合而引入的信号干扰。器件修饰完成后置于4℃冰箱内保存。
3. 利用血清配置1ng/mL及100ng/mL肌酸激酶同工酶标准样品以校正生物传感器。首先将空白血清溶液通入蠕动泵内，使用Agilent B1500A半导体参数测试仪测量传感器对空白样品的电流响应以校正背景电流，再分别通入1ng/mL及100ng/mL肌酸激酶同工酶血清溶液，测量生物传感器的响应，分别记录响应电流并绘制生物传感器的标准线性范围，其线性关系为：I ds =k×C CK-MB +I 0 ，其中k代表灵敏度，由实测曲线计算得出；C CK-MB 为样本中的肌酸激酶同工酶浓度，其适用范围1.0~100ng/mL；I 0 为样本通入前的背景电流。
4. 临床全血样本首先在37℃下孵育30min后离心，吸取上层血清并引入蠕动泵中，测量传感器对血清样本的电流响应，工作电压分别为V ds =0.5V，V g =5V，记录生物传感器响应电流，与标准线性范围比对得出临床样本中肌酸激酶同工酶的含量。
实施例4：
利用准一维硅纳米线场效应管生物传感器测定肌红蛋白：
1. 利用“自上而下”的方法制备单根准一维硅纳米线的场效应管：
首先利用电子束光刻技术在SOI硅片表面加工光刻胶图形，其中纳米线区域的宽度50nm，；
继而利用离子束刻蚀（IBE）技术刻蚀未被光刻胶覆盖的Si；
然后利用紫外光刻制备金属电极图形，再使用热蒸发设备沉积镍-金电极；
最后利用等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术在器件表面沉积氮化硅/氧化硅双层薄膜，其中钝化层表面为氮化硅，厚度100nm，氧化硅薄膜处于底层，厚度100nm；
器件加工完成后利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建单通道微流道系统，其方法为：首先用紫外光刻在普通硅片表面制备通道图形；然后利用深硅刻蚀技术在硅片表面加工出通道系统凸模；最后将PDMS浇筑至硅片表面，固化后揭下备用；通道高度为200μm，宽度为100μm。
2. 将上述场效应管浸入到20%乙醛水溶液反应1h，反应结束后用去离子水充分冲洗；将场效应管器件置于1% APTES乙醇溶液45min，反应完成后用大量乙醇冲洗表面并置于110℃下烘60min去除未牢固结合的APTES分子；继而将器件置于2.5%戊二醛溶液中1h，反应结束后置于10μg/mL 肌红蛋白单克隆抗体磷酸盐溶液（1× pH 7.4）中，常温修饰4h，使抗体表面的-NH2与器件表面的醛基充分结合。继而置于1mol/L乙醇胺溶液中30min，最后用0.5mg/mL BSA处理器件，使BSA与器件表面残余-NH2充分结合，降低在器件测量过程因非特异性蛋白结合而引入的信号干扰。器件修饰完成后置于4℃冰箱内保存。
3. 利用血清配置5ng/mL及250ng/mL肌红蛋白标准样品以校正生物传感器。首先将空白血清溶液通入蠕动泵内，使用Agilent B1500A半导体参数测试仪测量传感器对空白样品的电流响应以校正背景电流，再分别通入5ng/mL及250ng/mL肌红蛋白血清溶液，测量生物传感器的响应，分别记录响应电流并绘制生物传感器的标准线性范围，其线性关系为：I ds =k×C MYO +I 0 ，其中k代表灵敏度，由实测曲线计算得出；C MYO 为样本中的肌红蛋白浓度，其适用范围5~250ng/mL；I 0 为样本通入前的背景电流。
4. 临床全血样本首先在37℃下孵育30min后离心，吸取上层血清并引入蠕动泵中，测量传感器对血清样本的电流响应，工作电压分别为V ds =1V，V g =5V，记录生物传感器响应电流，与标准线性范围比对得出临床样本中肌红蛋白的含量。
实施例5：
利用准一维硅纳米线场效应管生物传感器测定肌红蛋白：
1. 利用“自上而下”的方法制备多根准一维硅纳米线的场效应管：
首先利用电子束光刻技术在SOI硅片表面加工光刻胶图形，其中纳米线区域包含4根硅纳米线，宽度均为50nm；
继而利用离子束刻蚀（IBE）刻蚀未被光刻胶覆盖的Si；
然后利用紫外光刻制备金属电极图形，再使用电子束蒸发设备沉积镍-金电极；
最后利用等离子增强化学气相沉积（PECVD）技术在器件表面沉积氮化硅/氧化硅双层薄膜，其中钝化层表面为氮化硅，厚度100nm，氧化硅薄膜处于底层，厚度100nm；
器件加工完成后利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）构建四通道微流道系统，其方法为：首先用紫外光刻在普通硅片表面制备四通道图形；然后利用深硅刻蚀技术在硅片表面加工出通道系统凸模；最后将PDMS浇筑至硅片表面，固化后揭下备用；通道高度为200μm，宽度为100μm。
2. 将上述场效应管浸入到20%乙醛水溶液反应1h，反应结束后用去离子水充分冲洗；将场效应管器件置于1% APTES乙醇溶液45min，反应完成后用大量乙醇冲洗表面并置于110℃下烘60min去除未牢固结合的APTES分子；继而将器件置于2.5%戊二醛溶液中1h，反应结束后在不同纳米线通道分别通入10μg/mL 心肌肌钙蛋白I单克隆抗体、心肌肌钙蛋白T单克隆抗体、肌酸激酶同工酶单克隆抗体以及100μg/mL肌红蛋白单克隆抗体磷酸盐溶液（1× pH 7.4）中，常温修饰4h，使抗体表面的-NH2与器件表面的醛基充分结合。继而置于1mol/L乙醇胺溶液中30min，最后用0.5mg/mL BSA处理器件，使BSA与器件表面残余-NH2充分结合，降低在器件测量过程因非特异性蛋白结合而引入的信号干扰。器件修饰完成后置于4℃冰箱内保存。
3. 分别利用血清配置0.05ng/mL及50ng/mL心肌肌钙蛋白I标准样品，0.05ng/mL及50ng/mL心肌肌钙蛋白T，1ng/mL及100ng/mL肌酸激酶同工酶以及5ng/mL及250ng/mL肌红蛋白标准样品以校正生物传感器。首先将空白血清溶液通入蠕动泵内，使用Agilent B1500A半导体参数测试仪测量传感器对空白样品的电流响应以校正背景电流，再向相应通道分别通入上述标准样品以测量生物传感器的响应，分别记录响应电流并绘制生物传感器的标准线性范围，其线性关系分别为：I ds-cTnI =k cTnI ×C cTnI +I 0 ；I ds-cTnT =k cTnT ×C cTnT +I 0 ；I ds-CK-MB =k CK-MB ×C CK-MB +I 0 ；I ds-MYO =k MYO ×C MYO +I 0 ；其中I ds-cTnI 、I ds-cTnT 、I ds-CK-MB 及I ds-MYO 分别代表各个通道的电流值；k cTnI 、k cTnT 、k CK-MB 及k MYO 分别代表各种蛋白的检测灵敏度，由相应通道的实测曲线计算得出；C cTnI 、C cTnI 、C CK-MB 及C MYO 为样本中的心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶及肌红蛋白浓度，其适用范围分别为0.05~50ng/mL、0.05~50ng/mL、1.0~100ng/mL及5~250ng/mL； I 0 为样本通入前的背景电流。
4. 临床全血样本首先在37℃下孵育30min后离心，吸取上层血清并引入蠕动泵中，测量传感器对血清样本的电流响应，工作电压分别为V ds =1V，V g =5V，记录生物传感器各个通道的响应电流，与相应标准线性范围比对得出临床样本中四种心肌梗死标志蛋白的含量。
以上实施例对本发明面向急性心肌梗死诊断的生物传感器及其制备与检测方法已做了全面而翔实的叙述。本发明可以实现对急性心肌梗死标志蛋白的快速、灵敏检测；生物传感器的加工采用具有高度一致性、重复性且有效降低成本的微纳米加工方法，具有明显的应用前景。
需要指出的是：上述关于具体实施方式及实施例的介绍并非是对本发明的适用范围限制，在本发明构思范围内，所进行的各种添加、替换、变换等，也应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，它包括具有FET场效应管结构的传感器基体，该传感器基体包括作为栅极的SOI硅片，所述硅片表面设有钝化层、一根以上表面偶联修饰有急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体的硅纳米线以及电极，所述电极包括分别与硅纳米线两端连接的金属源极和漏极；
同时，所述硅片表面上还设有微流道系统层，所述硅纳米线的至少局部表面暴露于该微流道系统层内的微流道中，所述微流道分别与微流道系统层上的样本溶液入口和样本溶液出口连通；
所述急性心肌梗死标志蛋白为心肌肌钙蛋白I、心肌肌钙蛋白T、肌酸激酶同工酶以及肌红蛋白中的任意一种以上。
2.根据权利要求1所述的面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，所述微流道系统层覆设在所述硅纳米线上，且所述硅纳米线表面整体暴露于该微流道系统层内的微流道中。
3.根据权利要求1所述的面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，所述硅片表面设有由平行分布的复数硅纳米线组成的硅纳米线阵列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，所述硅纳米线宽度为50nm-150nm。
5.根据权利要求1-2中任一项所述的面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，所述微流道系统层内分布有两条以上微流道，每一微流道分别与一根以上硅纳米线配合。
6.根据权利要求1所述的面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，所述钝化层由氮化硅/氧化硅双层薄膜结构组成。
7.根据权利要求1所述的面向急性心肌梗死诊断的生物传感器，其特征在于，所述微流道系统层由聚二甲基硅氧烷构建形成。
8.如权利要求1所述面向急性心肌梗死诊断的生物传感器的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）采用自上而下的方式依次在SOI硅片表面加工形成硅纳米线，金属电极以及钝化层，制得硅纳米线FET场效应管基体结构；
（2）在硅片表面上覆设微流道系统层，并至少使所述硅纳米线的局部表面暴露于该微流道系统层内的微流道中；
（3）利用共价键结合的方式在硅纳米线表面修饰急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体，获得目标产品。
9.根据权利要求8所述面向急性心肌梗死诊断的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体操作过程如下：
ⅰ）在所述钝化层表面修饰醛基，从而将钝化层表面封闭；
ⅱ）依次利用具有活性氨基的硅烷分子和戊二醛修饰硅纳米线，从而在硅纳米线表面连接醛基；
ⅲ）将急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体通过共价键固定到硅纳米线表面；
ⅳ）利用具有活性氨基的分子以及惰性蛋白质修饰纳米线，以钝化硅纳米线表面及钝化层表面的残余醛基，排除非特异性吸附位点，所述具有活性氨基的分子至少选自乙醇胺和乙胺。
10.根据权利要求9所述面向急性心肌梗死诊断的生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）的具体操作过程为：
首先使用20%乙醛溶液修饰由氮化硅薄膜组成的钝化层表面0.5~1h；
继而，以浓度为1~5%带有活性氨基的硅烷分子修饰硅纳米线表面30~45min，从而在硅纳米线的表面引入-NH2，所述硅烷分子为3-氨丙基三乙氧基硅烷和/或3-氨丙基三甲氧基硅烷；
然后，以2.5％戊二醛作为交联剂修饰硅纳米线表面0.5~1h，从而在硅纳米线表面修饰醛基；
而后，以含0.1~100μg/mL急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体的1× pH 7.4 磷酸盐缓冲在常温下液浸渍硅纳米线表面4~6小时或者4℃过夜，从而将急性心肌梗死标志蛋白的单克隆抗体固定到硅纳米线表面；
最后，利用乙醇胺或乙胺及1mg/mL的惰性蛋白质修饰硅纳米线表面及钝化层表面的残余醛基，排除非特异性吸附位点，所述惰性蛋白质为牛血清白蛋白、亲和素和链霉亲和素中的任意一种以上。
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