CN102423351A

CN102423351A - 用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物

Info

Publication number: CN102423351A
Application number: CN2011101542579A
Authority: CN
Inventors: 林娜; 陈卫衡; 孔祥英; 王荣田; 田能
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2012-04-25
Anticipated expiration: 2031-06-09
Also published as: CN102423351B

Abstract

本发明提供了一种用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：牛膝10～20、黄芪15～45、当归10～20、川芎10～20、赤芍6～18、桃仁10～20、红花10～20、地龙10～20、桂枝10～20、木瓜10～20、威灵仙10～20。本发明提供的含引经药牛膝的中药组合物具有促进自体骨髓干细胞归巢的作用，从而促进股骨头内骨修复与血管再生，对延缓股骨头坏死等骨关节疾病的病情发展具有显著效果，且毒副作用小，价格低廉。

Description

用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物

技术领域

本发明涉及一种中药组合物及其应用，具体地说，涉及一种用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物。

背景技术

股骨头坏死是一种发病率、致残率均较高的骨伤科常见难治性疾病，目前，我国的发病人数约为500～750万，且每年的新增患者达10～20万。股骨头坏死的治疗治疗有非手术和手术治疗两类，但是总体疗效并不满意，因此，寻求有效的治疗方法仍然是研究者们探索的方向。

干细胞治疗股骨头坏死是近年来兴起的治疗方法，但目前多集中在MSCs移植替代的研究，并且大多数研究还处于体外和动物体内实验阶段，要在临床推广应用还需要大量的研究和人体实验。

干细胞治疗的另一种方法是动员自体MSCs到外周血，通过血液循环使其“归巢”到病灶，以其无创伤性、不需外科手术或介入治疗的专门设备、不必首先在体外分离纯化并扩增干细胞等特点，因而更具有潜在的临床应用价值。但是由于因损伤引起机体自身修复反应，释放到外周血的BMSCs数量较少，归巢到病灶部位的干细胞数目更是极少，其自我修复的作用也极为有限。因此，如何增加外周血的干细胞数目及促进干细胞“归巢”到病灶，是自体干细胞治疗的难点。研究已证实，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是强有力的干细胞动员剂、可以在较短时间内使外周血干细胞增高数十倍至数百倍。因此，亟需研发具有促进干细胞归巢作用的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物，由如下重量份的原料药制成：牛膝10～20、黄芪15～45、当归10～20、川芎10～20、赤芍6～18、桃仁10～20、红花10～20、地龙10～20、桂枝10～20、木瓜10～20和威灵仙10～20。

优选地，前述含引经药牛膝的中药组合物，由如下重量份的原料药制成：牛膝12～18、黄芪20～40、当归12～18、川芎12～18、赤芍9～15、桃仁12～18、红花12～18、地龙12～18、桂枝12～18、木瓜12～18和威灵仙12～18。

更优选地，前述含引经药牛膝的中药组合物，由如下重量份的原料药制成：牛膝15、黄芪30、当归15、川芎15、赤芍12、桃仁15、红花15、地龙15、桂枝15、木瓜15和威灵仙15。

用于制备本发明中药组合物的原料药，其中，黄芪甘温，益气助推血行、当归甘温，养生活血，两者共用为君药；赤芍酸寒，活血化瘀，桂枝辛温，温经通脉，散寒止痛，地龙通经活络，川芎血中之气药，辛温走窜而行气，三者活血化瘀止痛为臣药；木瓜、威灵仙长于疏通经络，与地龙相配增强疏经通痹之功，桃仁、红花优于散瘀止痛、通络，共为佐药；牛膝，入血分，活血通经，且能引血下行，“能引诸药下行”，直达病所，为使药。诸药合用，共奏益气活血、疏经通痹之功。

本发明所述的重量份可以是μg、mg、g或kg等医药领域公知的重量单位。

本发明所述含引经药牛膝的中药组合物，优选使用口服制剂，包括水煎剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或口服液等，上述剂型均可以通过本领域常规方法制备得到。其中，优选为水煎剂(汤剂)，其制备方法为：将原料药加5～7倍重量的水，浸泡1～1.5小时，然后煎煮30分钟，过滤；药渣再加3～5倍重量的水，煎煮20分钟，过滤；合并两次滤液，制成水煎剂。

本发明还提供上述中药组合物在制备促进骨髓干细胞归巢药物中的应用。

本发明进一步提供上述中药组合物在制备治疗股骨头坏死的药物中的应用。

本发明含引经药牛膝的中药组合物，是基于中医药引经理论、干细胞归巢的理论以及干细胞技术，结合多年临床研究，采用益气活血、疏经通痹之品和引经药牛膝组成。本发明提供的含引经药牛膝的中药组合物具有促进骨髓干细胞归巢到股骨头组织中的作用，从而促进骨修复与血管新生，起到延缓股骨头坏死疾病进程的作用，对治疗早中期股骨头坏死效果尤佳，且毒副作用小、价格低廉。

附图说明

图1为显微镜下4w时四组动物股骨头组织中Brdu免疫组织化学染色结果，A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组。

图2为显微镜下4w时四组动物股骨头组织中SDF-1免疫组织化学染色结果，A伪手术组、B模型、C活骨组、D本发明组。

图3为显微镜下4w时四组动物股骨头组织病理形态学变化，A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组。

图4为显微镜下4w时四组动物股骨头组织中BMP2原位杂交检测结果，A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组。

图5为显微镜下4w时四组动物股骨头组织中VEGF免疫组织化学染色结果，A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 含引经药牛膝的中药组合物(水煎剂)及其制备方法

牛膝15 黄芪30 当归15 川芎15

赤芍12 桃仁15 红花15 地龙15

桂枝15 木瓜15 威灵仙15

按处方量称重上述原料药并混合，向原料药中加5倍重量的水，浸泡1.5小时后，煎煮30分钟，过滤；药渣再加3倍重量的水，煎煮20分钟，过滤；合并两次滤液，制成水煎剂。

实施例2 含引经药牛膝的中药组合物(水煎剂)及其制备方法

牛膝10 黄芪15 当归10 川芎10

赤芍6 桃仁10 红花10 地龙10

桂枝10 木瓜10 威灵仙10

实施例3 含引经药牛膝的中药组合物(水煎剂)及其制备方法

牛膝20 黄芪45 当归20 川芎20

赤芍18 桃仁20 红花20 地龙20

桂枝120 木瓜20 威灵仙20

按处方量称重上述原料药并混合，向原料药中加7倍重量的水，浸泡1小时后，煎煮30分钟，过滤；药渣再加5倍重量的水，煎煮20分钟，过滤；合并两次滤液，制成水煎剂。

实施例4 含引经药牛膝的中药组合物(丸剂)及其制备方法

1、按处方量称重下述原料药

牛膝15 黄芪30 当归15 川芎15

赤芍12 桃仁15 红花15 地龙15

桂枝15 木瓜15 威灵仙15

2、制备方法

(1)将牛膝、川芎、木瓜、桂枝、威灵仙研磨成粗粉，用80％乙醇回流提取2次，料液重量比为1∶20，提取液减压浓缩，干燥得浸膏。

(2)将地龙打粉，过100目筛，备用。

(3)向赤芍、桃仁、红花中加入10倍重量的纯化水，回流提取，提取液减压浓缩，干燥得浸膏。

(4)当归和黄芪用6倍重量的水煎煮提取3次，每次2小时，提取液醇沉，沉淀真空干燥，得到的药渣再以8倍重量的70％乙醇提取2次，每次1.5h，提取液浓缩干燥，得浸膏。

(5)将(1)、(3)和(4)中得到的浸膏与地龙细粉混匀。

(6)以水或黄酒、醋为黏合剂，泛制法制成水丸剂。

(7)以炼蜜为黏合剂，制成蜜丸。

实施例5 含引经药牛膝的中药组合物(胶囊剂)及其制备方法

1、按处方量称重下述原料药

牛膝15 黄芪30 当归15 川芎15

赤芍12 桃仁15 红花15 地龙15

桂枝15 木瓜15 威灵仙15

2、制备方法

(2)将地龙打粉，过100目筛，备用。

(5)将(1)、(3)和(4)中得到的浸膏与地龙细粉混合，加入1∶1～3(重量比)的淀粉、糊精或乳糖等辅料，混匀，制粒，装胶囊，即得。

实施例6 含引经药牛膝的中药组合物(颗粒剂)及其制备方法

1、按处方量称重下述原料药

牛膝15 黄芪30 当归15 川芎15

赤芍12 桃仁15 红花15 地龙15

桂枝15 木瓜15 威灵仙15

2、制备方法

(2)将地龙打粉，过100目筛，备用。

(5)将(1)、(3)和(4)中得到的浸膏与地龙细粉混合，加入1∶1～3(重量比)的淀粉、糊精或乳糖等辅料，混匀，制粒，即得。

实施例7 含引经药牛膝的中药组合物(冲剂)及其制备方法

1、按处方量称重下述原料药

牛膝15 黄芪30 当归15 川芎15

赤芍12 桃仁15 红花15 地龙15

桂枝15 木瓜15 威灵仙15

2、制备方法

(2)将地龙打粉，过100目筛，备用。

(5)将(1)、(3)和(4)中得到的浸膏与地龙细粉混合，加入1∶1～3(重量比)的淀粉、糊精或乳糖等辅料，混匀，制成粉剂或颗粒状冲剂。

实验例含引经药牛膝的中药组合物在促进骨髓干细胞归巢和治疗股骨头坏死中的应用

1材料：实施例1的水煎剂(水浴加热浓缩至含生药1g/mL)、健康成年日本大耳白兔(北京维通利华实验动物技术有限公司)。

2方法与结果

2.1方法

2.1.1模型制备和给药

采用液氮冷冻左侧股骨头方法建立兔股骨头坏死模型，造模后将其随机分为3组，并设立伪手术对照。造模后各组动物给予皮下注射G-CSF 30μg/kg·d，连续7天，同时分别给予实施例1的水煎剂(本发明组)、活骨汤(实施例1不含牛膝)水煎剂(活骨组)及蒸馏水(模型组、伪手术组)。

2.1.2动员骨髓干细胞与干细胞归巢指标检测

各组动物于皮下rhG-CSF注射前、注射后3、5、7天分别检测外周血白细胞计数，观察不同时间点白细胞数量的变化趋势，以间接反应骨髓干细胞的动员情况。取材前3天所有实验动物腹腔注射BrdU50mg/kg，连续3天。给药2w和4w后，每组4只动物处死取左侧股骨头，4％多聚甲醛固定、盐酸甲酸溶液脱钙、梯度酒精脱水，常规石切片。免疫组织化学染色检测BrdU和SDF-1的表达，以观察对骨髓干细胞归巢的作用。

2.1.3对股骨头坏死兔的治疗作用

上述组织，分别采用H E染色股骨头组织病理学观察，以鉴定本发明中药组合物对股骨头坏死兔的治疗作用。

2.1.4对股骨头坏死兔骨修复的影响

动物处死前取血，分离血清，ELISA法检测血清骨钙素(BGP)的水平，上述骨组织切片，经原位杂交检测股骨头BMP2的表达，以确定股骨头骨修复的情况。

2.1.5对股骨头坏死兔血管新生的影响

上述骨组织切片，经免疫组织化学检测股骨头VEGF的表达，以明确股骨头血管新生的情况。

2.2结果

2.2.1干细胞动员情况

G-CSF是一种常用的骨髓干细胞动员剂，它可将骨髓干细胞动员后，释放到外周血。因此常用外周血细胞计数来评价其动员情况。本发明中，采集各组动物注射rhG-CSF前和注射后3、5、7天静脉血，通过测量血细胞数量，主要是白细胞数量，来观察不同时间点骨髓干细胞的动员情况，结果如表1所示。

表1 rhG-CSF对各组动物外周WBC计数的影响

由表1可以看出，注射rhG-CSF动员剂后外周血WBC数量明显升高，且随着给予rhG-CSF时间延长，WBC数量进一步增加，注射后的7天达到峰值。各组动物于注射rhG-CSF前后呈现相同的趋势，并且各组之间无显著性差别，表明应用rhG-CSF可以成功动员骨髓干细胞到外周血。

2.2.2促进骨髓干细胞归巢作用

2.2.2.1对股骨头组织BrdU表达的影响

BrdU是一种胸腺嘧啶核苷的类似物，能够掺入到增殖或分裂细胞的核内，因此被广泛用来标记增殖期细胞，尤其是干细胞，以观察其增殖情况。在实验后2周和4周分别给动物注射BrdU，并取股骨头进行免疫组织化学染色，结果如表2所示。

表2 对股骨头组织BrdU表达的影响

注：与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表2可以看出，与伪手术组相比，2w和4w时模型组BrdU阳性细胞计数增多，但无统计学差异(P＞0.05)。与模型组相比，2w时仅本发明组显著增加(P＜0.05)，4w时活骨组和本发明组阳性细胞计数均显著性增加(P＜0.01)，表明本发明中药组合物对干细胞归巢有促进作用。

图1为显微镜下4w时四组动物股骨头组织中Brdu免疫组织化学染色结果，图片放大倍数为x400。图片显示A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组。各组动物均有Brdu阳性细胞表达，活骨组和本发明阳性细胞计数均高于模型组。

2.2.2.2对股骨头组织SDF-1的表达的影响

SDF-1是目前所知的促进干细胞归巢的最主要的细胞因子，我们分别检测伪手术组、模型组、活骨组及本发明组股骨头组织中SDF-1阳性表达，结果如表3所示。

表3 对股骨头组织SDF-1表达的影响

注：与伪手术组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.01；与模型组比较^**P＜0.01；与活骨组比较^△P＜0.05。

由表3可以看出，与伪手术组比较，2w时模型组SDF-1阳性平均光密度(IOD值)明显升高(P＜0.01)，4w时稍有下降，但无显著性差异；与模型组比较，2w、4w时，活骨组和本发明组IOD值均明显增高(P＜0.01)，且在2w时本发明组IOD值高于活骨组(P＜0.05)。SDF-1参与了干/祖细胞归巢的全过程的趋化蛋白，且干细胞的归巢有赖于SDF-1的浓度梯度，表明本发明中药组合物有促进骨髓干细胞的归巢活性。

图2为显微镜下4w时四组动物股骨头组织SDF-1阳性细胞免疫组织化学染色结果，图片放大倍数为x200。图片显示A伪手术组、B模型、C活骨组、D本发明组，各组动物均有SDF-1阳性细胞表达，活骨组和本发明阳性细胞计数均高于模型组。

2.2.3对股骨头组织病理学改变的影响

分别行HE染色观察伪手术组、模型组、活骨组及本发明组股骨头组织空骨馅窝率，结果如表4所示。

表4 对股骨头组织空骨馅窝的的影响

注：与伪手术组比较，^##P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与活骨组比较^△P＜0.05。

由表4可以看出，液氮冷冻2w后，模型组空骨陷窝增至38.2％；4w时坏死现象加重，坏死区域和空骨陷窝率进一步增多(P＜0.01)；活骨组和本发明组骨小梁较致密饱满，周边可见大量成骨细胞及少量破骨细胞，空骨陷窝明显低于模型组(P＜0.01)；实验4w时本发明组空骨陷窝率较活骨组明显减少(P＜0.05)，表明本发明中药组合物的疗效优于活骨组。

图3为显微镜下4w时四组动物股骨头组织病理形态学变化，图片显示A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组，图片放大倍数为x200。活骨组和本发明组骨小梁较致密饱满，周边可见大量成骨细胞及少量破骨细胞，骨细胞核较饱满，空骨陷窝明显低于模型组；本发明组空骨陷窝率较活骨组明显减少。

2.2.4对骨修复的影响

2.2.4.1对血清BGP

血清中BGP浓度可特异性地反映成骨细胞的活性，是骨形成功能的良好标志。因此在给药后的第2和4周，动物禁食8小时以上，心脏取血，采用放射免疫分析法测定血清中骨钙素的水平，反映动物不同时间点骨形成的状态，结果如表5所示。

表5 对血清BGP的影响

注：与伪手术组比较，^#P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与活骨组比较^△△P＜0.01。

由表5可以看出，2w和4w时模型组动物血清BGP含量比伪手术组显著升高(P＜0.05)；与模型组相比，2w时活骨组和本发明组BGP含量明显升高(P＜0.01或P＜0.05)，4w时仅本发明组组有统计学意义；且2w时本发明组血清BGP含量显著高于活骨组(P＜0.05)。BGP是成骨活性的标志，表明本发明中药组合物具有促进成的作用。

2.2.4.2对股骨头组织BMP2mRNA表达水平的影响

BMP2是目前已知的促骨形成作用最为明确的细胞因子，分别检测伪手术组、模型组、活骨组及本发明组股骨头组织BMP2mRNA的表达水平，结果如表6所示。

表6 对股骨头组织BMP2mRNA表达的影响

注：与伪手术组比较，^#P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

由表6可以看出，2w时，与模型组相比，活骨组和本发明组阳性细胞计数有增多的趋势，但各组之间均为显著差异。4w时，模型组阳性细胞计数较伪手术组明显降低(P＜0.05)；与模型组相比，活骨组和本发明组阳性细胞计数均显著增多(P＜0.01)。BMP2作为一种促成骨因子能更敏感反映成骨水平，表明本发明物具有促进动物的成骨活性。

图4为显微镜下4w时四组动物股骨头组织BMP2原位杂交检测结果，图片显示A伪手术、B模型组、C活骨组、D本发明组，图片放大倍数为x200。4w时，与模型组相比，活骨组和本发明组阳性细胞计数均显著增多。

2.2.5对股骨头组织细胞因子VEGF的表达的影响

分别检测伪手术组、模型组、活骨组及本发明组股骨头组织VEGF阳性细胞的表达，结果如表7所示。

表7 对股骨头组织VEGF阳性细胞的影响

注：与伪手术组比较，^#P＜0.05，^##P＜0.05；与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01；与活骨组比较^△△P＜0.01。

由表7可以看出，与伪手术组相比，模型组阳性细胞计数明显减少(P＜0.01或P＜0.05)；与模型组相比，活骨组和本发明组阳性细胞计数均显著增多，有统计学差异(P＜0.01)；与活骨组相比，本发明组VEGF阳性细胞计数明显增多(P＜0.01)。

图5为显微镜下4w时四组动物股骨头组织VEGF免疫组织化学染色结果，图片显示A伪手术组、B模型组、C活骨组、D本发明组，图片放大倍数为x200。各组动物股骨头软骨细胞、骨细胞、成骨细胞、髓腔部分造血细胞内可见棕色阳性颗粒表达。本发明组与活骨组相比较阳性细胞计数明显增多。

3结论

本发明的中药组合物能促股骨头组织中BrdU阳性细胞数和SDF-1阳性表达蛋白含量的作用，具有促进骨髓干细胞归巢的作用；本发明的中药组合物可缓解液氮冷冻诱导的股骨头坏死，表现为减少髓腔的脂肪化及细胞坏死，降低空骨陷窝率；本发明的中药组合物促进骨髓干细胞归巢治疗股骨头坏死的作用机制，体现在促进骨修复、血管新生方面。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种用于促进骨髓干细胞归巢的含引经药牛膝的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：牛膝10～20、黄芪15～45、当归10～20、川芎10～20、赤芍6～18、桃仁10～20、红花10～20、地龙10～20、桂枝10～20、木瓜10～20和威灵仙10～20。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：牛膝12～18、黄芪20～40、当归12～18、川芎12～18、赤芍9～15、桃仁12～18、红花12～18、地龙12～18、桂枝12～18、木瓜12～18和威灵仙12～18。

3.根据权利要求2所述的中药组合物，其特征在于，所述中药组合物由如下重量份的原料药制成：牛膝15、黄芪30、当归15、川芎15、赤芍12、桃仁15、红花15、地龙15、桂枝15、木瓜15和威灵仙15。

4.根据权利要求1-3任一项所述的中药组合物，其特征在于，其为口服制剂。

5.根据权利要求4所述的中药组合物，其特征在于，所述口服制剂为水煎剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、冲剂或口服液。

6.根据权利要求5所述的中药组合物，其特征在于，所述水煎剂的制备方法为：将原料药加5～7倍重量的水，浸泡1～1.5小时，然后煎煮30分钟，过滤；药渣再加3～5倍重量的水，煎煮20分钟，过滤；合并两次滤液，制成水煎剂。

7.权利要求1-6任一项所述的中药组合物在制备促进骨髓干细胞归巢药物中的应用。

8.权利要求1-6任一项所述的中药组合物在制备治疗股骨头坏死药物中的应用。