CN102429934A - 纳米级银杏叶提取物外用制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种纳米级银杏叶提取物外用制剂,所述的制剂由银杏叶提取物和基质组成,所述的银杏叶提取物的粒径为10~1000nm。本发明还提供了一种所述的纳米级银杏叶提取物外用制剂在制备抗皮肤衰老或美白药物中的应用。本发明的纳米级银杏叶提取物外用制剂,解决了银杏叶提取物在外用制剂中难于吸收的问题,提高了银杏叶提取物对皮肤的穿透性,使银杏叶提取物透过皮肤的吸收率提高,通过局部外用抗皮肤衰老以及美白。以皮肤组织为渗透屏障,限制银杏叶提取物在人体全身吸收,避免银杏叶提取物在人体代谢过程中的毒副作用,从而达到抗皮肤衰老以及美白的疗效,生物利用度提高,提高了患者顺应性,为患者提供了一种新的给药途径。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米级银杏叶提取物外用制剂及其应用,属于医药技术领域。
背景技术
银杏叶中提取有药用成分的化合物主要为总黄酮类及银杏内脂等,简称为银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract,GBE)。研究证明,银杏叶提取物是一种抗氧化剂,具有独特的抗自由基作用,抑制血小板活性因子PAF的活性,可促进肌肤的血液循环、减少自由基的生成,防止自由基对皮肤的伤害,预防皮肤的敏感反应,尤其是光敏感反应。银杏叶提取物还有治疗粉刺、美白皮肤的作用。银杏叶提取物对多种类型的病菌均有不同程度的抑制作用,银杏内酯是天然的血小板活化因子受体拮抗剂,对其诱导的皮肤炎症反应有明显的抑制作用,可促进受损肌肤的愈合。
银杏叶提取物目前临床为口服给药或静脉注射用药,但缺点是口服存在着首过消除效应及对胃肠道带来的刺激等不良反应,如头昏、头痛、乏力、口干、舌燥、胸闷、胃不适、食欲减退、腹胀、便秘、腹泻等。银杏叶复杂的成份作为注射剂使用具有巨大的安全隐患。
发明内容
本发明的目的克服现有技术的不足之处,提供一种银杏叶提取物得外用制剂,可避免口服制剂的不良作用以及注射剂的安全隐患,有着片剂的携带、使用方便,有着注射剂的直接用于作用部位起效快、吸收好,有着口服液的较高用药依从性。
本发明的纳米级银杏叶提取物外用制剂,所述的制剂由银杏叶提取物和基质组成,所述的银杏叶提取物的粒径为10~1000nm。
优选地,
所述的银杏叶提取物的含量为1%wt~5%wt,
所述的基质选自十八醇、十六醇、硬脂酸、异硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、十二烷基硫酸钠、甘油、平平加o、液状石蜡、固体石蜡、吐温-80、吐温-60、司盘-60、司盘-80、聚乙二醇4000、聚乙二醇400、聚乙二醇200、卡波姆、丙二醇、乙醇、苯甲醇、三乙醇胺、羧甲基纤维素、EDTA、羟苯甲酯、氮酮、羟苯乙酯、依地酸二钠和无水亚硫酸钠中的多个。
所述的制剂剂型为乳膏、软膏或凝胶。
本发明的纳米级银杏叶提取物外用制剂在制备抗皮肤衰老或美白药物中的应用。
本发明的纳米级银杏叶提取物外用制剂,解决了银杏叶提取物在外用制剂中难于吸收的问题,提高了银杏叶提取物对皮肤的穿透性,使银杏叶提取物透过皮肤的吸收率提高,通过局部外用抗皮肤衰老以及美白。以皮肤组织为渗透屏障,限制银杏叶提取物在人体全身吸收,避免银杏叶提取物在人体代谢过程中的毒副作用,从而达到抗皮肤衰老以及美白的疗效,生物利用度提高,提高了患者顺应性,为患者提供了一种新的给药途径。
附图说明
图1-1为正常皮肤组空白基质的实验兔皮肤病理检查图(HE×100);
图1-2为正常皮肤组银杏叶乳膏的实验兔皮肤病理检查图(HE×100);
图1-3为破损皮肤组空白基质的实验兔皮肤病理检查图(HE×100);
图1-4为破损皮肤组银杏叶乳膏的实验兔皮肤病理检查图(HE×100);
图2-1为正常对照组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-2为模型对照组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-3为空白对照组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-4为低剂量组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-5为中剂量组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-6为高剂量组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-7为维生素E组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图2-8为口服给药组小鼠皮肤病理检查图(HE×200);
图3为皮肤组织匀浆中MDA含量图;
图4为皮肤组织匀浆中SOD含量图;
图5为皮肤组织匀浆中HYP含量图;
图6为皮肤组织匀浆中SOD/GAPDH图。
具体实施方式
实施例1
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为150nm,按下述处方配制成银杏叶提取物乳膏:
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为150nm,备用。将处方量卡波姆置1/2处方量的纯化水中溶胀24小时,备用。将无水亚硫酸钠、依地酸二钠、三乙醇胺置剩余处方量水中溶解完全倒入卡波姆中,搅拌均匀,加热至75~80℃,备用。将处方量的硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、平平加o、氮酮、羟苯乙酯加热至75~80℃,至完全澄清,保温备用。将水相倒入油相中,搅拌均匀,得空白乳膏。将处方量纳米级Egb粉末投至处方量甘油中,搅拌均匀后,超声30分钟。倒入乳膏基质中,搅拌均匀,得乳膏。测定含量,灌装,包装,即得银杏叶提取物乳膏。
实施例2
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为600nm,按下述处方配制成银杏叶提取物乳膏:
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为600nm,备用。取硬脂酸、十八醇、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、液状石蜡、司盘60加热熔化为油相,保温至80~85℃。另将水加热至80~85℃,再加入处方量的吐温80、羟苯甲酯、EDTA溶解为水相。将水相倒入到油相中,边加边搅,15-20分钟后停止加热后,继续搅拌至室温。将主药加入到处方量的甘油中,搅拌分散均匀,倒入至乳膏基质中,搅拌均匀。测定含量,灌装,包装,即得银杏叶提取物乳膏。
实施例3
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为150nm,按下述处方配制成银杏叶提取物软膏:
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为150nm,备用。取白凡士林、固体石蜡加热熔化,搅拌至室温。将主药加入到处方量的液状石蜡中,搅拌分散均匀,倒入至软膏基质中,搅拌均匀。测定含量,灌装,包装,即得银杏叶提取物软膏。
实施例4
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为600nm,按下述处方配制成银杏叶提取物软膏:
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为600nm,备用。取聚乙二醇4000、聚乙二醇400加热熔化为基质,搅拌至室温。将主药加入到处方量的甘油中,搅拌分散均匀,倒入至软膏基质中,搅拌均匀。测定含量,灌装,包装,即得银杏叶提取物软膏。
实施例5
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为150nm,按下述处方配制成银杏叶提取物凝胶:
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为150nm,备用。将卡波姆置80%处方量的水中,溶胀24小时。将处方量EDTA、三乙醇胺加入到剩余处方量的水中,搅拌溶解倒入卡波姆中,将处方量的乙醇倒入卡波姆基质中,搅拌均匀。将主药加入到处方量的丙二醇中,搅拌分散均匀,倒入到卡波姆基质中。搅拌均匀。测含量,灌装,包装,即得银杏叶提取物凝胶。
实施例6
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为600nm,按下述处方配制成银杏叶提取物凝胶:
将银杏叶提取物原料通过纳米技术料粉碎成平均粒径为600nm,备用。将羧甲基纤维素置80%处方量的水中,溶胀24小时。将处方量EDTA加入到剩余处方量的水中,搅拌溶解倒入基质中,搅拌均匀。将主药加入到处方量的丙二醇中,搅拌分散均匀,倒入到基质中。搅拌均匀。测含量,灌装,包装,即得银杏叶提取物凝胶。
实施例7纳米级银杏叶提取物外用制剂抗皮肤衰老毒理、药效学试验
1、刺激性试验
1.1分组及给药
实验兔12只,分为正常皮肤组和破损皮肤组两组,采用同体左右侧自身对比法,每组6只,雌雄各半。试验前24h对给药区进行脱毛处理,左右各一块,去毛范围3cm×3cm。破损皮肤组在用药部位划“井”字,以渗出血为度。所有实验兔左侧脱毛处涂抹含银杏叶提取物4%浓度的乳膏0.5g,右侧涂抹等量空白基质作对照。用纱布覆盖,再用胶布固定,每天一次,连续14天,每次涂药前先用温水洗净皮肤。每日涂药前仔细观察涂药处皮肤有无红斑、水肿,停药后继续观察3天,根据皮肤刺激反应评分标准计算皮肤刺激性反应评分分值,进行皮肤刺激性强度评价;同时取皮肤做组织病理学检查。
1.2结果
1.2.1正常皮肤组
各实验兔左右两侧背部无皮肤红斑形成,也未见皮肤糜烂、溃疡等病变。反应评分分值均低于0.5(见表1)。病理检查显示:该组所有皮肤表皮完整,颗粒层、棘层厚度正常,细胞未见变性、坏死。真皮血管无明显的扩张、充血,间质无水肿,毛囊、皮脂腺等皮肤附件结构清楚(图1-1,1-2)。表明无论是空白基质还是银杏叶乳膏对正常皮肤均无刺激性。
1.2.2破损皮肤组
各实验兔左右两侧背部无皮肤红斑形成,也未见皮肤糜烂、溃疡等病变。给药初期,涂抹空白基质(2-6天)及银杏叶乳膏(2-7天)的皮肤评分分值高于0.5,低于2.99,随后症状逐渐减轻并消失(见表1)。说明空白基质及银杏叶乳膏对破损皮肤具有轻度刺激性,且可自行消退。
病理检查显示:该组所有表皮完整,颗粒层、棘层厚度正常,细胞未见变性、坏死。真皮血管无明显的扩张、充血,间质无水肿,毛囊、皮脂腺等皮肤附件结构清楚(图1-3,1-4)。
表1银杏叶乳膏皮肤刺激性反应评分平均值
2、银杏叶提取物乳膏抗皮肤衰老试验
2.1衰老模型的建立
取3月龄KM小鼠70只,小鼠颈背部皮下注射1000mg/kg D-半乳糖,1次/天,连续注射42天。另取10只小鼠作为正常对照组,皮下注射等体积0.9%氯化钠注射液。所有小鼠背部脱毛,暴露约2cm×2cm大小皮肤。
2.2分组及给药
将上述衰老模型小鼠随机分成6组,每组10只。空白对照组涂抹0.5g不含银杏叶提取物的空白基质,低、中、高剂量组分别涂抹含银杏叶提取物1%、2%、4%浓度的乳膏0.5g,维生素E组涂抹0.5g维生素E乳膏。每日早晚各一次,开始造模当日起连续涂抹42天,涂抹前先用温水洗净皮肤,并及时剃去新长出的鼠毛。口服给药组灌胃给予100mg/kg的银杏叶提取物,每日早晚各一次,开始造模当日起连续给药42天。
2.3实验标本与取材方法
42天后,所有小鼠颈椎脱臼处死,去毛,取背部正中皮肤0.5cm×0.5cm大小,迅速放入10%中性福尔马林液中固定,作组织病理学检查。取余下背部皮肤用于制备10%皮肤匀浆液。
2.410%皮肤匀浆液的制备
剪取背部皮肤组织0.5g,用预冷生理盐水漂洗,除去皮下脂肪和其他结缔组织,滤纸拭干,称重,剪碎组织块后倒入匀浆管中,加入该组织块9倍质量的生理盐水,用组织分散机制成质量分数为10%的组织匀浆。取少量组织匀浆涂片,在显微镜下观察细胞破碎情况,若破碎不完全,则反复冻溶3次,使其完全破碎,细胞内容物完全游离在液相中。
2.5SOD、MDA及HYP的检测
2.5.1组织切片染色方法
取已固定皮肤组织,石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、HE染色,光学显微镜(×200)下观察。
2.5.2皮肤生化指标的测定
皮肤组织匀浆SOD活力、MDA含量的分别参照南京建成生物工程公司SOD及MDA试剂盒说明书方法测定。
2.5.3皮肤组织HYP含量的测定
参照南京建成生物工程公司HYP试剂盒说明书方法测定皮肤组织匀浆中HYP含量。
2.5.4统计学处理
2.6抗衰老实验检测结果
2.6.1动物外观及行为学观察
连续造模42天后,模型对照组小鼠出现脊椎隆起,体形消瘦,毛色灰暗稀疏、无光泽,行动迟缓,与正常组相比,出现明显的老年体征,证明衰老模型成功建立。银杏叶乳膏中、高剂量组及维生素E组的衰老模型小鼠皮毛浓密光亮、顺滑、行动敏捷;空白基质组及低剂量组小鼠则无明显改善。
2.6.2皮肤组织病理学形态观察
正常对照组(图2-1),皮肤组织结构正常,基底细胞排列整齐,真皮层厚度正常,细胞层数均匀,胶原纤维丰富,排列致密,毛囊数目正常,排列均匀。模型对照组(图2-2)、空白对照组(图2-3)皮肤结构紊乱,真皮厚度变薄,皮下组织稀疏,基底细胞层数减少,体积减小,胶原纤维排列疏松,厚度变薄,毛囊数目减少。维生素E组(图2-7)、口服给药组(图2-8),皮肤结构较清晰,真皮层较模型对照组增厚,基底细胞增多,胶原纤维数目增多,排列较致密,毛囊数目较模型对照组增多。中、高剂量组(图2-5、2-6),皮肤结构清晰完整,与模型对照组相比,真皮层明显增厚,基底细胞增多,胶原纤维数目增多,排列致密,毛囊数目增多。低剂量组(图2-4)上述改善不明显,与模型对照组镜下所见无明显不同。
2.6.3小鼠皮肤生化指标检测
结果见表2、图3~图6,与正常对照组比较,模型对照组小鼠皮肤中丙二醛含量明显升高(P<0.01),超氧化物歧化酶活力明显减低(P<0.01),羟脯氨酸含量也显著降低(P<0.01)。与模型对照组相比,维生素E组小鼠皮肤中丙二醛含量明显降低(P<0.01),超氧化物歧化酶活力明显升高(P<0.05),羟脯氨酸含量也显著升高(P<0.05);银杏叶乳膏各剂量组小鼠皮肤中丙二醛含量降低,超氧化物歧化酶活力升高,羟脯氨酸含量也升高,除低剂量组外均具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),其中高剂量组各项指标的变化最为明显,并优于维生素E组。空白基质组各项指标与模型对照组比较均无显著差异(P>0.05)。
注:与模型对照组比较,*:P<0.05,**:P<0.01
3、银杏叶提取物乳膏对皮肤抗衰老SOD基因表达检测方法与结果
2.1皮肤组织总RNA的提取:总RNA的提取采用改进的异硫氰酸胍酚-氯仿RNA快速提取法。
2.2反转录:
取1μg总RNA作为模板反转录产生第一链cDNA(10μl),加入2μl OligodT12.18(50μM),0.5μl随机引物(50μM),4.5μl PEPC水,总体积为17μl。在72℃变性5分钟,置冰上快速冷却,再加入下面的组分:5.0μl 5X缓冲液,2.5μl dNTP(10mM),0.5ul RNase抑制剂,1.0μl ReverTra Ace,总体积25μl,混匀后,42℃反应1小时,95℃反应5分钟(使反转录酶失活,单链DNA变性),置冰上快速冷却。-20℃保存。
2.3实时定量PCR分析:
以小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参基因,进行Cu-Zn SOD基因的实时定量PCR分析,检测SOD基因的表达量。
表3.实时定量PCR的引物序列
反应体系:SYBR Green 4μl,上、下游引物(400pmol/μl)混合物各3μl,cDNA1μl,总计8μl。95℃1分钟预变性,然后按照95℃10秒,60℃1分钟,重复40个循环,融解曲线:95℃15秒,65℃15秒,95℃15秒。
2.4实时定量PCR结果分析
Ct值(cycle threshold):每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用GAPDH作为内参照基因,运用公式2-ΔΔCT计算目的基因的相对表达量。
2.5结果
以小鼠基因GAPDH作为内参,用实时定量PCR方法检测各组小鼠皮肤组织铜锌SOD基因mRNA变化.表3显示,D-半乳糖造模小鼠SOD基因表达下调,口服维生素E阳性对照组,口服银杏提取物组,银杏乳膏涂抹组SOD基因均有表达升高,其中银杏乳膏组中,高剂量组基因表达相对上调具有显著性差异,特别是高剂量组SOD基因表达上调极显著,结果见表4。
注:与模型组比较,*P<0.05表示差异显著,**P<0.01表示差异极显著.
4结论
实验研究结果表明,中、高剂量的银杏叶乳膏能明显增加衰老皮肤中羟脯氨酸含量,使衰老皮肤胶原蛋白的合成增加,进而促进胶原纤维形成,使皮肤真皮层厚度增加,从而缓解皮肤衰老。皮肤组织病理学形态观察也验证了这一结果。同时,银杏叶乳膏通过增强SOD基因表达,提高SOD活力,降低MDA含量,从而清除体内存在自由基,降低过氧化脂质形成速度,减少氧化应激,延缓皮肤衰老。高剂量的银杏叶乳膏抗皮肤衰老的效果明显优于维生素E乳膏。
而在小鼠局部给予银杏叶提取物(EGB)乳膏后,小鼠皮肤中的SOD基因表达上调,SOD、HYP有明显的升高,SOD酶活力上升,证明了银杏叶提取物(EGB)乳膏的抗衰老效果。通过与维E组、口服银杏叶提取物(EGB)粉末组的SOD、HYP、MDA等参数的对比,说明银杏叶提取物乳膏的抗衰老效果优于目前临床上使用的维E乳膏。局部效疗优于口服组,且能降低口服带来的不良反应。说明EGb乳膏涂于皮肤表面,有很好的吸收,清除过多的氧自由基,增加皮肤胶原蛋白的合成能力,抑制衰老。
Claims (5)
1.纳米级银杏叶提取物外用制剂,其特征在于,所述的制剂由银杏叶提取物和基质组成,所述的银杏叶提取物的粒径为10~1000nm。
2.根据权利要求1所述的纳米级银杏叶提取物外用制剂,其特征在于,所述的银杏叶提取物的含量为1%wt~5%wt。
3.根据权利要求1所述的纳米级银杏叶提取物外用制剂,其特征在于,所述的基质选自十八醇、十六醇、硬脂酸、异硬脂酸、单硬脂酸甘油酯、白凡士林、十二烷基硫酸钠、甘油、平平加o、液状石蜡、固体石蜡、吐温-80、吐温-60、司盘-60、司盘-80、聚乙二醇4000、聚乙二醇400、聚乙二醇200、卡波姆、丙二醇、乙醇、苯甲醇、三乙醇胺、羧甲基纤维素、EDTA、羟苯甲酯、氮酮、羟苯乙酯、依地酸二钠和无水亚硫酸钠中的多个。
4.根据权利要求1所述的纳米级银杏叶提取物外用制剂,其特征在于,所述的制剂剂型为乳膏、软膏或凝胶。
5.如权利要求1-4中任意一种所述的纳米级银杏叶提取物外用制剂在制备抗皮肤衰老或美白药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
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C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120502 |