CN102421897A - 用于克隆和操作基因组的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了用于在异源宿主细胞中克隆供体基因组的组合物和方法。在一种实施方式中，供体基因组可在宿主细胞中被进一步修饰。修饰的或未修饰的基因组可进一步从宿主细胞分离并转移到受体细胞。本文公开的方法可用于在更加容易处理的宿主细胞中改变来自难处理供体细胞的基因组。

Description

用于克隆和操作基因组的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2009年3月6日提交的题目为“用于克隆和操作基因组的方法(Methods for Cloning and Manupulating Genomes)”的美国临时申请号61/158,320的权益，其通过引用以其整体并入本文。
本申请与Gibson等于2008年10月7日提交的美国申请号12/247,126相关，美国申请号12/247,126要求于2007年10月8日提交的美国临时申请60/978,388；于2007年10月29日提交的美国临时申请60/983,549；于2008年1月23日提交的美国临时申请61/062,214；于2008年1月24日提交的美国临时申请61/023,392和于2008年9月11日提交的美国临时申请61/096,270的权益，其每一篇通过引用以其整体并入本文。
序列表的并入
本申请包含对氨基酸序列和/或核酸序列的引用，其与本申请同时经由EFS-Web提交，如在MPEP§1730 II.B.2(a)(C)中授权并阐明的，序列表文本文件为“616872004140.txt”，文件大小106,298字节，于2010年3月3日创建。上述序列表依照37 C.F.R.§1.52(e)(5)通过引用以其整体由此并入。
背景技术
使用具有高等遗传系统的生物作为从许多物种中分离的核酸分子的宿主允许在宿主中操作分离的核酸序列。但是，由于对可转移入具有易处理遗传学的物种比如酵母中的核酸分子大小的限制，在外源宿主中通过克隆和修饰染色体和基因组改造生物的能力受到限制。
尽管更大的核酸(例如，DNA)已经被转移入宿主细胞，但是通过常规方法克隆的核酸通常包括仅仅少数基因。例如，16kb小鼠线粒体基因组已被克隆入大肠杆菌(Itaya等，Nat Methods 5，41(2008)；Yoon和Koob，Nucleic Acids Res 31，1407(2003))、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)(Itaya等，Nat Methods 5，41(2008)；Yoon和Koob，Nucleic Acids Res 31，1407(2003))和酵母(Wheeler等，Gene 198，203(1997))中。139-kb玉米叶绿体基因组已被克隆入酵母(Gupta和Hoo，Plant MoI Biol 17，361(1991)中，和135kb水稻叶绿体基因组已被克隆入枯草芽胞杆菌(B.subtilis)(Itaya等，Nat Methods 5，41(2008))中。1.8Mb流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)基因组的大约10％已作为附加型元件(episomal element)克隆入大肠杆菌(Smailus等，Syst Synth Biol；1，139(2007))中。3.5Mb集胞藻属(Synechocystis)PCC6803基因组被插入枯草芽胞杆菌基因组的三个非连续区域，除了两个核糖体RNA操纵子(Itaya等，PNAS USA 102，15971(2005))。完全合成的0.6Mb生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)基因组已被作为环形酵母着丝粒质粒(YCp)装配入酵母(Gibson等，Science 319，1215(2008)；Gibson等，PNAS USA，105(51)：20404-9(2008))。
美国专利号6,670,154描述了通过融合细菌与酵母——使修饰的基因组线性化，使修饰的细菌基因组转化为人工酵母染色体的方法。美国专利申请公开号2005/0019924描述了用于将原核基因组作为环形分子引入真核细胞并转化为人工染色体的核酸和方法。WO 02/057437描述了包含巨细胞病毒(CMV)基因组的YAC载体。美国专利号7,083,971描述了用于克隆、操作和输送大核酸片段的重组方法和系统。美国专利申请公开号2005/0003511和Bradshaw等，Nucleic Acids Research，23，4850-56(1995)描述了用于通过同源重组克隆大DNA区域的酵母-细菌穿梭载体。
但是，所公开的克隆和操作方法受可转移入宿主细胞中的供体核酸大小的限制，且不能提供操作和/或转移在宿主细胞中增殖的核酸分子返回至与供体相关的受体细胞中，它们也不能解决克隆使用的不同细胞类型与外来核酸之间的不相容问题。需要另外的方法用于克隆大的核酸比如染色体或基因组入替代异源宿主、用于在替代宿主中操作大核酸的序列和用于转移操作的基因组返回至与供体生物相似的受体生物，例如相同属生物(例如，从原核到真核细胞并返回)。
至今，在不同种或不同属生物之间转移大的核酸比如染色体和基因组的障碍仍未克服。例如种之间核酸的转移可对宿主、供体和/或受体细胞具有毒性。在不同种、属或群的生物中和从原核细胞到真核细胞并返回的核酸操作和增殖还可造成核酸的不稳定性并抑制它们的活化，比如来自核酸的基因的表达。
发明内容
本文提供了用于将供体核酸转移(克隆)入宿主细胞；用于操作(例如，修饰)供体核酸，例如在宿主细胞中；用于将修饰的供体核酸移植入受体细胞的方法、核酸和系统。所提供的方法和其他组合物在整个生物学分科的核酸转移和操作中是有用的，比如用于在真核宿主细胞中操作原核核酸和移植核酸返回原核受体。
方法可用于通过转移入具有强的良好表征的遗传系统比如酵母中，操作具有弱遗传系统的生物的供体核酸。因此，该方法、核酸和系统可用于修饰难处理的生物的核酸并操作和改造包括基因组在内的大核酸，例如产生合成基因组和细胞，比如之前在实验室或自然中不存在的细胞和基因组。提供的方法可用于克隆、修饰并移植大于300千碱基(kb)的核酸和基因组，比如基因组，包括全基因组和至少最小基因组和细胞、病毒和细胞器基因组。从而供体基因组可在宿主细胞中被修饰以产生修饰的供体基因组，其赋予天然供体基因组否则不会展示的一种或多种表型。当这些修饰的供体基因组在拥有供体基因组的原始细胞类型中难以产生时，或当合成基因组可在宿主细胞中快速装配并修饰，然后使修饰的基因组移植返回原始期望的细胞类型中用于产生感兴趣的表型或产品时，该方法尤其有利。
本申请中鉴定和描述的组合物和方法允许将核酸分子和基因组从难处理的供体细胞转移入宿主细胞的新方法，在该宿主细胞中它们可被修饰以改变基因型并从而改变表型，以改变核酸分子或基因组。修饰的基因组可使用宿主细胞的遗传机器以一种或多种方式修饰。提供的方法还提供用于从宿主细胞中分离修饰的核酸分子或基因组。分离的修饰的核酸分子或基因组可先体外后体内(ex vivo)甲基化。受体细胞可用本文描述的方法处理以将修饰的核酸分子或基因组转移入细胞。然后，可进一步将修饰的核酸分子或基因组转移入受体细胞，从而改变受体细胞表型为修饰的核酸分子或基因组的表型。
本文提供了用于克隆供体基因组的方法，其包括：作为一条或多条片段，从供体细胞获得供体基因组或合成供体基因组；和将供体基因组和宿主载体引入异源宿主细胞，其中任选地供体基因组和宿主载体在引入宿主细胞之前连接，从而生成包含供体基因组的宿主细胞，所述供体基因组包含宿主载体，并且进一步其中供体基因组是基本上完整的细胞、病毒或细胞器基因组，其至少是最小基因组，且长度大于大约300kb。在一种实施方式中，供体基因组是基本上全细胞、病毒或细胞器的基因组。
在本文描述的方法中，供体基因组和宿主载体可同时或相继引入宿主细胞。如果供体基因组和宿主载体相继引入宿主细胞，可以以任意顺序引入。因此，在一种实施方式中，供体基因组可以引入宿主细胞，随后引入宿主载体。可选地，宿主载体可以引入宿主细胞，随后引入供体基因组。在另一种实施方式中，通过将宿主载体转化入包含供体基因组的供体细胞，将宿主载体与供体基因组连接，然后引入宿主细胞。
供体基因组可以是单分子。在一种实施方式中，包含供体基因组和宿主载体的核酸分子可作为环状着丝粒质粒存在。可选地，供体基因组可作为重叠DNA片段存在。在引入宿主细胞之前，可将供体基因组线性化或断裂。
提供的方法的某些实施方式还包括从宿主细胞中回收供体基因组和宿主载体。
在其他实施方式中，该方法还包括将供体基因组引入受体细胞。
在其他实施方式中，提供的方法还包括降解或除去受体细胞的基因组。
本文考虑的供体基因组包括但不限于真菌基因组、古生菌基因组、蓝细菌基因组、藻类基因组、病毒基因组、噬菌体基因组、细胞器基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组(例如，玉米叶绿体基因组或水稻叶绿体基因组)、细胞器基因组或合成基因组。
本文考虑的宿主细胞是真核细胞或原核细胞。宿主细胞包括但不限于，细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或藻类细胞。宿主细胞还包括酵母细胞。
本文描述的宿主载体可以是着丝粒质粒。在一种优选的实施方式中，宿主载体是酵母着丝粒质粒且宿主细胞是酵母细胞。
本文描述的宿主载体是可用于同源重组的载体。
本文描述的任何方法可进一步包括在宿主细胞内修饰供体基因组。
此外，本文描述的任何方法可进一步包括从宿主细胞回收包含宿主载体的供体基因组。任选地，宿主载体可从供体基因组中除去。一方面，方法还包括将回收的供体基因组引入受体细胞。
本文描述的方法可进一步包括降解或除去受体细胞的内源基因组。当方法包括将供体基因组引入受体细胞的第一种情况时，受体细胞的内源基因组是天然基因组。当进行多轮修饰时(见，例如，图1和16)，受体细胞的内源基因组可以是先前修饰的基因组或合成的基因组。因此，在一种实施方式中，提供的方法还包括以迭代(重复，iterative)的方式修饰供体基因组。
可在引入受体细胞之前，通过甲基化供体基因组中的一个或多个核苷酸，甲基化回收的供体基因组。
受体细胞可以是，例如细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或藻类细胞。一方面，在引入供体基因组之前，受体细胞的限制性内切酶功能是不存在的、被除去的或失活的。例如，可在受体细胞中突变限制性修饰酶以使它失活。
在优选的实施方式中，供体基因组源于原核细胞(自然的或合成的)并克隆入真核细胞，在那里任选地它可被修饰，并接着回收并引入返回真核细胞中。在某些优选实施方式中，供体基因组源于细菌细胞(自然的或合成的)并克隆入酵母细胞，在那里任选地它可被修饰，并接着回收并引入返回细菌细胞中。
本文提供的方法还包括将第二供体基因组引入宿主细胞，其中第二供体基因组不同于第一供体基因组，从而产生包含两个不同供体基因组的宿主细胞。可通过使包含第一供体基因组的宿主细胞与包含第二供体基因组的第二宿主细胞交配(结合，mate)，进行引入第二供体基因组。将回收的供体基因组引入受体细胞可表型上将受体细胞转化成与并入任何修饰的供体基因组相应的表型。
本文提供了用于制造细胞的方法，所述细胞展示由供体基因组编码的表型，所述方法包括：(a)将供体基因组和适合在宿主细胞中克隆供体基因组的宿主载体引入宿主细胞，这样获得包含供体基因组的产物，所述供体基因组包含宿主载体；(b)从宿主细胞回收在步骤(a)中获得的包含供体基因组的产物，所述供体基因组包含宿主载体；(c)在一定条件下，将(b)的产物引入受体细胞，以便受体细胞展示由该产物编码的表型；和(d)回收从步骤(c)得到的细胞；其中供体基因组是基本上完整的细胞、病毒或细胞器基因组，其至少是最小基因组，且长度大于大约300kb并包含核酸物质的最小组分，所述最小组分对于受体细胞展示由供体基因组编码的表型是必需的。一方面，方法还包括在宿主细胞内修饰(a)的供体基因组。另一方面，方法还包括降解或除去受体细胞的内源基因组。另一方面，方法还包括在宿主细胞中修饰(a)的供体基因组并降解或除去受体细胞的内源基因组。在某些实施方式中，这些方法可以是自动化的。
本文提供了展示期望表型的细胞，所述期望表型由供体基因组编码并且否则不会由细胞展示，其中细胞由本文描述的方法产生。
本文还提供了包含供体基因组并展示期望表型的细胞，所述期望表型由供体基因组编码并且否则不会由细胞展示，其中供体基因组包含大于300kb的外源基因组核酸物质和对于细胞展示期望表型必需的最小的基因组组分。期望表型可包括产生非初始细胞天然的表达产物，或修饰(例如，选择性表达或可调型表达)或增量调节现有表达产物。
提供的方法还包括在多个宿主细胞中克隆多个基因组。多个基因组可以是基因组变体。在一种实施方式中，将多个基因组引入宿主细胞包括将宿主载体和多个变体重叠片段引入宿主细胞，从而产生变体基因组的组合文库。
一方面，在从宿主细胞中回收供体基因组之后，提供的方法包括将供体基因组引入受体细胞且受体细胞以比宿主细胞更高程度地支持从供体基因组的基因表达。
一方面，提供的方法包括在宿主细胞中修饰供体基因组；和修饰供体基因组包括在供体基因组中诱导一个或多个替换、一个或多个缺失、一个或多个插入、一个或多个重排、一个或多个重组、一个或多个同源重组或其组合。
另一方面，方法包括修饰供体基因组；且与修饰之前的供体基因组相比，供体基因组的修饰实现或改善供体基因组的性质。
提供的方法还包括移植进入受体细胞，其中可在存在聚乙二醇(PEG)的情况下进行移植。在本方法中可使用的各种大小的PEG包括但不限于，范围从PEG 4,000到PEG 20,000的大小。在一种实施方式中，大小是PEG 8,000。在公开的方法中可使用各种PEG浓度，比如，例如从大约1％到大约20％。在一种实施方式中，以大约5％浓度使用PEG。
本文提供了用于全基因组修饰的载体，其包括至少是最小基因组的原核基因组；原核复制原点；原核选择标记；转座酶和反向重复序列；一条或多条能够支持在真核细胞中分离和复制的核酸序列；和真核选择标记。在提供的方法的一方面，真核细胞是酵母细胞。原核基因组、原核复制原点和选择标记可以是细菌的。在一种实施方式中，支持在真核细胞中分离和复制的核酸包括一个或多个CEN核酸和ARS核酸。在另一种实施方式中，原核基因组的长度包括至少在300kb或大约300kb。在另一种实施方式中，载体在真核和原核细胞中是稳定的。本文提供了包含多个载体的组合文库，其中原核基因组可以是基因组变体。
本文提供了通过本文描述的任何方法的制备的包含外源供体基因组的分离细胞、合成细胞或重组细胞。
本文提供了用于无缝修饰(seamless modification)靶核酸中的靶区域的酵母核酸构建体，其包括：第一同源部分，其包含沿着靶核酸长度在靶区域的上游或下游的一部分靶核酸的同源物；在诱导型启动子控制下，编码核酸内切酶的核酸；核酸内切酶识别的核苷酸序列；酵母选择标记；第二同源部分，其包含靶区域5’部分的同源物；和第三同源部分，其包含靶区域的3’部分的同源物。在一种实施方式中，第二和第三同源部分在第一同源部分、编码核酸内切酶的核酸和酵母选择标记的侧翼。核酸内切酶识别位点可邻近第二或第三同源部分，并可相对于第一同源部分在构建物的相对末端。与靶核酸中同源部分相比较，第二和第三同源区域的一个或两者包括一个或多个替换、一个或多个缺失、一个或多个插入、一个或多个重排、一个或多个重组、一个或多个同源重组或一个或多个它们的组合。
本文提供了用于在靶核酸分子中无缝引入修饰的方法，其包括：将诱变构建体和宿主载体引入宿主细胞，借此宿主载体在宿主细胞中与诱变构建体重组，其中诱变构建体包含在该修饰上游的靶核酸分子的5’部分的第一同源部分；核酸内切酶识别位点、启动子、编码核酸内切酶的基因和选择标记；与在靶基因座上游的基因组序列同源的第二同源重复部分；和在该修饰下游的靶区域的3’部分的第三同源部分；和在一定条件下温育细胞，借此在第一同源部分和上游或下游部分之间进行重组，从而无缝除去构建体的一部分，其在核酸分子中包含构建体的靶位点附近促进一个或多个双链断裂切割，借此将修饰无缝引入靶核酸分子。
促进双链断裂切割的处理可包括核酸内切酶的表达，所述核酸内切酶在识别位点处切割包含该构建体的靶核酸分子，产生双链断裂。一方面，提供的方法还包括进行选择步骤，借此选择其中酵母选择标记已从靶核酸中除去的细胞。
提供的方法包括移植入受体细胞，其中通过下列步骤进行移植：在琼脂糖存在的情况下分离供体基因组；在甲基转移酶存在的情况下温育供体基因组，借此甲基化供体基因组；使琼脂糖熔解；和将供体基因组与受体细胞一起温育。与甲基转移酶一起温育可与细胞粗提物一起温育。
提供的方法可进一步包括在与甲酰转移酶一起温育之后，在蛋白酶存在的情况下温育供体基因组，从而除去蛋白质。
典型地，本文考虑的供体基因组和修饰的基因组是大的核酸。在一种实施方式中，供体基因组的长度至少为或大约为或大于大约100kb、大约150kb、大约200kb、大约250kb、大约300kb、大约350kb、大约400kb、大约450kb、大约500kb、大约550kb、大约600kb大约600kb、大约650kb、大约700kb、大约750kb、大约800kb、大约850kb、大约900kb、大约1百万碱基(MB)、大约1.1MB、大约1.2MB、大约1.3MB、大约1.4MB、大约1.5MB、大约1.6MB、大约1.7MB、大约1.8MB、大约1.9MB、大约2MB、大约2.5MB、大约3MB、大约3.5MB、大约4MB、大约4.5MB或更大，或它们之间的任何数值。
附图简述
图1图解了多种实施方式，其中供体基因组和宿主载体可(通过转化或共转化)引入宿主细胞。可在宿主细胞中进行一个或多个基因组修饰。然后，可分离修饰的基因组并移植入受体细胞。
图2A-2C图解了用于在酵母中克隆细菌基因组的三种方法。(A)为了在转化后通过酵母增殖，可通过转化细菌将宿主载体并入细菌基因组；重组的基因组和宿主载体可被分离并用于转化酵母宿主细胞。可选地，(B)全基因组和任选地线性化宿主载体可被共转化入酵母宿主细胞，在那里通过同源重组基因组，酵母宿主细胞结合载体和细菌基因组。在另一方案(C)中，细菌基因组可通过装配多个重叠片段并与宿主载体共转化入酵母宿主细胞进行克隆，其中通过在酵母宿主细胞中同源重组，将细菌基因组片段和宿主载体结合。
图3A-3F图解了使用图2A的方法在生殖器支原体、蕈状支原体LC和肺炎支原体基因组的每个中的酵母载体插入。图3A、3B和3E图解了在实验中使用的两个穿梭载体。图3C、3D和3F图解了在每个基因组中载体插入的位置。支原体标记是螺旋素启动子，tetM和lacZ；酵母载体特征是CEN、ARS和HIS3；大肠杆菌质粒主链是氨苄青霉素抗性(ampR)和pUC19原点(ori)；BAC序列是BAC；和转座子元件是IS256外反向重复(outer invented repeat)(IR)、IS256内反向重复(innerinvented repeat)(IR)和转座酶(tnp)。
图4A-4B显示包含酵母载体序列的支原体全基因组克隆的分析。图4A提供了生殖器支原体cl16-2基因组的图谱。酵母载体的插入位置被标记。线条指示位置而数字指示PCR扩增子的大小。限制片段被编号且它们的大小提供在图例中；EagI消化对应于限制片段1而BssHII消化对应于限制片段2-6。图4B提供了肺炎支原体基因组的图谱。酵母载体的插入位置被标记。线条指示位置而数字指示PCR扩增子的大小。限制片段被编号和它们的大小提供在图例中；NotI消化对应于限制片段1-4而SbfI对应于限制片段5和6。
图5提供了蕈状支原体LC cl1.1基因组的图谱。箭头代表IS 1296元件。线条指示位置而数字指示PCR扩增子的大小。
图6A-D图解了使用同源重组作为四种可选方法靶向插入酵母载体。在具有双链断裂和没有双链断裂的情况下，在插入点尝试酵母载体插入。图6A：完整的基因组和线性载体。图6B：重叠基因组片段和与片段之一的内部同源的载体。图6C：在整合靶点和线性载体处切割的基因组。图6D：重叠基因组和与两个片段同源的载体片段。
图7A-7C表明粗提物保护供体质粒DNA免受宿主限制修饰系统影响并增加转化效率，但是抑制基因组移植。图7A图解了用甲基化步骤处理琼脂糖插块(琼脂糖块，agarose plug)或未处理的结果。图7B显示在缺乏粗提物情况下处理的天然基因组DNA(显示允许移植入受体细胞)展示点状(punctate)图案(右图)，而在粗提物存在的情况下处理的内源基因组DNA(显示抑制移植)形成大的聚集体(左侧两图)。图7C显示在与琼脂糖插块中基因组DNA温育后，通过蛋白酶K处理除去粗提物恢复了最初用未处理基因组DNA观察到的点状图案。
图8显示可使用的三种可选的全基因组移植方法。第一方法(1)，包括消化包含基因组DNA的琼脂糖插块(例如，用β-琼脂糖酶(熔解步骤))，然后直接移植入受体细胞。第二方法(2)与第一方法相同，除了受体细胞已被修饰以突变限制酶基因(ΔRE)。在第三方法(3)中，基因组DNA样品在体外被甲基化并进行去蛋白步骤(用蛋白酶K处理)，然后熔解步骤(β-琼脂糖酶消化)和移植入受体细胞。
图9A-9C图解了常规修饰方法就非特异性缺失或重排方面的问题。CEN6＝在结构中包含的圆圈。图9A图解了将野生型片段引入携带具有URA3插入的生殖器支原体的酵母，接着在包含FOA的SD-HIS平板上选择，得到两个不同类型重组事件(P1(野生型片段和基因组之间的重组)和P2(基因组中重复序列之间的重组)，如在图9B中显示)的选择。这些事件将产生携带图解在图9C中可选产物的细胞。
图10A-10D图解了可选无缝修饰方法。图10A示意性图解了diletto perfetto诱变盒的生成：使用乙酸锂整合转化，将该盒引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株。使用诊断引物Seq-F和Seq-R(如在插入位点两翼的小单箭头所示)，将单独的Ura+转化体通过PCR进行选择和分析。生成包含URA3标记以及与刚好在靶基因座上游的部分同源的358bp片段(“重复”片段)(标注为“重复”的大箭头)的融合产物。为生成最终诱变盒(图10B)，融合产物被PCR-再扩增：得到的盒包含按下列顺序的部分：50bp的靶区域5’部分的同源物(单碱基缺失的上游)、URA3标记、重复盒和50bp的靶区域3’部分的同源物。以这种方向设计盒，以便一旦转化入酵母宿主细胞，用该盒置换生殖器支原体基因组的CDS 139基因座中450碱基对靶区域(通过HR)将在基因组中在URA3选择标记的侧翼产生包含两个串联重复序列的区域(标注为“重复”的大箭头)。图10C：通过融合(GAL1/I-SceI)-URA3融合产物与位于靶基因座上游的358bp“重复”片段，生成TREC(具有核酸内切酶切割的串联重复)诱变构建体。所得TREC盒包含按下列顺序的部分：50bp的靶区域5’部分的同源物(单碱基缺失的上游)、CORE盒(由18bp I-SceI识别位点、GAL1启动子、编码I-SceI核酸内切酶的基因和URA3标记组成)、“重复”(与刚好在靶野生型基因座上游的基因组序列同源的358bp部分)和50bp的靶区域3’部分的同源物(被校正的单碱基缺失的下游)。所得LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-LoxP-LE诱变盒(图10D)包含按下列顺序的部分：50bp的靶区域5’部分的同源物(单碱基缺失的上游)、第一LoxP位点(LoxP-RE)、GAL1启动子、Cre重组酶基因ORF、URA3标记、第二LoxP位点(LoxP-LE)和50bp的靶区域3’部分的同源物(单碱基缺失的下游)。
图11图解了III型限制酶缺失的生成。为了在酵母中制造蕈状支原体LC III型限制酶基因(typeIIIres)缺失，通过使两个PCR产物CORE和串联重复序列(TRS)融合，构建线性DNA片段——敲除盒(KOC)。然后，将该盒转化入包含蕈状支原体LC基因组-YCp的酵母W303a菌株中以通过靶位点(ΔtypeMres::URA3)的50-bp同源序列置换RIII型ORF。半乳糖诱导使I-SceI核酸内切酶表达，其切割18-bpI-SceI位点(星号)，产生双链断裂，这有利于两个串联重复序列之间的同源重组(红箭头)。TRS之间的重组产生typeIIIres基因的无缝缺失(seamless deletion)(ΔtypeIIIR)。
图12A-12B图解了在合成生殖器支原体基因组的MG259基因座处工程化(改造)点突变。图12A图解了通过两个连续同源重组的突变校正的方案。两条引物(箭头)Seq-F和Seq-R在MG259基因座中分开0.4kb，1.1kb URA3标记的插入导致产生1.3kb PCR DNA片段。图12B图解了URA3标记从生殖器支原体YAC丢失的可能性。5-FOA抗性克隆可源自用野生型DNA片段置换URA3标记(R1)或源自重复序列之间的重组(R2)。重复序列的大小和位置是示意性的。
图13图解了示例性TREC方法的大纲。靶区域用诱变盒置换，所述诱变盒由敲除CORE(18-bp的I-SceI识别位点、受GAL1启动子控制的I-SceI基因、和URA3基因)和与靶位点上游相同的DNA片段(箭头所示)组成。置换生成包含CORE的串联重复序列。半乳糖诱导I-SceI的表达，其在I-SceI位点产生双链断裂(DSB)。DSB有利于重复序列之间的分子内同源重组，导致CORE的切除。
图14A和14B图解了分别通过delitto perfetto方法(定点突变法)(图14A)或串联重复突出(pop-out)方法(图14B)改造相同的基因座并产生点突变或450bp缺失的两种其他方法。
图15图解了最终诱变盒构建体的示例性生成。
图16图解了将供体基因组移入宿主细胞，改造它，并通过基因组移植使它安装回受体。在示例性方法中，在酵母中克隆具有酵母载体的细菌基因组之后，使用酵母遗传方法的所有技术以在细菌基因组中产生插入、缺失、重排、或修饰的任何组合。该改造基因组接着被分离并移植入受体细胞以生成改造的细菌。移植回受体细胞之前，使供体DNA甲基化可能是必须的，以保护它免受受体细胞限制系统(一个或多个)的影响。可从新改造的新基因组开始重复该循环(虚线箭头)。
图17提供了YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres蕈状支原体基因组移植体的无缝缺失区域的核酸序列，确认III型限制基因已按设计除去。斜体序列文本对应基因图谱图19的“typeIIImod”区域；下划线序列文本对应“typeIIIres”区域；和黑体文本对应“IGR”区域。由于typeIIImod和typeIIIres基因之间的重叠，缺失之后小部分typeIIIres基因仍然存在。typeIIIres基因的起始密码子和终止密码子是加下划线的放大字体；typeIIImod基因的终止密码子图解为加下划线、斜体、黑体的放大字体。图17公开了SEQ ID NO：195。
图18A-18C显示在酵母中增殖期间，蕈状支原体YCpMmyc1.1基因组的稳定性。图18A提供了YCpMmyc1.1基因组的示意图。显示了整合YCp的位置。在PCR扩增中使用的9个单独的引物对在基因组中它们近似位置处显示并对应在图18B中的扩增子编号。图18B，通过两种方法检测在酵母中增殖期间蕈状支原体基因组的稳定性。在第一个中，包含基因组的克隆的酵母培养物铺板在缺乏组氨酸的固体合成培养基上两天，并接着将单独的集落拼凑(patch)到新的平板上。在第二个中，包含基因组的克隆的酵母培养物生长至饱和，稀释至1/100份并再次生长至饱和。培养物接着铺板在缺乏组氨酸的固体合成培养基上两天并接着将单独的集落拼凑到新的平板上。在两种方法中，分离基因组DNA并在多重PCR扩增中用作模板，所述扩增使用在图A中显示的9个单独的引物对。通过凝胶电泳分析所得扩增子。在凝胶右侧的数字对应显示在A中的各引物对扩增子。泳道G是阳性对照而泳道N是没有基因组的阴性对照。分子量标记在泳道M中。显示的结果代表40个分析样品。所有40个克隆显示包含完整的基因组，表明细菌基因组在酵母中常规增殖期间是稳定的。图18C提供了蕈状支原体YCpMmyc1.1基因组的示意图；显示了整合YCp的位置。在PCR扩增中使用的9个单独的引物对在基因组中它们近似位置处显示，并对应于在图18B中的扩增子进行编号。对角线表示在克隆3中缺失的扩增子。用包含URA3的盒转化蕈状支原体YCpMmyc1.1酵母克隆之后，通过多重PCR评估Ura+克隆基因组，且通过凝胶电泳分析所得扩增子(数据未显示)。在克隆3中缺失扩增子5到8，提示在该基因组中有大的缺失。另外4个克隆显示包含完整的基因组。
图19图解了III型限制酶缺失的生成。为了在酵母中制造蕈状支原体III型限制酶基因(typeIIIres)缺失(iii)，通过使两个PCR产物CORE和串联重复序列(TRS)融合，构建线性DNA片段——敲除盒(KOC)(i)。该盒接着转化入包含YCpMmyc1.1蕈状支原体基因组的酵母W303a菌株(ii)。在(-)His(-)Ura培养基上生长，对通过盒经由与靶位点(ΔtypeIIIres::URA3)同源的50-碱基对(bp)序列置换III型限制酶开放阅读框(ORF)进行选择。半乳糖诱导使I-SceI核酸内切酶表达，其切割18-bp I-SceI位点(星号)，产生双链断裂，这有利于两个串联重复序(TR)(构建体上方无标记的线)之间的同源重组。TR之间的重组产生typeIIIres基因的无缝缺失(ΔtypeIIIres)，其在对URA3基因的5-氟乳清酸(5-FOA)反选择后被分离。IGR，基因间区域。对每个扩增子获得希望的大小(数据未显示)。
发明详述
A.定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有如本领域普通技术人员通常理解的相同意义。
所有专利、公开的专利申请、其他出版物、和来自GenBank和本文提到的其他数据库的序列，就相关的技术而言，通过引用以它们的整体并入。
除非另外指出，所提供实施方式的实施将采用分子生物学等的常规技术，其在本领域技术人员的技术范围内。这些技术在文献中充分解释。见例如MolecularCloning：A Laboratory Mannual，(J.Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)；Current Protocols in Molecular Biology(F.Ausubel等编辑，1987和最新的)；Essential Molecular Biology(Brown ed.，IRL Press 1991)；GeneExpression Technology(Goeddel编辑，Academic Press 1991)；Methods for CloningandAnalysis of Eukaryotic Genes(Bothwell等编辑，Bartlett Publ.1990)；Gene Transferand Expression(Kriegler，Stockton Press 1990)；Recombinant DNA Methodology(R.Wu等编辑，Academic Press 1989)；PCR：A PracticalApproach(M.McPherson等，IRLPress at Oxford University Press 1991)；Cell Culture for Biochemists(R.Adams编辑，Elsevier Science Publishers 1990)；Gene Transfer Vectors for Mamalian Cells(Miller &M.Calos编辑，1987)；Mammalian Cell Biotechnology(M.Butler编辑，1991)；AnimalCell Culture(Pollard等编辑，Humana Press 1990)；Culture of Animal Cells，2ndEd.(Freshney等编辑，Alan R.Liss 1987).
如本文所用，“一个(a)”或“一个(an)”意思是“一个(one)”、“至少一个”或“一个或多个”。
如本文所用，“核酸”、“核酸分子”、“核酸序列”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，且包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)二者以及修饰的核酸分子，比如肽核酸(PNA)、锁定核酸(LNA)和其他修饰的核酸分子，其非限制性地包括cDNA、基因组DNA和mRNA以及合成的核酸分子，比如化学合成的或重组产生的那些。核酸分子可以是双链的或单链的。其中单链的核酸分子可以是有义链或反义链。另外，核酸分子可以是环形的或线性的。
如本文所用，“限制性内切酶位点”指被限制酶识别并切割的靶核酸序列。限制酶是本领域所熟知的。
如本文所用，“基因组”包括全(完整的)基因组(例如，全细胞、病毒和细胞器基因组)，且还包括全基因组的一部分，其具有在至少一组环境条件下，足够实现和/或维持细胞生存(最小细胞基因组)、宿主细胞中依靠宿主细胞生存的生物的生存(例如，最小病毒基因组)或在宿主细胞中细胞器功能(最小细胞器基因组)的核酸序列。因此，术语基因组指全基因组及为至少最小基因组的其部分。可指定基因组引起或维持的具体环境条件和性质。在细胞器或病毒基因组或依靠宿主细胞增殖和生存的其他基因组的情况下，环境条件可包括适宜的和有功能的宿主细胞的环境。因此，术语基因组包括最小基因组和最小复制基因组和包含超过可见于这些最小基因组中的那些核酸序列的另外的核酸序列，但不包括在全基因组中存在的所有核酸序列。术语“基因组”包括自然发生的基因组和合成基因组，并包括遗传改造基因组，比如之前在实验室和自然中不存在的基因组，其包括修饰的基因组和包含来自多于一个种类的核酸和/或部分基因组的杂交基因组。术语“基因组”包括细胞器基因组(例如，线粒体和叶绿体基因组)、自我复制生物的基因组(细胞基因组)，其包括原核和真核生物、真菌、酵母、细菌(例如，支原体)、古细菌、脊椎动物、哺乳动物和其他生物，和病毒基因组以及依靠宿主增殖的其他基因组。基因组还包括没有落在任何已知林奈(Linnean)分类中的生物和合成生物的那些。示例性基因组可以是微生物基因组，比如包括细菌和酵母在内的单细胞生物的基因组。
如本文所用，“细胞基因组”指包含足够引起和/或维持细胞生存的核酸序列的基因组。这些核酸序列包括编码复制、转录、翻译、能量产生、运输、膜和细胞质组分产生和细胞分裂所需要的编码分子的那些核酸序列。细胞基因组包括最小细胞基因组、全细胞基因组和具有对最小细胞基因组附加的核酸但不是全细胞基因组的所有核酸的基因组。细胞基因组与“病毒基因组”和“细胞器基因组”不同，至少在于细胞基因组包含足够用于细胞复制和/或生存的核酸，而病毒和细胞器基因组包含例如在宿主细胞中维持或复制病毒或细胞器必需的、但不是维持宿主细胞生存或复制必需的核酸。
如本文所用，“最小基因组”指由最小核酸组或基本上由最小核酸组组成的基因组，所述最小核酸组，在至少一组环境条件下，足够实现和/或维持细胞生存(最小细胞基因组)、在宿主细胞中依靠宿主细胞生存的生物的生存(例如，最小病毒基因组)、或在宿主细胞中细胞器功能(最小细胞器基因组)。应理解，甚至全细胞器基因组没有必要编码使细胞器保存所需要的所有蛋白质，而是一些蛋白质被在包含细胞器的细胞的细胞核中的基因编码。因此，最小细胞器基因组仅需要包含在细胞环境中对于细胞器功能必需的那些基因。类似地，应理解，病毒依靠宿主细胞生存，因此最小病毒基因组仅需要支持病毒在宿主细胞中的生存。“最小复制基因组”是除足够维持生存的最小核酸序列之外，还包括足够用于细胞或生物自我复制的核酸序列的最小基因组。
如本文所用，合成核酸序列，包括合成基因组，其所有或部分已经从遗传组件或这些组件的拷贝构建，所述遗传组件已经在体外化学合成。拷贝可已经通过本领域已知的任何许多方法产生，包括体内和体外克隆和扩增方法。完整合成的核酸序列或基因组是这样的：其中全部核酸或基因组已经被在体外化学合成或从这些体外化学合成的核酸拷贝中产生或组装。与之相比，部分合成的核酸序列或基因组是其中一些遗传组件是自然发生的合成基因组，包括从自然发生的核酸中克隆的核酸。
如本文所用，外源或异源基因组或核酸序列是在宿主细胞中存在但是源于和宿主细胞不同种类的供体生物的基因组或核酸序列。供体生物可以是不同的属、目、界或其他遗传分类，或可简单是相同属中的不同种。
如本文所用，“靶核酸序列”指，为例如通过本文描述的和本领域已知的修饰方法进行修饰的目标的核酸序列。靶核酸序列的一个或多个修饰包括将一个或多个突变、一个或多个缺失、一个或多个替换和/或一个或多个插入引入靶核酸序列。靶区域是靶核酸序列的特定区域，比如作为修饰对象的单基因座、多基因座或其部分。在一种实例中，靶区域包括靶核酸序列的区域，其比如用另一核酸序列例如通过同源重组进行置换。靶核酸序列修饰之后，与初始靶区域相比，在修饰的核酸序列中没有必要修饰全部的靶区域。例如，靶区域的修饰可包括在靶区域内的靶位置/残基处单插入、缺失或替换，或可包括在靶区域的一个或多个靶部分的许多位置/残基的修饰。
B.用于克隆和操作基因组和大核酸的方法
本文提供了核酸、方法和系统，其用于将供体基因组和其他供体核酸序列引入异源宿主细胞，用于在宿主细胞中修饰供体基因组和核酸序列，从宿主细胞中回收供体基因组和核酸序列并将回收的供体基因组和核酸序列引入受体细胞。包括在提供的核酸序列、方法和系统的范围之内的是使供体、宿主和受体的核酸序列、细胞和遗传系统之间的不相容性例如和/或毒性最小化的方面。所提供方法的示例性实施方式图解在图1中，其中该方法用于通过将细菌供体基因组与酵母宿主载体连接使细菌供体基因组转化入酵母宿主细胞，在酵母宿主细胞中修饰供体基因组并移植修饰的供体基因组进入细菌受体细胞，从而，产生工程细菌。如在图1中指示，在工程细菌中存在的修饰基因组可被分离并在方法的随后轮次中以迭代方式用作供体基因组。如本文所描述，考虑该实施方式的许多变型，并落在本申请的范围内。所提供方法的另一示例性方法图解在图16中，其中该方法用于将宿主酵母载体插入细菌基因组，分离具有整合的酵母载体的基因组，用细菌基因组/酵母载体转化酵母宿主细胞，修饰细菌基因组，分离修饰的基因组，任选地甲基化基因组和移植供体基因组进入受体细胞。
实施例5描述了所提供方法的成功结合，通过将供体细菌基因组转化入酵母宿主细胞，在酵母细胞中修饰供体基因组，并接着移植所得修饰的供体基因组进入受体细胞，于是来自修饰的供体基因组的基因表达被诱导，产生了新的细菌生物。通过阴性对照和受体细胞中基因组的测序验证了该结果。该研究表明成功地生成了包含III型限制酶基因无缝缺失的蕈状支原体LC基因组，其在支原体中使用目前技术水平的方法、使用它的可利用的天然遗传系统还不能生成。移植产生了之前在实验室和自然中不存在的蕈状支原体LC菌株。因此，提供的方法可用于在编码被改造的基因组的细胞外成功进行遗传改造。
提供了用于操作基因组和大核酸的方法和工具以及所得到的细胞，以例如改造和改变可产生有用化合物比如疫苗、药物、生物产生的蛋白质或化学品和生物燃料的生物。方法对于操作具有弱遗传系统的生物比如难处理的生物的基因组和染色体尤其需要，以产生修饰的基因、基因组和生物，其产生新基因产物比如对能量产生和医学有用的那些。
本申请之前，用于操作基因组和其他大核酸的可用方法是有限的。具有期望的性质/特性/表型比如产生有用化合物的能力和能够在极端环境下起作用的能力的包括单细胞生物比如原核生物的许多生物，具有非常弱的或没有遗传系统(允许在实验室中修饰生物的核酸的系统)。因此，本公开提供了将这些基因组和核酸转移入具有更加期望的遗传系统的其他细胞(宿主细胞)并在这些其他细胞中使用期望的系统修饰基因组和核酸所需要的方法和工具。
为了从修饰的核酸中产生新的基因产物，本发明还提供了如此方法：将它们从宿主细胞移植进入在其中可表达基因产物的环境，比如合适的受体细胞。例如，尽管在宿主细胞中表达可能是足够的，但是可能期望供体基因组从宿主细胞中移植进入受体细胞，所述受体细胞具有与天然或合成供体基因组源自的初始供体细胞或生物的细胞环境更加相似(replicate)的细胞环境。一般而言，本文提供了可用于操作和改造基因组和其他核酸尤其是大核酸的提高的转移、克隆、修饰和移植方法、核酸和系统。
类似地，在本申请之前，通过可用的方法转移包括基因组的大核酸进入宿主细胞是受限的。尽管用于克隆核酸的常规方法是熟知的(具有良好遗传系统的细菌和酵母已经用作用于从许多生物中克隆核酸片段的宿主)，但与这些方法相关的限制可使它们不期望用于操作和改造基因组和大核酸。例如，使用常规方法可克隆入宿主细胞的核酸大小是受限的。通过常规方法克隆的核酸一般包含仅仅少数基因。
不相容性和毒性问题也可限制可用的克隆方法。例如，供体核酸对宿主细胞可以是有毒的(例如，如果有毒的蛋白质从供体核酸中表达)并在事件比如使用宿主的遗传系统进行宿主细胞复制和/或修饰期间可变得不稳定。这类事件可限制在宿主细胞中操作核酸的能力。此外，可在修饰过程期间发生的对供体基因组的不期望修饰通常对宿主细胞的生存没有负面影响的事实，可使供体基因组和其他核酸在宿主细胞中不稳定。
不相容性问题还可损害供体基因组从宿主细胞移植回到更加天然的基因产物表达的环境，比如进入与供体相同或紧密相关的种类的受体细胞的效率。在所提供实施方式中，修饰方法克服了这些问题，用于在遗传上不同的宿主细胞，比如用于移植进入与初始供体基因组的种类更不同的受体细胞的酵母宿主细胞中成功增殖和修饰包括基因组在内的供体核酸。
从宿主细胞中回收供体基因组并进一步将供体基因组引入受体细胞可引起另外的挑战，其中供体、宿主和受体细胞是较不紧密相关的(比如来自不同的生物分支)。例如，由于不相容性和毒性问题，将在真核宿主中增殖的供体基因组引入原核受体可能被限制。如果供体基因组已经在宿主细胞中增殖，在受体细胞中存在(或许也在供体细胞中存在)但是不在宿主细胞中存在的限制-修饰系统在移植后可造成不相容性。尽管一些宿主细胞，比如酵母不包含限制-修饰系统，但是它们可表达可修饰在宿主细胞中增殖的供体核酸的DNA甲基转移酶，从而当移植进入受体细胞后抑制供体核酸(例如，基因组)的活化。在宿主细胞中增殖和修饰之后，分离的供体基因组的结构和构象也可与在与供体生物更紧密相关的细胞中增殖的相同基因组的构象和结构不同。这种差异可不利地影响移植。
本文描述的方法克服了这些限制，用于成功地克隆供体基因组，在宿主细胞中修饰和/或繁殖供体基因组，回收供体基因组并将供体基因组引入受体细胞。一方面，从宿主细胞中回收的供体基因组被引入遗传上不同的受体细胞(比如从真核宿主到原核受体)。
供体核酸序列，例如，供体基因组被选择和合成、组装、和/或分离(例如，从供体细胞中)并克隆入宿主细胞。该方法包括以一条或多条片段从供体细胞获得供体基因组或合成供体基因组，和将供体基因组和宿主载体引入异源宿主细胞，其中任选地供体基因组和宿主载体连接，然后引入宿主细胞，从而生成包括供体基因组的宿主细胞，所述供体基因组包括宿主载体，并且进一步其中供体基因组是基本上完整的细胞、病毒或细胞器基因组，其至少是最小基因组，且长度大于大约300kb。
第一实施方式典型地涉及将宿主载体引入包含供体基因组的细胞，将供体基因组与宿主载体连接，回收包含宿主载体的供体基因组并转化宿主细胞，以便包含宿主载体的供体基因组在宿主细胞复制期间保持在宿主细胞中。
在第二种实施方式中，在宿主细胞中宿主载体和线性化供体基因组被共转化，其中在宿主细胞中宿主载体和供体基因组通过同源重组连接。
在第三种实施方式中，在宿主细胞中重叠DNA片段(天然或合成的)和宿主载体被共转化，其中在宿主细胞中宿主载体和DNA片段通过同源重组连接。
在本方法中使用的供体基因组可以是基本上全细胞、病毒或细胞器基因组。
供体基因组和宿主载体可同时或以任一顺序相继引入宿主细胞。在一种实施方式中，宿主载体与供体基因组连接，然后通过转化宿主载体进入包含供体基因组的供体细胞引入宿主细胞。
在本实施方式中使用的宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。宿主细胞包括但不限于，细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或藻类细胞。宿主细胞还包括酵母细胞。
宿主载体是可用于同源重组的载体。在本实施方式中使用的宿主载体可以是着丝粒质粒。在一种实施方式中，宿主载体是酵母着丝粒质粒且宿主细胞是酵母细胞。
在本实施方式中考虑使用的供体基因组可以是，例如细菌基因组、真菌基因组、酵母基因组、古细菌基因组、蓝细菌基因组、藻类基因组、噬菌体基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组、病毒基因组、细胞器基因组或合成基因组。
另一方面，方法还包括在宿主细胞中修饰供体基因组。
另一方面，方法还包括从宿主细胞中回收包含宿主载体的供体基因组。
另一方面，方法还包括将回收的供体基因组引入受体细胞。
另一方面，方法还包括降解或除去受体细胞的内源基因组.
任选地，回收的供体基因组可在进入受体细胞之前被甲基化。
任选地，受体细胞的限制性内切酶功能是不存在的、被除去的或失活的。
在本实施方式中考虑使用的受体细胞可以是，例如细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或藻类细胞。
另一方面，方法还包括将第二供体基因组引入宿主细胞，其中第二供体基因组与第一供体基因组不同，因此产生包含两个不同供体基因组的宿主细胞。引入第二供体基因组可包括使包含第一供体基因组的宿主细胞与包含第二供体基因组的第二宿主细胞交配。将回收的供体基因组引入受体细胞可表型上将受体细胞转化成与并入任何修饰的供体基因相应的表型。
本文提供了通过本文描述的任何方法产生的分离的、合成的或重组的细胞。
本文提供了用于制造细胞的方法，所述细胞展示由供体基因组编码的表型，所述方法包括：(a)将供体基因组和适合在宿主细胞中克隆供体基因组的宿主载体引入宿主细胞，这样获得包含供体基因组的产物，所述供体基因组包含宿主载体；(b)从宿主细胞中回收在步骤(a)中获得的包含供体基因组的产物，所述供体基因组包含宿主载体；(c)在一定条件下，将(b)的产物引入受体细胞，以便受体细胞展示由该产物编码的表型；和(d)回收从步骤(c)得到的细胞；其中供体基因组是基本上完整的细胞、病毒或细胞器基因组，其至少是最小基因组，且长度大于大约300kb并包含核酸物质的最小组分，所述最小组分对于受体细胞展示由供体基因组编码的表型是必需的。一方面，方法还包括在宿主细胞中修饰(a)的供体基因组。另一方面，方法还包括降解或除去受体细胞的内源基因组。另又一方面，方法还包括在宿主细胞中修饰(a)的供体基因组并降解或除去受体细胞的内源基因组。
本文提供了展示期望表型的细胞，所述期望表型由供体基因组编码并且否则不会由该细胞展示，其中细胞由本文描述的方法产生。
本文还提供了包含供体基因组并展示期望表型的细胞，所述期望表型由供体基因组编码并且否则不会由细胞展示，其中供体基因组包含大于300kb的外源基因组核酸物质和对于细胞展示期望表型必需的基因组最小组分。
修饰方法和工具包括使在修饰期间宿主细胞中供体核酸序列不稳定性的风险最小化的方面。在第三种实施方式中，供体核酸序列从宿主细胞中移植进入受体细胞，所述受体细胞可以是与供体细胞和宿主细胞不同的种类和/或不同的生物分支，或与供体细胞相同的种类。移植方法包括使供体基因组、宿主细胞和受体细胞之间不相容性和毒性的风险最小化的方面。
可分开进行转移、修饰和移植方法，也可组合相继进行。因此，在一种实施方式中，三个步骤可组合在一个方法中，通过该方法供体基因组被转移进入宿主细胞，在宿主细胞中修饰并移植进入受体细胞，以产生新细胞，从而生成之前在实验室和自然中不存在的基因组或细胞。受体细胞可进一步生长成在之前不存在的非人类生物或转移入其中。因此，提供的方法、核酸和系统可用于产生新的生物。还提供了新创造的生物和其核酸序列。
提供的方法和组合物对于操作和改造来自遗传上难处理的生物的基因组尤其有用。在一种实例中，方法、核酸序列和系统用于在酵母中克隆作为环状着丝粒质粒来自生殖器支原体、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)和蕈状支原体LC的全细菌基因组，以在酵母中使用具有修饰的酵母遗传系统修饰供体基因组，以使不相容性最小化，和进一步将修饰的细菌基因组移植进入不同种类的受体细胞，从而生成之前在实验室和自然中不存在的基因组和生物。
提供的方法、核酸序列、系统和生物可用于改造合成生物燃料的生物。例如，尽管细菌比如大肠杆菌(Escherichia coli)可被基因修饰，但是具有产生工业上有用的化合物的潜力或在极端环境下起作用的许多原核生物具有非常弱或没有遗传系统。原绿球藻(Prochlorococcus marinus)是地球上最丰富的光合生物之一。尽管期望操作并改造这种和其他这样的生物以产生生物燃料，但是由于缺乏遗传改造它们的可用方法，操作和改造这样生物的能力是受限的。提供的方法可用于进行这些操作。例如，在一种实施方式中，编码新的代谢途径组分的核酸序列可通过转移引入这些生物的基因组并在宿主细胞中修饰。这种再改造的基因组可移植进入适宜的受体细胞，以产生新细胞，例如，可使阳光和二氧化碳转化成生物燃料的新细胞。本文还提供了这类改造的细胞和生物。
提供的方法也可用于改造古细菌、克隆新细胞器进入真核生物和添加染色体到细胞和生物中。例如，真核线粒体和叶绿体是已经在它们宿主中被捕获的内共生细菌的残留物。提供的方法可用于在宿主中，例如在使用质粒的酵母中，使用同源重组改造这些细胞器基因组，从而比如在酵母或藻类中创造具有提高的能量产生效率和/或新陈代谢的新线粒体和叶绿体基因组。
在另一种实施方式中，提供的方法可用于操作病毒，比如具有对于在简单质粒中操作而言太大的大基因组的那些病毒，以产生具有治疗应用的病毒和噬菌体。一方面，病毒基因组被克隆和操作以提高它们的免疫原性和其他治疗优点。
在另一种实施方式中，提供的方法可用于操作真菌以产生在生产例如酒、面包、啤酒和药品中有用的真菌。一方面，克隆和操作真菌基因组以改善它们对温度、致病生物的抗性和其他优点。在另一种实施方式中，提供的方法可用于操作酵母以产生对于乙醇燃料、营养添加剂、益生菌剂、用于饮料(酒精类和非酒精类)生产的发酵或用在烘焙中的发酵有用的酵母。
尽管本文提供了某些实施方式，但是本发明的方法和工艺是可用于产生任何期望表型或感兴趣产品的通用工具。
本发明的方法和工艺易于自动化和适应高产量方法，例如，通过不需要人干预的计算机调控的和/或自动化方法可同时将许多核酸分子连接和转化进入宿主或受体细胞。
因此，本发明涉及系统的方法及其产物，其允许以高产量的方式有效地和大量地装配、克隆、修饰和转化包括基因组在内的核酸分子，并容易适合自动化实施。在可选实施方式中，核酸装配反应可在固体表面上进行——与在反应管内相反，例如在使用微流体的芯片上。
C.选择和分离供体基因组和核酸
在所提供方法的第一步骤中，选择用于转移、修饰和/或移植的供体基因组或其他核酸序列。通过本文描述的方法转移、修饰、移植和生成的核酸序列可以是任何天然或合成生物的核酸序列。因此，供体基因组通过分离或通过化学合成源于任何期望的细胞或其任何包含核酸的亚单位。例如，核酸序列包括来自已知生物或新生物的基因组(比如全基因组、为至少最小基因组和/或至少最小复制基因组的全基因组的一部分、细胞基因组、细胞器基因组和病毒基因组)、染色体和其他大核酸序列。核酸序列，包括基因组，可以是生物中任何来源的，包括细胞器基因组，比如线粒体和叶绿体基因组、染色体、植物和动物的基因组或染色体的一部分、藻类来源和支撑细胞生存的任何基因组物质，其包括细菌和其他原核生物和真核生物的全细胞基因组和最小细胞基因组。
从下面实施例的评述和本文提供的讨论中显见，所描述方法的适用性不限于构建模仿自然中存在的合成基因组。方法可用于，例如将不同生物的部分基因组连接在相同DNA分子中，以生成在自然或实验室中不存在的新基因组和生物。供体基因组和其他核酸被克隆、增殖和/或从细胞比如细胞或组织(包括遗传改造生物)分离，或可在体外化学合成。下面描述用于分离和制备核酸和基因组的方法。
i.供体生物、基因组和其他核酸
在所提供的方法中使用和生成的基因组和其他核酸序列(例如，供体核酸)包括源于真菌、酵母、细菌、其他原核生物和藻类但不限于这些生物的那些。它们可以是任何生物，天然的或合成的，例如原生生物(Protista)界、古细菌(Archaebacteria)界、真细菌(Eubacteria)界、真菌(Fungi)界、植物(Plantae)界和动物(Animalia)界的生物、和病毒——包括噬菌体。
示例性核酸序列是源于细菌、古细菌、蓝细菌(例如，原绿球藻、集胞藻PCC6803等)、藻类、病毒(例如，流感嗜血杆菌基因组)、真菌(例如，酿酒酵母、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、布拉酵母(Saccharomyces boulardii)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)等)和噬菌体的那些。示例性支原体菌株包括生殖器支原体(例如，在实施例1中描述的生殖器支原体菌株MS5、生殖器支原体G37(GenBank号：L43967))、蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)(例如，蕈状支原体亚种mycoides大集落(LC)菌株GM 12(实施例1)、山羊支原体(Mycoplasma capricolum)亚种capricolum(菌株California KidTM)(ATCC 27343)、蕈状支原体亚种mycoides(菌株GM12)(Damassa等，1983)、山羊支原体亚种capricolum(山羊支原体)比如野生型山羊支原体和山羊支原体突变体(山羊支原体-ΔRE)和肺炎支原体(例如，肺炎支原体菌株M129-B170(ATCC 29343)；肺炎支原体M129，GenBank进入号U00089.2(GI：26117688))、鸡败血支原体(ATCC15302)、肺炎支原体Eaton(ATCC15531)及其衍生物。
示例性基因组和核酸包括许多生物的完整和部分基因组，其基因组序列是公开可得的且可用于本公开的方法，比如但不限于超嗜热古细菌(Aeropyrum pernix)；根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)；鱼腥藻(Anabaena)；冈比亚疟蚊(Anopheles gambiae)；意大利蜜蜂(Apis mellifera)；超嗜热菌(Aquifex aeolicus)；阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)；超嗜热古菌(Archaeo globus fulgidus)；核黄菌(Ashbyagossypii)；炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)；地衣型芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)；枯草杆菌(Bacillus subtilis)；脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)；多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)；亨氏罗卡利马氏体菌(Bartonella henselae)；五日热巴通体(Bartonella Quintana)；蛭弧菌(Bdellovibrio bacteriovorus)；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；Blochmannia floridanus；支气管炎博德特菌(Bordetellabronchiseptica)；副百日咳杆菌(Bordetella parapertussis)；百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)；伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)；大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)；羊流产布氏杆菌(Brucella melitensis)；猪流产布氏杆菌(Brucella suis)；蚜虫内共生菌(Buchnera aphidicola)；鼻疽假单胞菌(Burkholderiamallei)；类鼻疽假单胞菌(Burkholderia pseudomallei)；线虫种(Caenorhabditisbriggsae)；秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)；空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)；光滑假丝酵母(Candida glabrata)；家犬(Canis familiaris)；新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)；鼠型沙眼衣原体(Chlamydia muridarum)；沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)；豚鼠嗜性衣原体(Chlamydophila caviae)；肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)；绿硫菌(Chlorobium tepidum)；紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)；玻璃海鞘(Ciona intestinalis)；丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)；产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)；白喉棒杆菌(Corynebacterium diphtheriae)；有效棒杆菌(Corynebacterium efficiens)；伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)；人隐孢子虫(Cryptosporidium hominis)；微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)；小球隐孢子虫(Cyanidioschyzon merolae)；德巴利汉逊酵母(Debaryomyces hansenii)；耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)；Desulfotalea psychrophila；脱硫弧菌(Desulfovibriovulgaris)；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)；脑炎原虫(Encephalitozoon cuniculi)；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)；胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)；大肠杆菌(Escherichia coli)；具核梭杆菌(Fusobaceterium nucleatum)；红原鸡(Gallusgallus)；硫还原泥土杆菌(Geobacter sulfurreducens)；无类囊体蓝藻(Gloeobacterviolaceus)；蓝隐藻(Guillardia theta)；杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)；流感嗜血杆菌；极端嗜盐古菌(Halobacterium)；肝螺杆菌(Helicobacter hepaticus)；幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)；智人(Homo sapiens)；克鲁雄酵母菌(Kluyveromyceswaltii)；约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；甘蔗宿根矮化病菌(Leifsonia xyli)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)；钩端螺旋体(Leptospira interrogans)；无害利斯特菌(Listeriainnocua)；单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)；稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)；产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)；Mesoplasma florum；百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)；甲烷细菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)；嗜冷产甲烷菌(Methanococcoidesburtonii)；詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)；海沼甲烷球菌(Methanococcusmaripaludis)；耐寒甲烷菌(Methanogenium frigidum)；甲烷嗜热菌(Methanopyruskandleri)；醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)；马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)；嗜甲烷菌(Methylococcus capsulatus)；小家鼠(Musmusculus)；牛型结核分枝杆菌Mycobacterium bovis)；麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)；副结核分枝杆菌(Mycobacterium paratuberculosis)；结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)；生殖支原体(Mycoplasma genitalium)；蕈状支原体(Mycoplasma mycoides)；穿通支原体(Mycoplasma penetrans)；肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)；肺支原体(Mycoplasma pulmonis)；运动支原体(Mycoplasma mobile)；纳古菌(Nanoarchaeumequitans)；脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)；粗糙脉胞菌(Neurospora crassa)；欧洲亚硝化单孢菌属(Nitrosomonas europaea)；皮诺卡菌(Nocardia farcinica)；伊平屋桥大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus iheyensis)；洋葱黄化植原体(Onions yellowsphytoplasma)；水稻(Oryza sativa)；黑猩猩(Pan troglodytes)；多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)；黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)；发光杆菌(Photorhabdus luminescens)；干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)；疟原虫(Plasmodiumfalciparum)；鼠疟原虫(Plasmodium yoelii yoelii)；毛果杨(Populus trichocarpa)；牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)；原绿球藻；疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)；Protochlamydia amoebophila；铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)；嗜气菌(Pyrobaculum aerophilum)；海底火球菌(Pyrococcusabyssi)；高嗜热古细菌(Pyrococcus furiosus)；极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)；延胡索酸火叶菌(Pyrolobus fumarii)；茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)；褐家鼠(Rattus norvegicus)；Rhodopirellula baltica；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)；康诺尔立克次体(Rickettsia conorii)；斑疹伤寒立克次体(Rickettsia typhi)；普氏立克次体(Rickettsia prowazekii)；西伯利亚立克次体(Rickettsia sibirica)；酿酒酵母；贝酵母(Saccharomyces bayanus)；布拉酵母(Saccharomyces boulardii)；糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)；肠沙门氏菌(Salmonella enterica)；鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)；粟酒酵母(Schizosaccharomyces pombe)；奥柰达希瓦氏菌(Shewanella oneidensis)；痢疾杆菌(Shigella flexneria)；苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)；无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)；变异链球菌(Streptococcus mutans)；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)；化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)；阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)；嗜超高温古菌(Sulfolobus solfataricus)；超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)；聚球蓝细菌(Synechococcus)；蓝细菌(Synechocystis)；红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)；黑青斑河豚(Tetraodon nigroviridis)；假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)；腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)；嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)；火山热原体(Thermoplasma volcanium)；海栖热袍菌(Thermotagoa maritima)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)；牙垢密螺旋体(Treponema denticola)；苍白密螺旋体(Treponema pallidum)；正惠普尔养障体(Tropheryma whipplei)；解脲支原体(Ureaplasma urealyticum)；霍乱弧菌(Vibrio cholerae)；副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)；创伤弧菌(Vibrio vulnificus)；Wigglesworthia glossinidia；沃巴赫氏菌(Wolbachia pipientis)；产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)；柑桔溃疡病菌(Xanthomonas axonopodis)；黑腐病菌(Xanthomonas campestris)；苛养木杆菌(Xylellafastidiosa)；脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；假结核耶尔森菌(Yersiniapseudotuberculosis)；和鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)核酸。
术语“藻类”包括蓝细菌(蓝藻纲(Cyanophyceae))、绿藻(绿藻纲(Chlorophyceae))、黄绿藻(黄藻纲(Xanthophyceae))、金藻(金藻纲(Chrysophyceae))、褐藻(褐藻纲(Phaeophyceae))、红藻(红藻纲(Rhodophyceae))、硅藻(硅藻纲(Bacillariophyceae))和“超微型浮游生物”(青绿藻纲(Prasinophyceae)和真鞭藻纲(Eustigmatophyceae))。术语藻类还包括分类学甲藻纲(Dinophyceae)、隐藻纲(Cryptophyceae)、裸藻纲(Euglenophyceae)、灰色藻纲(Glaucophyceae)和普林藻纲(Prymnesiophyceae)。微藻类是只有在显微镜的帮助下才能看到的单细胞或群落藻类。微藻类包括真核藻类和原核藻类两者(例如，蓝细菌)。光合作用细菌包括蓝细菌、绿硫细菌、紫色硫磺细菌、紫色无硫细菌和绿色无硫细菌。
示例性基因组和核酸包括许多藻类生物的完整和部分基因组，其基因组序列是公开可得的且可用于本公开的方法，比如但不限于曲壳藻属(Achnanthes)、茧形藻属(Amphiprora)、双眉藻属(Amphora)、纤维藻属(Ankistrodesmus)、星胞藻属(Asteromonas)、Boekelovia、Borodinella、葡萄藻属(Botryococcus)、乳球菌属(Bracteococcus)、角毛藻属(Chaetoceros)、四鞭藻属(Carteria)、衣藻属(Chlamydomonas)、绿球藻属(Chlorococcum)、绿梭藻属(Chlorogonium)、小球藻属(Chlorella)、蓝隐藻属(Chroomonas)、金球藻属(Chrysosphaera)、球钙板藻属(Cricosphaera)、隐甲藻属(Crypthecodinium)、隐藻属(Cryptomonas)、小环藻属(Cyclotella)、盐藻属(Dunaliella)、椭圆藻属(Ellipsoidon)、球石藻属(Emiliania)、独球藻属(Eremosphaera)、Ernodesmius、裸藻属(Euglena)、披刺藻属(Franceia)、披刺藻属(Fragilaria)、丽丝藻属(Gloeothamnion)、鞭毛藻Haematococcus)、Halocafeteria、膜胞藻属(Hymenomonas)、等鞭金藻属(Isochrysis)、鳞孔藻属(Lepocinclis)、微芒藻属(Micractinium)、单针藻属(Monoraphidium)、微球藻(Nannochloris)、微藻(Nannochloropsis)、舟形藻(Navicula)、新绿藻属(Neochloris)、肾鞭藻属(Nephrochloris)、肾藻属(Nephroselmis)、棱形藻属(Nitzschia)、棕鞭藻属(Ochromonas)、鞘藻属(Oedogonium)、卵囊藻属(Oocystis)、Ostreococcus、巴夫藻属(Pavlova)、Parachlorella、Pascheria、褐指藻属(Phaeodactylum)、噬菌体属(Phagus)、扁藻属(Platymonas)、颗石藻(Pleurochrysis)、肋球藻属(Pleurococcus)、原壁菌属(Prototheca)、Pseudochlorella、塔胞藻(Pyramimonas)、桑葚藻属(Pyrobotrys)、栅藻属(Scenedesmus)、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、骨条藻属(Skeletonema)、Spyrogyra、裂丝藻属(Stichococcus)、融合微藻(Tetraselmis)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、海链藻属(Thalassiosira)、Viridiella或团藻虫属(Volvox)种类。在一些实施方式中，可使用光合作用细菌，包括例如，绿硫细菌、紫色硫磺细菌、绿色无硫细菌、紫色无硫细菌或蓝细菌。可使用的蓝细菌种类包括但不限于片藻(Agmenellum、鱼腥藻属(Anabaena)、项圈藻属(Anabaenopsis)、组囊藻属(Anacystis)、束丝藻属(Aphanizomenon)、节旋藻属(Arthrospira)、星球藻属(Asterocapsa)、博氏藻属(Borzia)、眉藻属(Calothrix)、管孢藻属(Chamaesiphon)、绿棒粘属(Chlorogloeopsis)、拟色球藻属(Chroococcidiopsis)、色球藻属(Chroococcus)、发毛针藻属(Crinalium)、蓝细菌(Cyanobacterium)、蓝菌属(Cyanobium)、蓝囊胞菌属(Cyanocystis)、蓝螺菌属(Cyanospira)、蓝杆藻属(Cyanothece)、拟柱孢藻属(Cylindrospermopsis)、筒孢藻属(Cylindrospermum)、拟指球藻属(Dactylococcopsis)、小皮果蓝细菌属(Dermocarpella)、飞氏藻属(Fischerella)、Fremyella、吉特勒氏菌属(Geitleria)、Geitlerinema、粘杆菌属(Gloeobacter)、库氏粘球藻(Gloeocapsa)、粘杆藻属(Gloeothece)，盐螺旋藻属(Halospirulina)、Iyengariella、瘦鞘丝藻属(Leptolyngbya)、蓝丝藻属(Limnothrix)、鞘丝藻属(Lyngbya)、微鞘藻属(Microcoleus)、小球藻属(Microcystis)、粘囊藻属(Myxosarcina)、节球藻属(Nodularia)、念珠藻属(Nostoc)、拟珠藻属(Nostochopsis)、颤藻属(Oscillatoria)、席藻属(Phormidium)、浮丝藻属(Planktothrix)、宽球藻属(Pleurocapsa)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、原绿藻属(Prochloron)、绿发藻属(Prochlorothrix)、假鱼腥藻属(Pseudanabaena)、胶须藻属(Rivularia)、裂须藻属(Schizothrix)、双歧藻属(Scytonema)、螺旋藻属(Spirulina)、Stanieria、斯塔尔氏蓝细菌属(Starria)、多列藻属(Stigonema)、束藻属(Symploca)、集球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、单歧藻属(Tolypothrix)、束毛藻属(Trichodesmium)、Tychonema或异球藻属(Xenococcus)种类。
基因组和其他核酸序列包括源于这类基因组的修饰的和合成的核酸序列。目前所描述的方法同样适用于还未公开的核酸序列——当它们变得可得时，包括表征多细胞生物比如高等植物比如玉米和水稻、哺乳动物比如啮齿类动物(小鼠、大鼠、兔子等)、猪、母牛、公牛、马、灵长类、羊和伴侣动物(例如，狗、猫等)的那些。在一种实施方式中，从人类分离的细胞可用于获得供体基因组。目前这些的许多是可得的。核酸序列和基因组包括不模拟自然中存在的那些的核酸序列和基因组。
在一种实施方式中，被选择使用本方法操作的基因组和其他核酸序列源于难处理的生物或其他具有弱遗传系统或与宿主生物——包括某些原核生物和其他非酵母生物——相比较不合意的遗传系统的生物，比如其中普通遗传技术是低效的那些，比如双交换同源重组和转座子突变。例如，在某些细菌生物比如支原体种类中，这些技术是低效的。尽管在蕈状支原体LC中为了基因的靶向添加和破裂(disruption)，已经进行通过单交换事件整合质粒DNA(Janis，C等2005，Appl EnvironMicrobiol 71：2888-93)，但是该生物包含极少量选择标记，这限制了可在单个蕈状支原体LC细胞中进行的遗传修饰的数量。
感兴趣的是具有生产工业上有用的化合物和/或在极端环境下(例如，高温、高压等)起作用的潜力的生物，比如原核生物，其包括具有弱遗传系统的那些。示例性生物包括可用于产生生物燃料的那些。其他示例性生物包括经历光合过程的那些。基因组和生物可使用本文描述的和本领域已知的方法进行遗传修饰以生成用于生产生物燃料的新基因组和生物。例如，涉及光合作用和其他代谢过程的基因可被修饰以生成产生油例如生物燃料而不是葡萄糖或另一种碳源的生物。因此，本文包含的基因组是具有将阳光和二氧化碳转化成生物燃料的能力的被改造生物的那些基因组。一种这样的示例性生物是原绿球藻，其是地球上最丰富的光合生物之一，但是具有低效率的遗传系统。
在一种实施方式中，进行该方法以修饰和改造基因组，比如全(完整的)基因组(例如，全细胞、病毒和细胞器基因组)和全基因组的一部分，其包含在至少一组环境条件下，足够实现和/或维持细胞生存(最小细胞基因组)、宿主细胞中依靠宿主细胞生存的生物的生存(例如，最小病毒基因组)或在宿主细胞中细胞器功能(最小细胞器基因组)的遗传材料。一方面，基因组是最小基因组或最小复制基因组。另一方面，基因组包含在可见于最小基因组或全基因组中的那些之外的另外核酸序列。
基因组可以是自然发生的或合成的，比如遗传改造基因组，包括修饰的基因组和包含来自多于一个种类的核酸和/或部分基因组的杂交基因组。
一方面，基因组是细胞基因组，其包含足够引起和/或维持细胞生存的核酸序列，例如编码复制、转录、翻译、能量产生、运输、膜和细胞质组分产生和细胞分裂所需要的分子的那些。
另一方面，基因组是病毒或细胞器基因组。
在一种实施方式中，核酸序列是细胞器核酸序列，例如，细胞器基因组，比如质体，例如叶绿体和线粒体基因组。真核细胞器，比如线粒体和叶绿体，是包含细胞质DNA的、膜结合间隔，其被认为是在它们宿主中捕获的内共生细菌的残留物。一般地，线粒体天然见于所有真核细胞中，且叶绿体和其他质体天然见于植物和藻类中。质体基因组的大小从35到217kb变化，大多数在115和165kb之间。线粒体基因组的大小在不同种之间变化很大，并可从低于20kb到超过350kb。本申请的方法允许在宿主细胞中使用在宿主细胞中的核酸和遗传系统改造细胞器基因组。例如，细胞器可在酵母宿主中使用酵母质粒和同源重组进行修饰。提供的方法可用于生成新的线粒体或叶绿体基因组，例如在真核细胞，比如酵母和藻类中增加能量产生或代谢。
在另一种实施方式中，核酸是病毒和噬菌体核酸，比如病毒和噬菌体基因组。例如，病毒和细菌核酸以及基因组可通过所提供的方法进行修饰和改造以生成具有治疗用途的病毒。作为另一个例子，病毒基因组可使用本文描述的方法进行克隆和操作。在医学应用中病毒已被用于基因疗法、疫苗和用作特洛伊木马(Trojanhorses)；但是，病毒基因组对于在简单质粒中操作而言太大。类似地，噬菌体已被用作抗生素几十年；但是T噬菌体的基因组太大以致不能容易地加工。
在另一种实施方式中，通过所提供的方法修饰、改造和生成的核酸序列不是基因组。例如，核酸包括染色体和其他核酸序列。
典型地，核酸序列和基因组是大的核酸序列。一方面，基因组或其他核酸序列的长度为至少或大约100kb、150kb、200kb、250kb、300kb、350kb、400kb、450kb、500kb、550kb、600kb、650kb、700kb、750kb、800kb、850kb、900kb、950kb、1百万碱基(MB)、1.1MB、1.2MB、1.3MB、1.4MB、1.5MB、1.6MB、1.7MB、1.8MB、1.9MB、2MB、2.1MB、2.2MB、2.3MB、2.4MB、2.5MB、2.6MB、2.7MB、2.8MB、2.9MB、3MB、3.1MB、3.2MB、3.3MB、3.4MB、3.5MB、3.6MB、3.7MB、3.8MB、3.9MB、4MB、4.5MB、5MB、6MB、7MB、8MB、9MB、10MB、15MB或20MB，或其中任何具体的数值或范围。提供的方法也可用于操作和克隆更小的核酸序列，比如，例如小于大约100kb的那些。
ii.供体基因组和其他核酸的增殖、分离和合成
在转移之前，核酸序列可在细胞或组织中增殖和/或从细胞或组织中分离。供体核酸序列可从供体细胞或组织(例如，从供体生物的细胞和组织)中分离或使用熟知的克隆、细胞和质粒技术和系统，被转化入其他细胞并在其中增殖。在细胞中的核酸序列可以是天然的或合成的，包括部分合成的。在一些情况下，从细胞或组织中分离之后，核酸序列比如通过PCR进行扩增。
供体核酸还可在体外使用化学合成和装配方法化学合成，并因此在所描述的方法中使用之前不用从任何特定组织或细胞中分离。用于DNA和RNA化学合成和核酸装配的方法是已知的，并包括寡核苷酸合成、装配和聚合酶链反应(PCR)和其他扩增方法(比如，例如，滚环扩增、全基因组扩增)，比如本文描述和在Gibson等于2008年11月7日提交的美国申请号12/247,126中描述的那些。例如，可从DNA(例如，通过PCR)或从RNA，例如通过逆转录，合成DNA。核酸中的是合成基因组。例如，合成基因组可如本文描述的和在Gibson等于2008年11月7日提交的美国申请号12/247,126中描述的生产。
iii.核酸序列、载体-宿主系统和培养条件
核酸序列可从各种来源分离、遗传改造、扩增和/或重组表达/生成。从这些核酸序列生成的重组多肽可被单独地分离或克隆，并对期望的活性进行测试。可以使用任何重组表达系统，包括细菌、哺乳动物、真菌、酵母、昆虫或植物细胞表达系统。
可选地，核酸序列可在体外合成，比如通过熟知的化学合成技术，和/或从商业来源获得，和任选地装配，比如对于大核酸和基因组，例如，在Gibson等于2008年11月7日提交的美国申请号12/247,126中所描述的。
在科学和专利文献中充分地描述了用于核酸序列操作的技术，比如，例如亚克隆、标记探针(例如，使用Klenow聚合酶的随机引物标记、切口平移、扩增)、测序、杂交等。
获得和操作用于实施所提供方法的核酸序列的另一有用方法是从基因组样品克隆，且如果期望，筛选和再克隆从例如基因组克隆或cDNA克隆分离或扩增的插入物。在描述的系统和方法中使用的核酸序列的来源包括包含在例如哺乳动物人工染色体(MAC)，见，例如美国专利号：5,721,118；6,025,155；人类人工染色体，见，例如Rosenfeld(1997)Nat.Genet.15：333-335；酵母人工染色体(YAC)；细菌人工染色体(BAC)；P1人工染色体(见，例如Woon(1998)Genomics 50：306-316)；源于P1的载体(PACs；见，例如Kern(1997)Biotechniques 23：120-124)；粘端质粒、重组病毒、噬菌体或质粒中的基因组或cDNA文库。
用于分离核酸序列如基因组DNA的方法是熟知的。如对技术人员显而易见的是，分离的方法取决于被分离序列(一条或多条)的类型和大小、生物的类型和从中分离序列(一条或多条)的组织或细胞的类型。用于从各种生物中分离遗传物质的方法是熟知的并可在本实施方式中使用以分离供体核酸序列(基因组)。例如，用于DNA分离的常规方法是熟知的并可根据大小用于提供的方法，并可用商业上可得的大量用于分离核酸序列的试剂盒实施；例如，商业上可得的试剂盒可用于从细胞中分离基因组DNA。
天然和合成的核酸序列可通过扩增增殖，例如复制。扩增也可用于克隆或修饰提供的核酸序列。因此，提供了用于扩增所提供的核酸序列的扩增引物序列对。本领域技术人员可为这些序列的任何部分或全长设计扩增引物序列对。扩增也可定量在样品中核酸序列的数量，比如在宿主细胞中供体基因组的数量。
可选择并设计适宜的扩增引物。扩增方法也是本领域熟知的并包括，例如聚合酶链反应——PCR、连接酶链反应(LCR)、转录扩增(见，例如Kwoh(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173)；和自动维持序列扩增(见，例如Guatelli(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874)；Qβ复制酶扩增(见，例如Smith(1997)J.Clin.Microbiol.35：1477-1491)；自动Q-β复制酶扩增试验(见，例如Burg(1996)MoLCell.Probes 10：257-271)和其他RNA聚合酶介导的技术(例如，NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)；也参见Berger(1987)Methods Enzymol.152：307-316；Sambrook；Ausubel；美国专利号：4,683,195和4,683,202；和Sooknanan(1995)Biotechnology 13：563-564。
在一种实施方式中，核酸序列在细菌细胞比如大肠杆菌，例如大肠杆菌DH10B[F--mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 endA1araD139Δ(ara，leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG](Invitrogen))中，使用质粒克隆和增殖。在大肠杆菌和其他实验室菌株中克隆和增殖核酸的方法和质粒是熟知的且可与提供的方法结合使用。在一种实施例中，大肠杆菌细胞在培养基例如Luria-Bertani(LB)肉汤培养基中或在LB琼脂中在37℃下生长。
可增殖核酸序列，例如在支原体细胞中。支原体细胞可以是天然包含供体核酸的供体支原体细胞或供体核酸例如合成基因组已被转化入其中的支原体细胞。示例性支原体种类包括，例如，山羊支原体亚种capricolum(菌株CaliforniaKidTM)(ATCC 27343)和蕈状支原体亚种mycoides(菌株GM12)(Damassa等，1983)、山羊支原体亚种capricolum(山羊支原体)，比如野生型山羊支原体和通过如在下面描述的实施例中使野生型山羊支原体中的CCATC-限制酶基因失活获得的山羊支原体突变体(山羊支原体-ΔRE)。使这些和其他支原体细胞和其他细胞生长的方法是已知的。在一种实施例中，支原体供体在37℃下在包含17％胎牛血清(Invitrogen)的液体或固体SP4培养基中生长(Tully等1977)。
为了有利于选择包含期望的使用已知方法克隆和增殖的核酸的细胞，可改造细胞培养物和质粒系统。在一种实施例中，细菌细胞比如大肠杆菌根据位于用于克隆和增殖的核酸例如质粒中的抗性基因，在补充有抗生素或其他选择试剂例如50μg/ml的氨苄青霉素、5μg/ml的四环素或125μg/ml的嘌呤霉素的培养基中进行生长。类似地，已经用质粒、供体基因组或其他核酸转化的支原体细胞可在补充有5μg/ml的四环素或8μg/ml的嘌呤霉素的培养基例如SP4培养基中生长。
可使用熟知的方法检测在细胞中期望基因产物的表达。例如，可通过将支原体或其他细胞类型铺板在包含150μg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal，Promega)的固体培养基上检测β-半乳糖苷酶活性。技术人员可理解本文考虑使用常规技术用于表达基因产物的其他条件和方法。
a.在琼脂糖插块中分离核酸序列
核酸序列可在琼脂糖插块中分离以使损害最小化。在常规分离过程期间，大的核酸序列，比如范围从几千碱基对到10MB和更大的DNA(例如，基因组)，可被机械力(例如，滴管吸取)剪切，造成损害。在琼脂糖中分离这类核酸序列可使损害最小化。在该实施方式中，包含供体DNA的细胞被包埋在琼脂糖中并裂解。用于在琼脂糖例如低熔点琼脂糖中分离基因组核酸序列的方法，也是熟知的并可使用商业上可得的试剂盒，比如CHEF哺乳动物基因组DNA插块(plug)试剂盒(目录号170-3591)、CHEF细菌基因组DNA插块试剂盒(目录号170-3592)和CHEF酵母基因组DNA插块试剂盒(目录号170-3593)实施，其都来自Bio-Rad LaboratoriesHercules，CA。使用这样的试剂盒制备DNA可使用供应商推荐的条件和方案进行。
还可按照制造商建议的方案，使用低熔点琼脂糖和Bio-Rad CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒在琼脂糖插块中分离供体核酸序列(例如，细菌、支原体、酵母或藻类基因组)。在一种实施例中，细胞悬浮在没有血清或PBS的培养基中，且许多细胞(例如，制备每mL琼脂糖5×107或5×108个)被离心并重悬浮在待被制造的一半终体积的琼脂糖中。同时，在无菌水中制备低熔点琼脂糖(例如，Bio-Rad2％CleanCutTM琼脂糖)并熔解且平衡至50℃。细胞悬浮液平衡至相同的温度并温和地与琼脂糖混合。将混合物转移至插块模中并允许固化。在一种实施例中，为了溶胞，添加包含蛋白酶K的混合物(例如，以5ML蛋白酶K反应缓冲液，每mL插块包含100mM EDTA——pH8、0.2％的脱氧胆酸钠、1％的月桂酰肌氨酸钠和1mg/mL的蛋白酶K)，并在50℃下温育过夜。在另一种实施例中，为了溶胞，将在琼脂糖中的细胞在50℃下，在0.4M EDTA、0.4％N-月桂酰肌氨酸(N-lauroylsarcosine)、2mg/mL蛋白酶K中温育过夜到两天的期间，接着更换缓冲液并在相同的条件下第二次处理相同的时间。
溶胞之后，包含供体核酸的琼脂糖插块可针对10mM，pH 8.0的Tris(任选地包含1mM或50mM的EDTA)透析例如1小时。在一种实施例中，该透析之后，在10mM Tris、50mM ETDA、0.1mM PMSF中每次两小时透析两次，并在10mMTris、50mM EDTA中再次透析用于储存。在另一种实施例中，接着针对10mM(6％)PEG6000(United States Biochemical)、0.6M NaCl透析数小时，如Katsura等，Electrophoresis 21，171(Jan，2000)所描述，然后转移。在一种实施例中，插块在65℃下进一步熔解5分钟，接着添加两体积65℃的TE并温和地搅拌，接着在65℃下温育5分钟。
在某些方面，插块在转化进入宿主细胞之前，使用例如β-琼脂糖酶熔解并消化。在一种实施例中，插块通过CHEF(Bio-Rad)电泳两次(例如，第一次在1％脉冲场琼脂糖凝胶上，用0.5×TBE和50-90秒的转换时间，超过20小时，和第二次在1％低熔点凝胶上，用1×TAE和60-120秒转换时间，超过24小时)，以除去破碎的DNA但是留下完整的基因组，接着针对无菌的1×TAE透析并在73℃下熔解，平衡至42℃并用β-琼脂糖酶(New England Biolabs)消化，例如1.5小时。
b.分离细胞器基因组
供体核酸序列可以是细胞器基因组，例如从供体细胞中分离的细胞器基因组。本领域用于分离细胞器基因组的方法是已知的。来自许多制造商，包括Pierce(Rockford，111.)，Sigma-Aldrich(St.Louis，Mo.)和其他的用于从细胞中分离细胞器的试剂盒是可得的。
细胞器基因组和其他核酸可从各种细胞类型，比如真核和原核细胞，包括酵母细胞、植物细胞、藻类和哺乳动物细胞中分离。应当理解，如本领域众所周知的，分离过程可根据从中分离细胞器核酸的细胞的生物以及被分离的细胞器的类型变化。细胞器核酸分离过程可包括在总基因组DNA样品中从细胞核DNA分离细胞器DNA，例如，根据分子量，通过分级分离或凝胶分离。在某些实施方式中，在提取DNA之前，细胞器可从总细胞部分中纯化。
用于从植物中分离叶绿体(和其他质体)基因组的方法是已知的。分离通常通过(1)使质体与其他细胞器分开、(2)使叶绿体裂解和(3)纯化核酸进行。在一种实施例中，蔗糖或Percoll分级梯度用于从细胞裂解物中获得叶绿体，其接着被裂解并用于回收DNA。在具体实施例中，将植物放置在黑暗处以降低叶绿体淀粉水平、绿叶在自来水中漂洗并放入(10-100g)至分离缓冲液中以在预冷的搅拌器中匀浆，接着过滤通过粗棉布并离心。将沉淀(pellet)加样至一级梯度(one-step gradient)，其具有18mL 52％的蔗糖、覆盖有7mL 30％蔗糖，和任选地更多蔗糖梯度以增加产量，比如200g起始材料至少6个蔗糖梯度。离心分级梯度，例如在4℃下，25,000rpm，30-60分钟，并使用大口径吸液管从30-52％界面移出叶绿体带。接着如描述裂解叶绿体并离心以除去碎片。接着例如如描述的使用CsCl梯度纯化DNA。DNAseI处理可用于改进蔗糖梯度方法并破坏细胞核DNA。可选地，如本领域众所周知，高盐(例如，1.25M的NaCl)方法可用于分离而不用分级梯度离心。可使用荧光激活的细胞分选仪(FACS)分离，从线粒体和细胞核中分选叶绿体。
用于分离线粒体DNA(mtDNA)包括高度纯化的mtDNA的方法是已知的，并可结合提供的方法使用以分离线粒体基因组。高度纯化的mtDNA可从脊椎动物或无脊椎动物组织中使用蔗糖过垫(pad)梯度和氯化铯梯度制备。一般地，从生物中，如果有必要，通过匀浆组织，接着在低速下重复离心以除去细胞碎片和细胞核，接着在高速下离心并裂沉淀物，制备组织(例如脊椎动物和无脊椎动物胚胎的脑、睾丸、卵巢、肝脏、肾、心脏、骨骼肌)。在4℃下，通过25,000rpm超速离心1小时，对沉淀物进行蔗糖分级梯度，其中梯度包含TE缓冲液中10mL的1.5M蔗糖的过垫和1M蔗糖的10mL层。对于该过程，沉淀物在TE缓冲液中重悬浮并在梯度上分层，接着在4℃下，以27,000rpm离心1-2小时。用Pasteur吸液管收集在1M和1.5M蔗糖过垫的界面处的表现为乳白色带的高度纯化的线粒体，并放置在管中通过高速离心(例如，在4℃下，13,000rpm)进一步浓缩。
接着裂解沉淀的线粒体，例如通过在TE缓冲液中重悬浮并添加十二烷基硫酸钠(SDS)(例如，每mL TE 0.3mL 10％SDS)。在溶液显示澄清之后，添加饱和CsCl并在冰上温育混合物20分钟，接着以12,000rpm离心10分钟，保留上清液。用CsCl-碘化丙啶(PI)(或溴化乙锭)梯度(例如，每8mL上清液8g CsCl和0.6mL 2mg/ml PI，混合并调整密度至1.56g/mL)，纯化DNA。以36,000rpm离心之后，上面的带包含细胞核DNA，下面的带包含mtDNA，其可被收集并任选地接着进一步CsCl梯度。用于分离mtDNA的试剂盒是商业上可得的。在一种实施例中，使用mtDNAExtractor CT试剂盒(Wako，Osaka Japan，目录号：291-55301)从哺乳动物组织，比如肌肉或肝脏组织中制备线粒体DNA。用于分离真菌(例如，酵母)线粒体DNA——作为超螺旋环状DNA，其通常不能有效地释放至细胞匀浆中——的方案也是已知的。在一种实施例中，对DNA粗制备物的CsCl密度梯度离心在存在优选地与富含AT的DNA结合的染料(例如，DAPI或双苯甲亚胺(双苯酰亚胺))的情况下进行。在另一种实施例中，mtDNA从分离的线粒体中提取，所述线粒体通过以2000g离心裂解物20分钟使细胞核和细胞碎片沉淀，接着在蔗糖梯度上分离上清液(例如，2mL 60％蔗糖，覆盖有4mL 50％的蔗糖，覆盖有4mL 44％的蔗糖，接着用甩平式转子以120,000g离心90分钟并从44/55％的界面收集线粒体)进行分离。
D.将供体基因组和核酸序列引入宿主细胞
在提供实施方式中的是用于将包括供体基因组在内的供体核酸引入宿主细胞的方法和核酸，例如用于在宿主细胞中使用宿主细胞机器进行修饰。宿主细胞是提供期望能力的异源宿主细胞，所述能力通常在供体基因组来源的细胞中不存在，例如重组机器。如上述，供体核酸可从细胞或组织中分离然后转移、在体外化学合成和/或装配、和/或通过体外或体内方法从这类分离的或合成的核酸复制。
典型地，首先通过将供体核酸(其可以是环状、线性化的或断裂的)与通常是宿主载体的宿主核酸连接，以生成包含供体核酸和宿主载体的核酸，其可在宿主细胞中增殖和修饰。将供体核酸与宿主载体的连接可在在供体细胞或宿主细胞的体外或体内进行，将供体核酸(例如，供体基因组)转移入宿主细胞。在一种实施例中，宿主载体被转化入供体细胞，在那里它与供体基因组重组，接着分离具有载体插入的基因组(见，例如图2A)。在另一种实施例中，供体基因组和宿主载体分别共转化进入宿主细胞，且供体和宿主核酸在宿主细胞中重组。在与载体共转化入宿主细胞之前，供体基因组可被线性化(见，例如图2B)或断裂(见，例如图2C)。
i.宿主细胞
宿主细胞可以是任何宿主细胞，且通常是具有期望用于在实验室中修饰核酸的遗传系统的异源细胞，例如与供体生物或细胞相比具有改善的遗传系统。期望遗传系统的示例性方面是支持同源重组——包括双交换同源重组和转座子突变——的能力、确定的且良好表征的选择和其他标记组和用于克隆大核酸的能力。还期望宿主细胞具有使在宿主细胞中克隆、增殖和修饰核酸期间与供体核酸相容的性质。
例如，可选择特定的宿主细胞以使基因毒性最小化。可选择宿主/供体组合，以便在宿主细胞中来自供体核酸的基因表达不发生或与在供体细胞中相比在宿主细胞中来自供体核酸的基因表达减少。一方面，宿主和供体包含不同的翻译和/或转录信号和/或机器，比如酵母和细菌生物。另一方面，一个或多个密码子被供体翻译成氨基酸而被细胞机器处理为终止密码子。在一种实施例中，供体翻译密码子(例如，UAG)成氨基酸(例如，色氨酸)，而宿主细胞把相同的密码子读为终止密码子(例如，支原体对真核生物)。在这些方面，供体基因组和其他核酸可在具有期望遗传系统的宿主细胞中保留、复制和修饰而不(或最小)表达由供体基因组编码的基因产物。
宿主细胞可包括与克隆供体基因组或核酸相容的任何细胞。因此，例如，来自藻类的基因组可克隆入酵母并操作以当重新引入相同或不同的藻类受体细胞时提供更多有利的特性。达到与系统一定的相容程度，这些藻类基因还可被操作并提供给植物细胞培养物。类似的操作对于脊椎动物和无脊椎动物细胞是可行的。
在一种优选的实施方式中，宿主细胞是酵母细胞。酵母宿主包括“驮马种类”，酿酒酵母和其他酵母种类比如粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)，其可用于克隆甚至更大的基因组。由于它们独特的遗传操作工具组，酵母宿主尤其适合操作供体基因组物质。酵母细胞的天然能力和几十年的研究已产生了丰富的用于在酵母中操作DNA的工具组。这些优点是本领域熟知的。例如，酵母，用它们丰富的遗传系统，可通过同源重组装配和重装配核苷酸序列，这是许多容易得到的生物不具备的能力。酵母细胞可用于克隆不能克隆入其他生物的更大的DNA，例如，整个细胞、细胞器和病毒基因组。因此，所描述方法的一种实施方式利用酵母遗传的巨大能力，通过使用酵母作为用于操作难处理的和其他生物的基因组和合成基因组的宿主细胞，推进合成生物学和合成基因组学。
示例性酵母宿主细胞是酵母菌株VL6-48N、为高转化效率开发的亲代菌株：VL6-48(ATCC号MYA-3666TM))、W303a菌株和重组-缺陷酵母菌株，比如RAD54基因-缺陷菌株、VL6-48-Δ54G(MATa his3-Δ200 trp1-Δl ura3-52 lys2 ade2-101 met14 rad54-Δl::kanMX)，其可在酵母人工染色体(YAC)中减少多种重组事件的发生。
有许多组验证的、证实的和可靠的用于选择和反选择酵母突变体的选择标记，其使得在酵母宿主细胞中进行多轮次例如无限迭代轮次的无缝核酸改变成为可能。因此，酵母可用于引入许多不同的遗传修饰，包括单核苷酸变化(例如，插入、缺失、突变)，修饰靶核酸部分和区域并构建全新的染色体。对其他难处理的基因组或其他大核酸克隆拷贝的连续修饰可在酵母中快速连续地进行。酵母的交配能力对于修饰基因组和其他大核酸是有利的。当在酵母交配期间激活时，酵母重组机器可用于生成文库，例如，包含克隆基因组或核酸变体的组合文库。
例如，已经为数个不同的细菌构建了酵母人工染色体(YAC)文库(Azevedo等，PNAS USA 90，6047(1993)；Heuer等，Electrophoresis 19，486(1998)；Kuspa等，PNASUSA 86，8917(1989))。大的原核DNA片段可使用通用的遗传密码在酵母中克隆。有毒的基因表达通常不是在酵母中克隆供体核酸的障碍。例如，细菌和古生菌基因组的研究指示由于真核生物与这些细菌使用不同的蛋白表达机器，所以从克隆基因组表达的蛋白对酵母宿主具有很少的危害风险。在酵母中转录(Kozak，Gene234，187(1999))和翻译(Kornberg，Trends Cell Biol 9，M46(1999))信号与在细菌中的转录和翻译不同。事实上，大部分原核基因很可能不在酵母中表达。在酵母中没有限制障碍(Belfort和Roberts，Nucleic Acids Res 25，3379(1997)。如果有障碍，那么它可能是复制障碍，而不是基因表达障碍(Stinchcomb等，PNAS USA 77，4559(1980))。基因毒性被最小化，这是因为在真核生物比如酵母中的基因表达调节与在原核生物中的不同。而且，支原体使用密码子UGA用作色氨酸而不是作为翻译终止信号。因此，大部分支原体基因，如果表达的话，将在酵母中产生截短的蛋白质。这很大程度上避免了有毒基因产物的可能性。
可从供体生物中获得其天然形式的供体，并用酵母载体对供体修饰，然后转化进入酵母，或从天然或合成的片段与酵母载体一起装配，然后转化进入酵母细胞，或供体与酵母载体一起同时共转化进入酵母细胞。通过将这些基因组转移入相容的受体细胞中创造新的生物，所述这些基因组可任选地按期望操作。因此，一种实施方式首次提供了适合的技术，用于：将基因组转移入酵母宿主细胞，在宿主细胞中修饰基因组同时保留它们的稳定性和完整性，并从酵母宿主细胞移植克隆和操作的基因组返回更加紧密类似初始供体的受体细胞，从而制造先前不存在的和/或无法通过可用的遗传改造和克隆工具遗传操作它们的初始细胞制造的生物。
ii.宿主载体
典型地，使用宿主载体将供体核酸转化入宿主细胞并在其中增殖。因此，宿主细胞一般包含或支持引入宿主载体，用于在宿主细胞中转移、保留和修饰供体核酸。在一种实施方式中，宿主载体包含核酸序列以有利于从供体细胞转移供体核酸至宿主细胞和受体细胞和其他细胞，比如用于克隆和繁殖的细菌细胞(例如，大肠杆菌)，比如在本文实施例中描述的三穿梭载体(见，例如图3)。
一方面，载体包含在一个或多个期望细胞类型中促进载体复制所需的任何核酸(例如，复制原点)和用于不同细胞类型中的选择和/或抗性标记。
抗性标记是熟知的。技术人员能够为不同的宿主/供体组合确定合适的抗性标记。在一些情况下，期望使用非临床相关的标记。在其他情况下，抗性标记的选择取决于供体、宿主和/或受体细胞的性质。例如，靶向细胞壁的抗生素可能不可在支原体和其他缺少细胞壁的生物中使用。抗性标记之一是编码抗生素抗性，比如氨苄青霉素、卡那霉素和四环素抗性的基因，比如四环素抗性蛋白(TetM)和氯霉素酰基转移酶(CAT)、氨基糖苷类抗性蛋白(aacA/aphD)和其组合。例如，tet-抗性标记可用于细菌比如支原体中，其中四环素具有有效的效果且其展示低水平的自发抗性。也可使用赋予嘌呤霉素抗性的基因，例如用于克隆和修饰支原体核酸和使用支原体细胞。
嘌呤霉素是模拟氨酰化的tRNA的3’-末端并附着在生长蛋白链的羧基端以停止蛋白合成的抗生素。因为嘌呤霉素征募被细胞中所有各种tRNA使用的rRNA识别元件，所以可通过简单的点突变获得自发抗生素抗性是不可能的，其在一些情况下用其他标记可发生。嘌呤霉素是容易得到的，相对便宜，不在临床上使用并且它是在原核生物和真核生物二者中有效的翻译抑制剂。不存在已知的基于rRNA的抗性。
已经开发了密码子优化的盒以在5种不同的支原体种类中赋予嘌呤霉素抗性，并可在大肠杆菌中起作用，使它在穿梭载体中有功能。为了制作该盒，使用重叠寡核苷酸合成了597bp嘌呤霉素N-乙酰转移酶85基因(PAC)，如Smith等，PNASUSA 100：15440-5(2003)描述。简言之，编码密码子优化版本的两条链的5’磷酸化的寡核苷酸(为了在生殖器支原体中表达)从IDT(Coralville，IA)定购。寡核酸是48碱基，88长，具有24碱基重叠。混合上游链和下游链寡核酸，加热至95℃并缓慢冷却以使重叠退火。连接(ligate)反应12小时，并用作PCR的模板。PCR扩增子被克隆入pGEM-3Zf(+)(Promega，Madison，Wisconsin)并测序以鉴定正确的PAC克隆。然后，将优化的PAC基因在柠檬螺旋原体螺旋素启动子(Ps)控制下克隆并用于置换在Mini-Tn4001tet衍生物中的tetM基因，以及在pMycol中的tetM基因(Lartigue等(2003)，Nucleic Acids Res 31：6610-8)。新的质粒(Mini-Tn4001PsPuro)可用于转化生殖器支原体、鸡败血支原体和肺炎支原体，而pMycol衍生物(pMycoPuro)可用于转化蕈状支原体LC和山羊支原体。
载体还包括允许使载体与供体核酸连接的核酸。在一种实施例中，宿主载体包含供体基因组或核酸的同源区域，比如在线性载体的3’和5’端的同源区域，其与供体核酸内的邻近区域同源，以通过同源重组促进连接。在另一种实施例中，宿主载体包含编码转座酶和/或反向重复的核酸，以有利于连接入比如插入比如在供体细胞中的供体核酸。宿主载可另外地包含限制酶识别位点和核酸以在宿主细胞中和其他细胞中支持复制和分离。
一方面，酵母宿主载体包含复制原点(例如，从pUC19的高拷贝原点)；一个或多个抗性标记和/或选择标记(例如，抗生素抗性基因和可选择的宿主细胞(例如，酵母)标记)，比如在宿主细胞、供体细胞和受体细胞中用于选择的标记。示例性抗性/选择标记是抗生素抗性基因(例如，氨苄青霉素-抗性基因、卡那霉素抗性基因和其他熟知的抗生素抗性基因)和其他抗生素抗性基因；可选择的酵母或其他宿主细胞标记，(例如，HIS3)和/或选择标记；有利于插入供体核酸的核酸，例如转座酶和反向重复，比如用于转座进入支原体基因组；支持在宿主细胞中复制和分离的核酸，比如自主复制序列(ARS)、着丝粒序列(CEN)。在一种实施方式中，载体包含端粒序列.
示例性载体包括酵母的载体，其包括酵母着丝粒质粒，例如酵母人工染色体(YAC)载体，比如在下面实施例1A(i)(a)所描述和在图3A中图解的pmycYACTn；和在图3B中显示构建的miniTn-Puro-JCVI-1.7载体。pmycYACTn载体的特征包括：(i)自pUC19的高拷贝原点和用于在大肠杆菌中增殖的氨苄青霉素抗性标记、(ii)IS256、(iii)tetM和lacZ标记，二者从螺旋素启动子(16，17)表达，用于在大肠杆菌和支原体中进行选择和筛选，和(iv)ARS和CEN，用于在酵母中进行复制和分离，和作为可选择的酵母标记的HIS3。miniTn-Puro-JCVI-1.7载体与pmycYACTn的不同如下：(i)它不包含lacZ和用嘌呤霉素抗性标记替换tetM和(ii)它包含细菌人工染色体(BAC)载体，用于在大肠杆菌中可能的克隆。
iii.克隆策略：连接宿主和供体核酸并将供体基因组和核酸转移入宿主细胞
在提供的转移方法中，供体基因组或其他核酸与宿主核酸，通常是宿主载体连接，以产生包含供体核酸和宿主核酸、可在宿主细胞中增殖和操作的核酸。可使用在熟知的克隆方法中提取的许多方法进行连接宿主和供体核酸。下面更详细地描绘三个常规方法。
如上面所记录，酵母细胞是示例性宿主细胞。大DNA分子通过添加酵母着丝粒(CEN)已经稳定地克隆入酵母，所述着丝粒允许分子连同酵母染色体一起分离。这样的分子已经以线状形式通过添加端粒至末端克隆，并也作为环状克隆。因为细菌基因组是大体环状的，且环容易与线状酵母染色体分开，所以以环状克隆细菌基因组可以是有利的。
在用于连接供体基因组和具有宿主载体的核酸的第一种方法中，供体基因组在供体细胞或与供体相似的其他细胞类型中连接至宿主载体，接着分离包含供体基因组和宿主载体的核酸，并随后转移进入宿主细胞。实施例图解在图1中。例如，该方法可用于转移基因组和其他大核酸进入宿主细胞。在一种实施例中，宿主载体包含反向重复和/或编码转座酶的核酸，以有利于在细胞中插入供体基因组或其他核酸。
在供体细胞或与供体类似的细胞(例如，相同属的不同种)中连接供体和宿主核酸提供了优点。例如，它允许选择载体插入(例如，沿着供体核酸长度的载体插入位点)，其不会或不可能消弱或以其他方式影响供体细胞生存。但是，该方法的确需要供体或类似细胞容易引入外源核酸(例如，转化)，以便该载体可整合入供体核酸，例如基因组。用于将核酸引入多种细胞类型的许多方法是熟知的。在一种实施例中，如下面在实施例1A中所描述的，将酵母宿主载体在PEG存在情况下转化入细菌细胞。例如，根据在宿主载体中的抗性或其他选择标记，选择包含整合入供体核酸的宿主载体的供体细胞。核酸可从供体细胞分离，比如如上述在琼脂糖插块中，用于证实宿主载体插入，例如通过如本文描述的PCR或DNA印迹。一方面，在转移入宿主细胞之前，包含供体基因组和宿主载体的核酸被移植入受体细胞以确认该核酸可被移植并与特定的受体细胞相容。例如，从一种细菌种类移植基因组DNA到另一个中可如在Lartigue等，Science 317，632(2007)中描述的和如在下面实施例1A(ii)(b)中描述的进行。
在图2A中图解的实施例中，在细菌细胞中将线性酵母宿主载体与环状细菌基因组连接。所得环状核酸，例如在如上述的琼脂糖插块中分离并转化入酵母宿主细胞。该过程的实施例在下面实施例1A中描述。
在其实施例图解在图2B中的第二种方法中，供体基因组和宿主载体一起或分开地共转化入宿主细胞，随后它们例如通过在宿主细胞中同源重组连接。该方法在简单性方面是有优势的，具有最小的样品处理和步骤数。典型地，如在图2B中显示，载体通过同源重组插入供体基因组或核酸。
在图2B图解的实施例中，线性酵母宿主载体连同环状细菌基因组例如合成的基因组或已经从供体细胞——例如如上述在琼脂糖插块中——分离的基因组共转化入酵母宿主细胞。典型地，宿主载体包含与供体基因组或核酸同源的区域(一个或多个)。在显示在图2B的实施例中，线性酵母载体在每个末端包含与细菌基因组的部分同源的区域。在一种实施例中，如在图2B中显示，细菌基因组用限制酶切割，该限制酶在与宿主载体同源的区域的附近切割，然后转化进入宿主细胞。该过程在载体的插入位点附近生成双链断裂，这大大改善了在宿主细胞中连接宿主载体和供体基因组(通过将载体插入基因组)的效率。典型地，在供体基因组或其他核酸中选择限制酶识别位点，其与在该位点插入载体之后保持基因组或核酸的完整性相容。该过程的实施例在下面实施例IB中描述。
第二种方法改进的第三种方法的实施例图解在图2C中。通过将多个重叠核酸片段——其为供体基因组或核酸片段——连同宿主载体一起共转化入宿主细胞进行该方法。换句话说，每个片段包含供体基因组或核酸区域的同源物和沿着供体基因组或核酸长度的同源重叠区域。一旦转化入宿主细胞，片段和载体重组，例如通过同源区域的同源重组。
在图2C图解的实施例中，环状细菌供体基因组的重叠片段连同线性酵母载体一起共转化入酵母宿主细胞。再次，酵母载体在它的末端包含与细菌基因组的部分同源的区域。一旦将供体基因组片段和酵母宿主载体引入宿主细胞，片段和载体重组，从而连接供体基因组和宿主载体。实施例在下面实施例1C中描述。
在一些实施方式中，在与宿主载体连接之后(例如，第一种方法)或之前(例如，第二种和第三种方法)，如上述从供体细胞或类似的细胞中分离供体核酸。例如，包含基因组的大的供体核酸可在琼脂糖插块中从供体和其他细胞中分离，如上所述。分离或合成和装配之后，将供体核酸转化入宿主细胞。当宿主载体先前未与供体核酸连接时，它可使用相同的转化方法，同时或以任何顺序相继转化入宿主细胞。
转化方法是本领域熟知的并将根据宿主细胞变化。在一种实施例中，当宿主细胞是酵母宿主细胞时，酵母原生质球从酵母宿主细胞中制备，例如如下面所描述的，并且核酸通过与原生质球混合进行转化。在一些情况下，在PEG存在情况下进行转化。例如，供体核酸和/或宿主载体可以与原生质球在室温下温育10分钟，接着添加800μL PEG 8000，并通过倒置温和混合，并在室温下温育另一10分钟。
在一种实施例中，原生质球制备和转化如由Kouprina和Larionov，Nat Protoc 3，371(2008)所描述地进行。细胞生长至的OD可改变。用这些方法，在转化之前，酵母培养基用酵母宿主的单细胞集落接种，并在30℃下过夜生长，用力振荡以确保良好的通风，直到达到合适的OD660。样品可被离心并通过涡旋重悬浮在山梨糖醇中，离心和重悬浮，例如在SPE溶液(1M山梨糖醇、0.01M磷酸钠、0.01MNa2EDTA，pH 7.5)中。例如使用ZymolaseTM除去酵母细胞壁。通过比较在山梨糖醇溶液对2％SDS溶液(其中原生质球被裂解)中的细胞悬浮液的光密度可评估原生质球的水平。原生质球可被离心并通过非常温和的摇动重悬浮于1M山梨糖醇中，并且在STC溶液中(1M山梨糖醇、0.01M Tris-HCl、0.01M CaCl2，pH7.5)漂洗和重悬浮。通过混合核酸和原生质球进行转化，如上所述，任选地在PEG存在情况下。
转化之后，通常进行选择过程以选择供体核酸和宿主载体已经成功转化入的细胞。例如，在上述过程中，转化之后，原生质球可被离心并重悬浮于SOS溶液中，并在30℃下温育40分钟不振荡。原生质球可放置在选择培养基，比如本文描述的熔解的SORB-TOP-His选择培养基中，并在50℃下平衡，并铺板在包含选择培养基的平板上，并例如在30℃下生长，直到转化体可见。
iv.从宿主细胞分离和分析供体核酸
在通过所提供的修饰方法在宿主细胞中修饰之前和之后，利用所提供的方法，可分离和分析转化入宿主细胞的供体核酸。与从供体和其他细胞分离一样，根据细胞类型，分离方法会改变。在一些实施例中，可从分离的核酸样品中除去或减少天然宿主核酸，例如，以分离或富集供体核酸。该过程可通过预电泳除去染色体宿主DNA、或通过用消化宿主核酸但是不消化供体核酸的限制酶消化进行。
在一种实施例中，例如，使用Bio-Rad CHEF-DR III手册中的“制备琼脂糖包埋的酵母DNA”方案，和如在本文实施例中所描述的，在琼脂糖插块中分离供体核酸。在一些实施例中，在恒压下预电泳包含来自宿主细胞DNA的琼脂糖插块数个小时以除去酵母宿主染色体DNA。一方面，除去宿主DNA可通过用AsiSI、Fsel和RsrII或其他酶首先消化插块中的DNA进行，所述其他酶切割酵母染色体但是在供体核酸上没有识别位点，比如生殖器支原体或蕈状支原体LC。
供体核酸的分析可通过任何许多熟知的用于分析DNA的方法进行。典型地，期望进行方法以确认核酸的大小和/或序列，和载体及其他核酸的正确插入和方位，包括确认任何修饰。在一种实施例中，分离的DNA通过加热和/或限制消化经历线性化作用，接着通过凝胶电泳，比如倒转电场(Bio-Rad FIGE Mapper)或脉冲场(Bio-Rad CHEF-DR II或III系统)电泳分离。
例如，可通过PCR，比如多重PCR分析，设计的引物沿着期望供体核酸或修饰的供体核酸的长度结合多个区域。典型地，还设计引物识别宿主载体。在其他实施例中，通过在凝胶上使分离核酸的大小可视化，或通过限制消化并进行DNA印迹或其他杂交方法，例如，如在Gibson等，Science 319，1215(2008)所描述的进行分析。在实施例中描述了分离供体基因组的MPCR和DNA印迹分析的具体实施例。分析方法的改进对于技术人员将显而易见。测序方法是熟知的，并还可用于分析转移入宿主细胞并在其中增殖的供体核酸。
v.生成包含多个供体基因组的宿主细胞
在一种实施方式中，将多个供体核酸，比如来自不同供体的多个基因组引入单个宿主细胞。一方面，包含一个供体基因组或其他供体核酸的宿主细胞与另一个这样的包含从不同供体转移的核酸的宿主细胞杂交，生成包含两种核酸的宿主细胞。例如，包含来自不同供体的两种供体基因组比如来自不同种类的两个支原体基因组的二倍体酵母菌株，可通过杂交两个不同的单倍体菌株——每个携带一种供体基因组——生成。可使用熟知的方法进行单倍体酵母菌株杂交。许多独特的选择标记可用在各自单倍体菌株中，以允许在杂交之后选择包含两种基因组的细胞。例如，可将HIS3和TRP标记分别引入两个携带不同供体基因组的不同单倍体细胞中，接着在缺少组氨酸和色氨酸的培养基上选择二倍体细胞，如在本文实施例中所描述的。
E.在宿主细胞中修饰供体基因组
也在所提供的实施方式中的是在宿主细胞中修饰供体基因组和其他核酸的方法和核酸。在一种实施方式中，通过将一个或多个靶构建体引入供体核酸中进行所述方法。该构建体包含与供体核酸同源的部分、抗性基因、可选择的标记、编码酶比如限制酶的核酸、限制位点和/或其他在克隆和同源重组中使用的核酸。典型地，将该构建体引入包含供体核酸的宿主细胞。
为设计该构建体，选择供体核酸(例如，供体基因组)的靶区域进行修饰。方法没有必要修饰靶区域的每个残基。例如，可修饰在靶区域中的一个或多个靶部分或靶位置。修饰包括在靶区域中插入、缺失、突变、替换和/或一个或多个核苷酸的其他修饰。一方面，供体核酸被无缝修饰(seamlessly modified)。
典型地，靶区域或其部分首先用包含标记比如反选择标记的核酸构建物置换。接着，通过缺失标记或用另一核苷酸序列置换，从核酸中除去标记。一方面，通过引入具有与标记部分附近或邻近的靶区域的部分(一个或多个)同源的第二核酸构建体置换标记和周围部分。该第二构建体不必与靶区域的部分(一个或多个)小于100％同源。例如，与靶区域的部分相比较，该构建体可包含一个或多个突变、缺失或插入，借此一旦用该构建体置换，靶区域被修饰。该方法一般地包括一个或多个同源重组步骤。
一方面，通过在包含具有标记的构建体的供体核酸的核酸序列中引入断裂(break)(例如，双链断裂)，便于除去标记。在靶区域附近例如邻近靶区域或在靶区域内引入断裂。一般地，通过诱导表达识别并切割期望核酸序列的酶，比如核酸内切酶生成断裂。一般地，酶由在靶区域或掺入靶区域的构建体内的核酸编码。
一方面，通过将核酸序列引入供体核酸帮助除去标记，借此核酸序列的插入在靶区域或其部分的侧翼生成串联重复区域。一般地，核酸序列被包括作为靶构建体的一部分。
在一种实施方式中，方法包括引入断裂和引入生成串联重复区域的序列二者。一方面，方法是结合核酸内切酶切割的串联重复(TREC)方法，其中通过诱导表达酶生成的双链断裂和串联重复用于帮助重组事件和避免损害和不需要的突变。
与常规和其他可用的方法相比，所提供的方法提供了优势，尤其是用于在不同种、属和目的宿主中修饰供体核酸。一方面，可来自具有弱遗传系统的供体生物的供体核酸，在具有丰富的遗传系统的宿主，比如酵母宿主细胞中被修饰，例如，通过同源重组方法。例如，长度为几百kb的核酸片段可在酵母(酿酒酵母)宿主细胞中使用熟知的方法和标准的遗传工具——包括线性和环状形式的酵母人工染色体(YAC)——克隆并操作。修饰的供体核酸移植到包括初始细胞和不同种的细胞在内的受体细胞可用于例如基因和基因调控的功能研究、和产生修饰基因产物。提供的方法可用于在宿主细胞中成功地修饰供体基因组，以改造和修饰来自遗传上难处理生物的基因组。
如下面所讨论，修饰方法可用于产生基因组、生物和通过生物产生的商业上有用的基因产物，比如用于产生疫苗、药物、生物蛋白质和化学品、生物燃料和蛋白治疗剂(protein therapeutics)比如酶和抗体。在一种实施例中，修饰供体基因组以产生新的免疫组分以引起免疫应答，比如活病毒和其他免疫原。在另一种实施例中，例如，通过引入编码参与油合成途径的酶的DNA，例如通过用产生生物燃料的那些代谢途径基因置换代谢途径基因，修饰供体基因组用于生产生物燃料。在一种实施例中，修饰供体基因组(例如，光合作用细菌的供体基因组)，以便一旦移植进入受体细胞，受体细胞产生生物燃料而不是正常光合作用产物比如葡萄糖。其他用途在本文下面讨论。因此，提供的方法可用于体内例如在酵母宿主细胞中直接改造或重新设计合成细菌基因组。
所提供的修饰方法包括用于克服在不同种的供体和宿主生物之间的不相容性问题的方面，其否则可造成在不同种的宿主细胞中操作的供体核酸的不稳定性和不需要的突变。例如，当将供体核酸比如供体基因组引入宿主细胞时，供体核酸一般地不会有助于宿主细胞的生存，或者不会有助于与在克隆载体中存在的单独的选择标记(一个或多个)分开的宿主的生存。当供体和宿主是不同类型生物，比如不同的目或界时，例如当供体是原核生物而宿主是真核生物比如酵母时，这尤其正确。例如，如在下面实施例4描述的研究中讨论的，在酵母中作为环状YAC(具有组氨酸标记)增殖的生殖器支原体基因组，除了组氨酸原养型，对它的宿主没有功能上的补充。细菌基因组的任何缺失和重排对于酵母宿主可能是中性的。
使用可用的方法，因为宿主细胞不依靠供体核酸的完整性而生存，所以当供体核酸在宿主细胞中操作时，对于供体核酸存在不需要的突变和损害的高风险。所提供的方法克服这些问题并可用于在宿主细胞中增殖和修饰供体基因组，同时使在供体基因组中不需要的突变的风险最小化。所提供的方法可精确地高效修饰克隆入酵母宿主细胞的供体基因组比如细菌基因组。
提供的方法还可用于在宿主细胞中无缝修饰供体核酸，包括在供体核酸的靶区域内突变、缺失和/或插入核苷酸，其中没有添加或除去不需要的另外的核酸序列。
i.反选择标记
一般地，方法的第一步骤包括将反选择标记引入供体核酸。一般地，该标记通过同源重组插入，借此一部分靶区域被反选择标记置换。反选择标记是有利的，因为标记的存在和不存在二者都可进行选择。标记存在可用一组生长条件选择，而不存在可用一组不同的生长条件选择。一个示例性的熟知的反选择标记是URA3酵母基因。在酵母宿主中存在URA3基因允许它在缺少尿嘧啶的培养基上生长。因此，用该标记成功的置换供体核酸靶区域可通过在尿嘧啶-培养基上生长进行选择。与之相反，不存在URA3基因，比如在通过另一同源重组事件置换之后，可通过在具有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上的反选择进行选择。
例如，遗传标记URA3可例如通过同源重组整合入克隆入宿主细胞的供体核酸中的靶区域。通过在缺少尿嘧啶的培养基上生长选择标记整合。例如，通过缺失或用另一核苷酸序列置换——例如在第二轮同源重组中，通过反选择，例如在5-FOA上选择标记除去。
采用反选择标记的方法是期望的，因为它们可用于无缝修饰。此外，置换或除去反选择标记恢复营养缺陷型(例如，依赖尿嘧啶)，以便宿主细胞在下轮修饰中可使用相同的方法进行修饰。
方法可用于在酵母宿主细胞中引入和置换反选择标记。例如，已知方法通过第一轮同源重组引入URA3标记，并用第二轮的同源重组置换标记。这种方法的例子在下面实施例4A中描述，其中使用涉及两个连续同源重组事件的该常规方法，进行位点特异性诱变，以校正在酵母中保留的供体合成生殖器支原体基因组的CDS 139基因座中可见的单碱基胞苷缺失(309，388)。如在该实施例中所描述的，包含突变体细菌供体基因组的酵母宿主用包含URA3标记和与靶区域的部分同源的50bp末端部分的盒转化，置换包含单碱基缺失CDS 139基因座的靶区域。第二轮转化将包含非突变体DNA序列的构建体引回同一基因座，置换该标记。
采用反选择标记的常规方法，就它们在某些宿主细胞中有效修饰某些供体核酸的能力而言是受限制的。例如，这些方法对于在不依靠供体基因组的完整性生存的宿主细胞中修饰供体基因组可能是低效的。当宿主细胞不依靠供体基因组的完整性时，在修饰期间可发生许多自发缺失。这些缺失一般地导致反选择标记的丢失，并因此被选择。提供的方法克服了该问题并与常规方法相比提供了增加的效率。
ii.诱导酶表达和引入断裂
在一种实施方式中，在引入选择标记之后，在靶区域附近(例如，邻近)或靶区域中引入断裂，比如双链断裂(DSB)。一般地，通过诱导表达识别并切割位于靶区域附近或靶区域中的核酸序列的酶，比如核酸内切酶，例如I-SceI进行该过程。一般地，该酶是核酸内切酶或生成双链断裂的其他酶。据报道，在同源重组位点附近引入双链断裂同源重组效率增加大约二十倍(Leem等，Nucleic Acids Res 31，e29(2003))。因此，进行在靶区域附近引入双链断裂，增加修饰方法的效率并减少不需要的本底突变。
在典型的实施例中，包含选择标记的靶构建体还包括在诱导型启动子控制下编码酶的基因。一般地，该构建体还包括酶的识别序列。该构建体在宿主细胞中引入供体核酸。通过宿主细胞在诱导自诱导型启动子表达的特定条件下的生长，诱导酶的表达。在一种实施例中，启动子是GAL1启动子，可通过在包含半乳糖作为唯一碳源的培养基上生长诱导自其的表达。
可用的方法包括为了提高在酵母中基于重组的修饰的效率的目的，诱导引入双链断裂。一种这样的方法，Delitto perfetto(定点突变法)，描述在Storici等，NatBiotechnol，19，773-776(2001)中。该方法的例子在下面实施例4B(i)中描述。该方法基于在靶核酸中引入双链断裂(DSB)提高(刺激，stimulate)重组数个数量级的表现(Storici等，PNAS USA，100，14994-99(2003))。在实施例4B(i)中，使用Dilletto perfetto试图校正在生殖器支原体供体基因组CDS 139基因座中相同的单碱基缺失。过程图解在图10A中。
本文表明结合常规重组方法在酵母中诱导引入DSB对于修饰某些供体核酸是受限制的。见下面实施例4B(i)。该限制是由于负(反)选择标记的自发丢失的高本底(background)。提供的方法改善了效率并减少了不需要的本底突变(例如，自发缺失)。
iii.串联重复
在一种实施方式中，通过在包含标记的区域的侧翼存在串联重复区域有助于通过同源重组除去选择标记。一方面，用于引入标记的靶构建体还包括核酸序列，所述核酸序列的引入在靶区域或其包含插入标记的部分的侧翼产生串联重复区域。构建体最初插入靶区域或其部分的上游或下游，并包含具有分别与靶区域或部分的下游或上游部分同源的核酸部分。在靶核酸中的同源部分附近插入该部分，生成串联重复。
在一种实施例中，插入构建体在靶核酸内生成具有与靶区域的3’部分同源的标记的5’部分。在另一种实施例中，插入构建体在靶核酸内生成具有与靶区域的5’部分同源的标记的3’部分。因此，一旦引入，修饰的供体核酸(例如，修饰的供体基因组)在包含选择标记的核酸侧翼包含串联重复序列。
串联重复序的存在促进两条序列之间的同源重组，例如，用于除去包含反选择标记的构建体的部分。这种方法是熟知的并基于通过两条串联重复序列之间同源重组(HR)精确切除核酸片段。一个例子，通常称为“串联重复突出”方法，描述在Akada，R.等，Yeast，23，399-405(2006)中。这种方法的例子描述在下面实施例4B(ii)中，用于缺失生殖器支原体供体基因组中CDS 139基因座的区域。过程图解在图10B中。该技术可适合用于基因置换。
不同于许多使用选择标记的常规同源重组方法，使用串联重复诱导HR的方法可通过单转化事件引入并随后除去包含反选择标记的盒。例如，携带反选择标记和生成串联重复的序列的盒可在酵母宿主中通过转化引入供体基因组，接着对在盒和基因组中同源区域之间的自发同源重组进行选择。
可如上述，例如通过在URA3的情况下在不存在组氨酸的情况下生长，对最初的标记引入进行选择。随后转移细胞进入反选择培养基(例如，5-FOA)，通过串联重复序列之间的同源重组对自发的标记“突出”进行选择。这样的方法通过改变与靶核酸同源的盒部分可适合缺失、点突变和基因置换。
本文表明结合常规重组方法引入串联重复，用于“突出”，对于在酵母中修饰某些供体核酸是受限制的。见下面实施例4B(ii)。该限制是由于负(反)选择标记的自发丢失的高本底。提供的方法改善了效率并减少了不需要的本底突变(例如，自发缺失)并可用于在酵母中宿主细胞中修饰细菌基因组。
iv.串联重复-核酸内切酶切割(TREC)
靶区域附近的串联重复和酶切割二者都可用于帮助除去选择标记。一种这样的实施方式，称为“串联重复核酸内切酶切割”(TREC)方法，结合使用反选择标记的常规同源重组置换，通过核酸内切酶的表达在靶区域或附近诱导引入双链断裂，并在包含标记的核酸序列的侧翼引入串联重复序列。该方法可用于精确地高效修饰克隆入酵母宿主细胞的细菌供体基因组和大核酸。
利用TREC方法，侧翼的串联重复序列和近处的或邻近的双链断裂的结合大大地增强了靶特异性重组的效率并允许在酵母宿主中遗传改造细菌基因组。其中使用该方法成功地无缝缺失了在酵母中生长的生殖器支原体基因组中CD139基因座的例子在下面实施例4C中描述。该方法图解在图10C中。
本文描述的方法可用于引入任何修饰，比如点突变(例如，核酸和密码子替换，包括保守和非保守替换)、缺失、插入和对在宿主细胞中的供体核酸靶区域，比如在酵母宿主细胞中的细菌基因组的其他修饰。
v.靶盒(targeting cassette)和盒的生成
提供了用于设计和生成用于修饰方法中的核酸(例如，靶盒)的方法。还提供了用于该方法中的构建体和其他核酸。一般地，用于引入选择标记的靶盒包含与供体靶区域同源的部分(与同源部分相比，其任选地包含一个或多个突变、缺失、插入、替换或其他修饰)和选择标记，典型地是反选择标记，比如URA3。一般地，该盒包含与靶区域的5’部分同源的部分和与靶区域的3’部分同源的部分。
在一些实施方式中，生成第二靶构建体，以用具有与靶核酸同源性的核酸置换选择标记。该第二靶构建体包含靶区域或其部分的同源物并在靶区域与同源部分相比，任选地包含一个或多个突变、缺失、插入、替换或其他修饰。
在一些实施方式中，为了在靶区域附近、靶区域内或邻近靶区域引入双链断裂，靶盒还包含编码酶比如在特定序列中切割核酸比如dsDNA的核酸内切酶的基因，并还包括被酶识别的核苷酸序列，其一般地在盒末端或附近。一般地，编码核酸内切酶的基因在诱导型启动子，比如GAL1启动子的控制下，以便可通过在特定环境条件下，比如在存在半乳糖作为唯一碳源的情况下，生长宿主细胞，诱导基因表达。
在一些实施方式中，为了生成串联重复序列，靶盒包含与靶核酸同源的另外部分，其是沿着靶核酸长度的靶区域的上游或下游，以便一旦通过同源重组整合盒，串联重复序列将在靶核酸中存在。
当使用切割和串联重复序列时，该盒包含第一同源部分，其与沿着靶核酸长度的靶区域的上游或下游的靶核酸的部分同源(以产生串联重复)；第二和第三同源部分，其分别与靶区域的3’和5’部分同源(用于通过同源重组插入盒)；在诱导型启动子控制下编码酶(例如，核酸内切酶)的核酸；核酸内切酶识别的核苷酸序列；和选择标记，典型地反选择标记。一般地，第二和第三同源部分(与靶区域3’和5’部分同源)在包含第一同源部分序列(其生成串联重复)的侧翼。一方面，第二和第三同源部分还在包含编码酶(例如，核酸内切酶)的核酸序列的侧翼。它们典型地也在包含选择标记的序列的侧翼。
一方面，被酶识别的核苷酸序列位于邻近第二或第三同源部分并相对第一同源部分(其生成串联重复区域)在构建体的相对末端。
一方面，与靶核酸中同源部分相比，第二或第三同源部分(用于整合盒)之一或两者包含一个或多个核苷酸突变、插入或缺失。
在下面实施例的TREC中使用的示例性靶盒图解在图10C中。该示例性构建体包含I-SceI识别位点、在GAL-I启动子控制下编码I-SceI核酸内切酶的核酸、URA3反选择标记和与靶区域上游的靶核酸序列的部分(在靶核酸中标注“重复”，也描绘)同源的部分(标注“重复”)。该盒还包括与靶区域同源的为I-SceI位点的5’的50bp部分和与靶区域同源的为“重复”同源部分的3’的50bp部分。包含识别位点、核酸内切酶-编码基因和诱导型启动子以及选择标记的靶盒部分称作“CORE”盒。如在下面实施例4C中所描述，该盒用于在宿主细胞中，通过缺失基因组靶区域的450碱基对部分，修饰生殖器支原体供体基因组，所述供体基因组已经使用提供的方法转移入酵母宿主中。类似的构建体用于使用提供的方法在酵母宿主细胞中缺失在蕈状支原体LC基因组中的II型限制酶基因。
这些靶盒的变型，比如在图10A-D所描述的和在本文其他地方所描述的那些，也可用于提供的方法。例如，该盒的变型可用于将突变、替换、插入和其他修饰比如修饰的核苷酸引入靶核酸。这种提供的盒和方法的改型对于技术人员将是显而易见的。
可使用任何许多熟知的核酸合成、扩增、连接和装配方法，比如本文描述的那些和商业上可得的方法生成该盒。在一种实施方式中，通过扩增和/或装配构成该盒部分的核酸片段生成盒。可通过使用熟知的方法，比如化学合成或从质粒、基因组DNA或其他包含期望核苷酸序列的核酸扩增(例如，PCR)生成该片段。
一方面，使用融合PCR、使用重组PCR技术，如在Shevchuk，N.A.等，NucleicAcids Res，32，e19(2004)中描述的，装配片段以形成盒。
利用该方法，使用嵌合融合引物，扩增待被连接的两种不同片段，接着在无引物(primer-less)聚合酶反应(例如，无引物PCR)中连接。每个嵌合引物包含与待被连接的第一片段同源的部分和与待被连接的第二片段同源的部分。因此，使用引物扩增两个片段在扩增产物之间生成重叠的同源区域，比如在产物末端的40bp同源物。
这些产物接着用在不存在引物的许多(例如，10、11、12、13或更多)PCR循环中使用，以低退火温度，比如在56℃或大约56℃，以通过重叠延伸连接产物。以该方式连接的许多产物接着可在随后的融合PCR步骤中连接。一般地，融合产物在另外的PCR反应再扩增，比如使用包含在期望盒的末端处待添加的另外序列的引物。
其他装配方法是已知的，并可用于生成盒。例如，使用如所描述的常规合成方法制备该盒，或可从商业供应商购买。可使用其他装配方法，比如通过5’核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶协同动作的一步等温DNA装配方法，其描述在Gibson等，Nature Methods 6，343-345(2009)和于2009年2月19日提交的美国专利申请号12/371,543中。利用该方法，DNA片段通过5’核酸外切酶首先凹陷(recess)，产生单链突出端，其然后特异性地退火，接着使用聚合酶和连接酶填补缺口并共价连接。其他装配方法描述在美国专利申请公开号：US2007/0037197A1和US2007/0037196A1中。
vi.转化和修饰分析
为了修饰，将盒转化入包含供体基因组比如根据提供的方法产生的那些供体基因组的宿主细胞。转化方法是熟知的。在一种实施例中，根据公开的方法(Gietz，D.等，Nucleic Acids Res，20，1425(1992))，用2-3μg PCR产物和25μg载体DNA(Salmon testis DNA，Sigma，St.Louis，MO)，使用乙酸锂整合转化将盒引入包含供体基因组的酵母宿主细胞。
为了选择盒已经整合入靶核酸的细胞，细胞在缺少尿嘧啶的培养基中生长并选择单独的URA+转化体并任选地通过PCR分析，其使用与在盒插入区域侧翼的靶供体核酸部分特异性结合的诊断引物。通过使用这种引物评估扩增子的存在性和大小，确定盒是否正确地插入，所述引物根据盒是否插入产生不同大小的扩增子。一个例子在下面实施例4C(ii)中描述。在随后几轮同源重组中使用包含正确插入的细胞。
当进行酶诱导表达产生ds(双链)断裂时，包含反选择标记的细胞接着在诱导从诱导型启动子表达酶的条件下生长，比如在包含半乳糖的培养基中生长。在一种实施例中，细胞在包含半乳糖作为唯一碳源的SG(合成半乳糖)-His培养基上生长，例如，4小时或24小时，以诱导引入双链断裂的酶的表达。可进行在包含葡萄糖的培养基上生长，作为对照。
在一些实施方式中，将第二核酸转化入细胞，该第二核酸包含与将置换选择标记的靶核酸同源的序列。在一些情况下，与靶核酸相比，该第二核酸包含一个或多个突变、缺失、插入或替换。见实施例4A和4B。在其他情况下，通过插入载体之后，在靶核酸中生成的串联重复，自发地发生第二同源重组事件。利用TREC方法，这些方法的组合用于除去选择标记。
通过在利于丢失的条件下生长，选择反选择标记的丢失。在某些方面，当URA3用作标记时，在这种选择之前(例如，第二轮转化之后)，细胞在存在尿嘧啶情况下生长，在30℃下过夜，以在具有丢失URA3基因的酵母细胞中耗尽残留的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(由URA3基因编码)。接着在有利于丢失的条件下，比如在5-FOA存在情况下，比如在包含5-FOA的HIS平板上选择具有丢失的反选择标记的细胞，以选择URA3基因的丢失。可进行使用相同的或不同的诊断引物、在插入位点侧翼的PCR分析，以验证盒的缺失。
可进行多重PCR以分析供体核酸比如使用所提供的修饰方法修饰的基因组的完整性。例如，可如在D.G.Gibson等，PNAS USA，105：20404-9(2008)中所描述地实施多重PCR(MPCR)。
为了PCR和MPCR分析，可根据宿主细胞的类型使用本文描述的分离方法进行从宿主细胞中分离全部DNA。在一种实施例中，如在实施例3中描述的，进行从酵母宿主细胞中分离基因组DNA。可设计具有不同大小，沿着供体基因组长度，比如在酵母中环状细菌基因组周围，多个部分处具有同源性的MPCR引物组，以便可验证每个扩增子的存在性。见，例如D.G.Gibson等，PNAS USA，105：20404-9(2008))。可使用熟知的方法，包括商业上可得的试剂盒，比如Qiagen多重PCR试剂盒进行多重PCR。示例性反应描述在下面实施例4A中。每个扩增子的存在指示修饰的基因组是完全的，并典型地进行，以确保不发生自发不需要的重组事件，生成不需要的修饰。
根据供体、宿主和受体细胞类型，可结合提供的方法使用其他修饰方法。例如，可使用熟知的Cre-LoxP系统。Cre-LoxP系统是已知有效的位点特异性重组方法，其已经成功地用于在许多不同生物中除去选择标记和大的基因组DNA片段。如对于其他方法所描述的，例如通过两轮PCR反应，可产生具有突变体LoxP基因的Cre-LoxP诱变构建体。如在Araki，K.等，Nucleic Acids Res，25，868-872(1997)中所描述的，LoxP突变防止反向重组事件。例子描述在下面实施例4D中。在一种实施例中，修饰方法与通过Cre-LoxP系统的修饰相比，一样有效、基本上一样有效或更加有效。
F.移植修饰的供体基因组和核酸进入受体细胞
本文提供了用于移植供体核酸，包括供体染色体和/或供体基因组进入宿主细胞或受体细胞的方法。供体核酸可从宿主细胞移植到受体细胞。供体核酸包括在宿主细胞中修饰的那些。在另一种实施方式中，供体基因组被直接从供体细胞移植入受体细胞，例如通过移植天然基因组进入受体细胞。移植方法可用于有效地将在宿主细胞中增殖和修饰的供体基因组移植回在其中基因产物可从基因组表达的环境中。受体细胞与供体细胞或生物相比，可以是相同种的或紧密相关种的细胞。
用于克隆小核酸片段，比如基因片段，进入宿主细胞并将它们移植回初始或紧密相关细胞的方法是已知的，但是一般限于操作小核酸，例如修饰单核酸片段，其接着被分离并插入返回初始供体细胞的基因组。如Lartigue等，Science 317，632(2007)所描述的，支原体全基因组已经成功地直接从供体支原体细胞移植到不同种的紧密相关的受体支原体细胞，一旦移植，成功表达基因产物。
但是，就其从宿主细胞移植大核酸(例如，基因组和染色体)到受体细胞的能力而言，可用的移植方法是受限制的，所述受体细胞与基因组已经在其中增殖的宿主细胞相比是较不紧密相关的，比如，是不同生物分支的细胞。例如，可用的方法对于从真核宿主移植到原核受体是受限制的。
例如，使在真核宿主中增殖的原核供体基因组移植回原核受体可受到核酸回收、甲基化、不相容性和毒性问题所限制。需要这样的方法，其中从宿主细胞中回收足够量纯化的、完整的供体核酸，以生成足够量，比如可检测数量的包含移植供体核酸的受体细胞。
一旦移植已经在宿主细胞中增殖的供体核酸，在受体细胞中存在(和或许也在供体细胞中存在)、但是在宿主细胞中不存在的限制-修饰系统可造成不相容性。例如，由于酿酒酵母的酵母宿主细胞含有在一些细菌细胞中存在的限制-修饰系统，在酵母宿主中生长之后分离的细菌基因组可遭受细菌受体细胞的限制修饰系统(一个或多个)影响(Holt等，Bioessays 29，580(2007)。因此，将已经在酵母细胞中修饰和增殖的细菌基因组移植进入在其中表达供体基因产物的细胞中(比如供体细胞和其他细菌受体细胞)具有移植的基因组可与受体细胞不相容的风险。
此外，这些不包含限制-修饰系统的酵母宿主仍然可表达DNA甲基转移酶，其可修饰供体核酸(比如细菌基因组)，一旦移植进入受体细胞比如细菌，抑制它们的活化(例如，基因产物表达)。
此外，在宿主细胞中增殖和修饰之后，分离的供体基因组的结构和构象可以与在与供体生物更紧密相关的细胞中增殖的基因组的构象和结构不同。这些不同可不利地影响将供体核酸移植回受体细胞。本文描述的移植方法包括克服这些限制的方面，用于成功地将在宿主细胞中修饰和/或增殖的供体基因组移植入遗传上不同的受体细胞，比如从真核宿主到原核受体。这些方面之中的是在体外甲基化、用酶处理降解宿主细胞蛋白、并移植进入缺少限制-修饰系统的受体细胞，比如通过突变受体细胞中的这些系统。表明所提供移植方法成功的示例性研究详细描述在下面实施例3和实施例5中。
图8示意性图解了所提供移植方法的三个方面。在第一方法(用“1”标注箭头表示)中，在熔解的琼脂糖插块——比如用β-琼脂糖酶处理——中分离供体DNA，并直接移植入受体细胞。当核酸在相似的细胞之间移植并且不考虑不相容性问题时，典型地使用该第一方法。在第二方法(“2”表示)中，受体细胞被修饰以突变限制酶，然后如在第一方法中移植供体核酸。在第三方法(“3”表示)中，在琼脂糖插块中的供体核酸经历甲基化和去蛋白作用反应，然后熔解并移植，以保护供体核酸免遭受体R-M系统和构象变化的影响。另一方面，进行甲基化而没有去蛋白作用。
图16示意性图解了所提供移植方法的另外方面。细菌基因组可移入酵母、改造并通过基因组移植安装回细菌。酵母载体可通过转化插入细菌基因组；该细菌基因组被克隆入酵母。克隆之后，使用酵母遗传方法的所有技术以在细菌基因组中制造一个或多个插入、缺失、重排或其任何组合。该改造的基因组可接着被分离并移植入受体细胞以生成改造细菌。移植之前，在一些情况下，甲基化供体细菌DNA可以是必要的，以保护它免于受体细胞的限制系统(一个或多个)的影响。该循环可以以迭代方式从新改造的基因组开始重复(虚线箭头)。
i.从宿主细胞或供体细胞分离供体核酸
在第一步骤中，从宿主细胞或供体细胞中分离供体核酸(例如，供体基因组)。用于从细胞中分离核酸的方法是熟知的，包括用于分离基因组DNA，包括全基因组的方法和用于分离细胞器基因组的方法。任何这样的方法，包括本文描述的那些，可用于分离供体核酸。应当理解，方法的选择依赖于待分离的核酸类型和它从其中分离的细胞类型。
一般地，如在下面实施例中所描述的，在琼脂糖插块中进行大核酸比如基因组的分离。
所描述移植方法的数个方面提供了有效的和高产率的高质量移植核酸。一方面，包含供体核酸的细胞在存在氯霉素或类似物质的情况下生长，然后分离供体核酸。氯霉素用于在分离的核酸样品(比如琼脂糖插块)中获得紧凑和充分复制的供体基因组和染色体。使正在进行的复制轮次同步，抑制下一轮次的复制(Drakulic和Errera，Biochim Biophys Acta 31，459(1959)；Skarstad等，EMBO J 5，1711(1986)；Bernander等，J Bacteriol 111，1670(1995)；Skarstad等，在Flow cytometryapplications in cell culture A.N.E.Mohamed Al-Rubeai，Ed.(CRC Press，New York，1996)pp.241-255)和紧凑的类核(Murphy和Zimmerman，J Struct Biol 133，75(2001)；Seto和Miyata，J Bacteriol 181，6073(1999))是已知的。在支原体培养物中氯霉素的存在可帮助在琼脂糖插块中获得紧凑和充分复制的基因组。
a.从宿主细胞分离
在供体核酸从宿主细胞中分离的情况中，供体核酸可在琼脂糖插块中使用与宿主细胞相容的方案分离。一方面，当宿主细胞是酵母时，可例如用CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒(Bio-Rad)，按照制造商推荐的用于酵母DNA提取的说明书，使用任选的改进，制备琼脂糖插块。在一种非限制性实施例中，包含细菌供体核酸的酵母宿主细胞的培养物在30℃下、在选择性培养基中生长直到OD600达到大约1.5。在一种实施例中，每mL插块使用6×109个酵母细胞(代替制造商推荐的6×108个细胞)以增加每个插块可获得的供体核酸的量。包埋在琼脂糖插块中的酵母宿主的细胞壁被消化。可使用溶细胞酶(Biorad)，按照CHEF试剂盒制造商推荐，或使用100T(β-1，3-葡聚糖昆布五糖裂解酶(β-1，3-glucanlaminaripentaohydrolase)；USB，Cleveland，OH)进行细胞壁消化。在一种实施例中，ZymolaseTM酶以5mg/mL的浓度添加到插块的里面或外面。使混合物在37℃下放置2小时。
在一种实施例中，在1×TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8；50mM EDTA)中漂洗之后，通过与补充有每ml插块200μl蛋白酶K的5ml蛋白酶K反应缓冲液[100mM EDTA；0.2％脱氧胆酸钠；1％月桂酰肌氨酸钠；pH8.0]在50℃下温育两次24小时，裂解包埋的酵母细胞并消化蛋白质。琼脂糖插块在室温下用40ml 1×TE缓冲液搅动漂洗4次，每次1小时。样品接着在4℃下保存在相同的缓冲液中。在一些情况下，期望在随后的步骤中消化分离的核酸，比如用于除去宿主DNA或线性化供体基因组。在这样的情况下，在第二次漂洗期间添加1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
当供体核酸是细胞器基因组时，为了分离细胞器基因组，修改分离方案，如在本文中所讨论的细胞器基因组分离方法。
b.除去宿主核酸
为了从宿主细胞中分离供体核酸，可能期望除去宿主核酸。在一种实施例中，为了从酵母宿主细胞中分离细菌供体基因组，酵母基因组DNA也连同从宿主细胞中提取的细菌核酸被分离。一方面，分离包括“清理”步骤，其中除去污染物宿主核酸，比如使用识别宿主核酸但不识别供体核酸的限制酶。在一种实施例中，为了除去污染物酵母基因组DNA，插块用特异性消化酵母基因组DNA的限制酶混合物处理。
在一种实施例中，通过将插块与特异性切割宿主基因组DNA但保留供体DNA完整的限制酶(例如，在500μL反应体积中50单位AsiSI、RsrII和FseI酶(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA))在37℃下过夜温育，进行除去内源宿主DNA插块。插块接着在室温下用1ml 1×TE缓冲液漂洗1小时并加样至1％TAE琼脂糖凝胶(120分钟，120伏特)以从插块中除去消化的宿主DNA片段。
在另一种实施例中，在宿主基因组DNA是线性的而供体基因组是环状的情况中，通过脉冲场琼脂糖凝胶电泳除去宿主基因组DNA，借此宿主基因组DNA保留在加样孔中而供体基因组DNA被电泳到该孔外。(Lartigue等，Science 317，632(2007))。在一种这样的实施例中，酵母插块使用来自Bio-Rad的CHEF DR IIII，用钳位均匀电场(Chu等，Science 234，1582(1986))，在1％LMP凝胶，1×TAE缓冲液中进行电泳。一般地，在3.5V/cm下，脉冲时间从60缓升(ramp)到120秒，持续24小时。电泳之后，从孔中除去插块并在4℃下储存在1×TE缓冲液中。
在通过任一方法分离宿主DNA之后，可从孔中除去琼脂糖插块，用于进一步的处理。在一种实施例中，除去的插块在1mL 0.1×TE缓冲液中漂洗两次1小时并在1mL补充有BSA(100μg/mL)的1×NEB缓冲液2(New England Biolabs，Ipswich，MA)中平衡1小时。为了使供体基因组DNA线性化以使它在琼脂糖凝胶上电泳，可将插块与限制酶一起温育。在一种实施例中，将插块与50单位PspXI限制酶在37℃下温育过夜。温育之后，用1mL 1×TE缓冲液在室温下漂洗插块1小时并加样至脉冲场凝胶。
在另一种实施例中，在转化之前不除去宿主DNA。
c.从供体细胞分离
在另一种实施方式中，在供体核酸(例如，供体基因组)被直接从供体细胞移植入受体细胞的情况中，使用与供体细胞相容的分离方法。在一种实施例中，为了从供体细胞中分离供体细菌基因组，使用具有改进的CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒(Bio-Rad)制备包含基因组DNA的琼脂糖插块。
在一种实施例中，细胞(例如，包含供体基因组的蕈状支原体LC细胞或包含供体基因组的酵母细胞)在合适的培养基中生长，直到期望的OD，并接着将其与100μg/μl的氯霉素温育90分钟，然后收获。
用于从支原体供体细胞中分离完整的全基因组DNA的示例性方案，如Lartigue等，Science 317，632(2007)所描述的进行，任选地进行改进，比如在分离前对细胞培养物进行修饰。一种这样的例子描述在实施例2B(ii)中。
d.分离供体核酸的量化
在移植之前，可量化或评估分离的供体核酸的量。在一种实施方式中，从宿主细胞中分离的供体核酸在琼脂糖凝胶中电泳并与从已知量供体细胞分离的供体核酸比较。一个例子描述在实施例2B中。在另一种实施方式中，比如通过UV分光光度计量化分离的供体核酸的量。一种这样的例子描述在实施例2B(iv)中。
ii.处理分离的供体基因组和/或受体细胞
提供的方法包括用于克服宿主、供体和受体细胞/核酸之间不相容性障碍的步骤。在本文中描述了这种障碍，该障碍可限制将大核酸比如供体基因组从宿主细胞移植入供体基因产物可在其中表达的受体细胞。当宿主细胞与供体和受体生物不是紧密相关的(例如，来自不同的生物分支)时，尤其是这种情况。对于将在真核宿主中增殖的原核基因组移植入原核受体，这种障碍是有关系的(relevant)。
许多因素包括不相容性和毒性可引起该障碍。例如，一旦移植已经在宿主细胞中增殖的供体核酸，在受体细胞中存在(或许也在供体细胞中存在)、但是不在宿主细胞中存在的限制-修饰(R-M)系统可造成不相容性。限制-修饰系统是熟知的，并一般地被细菌生物使用以保护生物免受外源DNA的影响。限制修饰系统一般包括用于识别并切割外源DNA中的特定序列的蛋白质和用于修饰(例如，甲基化)的酶并因此保护在生物自身核酸中的那些序列。限制-修饰系统包括I型、II型和III型系统。I型系统一般包含分别识别(特异性)、切割(限制性)和修饰(修饰性)核酸序列的三种蛋白质的复合体。因此，该复合体甲基化并切割DNA。II型系统一般包含两个分开的修饰酶和限制酶，分别甲基化和切割DNA序列。III型系统包含形成异源二聚体的复合体的限制酶和修饰酶，用于修饰和切割。修饰酶还可以甲基化它们自己的DNA。
此外，移植入受体细胞之后，宿主细胞(包括不包含限制-修饰系统的那些)表达的DNA甲基转移酶可修饰供体核酸并抑制它们的活化(例如，基因产物表达)。在宿主细胞中增殖和修饰之后，供体核酸的结构和构象的变化可不利地影响供体核酸移植回受体细胞。
所提供的移植方法包括用于克服了这些限制的步骤，以成功地将在宿主细胞中修饰和/或增殖的供体基因组移植入遗传上不同的受体细胞，比如从真核宿主到原核受体。步骤包括(1)处理分离的供体核酸和(2)修饰受体细胞。
a.体外试验以评价限制修饰系统的不相容性
可利用体外试验确定在宿主细胞、供体核酸和受体细胞之间是否例如由于不同生物之间限制-修饰系统的不一致性而存在不相容性问题。供体基因组或受体细胞表达的限制-修饰系统可具有消弱成功移植和在宿主细胞中活化供体基因组的可能。
为了检查在不同类型生物的宿主细胞中增殖的供体基因组比如在酵母中增殖的细菌基因组的可能的限制-修饰问题，就限制-修饰系统方面评价供体、宿主和/或受体细胞。在供体和/或受体中限制-修饰系统的存在(和系统的识别位点特异性)可使用已知的方法从供体基因组序列中鉴定。也参见REBASE——限制酶数据库，可在万维网址：rebase.neb.com/rebase/rebase.html中获取。
为进一步确认R-M系统的存在，可在体外测试修饰酶的存在性。对于该过程，预测的识别位点的甲基化状态可使用商业上可得的识别预测位点的限制酶探测。例如，在消化反应中可使用商业上可得的对应预测的限制酶系统的限制酶同切点酶，以确定供体和受体基因组是否在合适的限制位点甲基化。在预测位点甲基化的基因组DNA可被保护免受商业上可得的识别该位点的酶切割。如果受体基因组DNA被保护免受切割，可证实R-M系统的修饰酶的存在。还可在从供体细胞中分离的基因组DNA上进行该过程，以便评价供体基因组是否可能被保护免受系统影响。一个例子描述在下面实施例2D中。
另外，从受体和供体细胞中制备的无细胞提取物可用于确定在细胞中是否存在预测的限制酶并有活性。用于制备无细胞提取物的方法是熟知的，且可根据细胞类型与所提供的方法一起使用。在一种非限制性实施例中，如下面实施例2D(ii)(b)中描述的，制备无支原体细胞提取物。包含预测限制位点的DNA与无细胞提取物在限制消化物中温育以确定在该序列识别并切割DNA的酶的提取物的存在。消化的样品可在琼脂糖凝胶中电泳以确定切割。如果期望，可在试验中比较在特定位点被甲基化或没有被甲基化的DNA。通过添加EDTA，比如10mM EDTA，无细胞提取物也可用作甲基转移酶活性源，以抑制核酸酶。可选地，在消化试验之前，重组甲基转移酶，比如大肠杆菌dam甲基转移酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)可用于甲基化DNA。甲基转移酶也可被纯化。这种消化试验的例子描述在下面实施例2D(ii)(b)中。
b.甲基化供体核酸
在从供体细胞分离之后并且在移植入受体细胞之前，可将供体核酸在体外甲基化。甲基化供体基因组，比如已经在宿主细胞中增殖的那些，可保护它们免受宿主细胞的限制修饰系统和/或由供体基因组编码的那些的影响。一方面，提供了如此方法，其保护已经在宿主细胞中增殖的供体核酸免受受体的R-M系统以及由供体编码的那些的影响。其他方面，提供了保护供体基因组免受这些生物之一的R-M系统影响的方法。例如，在许多情况下，用酶甲基化供体基因组是可能的，其保护它免受受体R-M系统的影响。当相应的供体限制酶的致死浓度达到之前，供体核酸被供体甲基转移酶甲基化时，就是这种情形。
如下面在实施例2中所描述的，当移植入山羊支原体受体细胞时，没有必要保护蕈状支原体LC供体基因组DNA免受它自己的限制系统影响，这暗示限制酶活性的致死水平达到之前，供体基因组被甲基化。这不奇怪，因为大部分核酸内切酶和甲基转移酶基因对可同时被克隆入大肠杆菌。见Holt等，Bioessays 29，580(2007)。应当理解，就它们的限制-修饰系统方面，评价供体细胞、宿主细胞和受体细胞以评价供体基因组是否在移植之前被保护。
当从酵母中移植其他细菌基因组时，在体外甲基化供体基因组以保护它免受它自己的限制酶的影响可能是必要的，比如通过使用无细胞提取物或从供体纯化的甲基转移酶在体外甲基化或通过在供体基因组中使限制性内切酶基因失活，如下面所描述。如下面所描述的，体外甲基化和限制消化可用于确定在具体移植研究中可能需要哪种甲基化反应。
一般地，使用甲基转移酶进行甲基化，所述甲基转移酶与来自期望保护的R-M系统的那些甲基转移酶相同或相似。可使用从细胞提取物(例如，受体细胞提取物)分离的甲基化酶或重组产生的和纯化的甲基化酶进行甲基化。
一方面，受体和/或供体细胞的R-M系统的甲基化酶外源表达并使用重组体方法纯化。用于所有甲基转移酶被R-M预测识别的编码序列可被密码子优化以在期望的系统比如酵母或细菌细胞中表达。可使用任何许多熟知的合成和/或装配方法，比如本文描述的那些，构建包含编码序列的片段。一个非限制性例子描述在实施例2E(i)(a)中，其中使用一步等温DNA装配方法生成甲基转移酶-编码核酸。构建之后，将片段克隆入表达载体，用于在选择的细胞中表达。
载体可用于转化细胞以表达基因产物。示例性表达系统包括BL21(DE3)密码子正(codon plus)细胞(Stratagene，La Jolla，CA)。可在细胞中诱导甲基转移酶表达，比如通过与IPTG一起温育。可使用熟知的方法，从细胞中纯化甲基转移酶。在一种实施例中，澄清细胞裂解物，柱-纯化，且包含甲基转移酶的片段对酶缓冲液透析以在随后的甲基化反应中使用，比如50mM HEPES-NaOH pH 7.2，50mM NaCl，0.1mM EDTA，10％甘油)。如果需要，可接着浓缩样品。示例性表达和纯化方案在下面实施例2E(i)(b)中详细描述。
另一方面，来自具有R-M系统的细胞(比如受体细胞或供体细胞)的粗提物用于甲基化从宿主细胞中分离的供体核酸。如果不确定受体或宿主细胞的所有R-M系统已经被确定，该方面可以是有利的。例如，如果受体细胞的R-M系统是未知的，那么使用来自受体细胞的粗提物将确保在甲基化反应中存在所有相关的甲基转移酶。可使用任何熟知的用于制备适合细胞提取物的方法。一个例子描述在下面实施例2E(ii)中，用于从支原体受体细胞中制备包含甲基转移酶的细胞粗提物。在细胞提取物中的核酸酶可被抑制，比如通过添加10mM EDTA，以使它们在甲基化反应中使用。
纯化的甲基转移酶或包含甲基转移酶的细胞粗提物可用于甲基化从宿主细胞中分离的供体核酸。在一种实施例中，包含供体核酸的琼脂糖插块可在甲基化缓冲液(例如，100mM Tris-HCL pH 7.5；10mM EDTA；3μM DTT；200μM S-腺苷甲硫氨酸(SAM))中漂洗和平衡。然后，插块可在包含甲基化缓冲液和细胞粗提物或者纯化的甲基转移酶的甲基化反应中温育。没有SAM的平行反应可用作对照。一方面，可在存在dam甲基转移酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)的情况中进行甲基化反应。在甲基化之后，每个酵母插块可在补充有40μl蛋白酶K的1ml蛋白酶K反应缓冲液中，50℃下温育4小时。插块可接着漂洗4次45分钟，每次用1ml 1×TE缓冲液，并在室温下漂洗2次30分钟，每次在0.1×TE缓冲液中，温和搅动。除去最终漂洗缓冲液之后，可熔解填料。一个例子描述在实施例3A(iii)中。在移植研究之前，可在体外测试甲基化反应对于保护供体核酸免受受体R-M系统影响的效力。根据R-M系统评价结果可作出调整。可通过对供体基因组DNA或包含供体核酸的质粒实施甲基化反应，进行该过程。甲基化反应之后，可使用受体细胞的限制酶进行限制消化反应，以确保通过甲基化保护供体核酸。一个例子描述在实施例2E中。
c.去蛋白作用
用粗提物温育可改变供体DNA的构象，一旦移植其又可造成不相容性。可通过可视化在存在或不存在细胞提取物的情况下温育的供体基因组DNA评价这种构象变化，比如在实施例2B(iv)中所描述的。因此，在一些实施方式中，在甲基化之后并在移植之前，供体核酸可进行去蛋白步骤，以在粗提物中除去蛋白质。一方面，可使用蛋白酶比如蛋白酶K去除蛋白质。在示例性处理中，已经进行甲基化反应的琼脂糖插块可进一步在蛋白酶K反应缓冲液和蛋白酶K在50℃下温育4小时。在继续熔解插块和移植之前，可漂洗插块。见实施例2B(iv)和3A(iii)。
d.遗传修饰受体细胞R-M系统
在一些情况下，在移植供体核酸或基因组之前，受体细胞的限制修饰系统可能需要被失活；可在体外或体内进行R-M系统的修饰。代替在体外甲基化，限制修饰系统可至少从受体细胞和可能地从供体基因组或核酸中除去或失活。
受体细胞R-M系统的一个或多个限制酶(一个或多个)可通过突变编码酶的基因失活。该过程一般地可作为在移植之前在体外甲基化供体核酸的替代方式。
但是，供体基因组的限制修饰系统失活，在一些情况下可能是不实际的。例如，在移植之后立刻表达由供体基因组编码的限制性内切酶可通过降解受体细胞的居民基因组帮助促进移植。因此，在这种情况系除去供体限制修饰系统是不期望的，应当使用甲基化。应当理解，移植之前可就这一点评价供体、宿主和受体细胞的每一个，以鉴定用于失活R-M系统的最好系统。
任何突变过程可用于失活R-M系统。一个例子描述在下面实施例2F中，其中在移植供体核酸之前，在支原体受体细胞中编码单一限制酶的基因被失活。在该实施例中，基因通过用允许选择包含突变基因的细胞的嘌呤霉素抗性标记中断被突变。本文考虑其他失活方法并包括许多也可用于选择包含突变基因的细胞的抗性标记；本文描述了这样的标记且它们在本领域也是已知的。从这种突变体受体细胞中制备的细胞提取物可在甲基化反应中用作对照，如本文所描述的。
可选地，供体基因组可在体内被甲基化，例如，当还在宿主细胞中时。通过表达克隆入宿主载体的供体或受体的甲基化酶，可在宿主细胞中进行体内甲基化。这方面可能是较不期望的，因为它可能导致供体基因组中不期望的变化。例如，在酵母中表达细菌甲基化酶已经显示增加了酵母的同源重组，其可导致位于酵母人工染色体(YAC)中或者酵母着丝粒质粒(YCp)中的供体细菌基因组改变。可发生该结果，这是因为酵母宿主细胞没有选择压力保持细菌基因组的完整性，除了所述细菌基因组的插入酵母载体序列区域。应当理解，可评价体外甲基化、体内甲基化或通过插入例如抗性标记失活R-M系统是否可用于失活受体细胞的R-M系统。
iii.移植入受体细胞
在分离和处理之后，供体核酸可进一步使用本文描述的或本领域已知的方法移植入受体细胞。一个示例性移植方案描述在下面实施例3中。用于从供体移植支原体基因组到支原体受体的一个方法被Lartigue等，Science 317，632(2007)描述。这样的方法可用于在分开的宿主中修饰来自难处理细胞或生物的基因组或核酸以赋予供体基因组特定的性质。修饰的基因组可接着被移植回相同的供体细胞或进入供体细胞，从而赋予受体细胞修饰基因组的表型。
一般地根据它们支持从供体核酸比如供体基因组基因表达的能力，选择受体细胞。本文作为示例性方法提供了转移细菌基因组进入真核宿主，其并不拟为限制性的。例如，在细菌基因组已经转移入具有优选的遗传操作系统的真核宿主细胞(例如，酵母)中并在其中修饰之后，为了从修饰的基因组表达基因产物，将基因组移植回细菌受体细胞是必要的。如本文所讨论的，翻译和转录的不同和不同密码子应用等等因素可阻止在宿主细胞中表达供体基因产物。因此，受体细胞与供体细胞或生物可以是相同种或相似种的。它与供体通常是相同的目或界。技术人员能够基于期望从其表达的供体基因组或其他核酸，确定合适的受体细胞。
供体核酸在琼脂糖插块中分离之后，可任选地除去宿主DNA(例如，通过消化和/或电泳)并任选地用甲基转移酶和/或蛋白酶处理。
可通过例如与β-琼脂糖酶I(New England Biolabs)一起温育，熔解琼脂糖插块，如在下面实施例3A(ii)(b)中所描述的。
可在聚乙二醇(PEG)比如PEG-6000或PEG-8000或其他PEG存在情况下进行移植以有利于转化。PEG的来源、数量和大小可变化以确定最优的PEG。在一种实施例中，PEG是PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、PEG-10000、PEG-20000或其他。PEG的浓度可根据移植的条件变化；浓度包括例如为或大约为5％或为或大约为10％的那些。例子描述在下面实施例3A(ii)(c)中。熔解的插块可在PEG存在情况下添加到受体细胞，温和摇动以混合。允许回收细胞，离心并在包含合适选择培养基的培养基中生长，以对包含移植供体核酸的受体细胞进行选择。一方面，细胞被铺板在培养基上并在对于受体细胞类型合适的条件下生长直到出现集落。挑选集落，并继续在选择培养基上进一步生长，以产生期望量的包含移植基因组或其他供体核酸的受体细胞。
根据需要可保持受体细胞与供体核酸的特定比率。在一种实施例中，可保持在每2μg基因组DNA为或大约为107个和为或大约为108个之间的受体细胞的比率。提供的移植方法可用于对200ng内源基因组DNA获得大约30转化体，或每个反应在500和1500移植体之间，或从宿主或供体细胞得到的其他合适的量。在一种非限制性实施例中，移植用对于约107个受体细胞、20μl熔解的包含100ng/μl供体基因组的琼脂糖插块中进行。应当理解，受体细胞与供体核酸的比率可根据细胞类型变化，且经验评估可用于优化该比率。
示例性移植方法图解在图8(“3”)中：在该方法中，包含合适标记和用于在宿主和受体细胞中增殖的元件的基因组DNA，在琼脂糖插块中从宿主细胞中分离，用粗提物或纯化的甲基转移酶甲基化并用蛋白酶K去蛋白。熔解琼脂糖插块，将DNA与受体细胞一起温育，其然后铺板在选择培养基上。作为实施例，完整的包含YCp元件、四环素标记和β-半乳糖苷酶基因的全蕈状支原体LC供体基因组DNA可在琼脂糖插块中从酵母宿主中分离，用蕈状支原体LC粗提物甲基化，并接着用蛋白酶K去蛋白。熔解包含甲基化基因组DNA的琼脂糖插块并与山羊支原体受体细胞一起温育，并接着铺板在包含用于选择转化体的四环素的SP4培养基上。
G.迭代方法(重复方法，iterative method)
本文描述的方法可以以迭代的方式用于多轮基因组或其他核酸修饰。
在一种实施方式中，通过该方法改造的细胞(比如包含通过提供的方法例如在宿主细胞中已经修饰的移植、修饰基因组的受体细胞)可在随后轮的转化、修饰和移植中用作供体核酸的来源，从而生成进一步修饰的基因组和生物。
在一种非限制性实施例中，如在图1中所图解，通过该方法生产的改造细菌细胞(比如包含通过提供的方法例如在酵母中已经修饰的移植、修饰细菌基因组的受体细胞)可在随后轮的转化、修饰和移植中用作供体核酸的来源，从而生成进一步修饰的基因组和生物。
在可选的移动供体基因组进入宿主细胞、改造它并通过基因组移植使它安装回供体的迭代实施方式中，通过转化将宿主载体插入供体基因组中。该基因组被克隆入宿主细胞；克隆之后，使用宿主遗传方法的所有技术在供体基因组中制造插入、缺失、重排或修饰的任何组合。该改造基因组接着被分离并移植入受体细胞以生成改造的具有改变表型的受体细胞。移植其之前，甲基化供体DNA是必要的以保护它免受受体细胞限制系统(一个或多个)的影响。可从新改造的基因组开始重复该循环。
在图16中提供的是移动细菌基因组进入酵母、改造它并通过基因组移植使它安装回细菌的非限制性实施例，通过转化将酵母载体插入细菌基因组。该基因组被克隆入酵母；克隆之后，使用酵母遗传方法的所有技术在细菌基因组中制造插入、缺失、重排或修饰的任何组合。该改造的基因组接着被分离并移植进入受体细胞以生成改造细菌。移植之前，甲基化供体DNA是必要的以保护它免受受体细胞的限制系统(一个或多个)的影响。可从新改造的基因组开始重复该循环(虚线箭头)。
用于选择和反选择酵母突变体的许多可用的、验证的、证实的和可靠的选择标记能够使用提供的方法在酵母宿主细胞中进行许多例如无限迭代轮次的无缝核酸改变。对其他难处理的基因组或其他大核酸克隆拷贝的连续修饰可在酵母中快速连续地进行。酵母的交配能力对于修饰基因组和其他大核酸是有利的。当在酵母交配期间激活时，酵母重组机器可用于生成文库，例如，包含克隆基因组或核酸变体的组合文库。尽管本文描述的实施方式利用酵母细胞作为宿主细胞，但是应当理解所提供的方法包含其他宿主细胞，所述其他宿主细胞就例如用于选择和反选择宿主细胞突变体的选择标记方面已经被理解，或就该点已经被评价。考虑该实施方式的许多变型并落在本申请的范围内。
H.提供的方法和组合物的应用
提供的方法和组合物可用于解决与环境、能量产生和医学相关的问题。提供的方法和组合物可用于生产、改造和修饰基因组和生物以及用于商业上使用的其他产品，比如免疫原、生物蛋白质和化学品、疫苗、生物燃料和有用的蛋白质比如酶。例如，所提供的方法可用于操作和改造来自任何生物特别是具有弱遗传系统的那些生物的核酸，比如其基因组不容易通过常规方法操作的那些。所提供的方法可用于建造合成基因组并移植该基因组进入受体细胞以产生合成细胞。因此，该方法可用于产生医学上有用的蛋白质，包括酶、蛋白和核酸治疗剂、抗体、免疫原、疫苗和其他细胞产品。
疫苗一般指提高对和疾病相关的特定微生物(细菌或病毒)免疫性的免疫原性制剂。疫苗典型地包含少量类似微生物的试剂。该试剂刺激机体的免疫系统以识别该试剂为外来物，破坏它并记住它，以便免疫系统可更容易地识别和破坏它随后遇到的任何这样的微生物。疫苗可以是预防性的(例如，预防或改善被任何天然或“野生”病原体将来感染的效果)或治疗性的(例如，癌症疫苗)。疫苗可以是单价的(也称一价的)或多价的(multivalent)(也称多价的(polyvalent))。可设计单价疫苗以免疫对抗单一抗原或单一微生物。可设计多价(multivalent)或多价(polyvalent)疫苗以免疫对抗两个或更多个相同微生物菌株或对抗两个或更多个微生物。在某些情况下，单价疫苗可用于快速开发强的免疫应答。疫苗用于试图降低疾病的风险，而保留诱导有益免疫应答的能力。疫苗可包含死的或失活的生物或源于它们的纯化产物。免疫原性组分可用于处理人类和非人类群体(例如，灵长类、兽医动物等)。
所提供的技术可用于产生免疫组分，以从生物，比如免疫原性组分，比如包括活细胞和病毒的那些，引起免疫应答，所述活细胞和病毒包括但不限于，修饰的腺病毒科(Adenoviridae)(例如，腺病毒)、小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，柯萨奇病毒、甲型肝炎病毒、脊椎灰质炎病毒)、疱疹病毒科(Herpesviridae)(例如，各种单纯疱疹病毒类型、埃巴病毒、人巨细胞病毒)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(例如，乙型肝炎病毒)、黄病毒科(Flaviviridae)(丙型肝炎病毒、黄热病毒、登革热病毒、西尼罗病毒等)、逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷病毒(HIV))、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如，麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人变性肺病毒等)、乳头状瘤病毒科(Papillomaviridae)(例如，乳头状瘤病毒)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如，狂犬病病毒)、披膜病毒科(Togaviridae)(例如，风疹病毒)和细小病毒科(Parvoviridae)(例如，人博卡病毒(Human bocavirus)、细小病毒B19)、流感(influenza)(例如，H1N1流感、B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzaetype B)等)、脊髓灰质炎、牛痘、水痘带状疱疹、呼肠病毒(reovirus)、逆转录病毒、痘病毒、细小病毒、微小RNA病毒、副粘病毒和BCG。
所提供的技术可用于产生免疫组分，以从生物，比如免疫原性组分，比如包括活细胞和细菌的那些，引起免疫应答，所述活细胞和细菌包括但不限于修饰的博德特菌属(Bordetella)(例如，百日咳博德特氏菌)、疏螺旋体属(Borrelia)(例如，伯氏疏螺旋体)、布鲁杆菌属(Brucella)(例如，流产布氏杆菌、犬布氏杆菌、羊流产布氏杆菌和猪流产布氏杆菌)、弯曲杆菌属(Campylobacter)(例如，空肠弯曲杆菌)、衣原体属(Chlamydia)(例如，肺炎衣原体、鹦鹉衣原体和沙眼衣原体)、梭菌属(Clostridium)(例如，肉毒梭菌、难辨梭菌、产气荚膜梭菌和破伤风梭菌)、棒杆菌属(Corynebacterium)(例如，白喉棒杆菌)、肠球菌属(Enterococcus)(粪肠球菌和肠球菌)、埃希氏菌属(Escherichia)(例如，大肠杆菌)、弗朗西斯菌属(Francisella)(例如，土拉热弗朗西丝菌)、嗜血菌属(Haemophilus)(例如，流感嗜血菌)、螺杆菌属(Helicobacter)(例如，幽门螺杆菌)、军团病杆菌属(Legionella)(例如，嗜肺军团病杆菌)、钩端螺旋体属(Leptospira)(例如，问号钩端螺旋体)、李斯特菌属(Listeria)(例如，单核细胞增多性李斯特菌)、分枝杆菌属(Mycobacterium)(例如，麻风分枝杆菌和结核分枝杆菌)、支原体属(Mycoplasma)(例如，肺炎支原体)、奈瑟球菌属(Neisseria)(例如，淋病奈瑟球菌和脑膜炎奈瑟球菌)、假单胞菌属(Pseudomonas)(例如，铜绿假单胞菌)、立克次体属(Rickettsia)(例如，立克氏立克次体)、沙门菌属(Salmonella)(例如，伤寒沙门菌和鼠伤寒沙门菌)、志贺菌属(Shigella)(例如，宋内志贺菌(Shigella sonne))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌和腐生性葡萄球菌)、链球菌(Streptococcus)(例如，无乳链球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌)、密螺旋体属(Treponema)(例如，苍白密螺旋体)、弧菌属(Vibrio)(例如，霍乱弧菌)和耶尔森菌属(Yersinia)(例如，鼠疫耶尔森菌)，其具有免疫原性特征，使它们成为有吸引力的疫苗候选。
可用的疫苗制备方法已不能有效地去掉许多生物的病原性的同时保持它们的免疫原性。所提供的可用于改造和操作大核酸和基因的方法和组合物例如组合地可用于改造这样的疫苗。
本文描述的方法可用于产生有效的组合物以治疗、预防或显著减少下列的生物影响：水痘、带状疱疹(shinges)、流感、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹、中毒性休克、霍乱、腺鼠疫、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、黄热病、疟疾、结核病、破伤风、脑炎、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、麻风病、犬瘟热、犬细小病毒、犬传染性肝炎、腺病毒-2、钩端螺旋体病、博德特氏菌(bordatella)、犬副流感病毒、登革热、莱姆病和另外其他疾病，对于它们，疫苗在治疗和/或处理一种或多种症状中是有用的。
考虑在本文描述的方法中使用的另外的病毒类型、家族和相关疾病提供在下表中。
Figure BPA00001462307600641
考虑在本文描述的方法中使用的另外的细菌种类和相关疾病提供在下表中。
Figure BPA00001462307600642
Figure BPA00001462307600651
Figure BPA00001462307600661
本文描述的方法可用于生产有效治疗或预防牛传染性胸膜肺炎(CBPP)的组合物，该疾病是由细菌蕈状支原体小集落引起的。这种疾病，也称为牛胸膜肺炎，是黄牛、犁牛、水牛和瘤牛的主要病原体。该疾病在非洲、中东、南欧以及亚洲部分地区广泛传播。因此确实需要改进的疫苗。该疾病生物是此处用来说明本发明所提供方法的方面的细菌——蕈状支原体大集落菌株GM12——的系统发育近亲属。蕈状支原体小集落细菌的抗原基因和/或基因组可使用所提供的技术克隆并操作，以生成起活疫苗作用的细胞，例如突变体。
提供的方法与例如蕈状支原体LC和紧密相关种类一起使用，作为用于探究支原体的病原性和生物学的模型体系。支原体的mycoides组引起反刍动物的大部分疾病，迫切需要疫苗。提供的方法可加速活疫苗菌株的构建。方法还可用于确定生命需要的最小基因补充，特别在小基因组比如蕈状支原体基因组中。
施用疫苗的方法在本领域是已知的，并包括注射和气溶胶输送免疫原性疫苗组合物到受试者。可配制组合物并与药学上可接受的载体或赋形剂一起施用。这里还提供了包含免疫原性疫苗的组合物，所述疫苗配制在用于治疗本文所述的疾病或状况的药物中。施用至受试者之后，可就免疫应答的一个或多个方面测量免疫原性疫苗组合物的效果。免疫应答包括，例如诱导抗体反应(增加抗体效价)、细胞因子、诱导T辅助(TH1和TH2)细胞分化和增殖等。每个这样的应答可被量化。免疫应答还包括减少在患者中的总细菌或病毒载量。
当前公开的方法也可用于开发生物燃料。
生物质原油(biocrude)是生物产生的化合物或生物产生的不同化合物的混合物，用作精炼厂的原料，替换或补充原油或其他形式的石油。一般地，但不是必需的，这些原料已经通过生物、化学、机械或热处理，以成为适合引入炼油厂的液态。
微生物可使用本文描述的方法修饰以产生生物质原油，其可接着进一步加工成生物燃料组合物。该生物燃料可接着作为成品燃料或燃料添加剂使用。
“成品燃料”指化合物或化学化合物的混合物(通过化学、热化学或者生物途径产生)，其处于合适的化学和物理状态被直接用作发动机中的纯燃料或燃料添加剂。在许多情况下，但不总是，在发动机应用中使用的成品燃料的适宜性通过描述需要满足的必需物理和化学性质的规格确定。发动机的一些实例是：内燃机、燃气涡轮机、蒸汽轮机、外燃机和蒸汽锅炉。成品燃料的一些实例包括：压缩点火(柴油机)内燃机中使用的柴油，在航空涡轮机中使用的喷气燃料，在锅炉中使用以生成蒸汽的燃料油或在外燃机中使用的燃料油，在弹性燃料发动机中使用的乙醇。燃料规格的实例是主要在美国使用的ASTM标准和主要在欧洲使用的EN标准。
“燃料添加剂”指由于各种原因与另一种燃料组合使用的化合物或组合物，所述原因包括但不限于符合使用生物燃料的任务、减少化石燃料来源的产品的消耗或者增强燃料或发动机的性能。例如，燃料添加剂可以用于改变凝固点/胶凝点、浊点、润滑性、粘度、氧化稳定性、点火性能、辛烷值和闪点。添加剂还可作为抗氧化剂、破乳剂、增氧剂(oxygenates)、热稳定性改良剂、十六烷值改进剂、稳定剂、低温流动改进剂、燃烧改良剂、消泡剂、消雾添加剂(anti-haze additives)、结冰抑制剂、喷油器清洁添加剂、抑烟剂、减阻添加剂、金属钝化剂、分散剂、清洁剂、破乳剂、染料、标记、静电消除剂(static dissipaters)、杀菌剂和/或腐蚀抑制剂。
一些真核藻类合成多达其干重的70％的油类。为光合作用产物的这些油类是理想的生物燃料候选物。产生这些油类的生物可以在池塘和沙漠中生长，因此对于产生生物燃料不会失去适于耕种的耕地。这些藻类的使用一般地受到它们的缓慢生长所限制。但是，所提供的方法可用于操作生物的基因组，例如改造新的生物，例如原核生物，其表达参与油合成途径的酶，例如通过操作转录启动子、翻译信号和密码子优化。该方法可用于修饰光合作用细菌的基因组以改造新的细菌，其具有产生生物燃料比如通过藻类产生的油类而不是光合作用的正常产物(葡萄糖)的嵌合基因组。
使用公开的方法制造的重组微生物可包含改造的能够使葡萄糖和源于木质纤维生物质的其他糖转化为香叶醇的生物合成途径。
使用公开的方法制造的重组微生物(例如，光合微生物菌株)可用于生物学产生支链醇，包括例如，2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和异丁醇。一方面涉及通过引入编码酶的异源基因，产生重组光合微生物，所述酶增强2-酮支链酸的生产和脱羧，导致产生相应的支链醛。可接着进行另外基因的引入，用于有效地使支链醛还原成相应的支链醇。另外，可改造微生物，以便支链醇在体内被酶促脱水以产生各种支链α-烯烃。
使用公开的方法制造的重组微生物编码植物酰基-ACP硫酯酶。这样核酸分子可用于转化生物，比如光合生物和原核生物，用于合成脂肪酸和脂肪酸产品比如脂肪醛、脂肪醇、包括蜡酯的脂肪酯、和烃。还包括使用本文提供的方法转化的生物。
使用公开的方法制造的重组微生物(例如，重组光合微生物)包含核酸分子，其包括至少一个产生至少一种外源酰基-ACP硫酯酶的重组表达系统，其中所述酰基-ACP硫酯酶释放包含6-20个碳的脂肪酸链，且微生物分泌被酰基-ACP硫酯酶释放的脂肪酸进入培养基。硫酯酶可用于释放包含6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳的脂肪酸链。如此获得的脂肪酸可被进一步合成改性或直接用作生物燃料或化学品的成分。
在这样的构造中，可期望除去编码质体转运肽区域(plastid transit peptide region)的基因部分，因为该区域在原核生物中是不合适的。可选地，如果表达发生在真核细胞中，宿主生物合适的质体转运肽编码区域可被替代。取决于宿主，也可采用优选的密码子。
可进一步修饰微生物的基因组以包括用于编码β-酮脂酰合成酶(KAS)的异源基因的表达系统，所述合成酶优选产生具有中等链长度的酰基-ACP。这种KAS酶可用作增加用于被异源中等链酰基-ACP TE识别并切割的适当长度的酰基-ACP分子的可用性。另一种实例是包含异源酰基-ACP TE基因的光合宿主细胞可被进一步修饰包括用于编码多功能的酰基-CoA羧化酶的异源基因或编码多亚单位类型的酰基-CoA羧化酶的各种亚单位的一组异源基因的表达系统。编码脂肪酸生物合成途径的另外的酶或成分的其他异源基因也可引入并在包含酰基-ACP TE的宿主细胞中表达。
还可修饰光合微生物以便编码β-氧化途径酶的一个或多个基因已经被失活或下调，或酶本身可被抑制以防止从酰基-ACP释放的脂肪酸降解，因此增加分泌的脂肪酸的产量。在期望的产物是中等链脂肪酸的情况下，失活或下调编码优先使用这些链长度作为底物的酰基-CoA合成酶和/或酰基-CoA氧化酶的基因是有益的。编码中等链特异性酰基-CoA合成酶和/或中等链特异性酰基-CoA氧化酶基因的突变使酶的活性减小，对于增加分泌脂肪酸的产量也是有效的。另外的修饰使酰基-ACP合成酶失活或下调或使基因或蛋白质失活。
光合微生物也可被修饰，以便编码贮藏碳水化合物或聚羟基脂肪酸酯(PHA)生物合成途径酶的一个或多个基因已经被失活或下调，或酶本身可被抑制。例子包括参与糖原、淀粉或金藻昆布多糖合成的酶，包括葡聚糖合酶和分支酶。其他例子包括参与PHA生物合成的酶比如乙酰乙酰基-CoA合成酶和PHA合成酶。
公开的方法也可用于产生工业酶和工业生物。公开的方法可用于产生新的具有嵌合基因组的生物，例如，为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)和解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)嵌合体的基因组，其具有来自前一种类的基因，编码从葡萄糖中合成乙醇需要的酶；和来自后一种类的基因，编码可有效降解纤维素的纤维素酶。因此，提供的方法和组合物可用于产生有效降解纤维素以产生乙醇的细胞和生物。
其他应用在下面描述并被本文考虑。该方法一般可用于克隆全基因组和部分基因组，其帮助研究来自难以培养的生物的基因组并帮助构建和增殖合成的基因组。尽管本文已经描述了某些优选的工业应用，但是本发明的方法和工艺是从改造的基因组产生任何感兴趣的表型或产物的广泛适用的工具。
I.实施例
提供下面实施例以阐明所提供的实施方式，并且不拟限制本申请的范围。
实施例1
将细菌供体基因组转移入酵母宿主细胞
该实施例描述了使用本文提供的三种不同的克隆方法(图2)在酵母宿主细胞中成功克隆细菌基因组。如下面所描述的，每种方法产生具有核酸的宿主细胞，所述核酸包含与酵母宿主载体连接的供体细菌基因组。通过这些方法将供体基因组转移到宿主细胞可与所提供方法一起使用，用于在宿主细胞中增殖和修饰供体基因组，并从宿主细胞移植供体基因组进入受体细胞(图1)。
通过将酵母宿主载体插入供体细菌基因组然后转化酵母，从而产生连接分子，连接分子接着被转化入酵母，进行在图2A中显示的第一克隆方法。分别通过在宿主细胞中使用同源重组连接供体细菌基因组和酵母载体，进行在图2B和2C中显示的第二和第三方法。利用第二方法，细菌基因组和酵母(宿主)载体被共转化入酵母宿主细胞(图2B)。宿主载体是包含与细菌供体基因组中位点同源的末端区域的线性酵母载体，并从而通过同源重组被插入。利用第三方法(图2C)，细菌基因组的多个重叠片段连同酵母载体被转化入酵母宿主细胞。酵母细胞中的同源重组实现同源重组，连接片段和酵母载体以产生包含与酵母载体连接的供体细菌基因组的分子(图2C)。采用每个方法的研究在下面详细描述。
利用每个方法，将生殖器支原体基因组克隆入酵母宿主细胞。另外，使用第一方法，将蕈状支原体LC和肺炎支原体基因组转移入酵母，如在图2A中所描述的。使用第一方法(图2A)，将生殖器支原体和蕈状支原体LC基因组作为分开的分子(每个与酵母宿主载体连接)进一步转移入单酵母细胞。
实施例IA
使用整合的酵母载体将支原体供体全基因组转移入酵母宿主细胞
该实施例描述了使用第一种用于将供体基因组引入宿主细胞的方法，成功克隆(转移和增殖)三种不同的支原体供体基因组(生殖器支原体菌株MS5；蕈状支原体亚种mycoides，大集落菌株GM 12；和肺炎支原体菌株M129-B170(ATCC 29343))进入宿主酵母细胞。生殖器支原体菌株MS5是生殖器支原体G37(GenBank号L43967)的衍生物。它在G37菌株中通过中断基因被制造，如在Dhandayuthapani等，J Bacteriol 183，5645(2001)中描述的。蕈状支原体亚种mycoides，大集落菌株GM 12(具有Genbank获取号NZ_AAZK01000004.1(GI：149364882)的基因组序列)描述在DaMassa等，Am J Vet Res 44，322(1983)和Lartigue等，Science 317，632(2007)中。肺炎支原体菌株M129-B170(ATCC 29343)是肺炎支原体M129的衍生物，GenBank获取号U00089.2(GI：26117688)。
通过将酵母载体插入供体基因组进行转移每个支原体供体基因组，以生成包含基因组和宿主载体的核酸分子，并接着将该分子通过转化引入宿主细胞。
i.构建三穿梭宿主载体用于克隆支原体基因组进入酵母
设计两个三穿梭酵母宿主载体，以使用在图2A中显示的方法，克隆支原体基因组进入酵母宿主细胞。这些载体——pmycYACTn和miniTn-Puro-JCVI-1.7，示意性图解在图3中。
a.构建pmycYACTn载体
载体pmycYACTn(图3A)长度是10kb并包括：(i)来自pUC19的高拷贝原点(ori)和用于在大肠杆菌中增殖的氨苄青霉素抗性标记、(ii)IS256转座酶基因和用于转座进入支原体基因组反向重复；(iii)tetM和lacZ标记，二者由螺旋素启动子表达，如在Lartigue等，J Bacteriol 164，1094(1985)所描述的，用于在大肠杆菌和支原体中选择和筛查；和(iv)自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(CEN)，用于在酵母中复制和分离；和(v)HIS3，选择酵母标记。
从图解在图3E中的重叠片段(标注为片段1、2和4-7)构建载体，其使用公开的体外装配方法(Gibson等，Science 319，1215(2008)、美国专利申请系列号12/247,126和WO09/048885，所有通过引用并入本文)。片段1(1846碱基对(bp))包含大肠杆菌氨苄青霉素抗性(bla)、pUC19原点，其被包括以促进高产率质粒分离。片段2(1256bp)包含支原体IS256转座酶和启动子以及IS256反向重复(在图3E中标注为“3”)，其被包括以促进通过转座的载体插入。片段4(2294bp)和5(3335bp)每个包含支原体螺旋素启动子并分别包含支原体四环素抗性(tetM)和LacZ基因，其被包括以促进对载体插入供体基因组进行选择。片段5另外包含IS256反向重复以促进转座插入。片段6(847bp)包含酿酒酵母HIS3基因和启动子，其被包括以促进对转化入宿主细胞的选择。片段7(505bp)包含酿酒酵母ARSH4和CEN6基因，其被包括以促进复制和分离。见图3E。
通过PCR，使用表1中列出的引物(Integrated DNA Technologies，Coral ville，IA)构建这些重叠片段。在表1中，与其他片段重叠的区域被加下划线；IS256反向重复(在图3E中标注为“3”)为黑体类型。下列质粒在单独片段的PCR中用作模板。对于片段1、4和5，模板是从pMYCO1质粒修饰的pMYCO1PSlacZ质粒的pBS+部分(Stratagene，San Diego，CA)，描述在Lartigue和Blanchard等(2003)，NucleicAcids Res 31(22)：6610-8中。对于片段2，模板是pISM31.1载体的3.7kb Pcil-Sall片段，描述在Pour-El等，Plasmid 47(2)：129-37(2002)中。对于片段6和7，模板是pARS-VN质粒，描述在Noskov等，BMC Genomics 4(1)：16(2003)中。
表1：用于构建大肠杆菌-支原体-酵母穿梭载体pmycYACTn的片段的PCR引物
Figure BPA00001462307600711
Figure BPA00001462307600721
为了产生每条片段(扩增子)，使用10ng的质粒模板在100μL反应体积中进行PCR。包含根据制造商方案量的在表1中指出的引物、Phusion DNA聚合酶、HF缓冲液(New England Biolabs，Ipswich，MA)，另外添加MgCl2使最终浓度为2.0或3.0mM。循环条件如下：98℃，30秒；接着在98℃下温育10秒、退火30秒和在72℃温育90秒的30个循环；接着72℃，5分钟。循环之间和不同片段PCR之间的退火温度可如下变化。对于循环1-5，退火温度在46℃和59℃之间，对于循环6-30增加5℃(到51℃和64℃之间)。具体地，循环1-5退火温度是片段1，56℃和59℃；片段5，46℃和48℃；片段4，46℃和50℃；片段2，46℃；片段6和7，48℃和52℃。对于循环6-30，每个温度比循环1-5的温度高5℃。对于每个片段，集中PCR产物并使用β-琼脂糖酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)凝胶纯化扩增子。
对于包含转座酶基因的片段2，从模板pISM31.1扩增，PCR引物之一包含在期望位置与模板同源的标准20个碱基对，但还包含与IS256反向重复的2个另外拷贝同源的26个碱基对，其也存在于质粒的其他部分中。为了有利于正确片段的特异性扩增，这些IS256拷贝用Pcil和Sail的双限制酶消化，与pISM31.1期望的模板部分分开，然后琼脂糖凝胶-纯化正确得到的3.7kb片段，其接着在片段2的PCR扩增中用作模板。
使用公开的体外装配方法，装配纯化的片段，生成pmycYACTn载体，所述体外装配方法描述在D.G.Gibson等，Science 319，1215-1220(2008)、美国专利申请系列号12/247,126和WO 09/048885中，所有通过引用并入本文。如所描述的(Gibson等，Science 319，1215-1220(2008)；美国专利申请系列号12/247,126；和WO09/048885)，通过在存在5％PEG-8000、50mM Tris-Cl、pH 7.5、10mM MgCl2、10mM DTT、25ug/ml BSA、200uM每dNTP和1mM NAD的情况下，将该装配与Taq DNA连接酶和Taq DNA聚合酶在45℃下温育15分钟，修复整个“咀嚼后装配(chew back assembly)”(CBA)反应。反应接着进行苯酚提取、异丙醇沉淀、重悬浮并电穿孔入EPI300细胞(Epicentre Biotechnologies，Madison，WI)。用羧苄青霉素选择转化体。使用三个分开的限制消化，从选择克隆的DNA中筛选正确大小的质粒。如下，表型上测试质粒各种元件的存在性。在大肠杆菌中增殖确保pUC19原点的功能；在大肠杆菌中用羧苄青霉素和四环素选择并用X-gal筛选验证存在bla、tetM和lacZ标记的完整拷贝；和用分离的载体成功转化酵母表明HIS3、ARSH4和CEN6标记可用。如下面描述的，通过转化进支原体，证实有功能的转座子的存在。
b.构建miniTn-Puro-JCVI-1.7载体
miniTn-Puro-JCVI-1.7载体(图3B)长14kb，并除了下列之外与pmycYACTn相同：(i)它不包含lacZ；(ii)它包含嘌呤霉素抗性标记，而不是tetM标记；和(iii)它包含细菌人工染色体(BAC)载体。
ii.将宿主载体插入供体基因组
a.生殖器支原体MS5
在准备转移生殖器支原体菌株MS5供体基因组进入酵母宿主细胞中，通过电穿孔生殖器支原体供体细胞，将载体pmycYACTn载体插入供体基因组，如在J.I.Glass等，PNAS USA 103，425(2006)中所描述。通过在存在四环素的情况下生长，选择转化体，且选择单克隆用于进一步分析。使用载体内部的引物进行直接基因组测序(如在J.I.Glass等，PNAS USA 103，425(2006)中所描述的)以确定载体插入的位点。选择的克隆包含pmycYACTn的两个IS256反向重复之间的序列并包括pmycYACTn的两个IS256反向重复，指示已经发生转座，如所设计的(图3C)。转座酶、pUC19原点和氨苄青霉素抗性基因在转座期间失去。宿主载体插入供体基因组中非必需MG411基因组内(J.I.Glass等，PNAS USA 103，425(2006)；C.A.Hutchison等，Science 286，2165(1999))。
b.蕈状支原体亚种cycoides，大集落菌株GM12
在准备转移蕈状支原体亚种mycoides，大集落菌株GM12基因组进入酵母宿主中，支原体供体细胞使用PEG用pmycYACTn转化，如在K.W.King和K.Dybvig，Plasmid 26，108(1991)中所描述的。通过在补充有四环素的平板上生长选择转化体。
四个选择的克隆通过直接基因组测序分析以定位宿主载体插入供体基因组的位点。结果显示，在四个克隆的每个中，整个宿主质粒已经整合入供体基因组，而不是通过转座整合部分pmycYACTn构建体。在四个克隆的三个中，载体(pmycYACTn)已经通过在pUC原点中或非常邻近pUC原点处的交换事件(crossover event)被插入。在四个克隆中，在酵母HIS3基因中已经发生了交换，且因此没有用于随后的转化基因组进入酵母。在所有情况下，在邻近IS1296元件的位置处已经发生宿主载体的插入。
示意性图解在图3D中的克隆生长稳健。为了证实该克隆的基因组可有效地移植，进行在C.Lartigue等，Science 317，632(2007)中描述的氯化钙转化过程以使它从生殖器支原体供体细胞移植入山羊支原体受体细胞。克隆1.1的基因组有效地移植进入山羊支原体宿主细胞。因此，选择该克隆用于从供体支原体转移基因组进入酵母宿主细胞。
c.肺炎支原体菌株M129-B170(ATCC 29343)
在准备转移肺炎支原体菌株M129-B170供体基因组进入酵母宿主细胞中，支原体用MiniTn-Puro-JCVI-1.7通过电穿孔转化，如在J.I.Glass等，PNAS USA 103，425(2006)中所描述的。在液体培养物中选择嘌呤霉素抗性转化体库。
iii.分离包含插入酵母载体的供体基因组
为了使断裂最小化，根据制造商建议的方案，使用低熔点琼脂糖和Bio-RadCHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)，在琼脂糖插块中分离包含酵母载体插入的供体基因组。包含具有插入的支原体基因组的琼脂糖插块对10mM Tris pH 8.0(在一些情况下用1mM EDTA)透析1小时。插块接着对10mM(6％)PEG 6000(United States Biochemical)、0.6M NaCl透析数小时，如在S.Katsura等，Electrophoresis 21，171(2000)中所描述的。对分离包含载体用于转移进入W303细胞的蕈状支原体LC基因组(见下面)，或对分离包含载体用于转移进入VL6-48N细胞的肺炎支原体基因组(见下面)，不进行该PEG/NaCl处理。
插块接着在65℃下熔解5分钟，其后添加2体积65℃TE并温和地搅动混合物，并且在65℃下进一步温育5分钟。使用20微升进行转化。
iv.将具有酵母载体的供体基因组转移入酵母宿主细胞
为了将供体基因组引入宿主细胞，使用N.Kouprina和V.Larionov，Nat Protoc3，371(2008)描述的公开方法，除了有时培养物生长至小于推荐的OD，用来自插块的DNA转化酵母原生质球。
使用该方法，将包含酵母载体插入物的所有三个基因组转化入被开发用于高转化效率的酵母菌株VL6-48N(V.Larionov等，PNAS USA 94，7384(1997))。具有插入物的生殖器支原体cl16-2和蕈状支原体LC cl1.1基因组也被转化入常用的W303a菌株(MATa his3 leu2 ura3 trp1 ade2)。具有插入物的蕈状支原体LC cl1.1基因组也被转移入重组-缺陷的酵母菌株，VL6-48-Δ54G，其是在RAD54基因中有缺陷的(MATahis3-Δ200 trp1-Al ura3-52 lys2 ade2-101 metl4 rad54-Δl::kanMX)。进行转化入VL6-48-Δ54G菌株以解决基因组在其他酵母中可能不稳定——由于在多个几乎相同的1.5kb IS1296拷贝之间的重组——的可能性。在RAD54基因中缺陷的酵母菌株可减少在酵母人工染色体(YACs)中许多重组事件的发生(Y.Le和M.J.Dobson，Nucleic Acids Res 25，1248(1997))。几乎与VL6-48N等基因的rad54突变体菌株是来自Vladimir Larionov(Laboratory of Molecular Pharmacology，National CancerInstitute，National Institutes of Health)的赠品。
v.分析和确认全基因组转移
分析来自每个转化酵母宿主细胞的DNA以确认包含完整宿主载体的供体基因组转移入宿主细胞。通过多重PCR(MPCR)筛选在酵母中克隆的支原体基因组以确认完整性。用来自Qiagen(Valencia，CA)的多重PCR试剂盒，使用1或2组、每组10个扩增子，使用来自IDT的引物，进行MPCR。各个反应在下面更详细地描述。
为了确认包含插入物的基因组的大小，通过凝胶电泳，从包含支原体基因组的单个酵母克隆中分离并分析总的DNA，如下面所描述。一般地，使用来自Bio-RadCHEF-DR III手册“制备琼脂糖包埋的酵母DNA”的方案分离DNA。其中指示，在恒压下预电泳插块数个小时以除去酵母染色体DNA。其中指示，为了增加该步骤的效率，插块首先用切割酵母染色体但是不识别在生殖器支原体或蕈状支原体LC中位点的AsiSI、Fsel和RsrII消化。分离的DNA进行限制消化(用指出的酶(一种或多种))，接着倒转电场(Bio-Rad FIGE Mapper)或脉冲场(Bio-Rad CHEF-DR II或III系统)电泳，如指示的，或通过在55℃下加热线性化1小时。其中指示，在凝胶上进行DNA印迹。如在D.G.Gibson等，Science 319，1215(2008)中的描述的，进行DNA印迹，除了在一些情况下——其中探针标记和探测使用具有CDP-Star的Amersham AlkPhos直接标记和探测系统(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。
a.从酵母宿主PCR分离和分析生殖器支原体基因组
来自将包含酵母载体的生殖器支原体cl16-2基因组转移到菌株VL6-48N之后回收的24个单独克隆的基因组DNA和来自将生殖器支原体转移入W303a菌株后回收的8个单独克隆的基因组DNA在琼脂糖插块中分离，并通过PCR分析以确认完整性。生殖器支原体合成基因组(sMgTARBAC37，如在(D.G.Gibson等，Science 319，1215(2008))中描述的生成)和天然生殖器支原体基因组用作阳性对照。
在下面表2中列出的PCR引物在MPCR反应中使用以生成扩增子，其围绕包含酵母载体插入物的生殖器支原体基因组均匀地隔开。沿着基因组长度的扩增子的位置显示在图4A中，其中扩增子用黑色线条指示且数字代表扩增子的大小。用于从在VL6-48N和W303中的克隆回收DNA的PCR的结果(数据未显示)总结在表5中。通过PCR分析(数据未显示)，从24个VL6-48N菌株分离的24个克隆中的二十二(22)个和从W303a菌株分离的8个克隆的5个表现完整(对于每个扩增子正确大小的产物)。
表2：生殖器支原体多重PCR引物序(组1)
Figure BPA00001462307600761
Figure BPA00001462307600771
大小分析
为了确认在来自VL6-48菌株的完整克隆中包含酵母载体的生殖器支原体cl16-2基因组是正确的大小，对通过MPCR认为完整的3个克隆(11、16和24)进行CHEF凝胶分析。对于该过程，使用来自Bio-Rad CHEF-DR III手册“制备琼脂糖包埋的酵母DNA”的方案在琼脂糖插块中从克隆中分离DNA。为了除去染色体DNA，插块在恒压下预电泳数个小时以除去酵母染色体DNA。为了提高该步骤的效率，插块首先用切割酵母染色体但是不识别在生殖器支原体中位点的AsiSI、Fsel和RsrII消化。
预电泳之后，用EagI或BssHII消化DNA。通过这些酶产生的具有载体插入物的生殖器支原体基因组的片段和它们的大小在图4A的图谱和图谱附近的栏中指出。消化的DNA通过倒转电场(Bio-Rad FIGE Mapper)凝胶电泳被分开。结果总结在表5中(凝胶未显示)。这三个克隆中的两个(11和16)是期望的大小。
为了确认在来自W303菌株的完整克隆中包含酵母载体的生殖器支原体cl16-2基因组是正确的大小，对5个完整的克隆进行CHEF凝胶分析。对于该过程，按上面对VL6-48N菌株的描述，在琼脂糖插块中分离来自这些克隆的DNA，在恒压下预电泳数个小时以去除酵母基因组，如上述。分离的DNA接着用EagI线性化。
通过脉冲场电泳分开样品。合成的sMgTARBAC37基因组(见上面)用NotI切割并用作阳性对照。结果总结在表5中(凝胶未显示)。5个克隆中的4个是期望的大小；克隆4包含大约300kb的额外的模糊条带。
b.通过PCR从酵母宿主分离和分析蕈状支原体cl1.1
如上述，通过多重PCR分析从将包含酵母载体插入物的蕈状支原体LC cI1.1基因组转移到菌株VL6-48N之后回收的48个单独克隆分离的基因组DNA，以确认完整性。使用来自Bio-Rad CHEF-DR III手册“制备琼脂糖包埋的酵母DNA”的方案在琼脂糖插块中从克隆中分离DNA。
设计在表3中列出的PCR引物，并用于生成扩增子以评价转移的蕈状支原体基因组的完整性。如在图5中显示的，扩增子位于IS1296元件的多数对之间，在图5中图解的具有插入物的基因组的图谱上由箭头指示。另外的230bp扩增子是酵母载体的HIS3标记区域。另一引物组(NSF1179/18和NSR1642/16；见表3)产生464bp的扩增子(酿酒酵母rDNA的区域)，并为了试验作为阳性对照。引物组和由此产生的扩增子的大小在表3中列出。
用多重PCR分析转化入Δ54重组-缺陷菌株中包含酵母载体插入物的蕈状支原体LC cI1.1基因组，获得类似的结果(凝胶未显示)。
多重PCR分析来自用包含酵母载体插入物的蕈状支原体LC cI1.1基因组转化的W303a细胞的DNA，显示15个克隆中的8个是完整的(凝胶未显示)。
表3：蕈状支原体LC多重PCR引物序列
Figure BPA00001462307600791
大小分析
为了确认在来自VL6-48菌株的完整克隆中包含酵母载体的蕈状支原体cI1.1基因组是正确的大小，对6个完整的克隆进行CHEF凝胶分析的DNA印迹分析，显示6个中的5个是正确的大小。
对用包含酵母载体的蕈状支原体cI1.1基因组转化VL6-48N菌株之后回收的这5个克隆中的3个如下进行CHEF凝胶分析：如上所述，在琼脂糖插块中从克隆(07、14和38)分离DNA，不用预电泳。分离的DNA用BssHII消化并接着通过脉冲场凝胶电泳(CHEF)分开。对于每个克隆，分析亲代克隆和3-4个亚克隆(凝胶结果未显示)。在分析中使用的标记和对照是：(1)低范围PFG标记(New England Biolabs，Ipswich，MA)；(2)酿酒酵母标记(Bio-Rad)；(3)VL6-48N(未消化的(3)和BssHII-消化的(4))；和蕈状支原体LC cI1.1(未消化的(5)和BssHII-消化的(6))。结果表明所有3个克隆为正确的大小并且稳定。
对用包含酵母载体插入物的蕈状支原体LC cI1.1基因组转化W303a细胞之后回收的8个完整克隆进行CHEF凝胶分析以确认大小。对于该过程，如上所述，在琼脂糖插块中从克隆分离DNA，如上所述使用预电泳以除去酵母基因组。DNA未处理(-)或者用BssHII消化(+)。DNA接着通过脉冲场凝胶电泳分开。电泳蕈状支原体LC cI1.1DNA作为阳性对照。结果总结在表5中(凝胶结果未显示)。结果表示8个克隆的每个包含正确大小的基因组。
c.通过PCR从酵母宿主分离和分析肺炎支原体
从将包含酵母载体的肺炎支原体基因组转移到菌株VL6-48N之后回收的20个单独克隆分离的基因组，如上所述通过多重PCR分析以确认完整性。进行两个不同的多重PCR。对于组1和组2的引物以及由此产生的扩增子的大小在表4中列出(凝胶结果未显示)。如在图4A中所显示，扩增子(用黑色线条和数字指示；里面：组1；外面：组2)围绕包含载体插入物的肺炎支原体基因组均匀地隔开。结果表明20个转化体的13个是完整的。
表4：肺炎支原体多重PCR引物序列
Figure BPA00001462307600801
Figure BPA00001462307600811
大小分析
对这些完整转化体的9个进行CHEF凝胶分析。对于该过程，使用来自Bio-RadCHEF-DR III手册“制备琼脂糖包埋的酵母DNA”的方案在琼脂糖插块中从这些克隆中分离DNA。为了除去染色体DNA，插块在恒压下预电泳数个小时以除去酵母染色体DNA。DNA接着用NotI或SbfI消化。通过这些酶产生的具有载体插入物的肺炎支原体基因组的片段(编号1-6)在图4B的图谱中指出，片段和它们的大小在图谱附近的栏中列出。
消化的DNA通过脉冲场电泳(Bio-Rad CHEF-DR II或III系统)分开。结果总结在表5中(凝胶结果未显示)。限制片段如在图4B中被编号。酵母克隆8未被完全消化(数据未显示)。
表5总结来自实施例1(A)的结果，其中包含整合的酵母载体的3个支原体基因组被转移入酵母。通过用1或2组、每组10个扩增子的多重PCR，筛选完整的克隆。通过限制消化和凝胶电泳，在一些情况下接着DNA印迹，测试克隆的大小。
表5：在酵母中克隆包含整合的酵母载体的3种支原体基因组
Figure BPA00001462307600821
Figure BPA00001462307600831
实施例IB
通过同源重组全基因组和酵母宿主载体将生殖器支原体基因细转移到酵母宿主细 胞
使用在图2B中描绘的方法，通过在宿主细胞中基因组与酵母载体的同源重组，将线性、生殖器支原体全基因组转移入酵母细胞。生殖器支原体基因组包含3个单切点限制位点，其中2个位于它的rRNA操纵子内。第三个位于tRNA编码序列的3’末端。因为可设计克隆以保存tRNA的完整性，通过同源重组插入载体靠近该AscI位点。
酵母克隆载体pARS-VN(在V.N.Noskov等，BMC Genomics 4，16(2003)中描述)用作PCR的模板，用一对引物，每个包含与在生殖器支原体基因组中插入位点侧翼的区域同源的60bp和与载体同源的20bp。通过IDT PAGE-纯化提供引物。它们的序列如下，载体序列为黑体，ClaI(第一引物)或XhoI(第二引物)位点为加下划线：
TTAATAACAAAAAAATCTCTATTAAAAAAACCAACTTTAAAGTTGGTTTGA
AATTCTAAA(SEQ ID NO：97)和
GGATAGAGTGTCTGGCTTCGGACCAGAAGGTTATGGGTTCAAGTCCTATTG
GGCGCGCCA
Figure BPA00001462307600833
(SEQ ID NO：98)。
利用这些引物的载体PCR扩增整个载体，除了单一(unique)ClaI和XhoI限制位点之间的9bp，产生6.5kb产物。
制备该线性载体DNA与来自生殖器支原体菌株MS5的DNA的混合物，用于共转化入酵母菌株VL6-48N原生质球。生殖器支原体DNA如下在琼脂糖插块中分离，以使断裂最小化。生殖器支原体基因组DNA在低熔点琼脂糖插块中从在SP-4培养基上生长的菌株MS5中以两批分离。用于第2批的培养物补充庆大霉素至200μg/ml。粘附细胞用PBS冲洗两次，接着刮入包含8.0mM HEPES、pH 7.4、272mM蔗糖和10％甘油的缓冲液中。每个插块包含来自大约6(第1批)或10(第2批)cm2融合细胞的DNA。为了溶胞，将在琼脂糖中的细胞在50℃下，在0.4MEDTA、0.4％N-月桂酰肌氨酸和2mg/ml蛋白酶K中温育过夜到2天之间的一段时间，接着更换缓冲液，并且在相同的条件下第二次处理相同的时间范围。插块对10mM Tris、50mM EDTA彻底透析，接着在补充PMSF至0.1mM的10mM Tris、50mM EDTA中透析2次，每次2小时，并接着在10mM Tris、50mM EDTA中再透析并储存在10mM Tris、50mM EDTA中。
转化之前，熔解插块并用琼脂糖酶消化，如下。第一批插块通过CHEF(Bio-Rad)电泳两次，其除去破碎的DNA，而保留完整的环状基因组(以增加插块中完整的环状基因组的频率)。在1％的脉冲场琼脂糖凝胶上，用0.5×TBE和50-90秒的转换时间进行第一电泳，超过20小时。在1％的低熔点凝胶上，用1×TAE和60-120秒的转换时间进行第二电泳，超过24小时。两个凝胶都在14℃下，以120°、6V/cm电泳。来自2批的每个的3个插块对无菌1×TAE彻底透析，在73℃下熔解数分钟，平衡至42°，接着用β-琼脂糖酶I(New England Biolabs，Ipswich，MA)消化1.5小时。每个体积的一半移至新的Eppendorf管中。转化之前，基因组用20U Ascl(在1×NEB缓冲液4中；New England Biolabs，Ipswich，MA)在37℃下消化过夜，其在意图与宿主载体重组的位点附近产生双链断裂，如在图6A中所图解的。
为了将供体基因组(通过与酵母载体共转化)引入宿主细胞，使用Kouprina和Larionov，Nat Protoc 3，371(2008)描述的公开方法，除了有时培养物生长至小于推荐的OD，用来自插块的DNA转化酵母原生质球。利用该公开的方法，如上述，酵母细胞悬浮在1M山梨糖醇中并在转化之前用ZymolyaseTM(β-1，3-葡聚糖昆布五糖裂解酶)处理以除去细胞壁。从琼脂糖插块中回收的DNA与原生质球一起温育。在生长培养基中回收之后，细胞铺板在选择性培养基中。
挑选克隆并通过多重PCR和凝胶电泳评估，如在上面实施例1A(v)(a)中所描述的，除了使用两组10个扩增子，而不是一组。用于生成第一组扩增子的引物在上面表2中列出。用于生成第二组扩增子的引物和由此产生的扩增子的大小在下面表6中列出。
表6：生殖器支原体多重PCR引物序列(第2组)
Figure BPA00001462307600841
用AscI-消化的DNA转化产生45个转化体。所有这些使用引物通过多重PCR检查，以产生20个扩增子，如上面所讨论的(表2、表6)。21个表现是完整的。通过CHEF凝胶的DNA印迹检查这21个转化体，且15个表现为正确大小。用未消化的生殖器支原体基因组转化产生50个转化体。所有这些通过相同的多重PCR检查，且7个表现是完整的。这些中的一个为正确大小。这些结果表明通过用限制酶在重组位点消化并与酵母宿主载体共转化，接着在酵母宿主细胞中通过体内重组，成功转移供体支原体全基因组。
实施例1C
在酵母宿主细胞中通过体内重组，装配基因组的重叠片段和酵母宿主载体， 将生殖器支原体基因组转移至酵母宿主细胞
该实施例描述了使用图解在图2C中的方法成功转移生殖器支原体供体基因组到酵母宿主细胞并在其中增殖。在该方法中，通过同源重组基因组的多个重叠片段，在宿主细胞(酵母)中装配基因组。
使用源于大肠杆菌BAC克隆的片段(piece)进行该策略(见Gibson等，Science319，1215(2008)，包括补充的在线材料；Gibson等，PNAS USA，(2008)105：20404-9；和美国专利申请，公开号12/247,126，发明人名字：Gibson等)。
在本研究中，使用上述公开的第一种方法(在Gibson等，Science 319，1215(2008)中描述的多阶段方法和补充的在线材料)，通过使用体外重组和使用BAC载体在大肠杆菌中克隆，通过三个阶段的装配，首先生成1/4基因组(每个大约144kb)，从6个片段(piece)装配合成的生殖器支原体基因组。这4个“1/4基因组”(1-4)在图6B中图解。
如在实施例1A中描述的，进行从宿主细胞中分离基因组DNA，不预电泳且不用酵母特异性酶消化来耗尽酵母基因组DNA。如上述，使用CHEF分析，分析样品。也进行DNA印迹(数据未显示)。
表7：用于分析使用重叠片段的同源重组转移到酵母细胞的生殖器支原体基因组的引物
Figure BPA00001462307600861
结果显示这些转化体的6个包含正确的序列。利用未消化的样品，只获得2个转化体，其中没有任何一个在PCR和DNA印迹分析中显示完整的生殖器支原体基因组。使用如上述相同的过程进行另一研究，除了四分之一3在该四分之一的单一BsmBI位点切割，而不是AscI消化。使用相同的转化和分析方法。用BsmBI消化的研究产生73个转化体，当通过PCR评价时其中44个是正确的。通过DNA印迹检查的28个这些克隆的五(5)个是正确的。这些结果显示当转化之前片段之一用限制酶切割时，用于将供体基因组转移入酵母宿主细胞的该方法(通过在宿主中体内重组重叠片段和载体)更加有效，这可能是由于在DNA末端更高效的同源重组(Orr-Weaver等，PNAS USA 78，6354(1981)。
实施例1D
构建携带2个供体支原体基因组(生殖器支原体和蕈状支原体)的二倍体酵母菌 株
该实施例描述了产生携带2个供体支原体基因组的二倍体酵母宿主菌株，所述2个供体支原体基因组通过描绘在图2A中的方法转移进入(见上面实施例1A)。对于该过程，2个单倍体菌株——每个携带1个基因组，如在D.C.Amberg等，酵 母遗传学中的方法：冷泉港实验室过程手册(Methods in Yeast Genetics：A Cold  Spring Harbor Laboratory Course Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，ed.2005，2005)，pp.230中所描述的，进行杂交(cross)。
包含生殖器支原体cI16-2的W303a菌株(交配型a)与包含蕈状支原体LCcI1.1的VL6-48菌株(交配型α)交配(见上面实施例1A和表1)。交配之前，如下，在生殖器支原体基因组中的HIS3标记用TRP标记置换，以允许在缺乏组氨酸和色氨酸的培养基上选择携带二种基因组的二倍体。
为了用TRP1置换HIS3标记，通过PCR从质粒pRS304(描述在Sikorski和Hieter，Genetics 122，19(1989)中，Genbank获取号：U03436.1，gi编号416305)扩增1059bpTRP1片段。使用具有下列序列的引物，从质粒扩增与生殖器支原体MS5 cI16-2同源的片段：
Figure BPA00001462307600871
Figure BPA00001462307600872
CAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACC(SEQ ID NO：131)和
Figure BPA00001462307600873
Figure BPA00001462307600874
ATCTGTGCGGTATTTCACACCGC(SEQ ID NO：132)。
在每个引物序列中，与生殖器支原体cI16-2序列同源的部分为黑体。使用Gietz等，Nucleic Acids Res 20，1425(1992)描述的技术，使用醋酸锂将1059bp片段转化入酵母。
通过用2条引物(序列：ATTATTCCATCATTAAAAGA(SEQ ID NO：133)和AGTCAAGTCCAGACTCCTGT(SEQ ID NO：134))扩增，确认HIS3被TRP1置换，利用该扩增当HIS3被TRP1置换时产生1207bp片段，当没有发生置换时产生927bp片段。结果显示正确置换。
置换之后，携带2个不同供体基因组的单倍体菌株如在D.C.Amberg等，酵 母遗传学中的方法：冷泉港实验室过程手册(Methods in Yeast Genetics：A Cold  Spring Harbor Laboratory Course Manual)(Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，ed.2005，2005)，pp.230中所描述的，进行杂交。杂交之后，使用来自Bio-Rad CHEF-DR III手册“制备琼脂糖包埋的酵母DNA”的方案，在琼脂糖插块中从单独的克隆中分离DNA。琼脂糖插块在恒压下预电泳数个小时以除去酵母染色体DNA。分离的DNA通过在55℃下加热1小时进行线性化；对照样品不加热(数据未显示)。结果表明在该研究中生成的5个二倍体中的全部5个包含生殖器支原体和蕈状支原体基因组二者，证实成功生成了包含不同种的2个全供体支原体基因组的二倍体酵母宿主细胞。
实施例1E
在不存在ARS序列情况下在酵母宿主细胞中保留支原体供体基因组。
如通过Gibson等，Science 319，1215(2008)描述和在上面实施例1C中描述生成的合成生殖器支原体基因组中的酵母载体，从它在RNaseP基因中的初始位点被转移至在MG411中的新位点，以便不中断必需基因。对于该过程，包含如在上面实施例1C中描述的合成生殖器支原体的酵母克隆与两(2)个片段被共转化。长1842bp的第一片段，使包含URA3、GAL1启动子和着丝粒的酵母载体序列插入MG411中。通过PCR使用具有下列序列的引物生成该片段：
Figure BPA00001462307600881
Figure BPA00001462307600882
GCGGCCGCTTGATTTCGGTTTCTTTGAAAT(SEQ ID NO：135)
和
Figure BPA00001462307600883
Figure BPA00001462307600884
GCGGCCGCGGGTCCTTTTCATCACGTG(SEQ ID NO：136)(生殖器支原体序列为黑体；NotI位点加下划线)。用于该PCR的模板是具有在SEQ ID NO：137中提供的序列的构建体(表8)。
表8.用于生成酵母载体序列的PCR模板的序列
TTGATTTCGGTTTCTTTGAAATTTTTTTGATTCGGTAATCTCCGAACAGAAGGAAGAACGAAGGAAGGAGCACAGACTTAGATTGGTATATATACGCATATGTAGTGTTGAAGAAACATGAAATTGCCCAGTATTCTTAACCCAACTGCACAGAACAAAAACCTGCAGGAAACGAAGATAAATCATGTCGAAAGCTACATATAAGGAACGTGCTGCTACTCATCCTAGTCCTGTTGCTGCCAAGCTATTTAATATCATGCACGAAAAGCAAACAAACTTGTGTGCTTCATTGGATGTTCGTACCACCAAGGAATTACTGGAGTTAGTTGAAGCATTAGGTCCCAAAATTTGTTTACTAAAAACACATGTGGATATCTTGACTGATTTTTCCATGGAGGGCACAGTTAAGCCGCTAAAGGCATTATCCGCCAAGTACAATTTTTTACTCTTCGAAGACAGAAAATTTGCTGACATTGGTAATACAGTCAAATTGCAGTACTCTGCGGGTGTATACAGAATAGCAGAATGGGCAGACATTACGAATGCACACGGTGTGGTGGGCCCAGGTATTGTTAGCGGTTTGAAGCAGGCGGCAGAAGAAGTAACAAAGGAACCTAGAGGCCTTTTGATGTTAGCAGAATTGTCATGCAAGGGCTCCCTATCTACTGGAGAATATACTAAGGGTACTGTTGACATTGCGAAGAGCGACAAAGATTTTGTTATCGGCTTTATTGCTCAAAGAGACATGGGTGGAAGAGATGAAGGTTACGATTGGTTGATTATGACACCCGGTGTGGGTTTAGATGACAAGGGAGACGCATTGGGTCAACAGTATAGAACCGTGGATGATGTGGTCTCTACAGGATCTGACATTATTATTGTTGGAAGAGGACTATTTGCAAAGGGAAGGGATGCTAAGGTAGAGGGTGAACGTTACAGAAAAGCAGGCTGGGAAGCATATTTGAGAAGATGCGGCCAGCAAAACTAAAAAACTGTATTATAAGTAAATGCATGTATACTAAACTCACAAATTAGAGCTTCAATTTAATTATATCAGTTATTACCCACGGATTAGAAGCCGCCGAGCGGGTGACAGCCCTCCGAAGGAAGACTCTCCTCCGTGCGTCCTCGTCCTCACCGGTCGCGTTCCTGAAACGCAGATGTGCCTCGCGCCGCACTGCTCCGAACAATAAAGATTCTACAATACTAGCTTTTATGGTTATGAAGAGGAAAAATTGGCAGTAACCTGGCCCCACAAACCTTCAAATGAACGAATCAAATTAACAACCATAGGATGATAATGCGATTAGTTTTTTAGCCTTATTTCTGGGGTAATTAATCAGCGAAGCGATGATTTTTGATCTATTAACAGATATATAAATGCAAAAACTGCATTAACCACTTTAACTAATACTTTCAACATTTTCGGTTTGTATTACTTCTTATTCAAATGTAATAAAAGTATCAACAAAAAATTGTTAATATACCTCTATACTTTAACGTCAAGGAGAAAAAACCGGCCTGAGAGCAGGAAGAGCAAGATAAAAGGTAGTATTTGTTGGCGATCCCCCTAGAGTCTTTTACATCTTCGGAAAACAAAAACTATTTTTTCTTTAATTTCTTTTTTTACTTTCTATTTTTAATTTATATATTTATATTAAAAAATTTAAATTATAATTATTTTTATAGCACGTGATGAAAAGGACCC(SEQ IDNO：137)
第二片段长302bp，具有下列序列：
TTAAAGTCAGTTATTTATCTACAGCAATTGCTGTCATTACTTTAATTATTTGTTCTTAAAGCAACATTCCCTTACCAAAATTTAGGTTTCTTGCTTGTGGAGTTTACCGCGTTTCATACCTGGTTTTCACCAAGCTCGTCTCTGTGGCACTTTCAAAACATCATCATAGTATTAACCTTAGACTAGTTATGTCGTTATGGCTATCACATCCTAAATCTTATCGCTTTGATTTACACAAACACTACTTGCATTCCAGCAAGTGCAAGCATGGACTTTCCTCTACTTTAAATATATCTTTAAAG(SEQ ID NO：138)。该片段用于用生殖器支原体序列置换RNaseP中酵母载体插入，以便恢复该基因的编码区域。利用具有下列序列的引物通过PCR从生殖器支原体DNA生成该片段：TTAAAGTCAGTTATTTATCTACAGC(SEQ ID NO：139)和CTTTAAAGATATATTTAAAGTAGAGG(SEQ ID NO：140)。
共转化之前，将TRP1插入MG411，如下：使用具有下列序列的2条引物，从质粒pRS304(Genbank获取号U03436.1，gi number 416305)扩增具有与MG411同源性的1177bp TRP1基因片段：
Figure BPA00001462307600901
Figure BPA00001462307600902
CAGAGCAGATTGTACTGAGA(SEQ ID NO：141)和
Figure BPA00001462307600903
Figure BPA00001462307600904
ATCTGTGCGGTATTTCA(SEQ ID NO：142)。在每条引物中，与生殖器支原体基因组同源的部分以黑体列出。通过PCR，使用一组引物(序列GCCATTGTTTCACTAATTGC(SEQ ID NO：143)和TAATCCTATCTTTGGAGCTT(SEQ ID NO：144))，确认TRP1基因插入，所述PCR扩增1739bp(如果发生插入)和680bp——如果没有插入。选择为His-Trp-Ura+的共转化体。通过PCR扩增513bp的产物，使用具有下列序列的引物，确认RNaseP的恢复：CTCCATCATGCGCAGTAATA(SEQ ID NO：145)和CTTTAAAGATATATTTAAAGTAGAGG(SEQ ID NO：146)。通过PCR扩增1841bp的产物，使用具有下列序列的引物，确认TRP1被酵母载体置换：TTGATTTCGGTTTCTTTGAA(SEQ ID NO：147)和CAGGCAGGAATTTGATTCCC(SEQ ID NO：148)。
插入新位点的载体不包含ARS。这些研究的结果证实，包含生殖器支原体供体基因组的载体保留在酵母宿主细胞中不需要存在ARS序列。生殖器支原体富含AT并因此可能包含起到酵母中ARS作用的序列。ARS样序列在真核富含AT的DNA中时常发生(见Montiel等，Nucleic Acids Res 12，1049(1984)；Stinchcomb等，PNAS USA 77，4559(1980))。
总的来说，在该实施例中描述的研究证实，使用提供的方法，将3种不同的供体支原体全基因组(最大的大小是1.1MB)成功转移到酵母宿主细胞中，并在酵母宿主细胞中增殖并保留。在每个情况下，回收全部克隆并未检测到不稳定迹象。另外，在几个研究中，通过DNA印迹，回收并检测到大约2MB大的分子。这些分子可能代表多联体的克隆并显示提供的方法可用于克隆和转移更大基因组和核酸分子进入酵母宿主细胞。这类方法可用于生成包含供体基因组的宿主细胞，供体基因组接着可在宿主细胞中增殖和修饰并使用提供的方法移植进入受体细胞。
实施例1F
在酵母中增殖期间蕈状支原体MCpMmyc1.1基因组的稳定性和评估
评价蕈状支原体MCpMmyc1.1基因组在酵母中增殖期间的稳定性。图18A提供YCpMmyc1.1基因组的示意图并显示整合YCp的位置。在PCR扩增中使用的九(9)个单独的引物在基因组中它们近似的位置处显示并相应于图18B中的扩增子编号。通过2种方法检测肺炎支原体基因组在酵母中增殖期间的稳定性。在第一种中，包含基因组的克隆的酵母培养物铺板到缺乏组氨酸的固体合成培养基上两天，然后将单独的集落拼凑(patch)到新的平板上。在第二种中，包含基因组的克隆的酵母培养物生长至饱和，稀释至1/100分数并再次生长至饱和。培养物接着铺板到缺乏组氨酸的固体合成培养基上两天，并接着将单独的集落拼凑到新的平板上。在两种方法中，分离基因组DNA并在使用图18A中显示的9个单独的引物对的多重PCR扩增中用作模板。通过凝胶电泳分析所得的扩增子。在凝胶右侧的数字对应显示在图18B中的单独的引物对扩增子。泳道G是阳性对照而泳道N是没有基因组的阴性对照。分子量标记在泳道M中示出。显示的结果代表40个分析样品。所有40个克隆表现包含完整基因组，表明细菌基因组在酵母中在常规增殖期间是稳定的(图18B)。
评估在酵母中在III型限制酶基因组操作的蕈状支原体YCP基因组。蕈状支原体YCpmyc1.1基因组的示意图显示在图18C中；显示整合YCp的位置。在PCR扩增中使用的9个单独的引物对在基因组中它们近似的位置处显示并对应扩增子编号(凝胶结果未显示)。图18C中的对角线表示在克隆3中缺失的扩增子(凝胶结果未显示)。用包含URA3的盒转化蕈状支原体YCpMmyc1.1酵母克隆之后，通过多重PCR评估Ura+克隆的基因组，且通过凝胶电泳分析所得扩增子(凝胶结果未显示)。在克隆3中缺失扩增子5到8，提示在该基因组中有大的缺失。另外4个克隆表现出包含完整的基因组。
实施例2
移植在酵母宿主细胞中增殖的支原体供体全基因组进入支原体受体细胞
提供了用于转移大核酸比如基因组的方法，所述大核酸在不同生物和细胞类型(比如，供体、宿主和受体)之间转移，其可以是不同种、界和/或目的(例如不同的细菌种和细菌对真核酵母细胞)。因此，在一些实施方式中，该方法包括用于克服不同细胞类型之间潜在不相容性的步骤，比如用于成功地将已经在宿主细胞中增殖的供体基因组移植入受体细胞。
下面实施例2A描述了使用所提供的方法成功地将已经在酵母宿主细胞中增殖的全供体基因组(蕈状支原体LC(Genbank获取NZ_AAZK00000000.1(GI：149364883)移植入不同(山羊支原体)种的受体细胞。该实施例描述了分析这3种不同生物(供体、宿主和受体)之间的差异并开发可使用所提供的方法用来克服这些差异的各种方法。
实施例2B表明可从酵母宿主细胞中回收足够量纯化的、完整供体支原体基因组DNA，用于移植入受体细胞。实施例2C表明所提供的用于移植天然细菌供体基因组进入受体细胞的移植方法具有高效率。实施例2D描述了评估宿主和受体细胞中的限制-修饰系统(酵母中不存在)，并评估甲基转移酶(其在酵母中表达)表达和甲基转移酶对供体基因组和活化的影响。实施例2E描述了在所提供方法中使用的处理以克服与限制-修饰(R-M)系统相关的宿主-供体-受体不相容性问题。实施例2F描述了突变受体细胞的R-M系统，和实施例2G表明成功地将供体基因组(从支原体转移到酵母宿主细胞)从酵母宿主细胞中移植到不同种的受体细菌。
实施例2A
细菌菌株、培养物条件和载体
为了在该实施例和下面实施例3中描述的研究，大肠杆菌DH10B[F--mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ(ara，leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG](Invitrogen，Carlsbad，CA)用作克隆过程和质粒增殖的宿主菌株。大肠杆菌细胞在37℃下，在Luria-Bertani(LB)肉汤培养基或在LB琼脂中生长。根据在给定质粒中存在的选择标记，大肠杆菌转化体在补充有50μg/ml氨苄青霉素、5μg/ml四环素或125μg/ml嘌呤霉素的LB培养基中生长。
在该实施例和下面实施例3描述的研究中使用2种支原体种类：山羊支原体亚种capricolum(菌株California KidTM)(ATCC 27343)和蕈状支原体亚种Mycoides(菌株GM12)(Damassa等，1983；上述)。支原体细胞在37℃下，在包含17％胎牛血清(Invitrogen，Carlsbad，CA)的液体或固体SP4培养基中生长(Tully等1977)。用质粒或全-基因组转换的支原体在37℃下，在补充有5μg/ml四环素或8μg/ml嘌呤霉素的SP4培养基中生长。通过将支原体铺板在包含150μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal，Promega，Madison，WI)的固体培养基上检测β-半乳糖苷酶活性。
在下面实施例中2种山羊支原体亚种capricolum(山羊支原体)菌株用作受体细胞：野生型(wt)山羊支原体和通过在野生型山羊支原体中失活CCATC-限制酶基因获得的无限制的山羊支原体突变体(山羊支原体-ΔRE)(描述在下面实施例2F中)。用于移植的供体基因组DNA来自蕈状支原体亚种mycoides LC(蕈状支原体LC)克隆(cl1.1)，描述在上面实施例1中，其基因组包含四环素抗性标记、lacZ基因和整合在ORF04334(lppA)和ORF04335(IS1296的转座酶B)之间的酵母着丝粒质粒。如下面详细描述，或者直接从蕈状支原体LC细胞克隆1.1(天然基因组DNA)或从在上面实施例1所描述生成的携带蕈状支原体克隆1.1基因组的酵母宿主细胞，在琼脂糖插块中制备支原体基因组DNA。
在下面实施例中使用的一些载体源于oriC质粒，其能够在蕈状支原体LC(pMYCO1(SEQ ID NO：149))和在山羊支原体(pMYCO1(SEQ ID NO：149)；pSD4(SEQ ID NO：150))中复制(Lartigue等，Nucleic Acids Res 31，6610(2003))。那些质粒基于pBS(+)质粒(Stratagene)并包含通过螺旋素启动子驱动的自转座子Tn916的tetM基因，作为抗性标记(Lartigue等，Plasmid 48，149(2002)。限制缓冲液来自New England Biolabs，Ipswich，MA。
实施例2B
从宿主酵母细胞中分离蕈状支原体LC供体基因组，确认回收的全基因组DNA 的数量并开发移植方法
为了从酵母细胞分离完整支原体供体基因组并进行分析，将已经用蕈状支原体大集落(蕈状支原体LC)GM12克隆1.1基因组转化的酵母W303细胞——如在上面实施例1A(ii)b和1A(iv)中所描述——包埋在琼脂糖插块中，如下面所描述的。该基因组携带四环素抗性基因(tetM)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)。从插块分离DNA并评估。不携带供体基因组的天然酵母的基因组DNA和分离的天然供体支原体细胞以类似的方式评估，用于对比。
i.包含供体基因组的酵母琼脂糖插块
酵母培养物在30℃下，在选择性培养基中生长直到OD600达到大约1.5。使用来自Bio-Rad Laboratories(Valencia，CA)的CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒，按照制造商建议的方案和下面的细节/改进，将酵母细胞包埋在琼脂糖插块中，并从该插块分离DNA。为了增加每个插块中可得的蕈状支原体LC基因组DNA的量，使用每mL待制备的插块6×109个酵母细胞(而不是6×108个细胞)，以产生6×108个细胞每插块。包埋在插块中之后，不是用溶细胞酶(Bio-Rad Laboratories)处理，而是使用ZymolyaseTM 100T酶(USB Corporation，Cleveland，OH)消化以消化酵母细胞壁。该酶以5mg/mL的浓度添加到插块的里面或外面；使混合物在37℃下放置2小时。在1×TE缓冲液(20mM Tris-HCL pH 8；50mM EDTA)中漂洗之后，使用与补充有每ml插块200μl蛋白酶K的蛋白酶K反应缓冲液(100mM EDTA；0.2％脱氧胆酸钠；1％月桂酰肌氨酸钠；pH 8.0)在50℃下温育2次，每次24小时，裂解包埋的酵母细胞(原生质球)和降解蛋白质。琼脂糖插块接着在室温下在1×TE缓冲液(20mM Tris-HCL pH 8；50mM EDTA)中漂洗4此，每次1小时，伴随搅拌，并在4℃下保存在相同的缓冲液中。对于将被用限制酶消化的酵母插块(见下面)，在第二次漂洗期间添加终浓度1mM的苯甲基磺酰氟(PMSF)。
制备携带蕈状支原体LC基因组DNA的酵母琼脂糖插块和包含对照酵母DNA的那些，使用来自Bio-Rad(Valencia，CA)的CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒分析。为包含供体基因组的酵母(A2、B2和C2)和为天然酵母(A1、B1和C1)制造一系列3个琼脂糖插块(A、B和C)。插块在室温下在1mL 1×TE缓冲液中漂洗2次1小时，并在室温下1mL补充有BSA(100μg/mL)的1×NEB缓冲液2中平衡1小时。
为了除去内源酵母基因组DNA(其与在下面描述的CHEF凝胶分析中与蕈状支原体LC基因组DNA迁移在相似的位置)，插块B和C(对于每组酵母)在37℃下，在500μL反应体积中与50单位AsiSI、RsrII和Fsel限制酶(New England Biolabs)一起温育过夜，所述限制酶特异性切割酵母基因组DNA并保持供体DNA完整。在相同的条件下，将插块A与这些酶一起温育。所有3个插块接着在室温下在1×TE缓冲液中漂洗1小时并加样到1％TAE琼脂糖凝胶(120分钟、120伏特)中，以从插块中移出消化的酵母基因组DNA片段。
迁移之后，琼脂糖插块从加样孔中除去并在1mL 0.1×TE缓冲液中漂洗两次1小时，并在1mL补充有BSA(100μg/mL)的1×NEB缓冲液2(New England Biolabs，Ipswich，MA)中平衡1小时。为了线性化蕈状支原体LC基因组DNA，允许DNA进入凝胶，插块C在37℃下与50单位PspXI限制酶一起温育。插块A和B(对于每组酵母)在相同的条件下不加酶温育用于模拟-消化(mock-digestion)。温育之后，所有插块在室温下用1mL 1×TE缓冲液漂洗1小时，并加样至脉冲场凝胶。
ii.天然蕈状支原体LC琼脂糖插块
为了比较回收DNA的量，使用来自Bio-Rad(Valencia，CA)CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒，也从蕈状支原体细胞中制备包含不同量的基因组DNA的天然供体蕈状支原体LC琼脂糖插块。如Lartigue等，Science 317，632(2007)所描述的——具有一些改进、特别是分离之前细胞培养的方式，进行从蕈状支原体LC中分离完整的全基因组DNA。五百(500)mL蕈状支原体LC(tetM、lacZ、YCp)细胞在补充有10μg/μl四环素和10μg/μl链霉素的SP4培养基中生长，直到培养基的pH达到6.5(大约109个细胞/mL)。收集细胞之前，添加100μg/μl氯霉素至培养基，且在37℃，该细胞浓度下温育细胞另外90分钟，以便使正在进行的染色体复制轮次同步，并抑制下一轮的复制。
在10mM Tris pH 6.5、0.5M蔗糖中漂洗细胞一次，并重悬浮在2mL相同的缓冲液中。从该细胞悬浮液中，通过2倍系列稀释蕈状支原体LC细胞，制备8系列(级数，seires)蕈状支原体LC基因组DNA(MLC gDNA)琼脂糖插块。来自系列1的插块每插块大约包含1010个天然蕈状支原体LC细胞；来自系列7的插块每插块大约包含1.5x108个；和来自系列8的插块每插块大约包含7x107个。为了比较来自酵母的基因组DNA，用PspXI消化包含天然DNA的插块和包含从酵母中分离的蕈状支原体LC基因组DNA的插块(见上面)，以使MLC基因组线性化，如上所述，用于在脉冲场凝胶上分析。
iii.在脉冲场凝胶上比较回收的基因组DNA
通过比较在琼脂糖插块中从酵母细胞中分离的基因组DNA的量与在琼脂糖插块中从2倍系列稀释的蕈状支原体LC细胞中分离的天然基因组DNA的许多量，估计在酵母细胞中蕈状支原体LC基因组DNA的量。对于该过程，酵母琼脂糖插块(实施例2B(i)，插块A1、B1和C1和A2、B2和C2)和八个蕈状支原体LC琼脂糖插块(实施例2B(ii))在TAE 1X中1％验证的脉冲场琼脂糖凝胶(Bio-Rad，Valencia，CA)中，用钳位均匀电场(Chu等，Science 234，1582(1986))(CHEF DR III；Bio-Rad)进行电泳。脉冲时间从60缓升到120秒，在4.5V/cm下27小时。迁移之后，用SYBR
Figure BPA00001462307600951
GOLD核酸染色剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)(1/10,000稀释)染色凝胶，且PFGE图案用GE Typhoon 9410图像仪扫描。酿酒酵母CHEF DNA大小标记用于评估DNA大小；该标记包含酿酒酵母染色体并用于量在0.2-2.2Mb范围的大小。
具有插块A2-C2(来自包含蕈状支原体供体基因组的酵母)和A1-C1(天然酵母)(实施例2B(i))的泳道和标记泳道一起在凝胶上电泳。插块(组7和8)包含增加浓度的蕈状支原体天然DNA(实施例2B(ii))。在某些泳道中脉冲场凝胶的期望位置处检测到1.12Mb蕈状支原体LC基因组。在包含蕈状支原体供体基因组的酵母宿主细胞中，用酶混合物(AMSI、RsrII、FseI限制酶)选择消化酵母基因组DNA，接着电泳(样品B2和C2；见上面实施例2B(i))提高了蕈状支原体供体基因组DNA的回收(数据未显示)。此外，线性化蕈状支原体LC基因组(C2)大大提高了1.2Mb蕈状支原体(CT)的回收。在来自天然(野生型)不包含蕈状支原体基因组(B1、C1)的酵母细胞的平行样品中，没有检测到1.2Mb带，证实在1.2Mb的带的确代表在酵母中细胞中存在蕈状支原体基因组。在包含天然蕈状支原体基因组DNA的泳道中出现相同的带。
从酵母细胞中回收的蕈状支原体LC基因组DNA的量与从天然蕈状支原体LC基因组DNA标准品——其也如上述用PspXI处理——的量进行比较。从6×108个酵母细胞获得的蕈状支原体LC基因组DNA的量与从来自系列7的天然蕈状支原体LC插块(每插块大约1.5×108个天然蕈状支原体LC细胞)回收的基因组DNA的量相似。
iv.量化回收的DNA
UV分光光度计用于测定从天然蕈状支原体细胞制备的在熔解插块中存在的天然蕈状支原体LC基因组DNA的量，如在实施例2B(ii)中描述的。结果在下面表9中列出。如在该表中所显示的，来自系列7的插块包含大约12ng/μl蕈状支原体LC基因组DNA(每100μL插块1.2μg)。如上所记录的，脉冲场凝胶在具有该样品(7)的泳道和包含从酵母样品(C2)(见上面实施例2B(iii))回收的DNA的泳道中显示相当的1.2Mb带强度。因此，确定从包含供体基因组的宿主细胞中回收的每100μL插块中蕈状支原体LC基因组DNA的量大致等于1μg。
表9：天然蕈状支原体LC基因组DNA的量化和移植
Figure BPA00001462307600971
实施例2C
移植从插块中回收的DNA进入受体细胞
对于来自熔解的天然蕈状支原体LC琼脂糖插块(实施例2B(iv)；表9)系列的每个样品，将1/5的插块(20μL)移植进入山羊支原体受体细胞，其使用与Lartigue等，Science 317，632(2007)描述的类似的方案，具有一些改进，如下：
i.培养物和制备受体细胞
六(6)mL山羊支原体受体细胞在补充有胎牛血清(17％)、葡萄糖(10g/L)、2ml苯酚红(1％)和100μl青霉素G(5mg/ml))的SOB(+)培养基(Bacto SOB培养基(Becton Dickinson；Franklin Lakes，NJ))中生长，直到培养物的pH达到pH 5.7到5.85(大约5×107个细胞/ml)。受体细胞在10℃下，以4575g离心15分钟，在S/T缓冲液中(10mM Tris-HCl、pH 6.5；和250mM NaCl)漂洗一次，重悬浮在200μlCaCl2(0.1M)中，并在冰上温育30分钟。
ii.在琼脂糖插块中制备分离的供体基因组DNA
移植之前，包含蕈状支原体LC基因组DNA的琼脂糖插块(系列1-7)在室温下温和的搅动，在0.1×TE缓冲液[2mM TRIS-HCl、pH 8.0，5mM EDTA]中漂洗2次，每次30分钟。完全除去缓冲液并在65℃下，用1/10体积的10×β-琼脂糖酶缓冲液[10mM Bis Tris-HCl pH 6.5；1mM Na2EDTA]熔解琼脂糖插块10分钟。熔解的琼脂糖冷却至42℃，持续10分钟，并在该温度下，每100μl插块与3单位的β-琼脂糖酶I(New England Biolabs，Ipswich，MA)一起温育过夜。
iii.使用5％PEG移植
在冰上30分钟之后，200μl受体细胞与400μl包含20μl熔解供体基因组DNA的琼脂糖插块(1/5的插块)——如在上面实施例2B(ii)中生成——的SP4(-)培养基[0％胎牛血清、0.45％NaCl]温和地混合。如下面，刚好在进行下一步骤之前，添加插块。
等体积(620μl)的2×融合缓冲液(20mM Tris-HCl pH 6.5、250mM NaCl、20mMMgCl2、10％Fluka PEG-6000(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))立即添加到SP4(-)、基因组DNA和细胞的混合物中，并通过温和地摇动管30秒使混合物均匀。在37℃下，50分钟之后，添加5ml预暖的SP4并温和地混合细胞。在37℃下，另3小时之后，在10℃下，以4,575g离心细胞15分钟，重悬浮在0.6ml SP4中并铺板在包含4μg/ml四环素和150μg/ml X-gal的SP4平板上。3-4天之后，挑选单独的集落，并在包含10μg/ml四环素的肉汤培养基中生长。
结果在上面表9中提供，其表明回收的转化体(具有供体DNA的受体细胞集落)的数量相对在移植反应中存在的天然蕈状支原体LC基因组DNA的量呈成比例地增加。在检测的最高DNA浓度(系列8)下观察到转化体的数量降低。用200ng基因组DNA获得三十(30)个转化体。在随后使用该方法的实验中，每1μg天然蕈状支原体LC供体基因组DNA通常获得大约200个转化体集落。这些数据表明该方案的效率是足够高的，从酵母宿主细胞中获得的供体蕈状支原体LC DNA的数量在使用该方法的基因组移植中不是限制性因素。
通过在溶液中将20μL熔解的琼脂糖插块替换为10μg质粒DNA，上述移植方法还可用于用质粒DNA(不在琼脂糖插块中)转化山羊支原体受体细胞。
实施例2D
评估限制-修饰(R-M)系统
因为供体细胞、宿主细胞和受体细胞之间限制-修饰系统的不同可能导致基因组移植困难，所以研究这些系统。该实施例说明了在本文移植中使用的一些支原体细胞中存在和活化的限制-修饰系统的组分，并说明了所提供的方法的一些方面用于破坏(subvert)这些系统以成功移植。
i.鉴定在供体和受体细胞中的预测R-M系统
预测已经被测序的蕈状支原体LC基因组(Genbank获取号：NZ_AAZK00000000；GI：149364883)包含6个不同的限制-修饰系统(5个II型系统和1个III型系统)。山羊支原体基因组序列显示存在1个II型系统。从该基因序列(Dr.R.Roberts，私人信件)预测II型酶识别位点特异性，如在Roberts RJ等，Nucleic Acids Res.35(数据库刊)：D269-70(2007)中所描述生物。还参见REBASE，限制酶数据库，可在万维网地址：rebase.neb.com/rebase/rebase.html获取。这些识别位点和商业上可得的在这些位点切割的限制酶在下面表10中列出。III型系统的特异性没有预测。
表10：从山羊支原体和蕈状支原体LC序列预测的限制-修饰(R-M)系统
Figure BPA00001462307600991
ii.R-M系统的确认
a.限制位点的甲基化状态
使用商业上可得的相应于预测的II型限制酶系统的限制酶同切点酶确认蕈状支原体LC和山羊支原体的天然基因组在列在表10中的预测位点处被甲基化。用同切点酶消化蕈状支原体LC和山羊支原体基因组DNA指示，天然基因组DNA在预测的位点处被甲基化(数据未显示)。这些结果显示山羊支原体和蕈状支原体LC二者都包含CCATC限制修饰系统。
为了该研究，使用Wizard
Figure BPA00001462307600992
基因组DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，WI)，按照制造商的说明书，纯化来自蕈状支原体LC和山羊支原体的基因组DNA。如制造商(New England Biolabs，Ipswich，MA)描述的，将大约各自1μg的蕈状支原体LC和山羊支原体基因组DNA分别与BccI、HinfI、HpyAV、MboI和SfaNI温育。接着通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA(数据未显示)。
如基于预测的R-M系统(见表10)所预期的，蕈状支原体LC基因组DNA抗所有测试的5种限制酶同切点酶的切割，表明DNA在这些的每个位点处被甲基化。另一方面，山羊支原体基因组DNA只抗限制酶同切点酶(BccI)的切割，该限制修饰系统在两个生物中都被鉴定。这些结果确认这些各自R-M系统(表10)在支原体种类中存在，并显示例如蕈状支原体LC和山羊支原体二者都包含CCATC限制修饰系统。
相应于来自山羊支原体预测的限制酶系统的商用限制酶同切点酶的可得性使得我们可测试2个基因组是否在合适的限制位点处被甲基化。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒纯化来自蕈状支原体和山羊支原体的基因组DNA。将各自大约1μg的蕈状支原体和山羊支原体基因组与BccI温育。接着通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA。如预期的，蕈状支原体和山羊支原体基因组DNA二者都抗BccI的切割，所述BccI是相应于2个生物的同源R-M系统的酶(数据未显示)。
b.限制酶活性
从蕈状支原体LC和山羊支原体制备无细胞提取物，以表明在两个种类中限制酶是活化的。如下面所描述，提取物被用在限制酶试验中，以测试它们切割蕈状支原体LC、山羊支原体和生殖器支原体基因组DNA的能力。
c.制备细胞提取物
对于蕈状支原体LC，1升在SP4培养基中的细胞培养物在37℃下生长，直到达到6.2-6.3的pH。通过将细胞分成5个200mL的部分并在4℃下在SLA-1500Sorvall转子中以5,000×g离心15分钟，收获培养物。每个蕈状支原体LC沉淀物接着用200mL 8mM的Hepes，pH 7.4和272mM的蔗糖漂洗，在4℃下在SLA-1500Sorvall转子中以5,000×g离心15分钟。每个所得沉淀物重悬浮在1ml提取缓冲液中(20mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1mM EDTA、150mM NaCl、1mM DTT和10％甘油)，并随后使用输出控制(output control)为3的探头(microtip)在冰上超声处理5次，10-12秒脉冲(brust)。通过在4℃下，以18,000×g微量离心30分钟，使每个溶液澄清。组合每个所得的可溶部分，测试蛋白浓度，等分成200μl部分，并在-80℃下保存。以该方式制备的提取物的蛋白浓度范围典型地从15到25mg/ml。
对于山羊支原体，除了1升培养物在包含10μg/ml四环素的SP4培养基中生长，使用与对蕈状支原体LC描述的相同方法制备提取物。
d.限制酶活性鉴定
蕈状支原体LC提取物的限制酶活性如下测定。使用WIZARD
Figure BPA00001462307601001
基因组DNA纯化试剂盒(Promega Corporation，Madison，WI)单独地在各自反应中，从山羊支原体、蕈状支原体LC和生殖器支原体分离的两(2)μg基因组DNA，在37℃下，在总体积100μl的1×NEB限制酶缓冲液4加100μM脱氧核苷酸与8μg提取物中温育。最后，以0、5、10和15分钟时间间隔添加蛋白，移出20μl等分试样，并添加到20μl 2×终止缓冲液(2％SDS、20mM EDTA)中。用40μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取溶液并在室温下以18,000×g离心2分钟。水相放入具有4μl的10×蓝汁(BlueJuice)(Invitrogen，Carlsbad，CA)的新管中，并加样18μl的每个溶液到0.8％1×TAE琼脂糖凝胶并在120V、0.1-0.6线性和80V、0.1-0.6线性的FIGE条件下电泳16小时。琼脂糖凝胶接着用SYBR
Figure BPA00001462307601011
GOLD核酸染色剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)(1/10,000稀释)染色30分钟，并用GE Typhoon 9410图像仪扫描。
除了在每个反应中使用1×NEB限制酶缓冲液1和12μg山羊支原体提取物，以相同的方法检测山羊支原体提取物的限制酶活性，并且等分试样以0、15、30和45分钟间隔移出并处理。
在实施例2D(ii)(a)中描述的研究结果(凝胶结果未显示)表明，蕈状支原体LC基因组DNA应当被保护免受山羊支原体的限制修饰系统切割，但是山羊支原体基因组DNA应当容易被蕈状支原体LC限制-修饰系统切割。事实上，如通过同源限制修饰系统所预测的，来自蕈状支原体LC的基因组DNA和来自山羊支原体的基因组DNA未被切割，而不包含任何限制修饰系统的来自生殖器支原体的基因组DNA容易被切割。切割生殖器支原体基因组DNA是由于在山羊支原体中限制酶的活性。这被下列事实所证明：源于山羊支原体菌株的粗提物——其中预测的限制酶基因被破坏(见实施例2F)——，不切割来自3种所检测的支原体菌株的任一种的基因组DNA。也如预期的，当与蕈状支原体LC粗提物一起温育时，来自山羊支原体的基因组DNA被切割而来自蕈状支原体LC的基因组DNA未被切割。这些结果表明山羊支原体和蕈状支原体LC包含活性限制-修饰系统，其具有影响从酵母分离的未甲基化的蕈状支原体LC供体基因组的活性的潜能。λDNA被野生型山羊支原体提取物消化。将DNA与从山羊支原体RE(-)菌株制造的提取物一起温育，不导致指示该菌株限制活性不存在的带出现。
e.蕈状支原体供体和移植体克隆的基因组测序和基因组比较
两个蕈状支原体克隆被测序。一个是供体基因组，其被Lartigue等，于2007年在Science(317，362)公开的“在细菌中的基因组移植：使一种物种变成另一种(Genome transplantation in bacteria：changing one species to another)”文章描述(1,088,905bp，GenBank#CP001621)。另一个是包含III型限制酶基因缺失(ΔtypeIIIres；图17)的移植的蕈状支原体克隆(1,084,586bp，Genbank#CP001668)。在2007年的文章中使用的克隆只使用Sanger DNA测序化学进行测序。本文描述的III型限制酶基因缺失克隆通过Sanger方法测序至8x覆盖也使用454 FLX成对端读取焦磷酸测序化学(paired-end read pyrosequencing chemistry)测序。
为了确认转化体全部是蕈状支原体而不是包含酵母序列或山羊支原体受体细胞序列的嵌合体，并为了确认当克隆入酵母时，细菌基因组是否稳定，比较2个序列。所有装配的ΔtypeIIIres基因组匹配蕈状支原体，除了匹配YCp载体的那些区域之外。另外，除了故意在基因组中制造的差异之外，具有III型限制酶基因缺失的转化体蕈状支原体基因组序列与之前测序的蕈状支原体基因组相同，位点95除外。应当注意，这些95序列不同在本文中使用的供体蕈状支原体菌株和改造的基因组之间没有差别。在2007文章(Id.)中的蕈状支原体菌株序列(Genbank #CP001621)和本文改造的基因组(Genbank # CP001668)之间它们是差异。我们测序在蕈状支原体YCpMmyc1.1——其用于生成起始蕈状支原体酵母克隆——中那些95位点的每一个。在每个实例中，移植体序列匹配其所源于的YCpMmyc1.1供体。因此，在酵母中克隆、在酵母中增殖和改造或移植出酵母以制造改造的蕈状支原体菌株期间，没有引起任何95序列不同。基于这样的假设：在2个完全测序的蕈状支原体基因组中相同的所有序列在YCpMmyc1.1供体菌株中也相同，得出结论，除了故意改造的那些之外，在酵母中克隆和增殖以及移植回细菌期间没有序列发生改变。
这些数据表明酵母或受体细胞基因组与蕈状支原体供体基因组没有重组，且这些细菌基因组序列在酵母中作为YCp增殖、改造和保存期间是稳定的。
实施例2E
用于保护供体基因组和核酸免受限制修饰系统不相容性影响的方法
该实施例描述了用于保护支原体(例如，蕈状支原体LC)供体基因组免受被限制-修饰系统的切割的两种甲基化方法。对每种方法进行甲基化试验以确认效果。
i.通过构建和纯化的甲基转移酶甲基化
首先，如下面所描述，确定的蕈状支原体LC基因组的序列用于外源表达并纯化每个鉴定的甲基转移酶(见上面表10)。因为在山羊支原体中鉴定的唯一R-M系统与在蕈状支原体LC中所鉴定的相同，所以只有蕈状支原体LC甲基转移酶被纯化用于该研究。
a.甲基转移酶构建
来自蕈状支原体LC中的潜在限制-修饰系统的5个鉴定的甲基转移酶(CCATC-M、CCTTC-M、TypeIII-M、GCATC-M和GANTC-M)的编码序列被密码子优化，用于在酵母中表达。接着通过5’核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶协同动作，使用一步等温DNA装配方法从许多重叠60bp寡核苷酸构建这些序列，所述装配方法描述在Gibson等，Nature Meghods 6，343-345(2009)和于2009年2月19日提交的美国专利申请号12/371,543中。简单地说，利用该方法，DNA片段通过5’核酸外切酶首先凹陷(recess)，产生单链突出端，其然后特异性地退火，接着使用聚合酶和连接酶填补缺口并共价连接。构建之后，CCATC-M、CCTTC-M和TypeIII-M序列被克隆入pTYB1表达载体(New England Biolabs，Ipswich，MA；SEQ ID NO：156)。GCATC-M和GANTC-M序列用GATEWAY
Figure BPA00001462307601031
重组克隆技术(Invitrogen，Carlsbad，CA)克隆入N-末端组氨酸标签表达载体。
b.甲基化酶纯化
CCATC-M、CCTTC-M表达质粒
CCATC-M和CCTTC-M表达质粒被转化入BL21(DE3)密码子正细胞(Stratagene，La Jolla，CA)，且转化体被用于单独地接种250ml包含100mg/ml羧苄青霉素和34mg/ml氯霉素的ZYM-505培养基(Studier，FW，Protein Expr Purific41：207-34(2005))，并在37℃下强力振荡(315rpm)生长。大约4小时之后，将培养物转移到16℃并通过添加0.3mM IPTG诱导表达，过夜。细胞成团，悬浮在50mlIntein裂解缓冲液(25mM HEPES-NaOH pH 7.2、500mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油、正蛋白酶抑制剂(plus protease inhibitor)(完全蛋白酶抑制剂混合物，RocheApplied Sciences，Indianapolis，IN))中，并通过两次穿过高压匀浆器裂解。
裂解物(溶胞产物)通过在4℃下，以20,000×g离心20分钟澄清。澄清裂解物在1.5ml几丁质珠的柱中，按制造商(New England Biolabs，Ipswich，MA)的建议纯化。集中包含适当甲基转移酶的部分并对酶缓冲液(50mM HEPES-NaOH pH 7.2、50mM NaCl、0.1mM EDTA、10％甘油)透析。透析之后，使用Amicon超离心过滤器装置(Millipore，Billerica，MA)浓缩甲基转移酶。
TypeIII-M
使用相同的方案纯化TypeIII-M蛋白，除了在几丁质珠的柱上纯化之后，使用HiTrap MonoQ柱(GE Heathcare)进一步纯化蛋白。将蛋白质载入缓冲液A(50mM HEPES-NaOH pH 7.2、50mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油)，并用从0到100％缓冲液B(50mM HEPES-NaOH pH 7.2、1M NaCl、1mM EDTA、10％甘油)的线性梯度洗脱。集中包含TypeIII-M的部分，透析进入包含100mM NaCl的酶缓冲液，并如对CCATC-M和CCTTC-M蛋白质描述的，进行浓缩。
GCATC-M和GANTC-M表达质粒
将M.GCATC和M.GANTC表达质粒转化入BL21(DE3)密码子正细胞且转化体用于单独地接种2ml包含100mg/ml羧苄青霉素的ZYM-505培养基，并在37℃下强力振荡过夜生长。1毫升过夜的培养物用于接种250ml ZYM-5052培养基(Studier，FW，Protein Expr Purific 41：207-34(2005))。细胞接着在27℃下强力振荡20小时。将细胞成团，悬浮在50ml Nickel裂解缓冲液(50mM HEPES-NaOH pH7.2、500mM NaCl、30mM咪唑、10％甘油、正蛋白酶抑制剂(plus proteaseinhibitor)(完全蛋白酶抑制剂混合物，Roche Applied Sciences，Indianapolis，IN))中，并通过两次穿过高压匀浆器裂解。裂解物通过在4℃下，以20,000×g离心20分钟澄清。澄清裂解物使用5ml HisTrap柱纯化，Nickel裂解缓冲液作为电泳缓冲液和具有300mM咪唑的Nickel裂解缓冲液作为洗脱缓冲液。集中M.GCATC蛋白，透析入包含100mM NaCl的酶缓冲液，并如上浓缩。M.GANTC蛋白利用如用于M.TypeIII的缓冲液A和B进一步使用1ml HiTrap MonoQ肝素柱纯化。集中包含M.GANTC的部分，透析入包含100mM NaCl的酶缓冲液，并如上述浓缩。
c.甲基转移酶研究
纯化的甲基转移酶在甲基化试验中使用以确定它们是否可甲基化包含支原体DNA的质粒。使用Wilson和Hoffman，Anal Biochem 191，370(Dec，1990)描述的缓冲液条件进行甲基化试验。在37℃下，在100μl体积中进行反应。反应混合物包含100mM Tris-HCl，pH 7.5、10mM EDTA、3μM DTT、200μM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)、3μg pSmart-pMYCO1质粒DNA(酵母-大肠杆菌-支原体三穿梭载体)。
为了评估DNA是否已经被纯化的甲基转移酶甲基化，使用购买自NewEngland Biolabs的限制酶同切点酶，根据制造商的说明书切割4μl的每个样品。使用的限制酶同切点酶取决于被评估甲基化的序列(BccI(识别位点，CCATC)、HinfI(GANTC)、HpyAV(CCTTC)、SfaNI(GCATC)。样品在1％的48-孔琼脂糖E-凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，以70V电泳25分钟。凝胶在GE Typhoon 9410图像仪中扫描。
结果表明单独的纯化甲基转移酶能够完全纯化支原体质粒DNA，如通过与单独的甲基转移酶(见表10)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM)温育之后相应的限制酶同切点酶完全不能切割质粒DNA(凝胶数据未显示)判断的。
在另一研究中，在有或没有SAM的情况下，使用蕈状支原体粗提物处理pMYCO1质粒DNA。DNA接着被BccI消化以检查提取物中甲基转移酶的活性(数据未显示)。蕈状支原体的提取物还保护进入的供体DNA。在蕈状支原体供体基因组中存在的其他限制-修饰系统不影响移植。
ii.通过粗提物甲基化
为了消除被来自在基因组序列中没有鉴定的未鉴定限制-修饰系统的酶甚至在甲基化之后切割的可能性(因此未被纯化的甲基化酶解决)，开发了使用从山羊支原体和蕈状支原体LC中制备的粗提物甲基化DNA的方案。通过添加10mM抑制核酸酶的EDTA，提取物可用作甲基转移酶活性的来源。
a.制备细胞提取物
对于蕈状支原体LC，1升在SP4培养基中的细胞培养物在37℃下生长，直到达到6.2-6.3的pH。通过将细胞分成5×200mL的部分并在4℃下在SLA-1500Sorvall转子中以5,000×g离心15分钟，收获培养物。每个蕈状支原体LC颗粒物接着用200mL 8mM的Hepes，pH 7.4和272mM的蔗糖漂洗，在4℃下在SLA-1500Sorvall转子中以5,000×g离心15分钟。每个所得沉淀物重悬浮在1ml提取缓冲液中(20mM Tris-HCl、pH 7.5、0.1mM EDTA、150mM NaCl、1mM DTT和10％甘油)，并随后使用输出控制为3的探头在冰上超声处理5次，10-12秒脉冲。通过在4℃下，以18,000×g离心30分钟，使每个溶液澄清。组合每个得到的可溶部分，测试蛋白浓度，等分成200μl部分并在-80℃下保存。以该方式制备的提取物的蛋白浓度范围典型地从15到25mg/ml。
对于山羊支原体，除了1升培养物在包含10μg/ml四环素的SP4培养基中生长，使用与对蕈状支原体LC描述的相同方法制备提取物。
b.通过粗提物评价甲基化
使用甲基化试验表明粗提物甲基化在各种宿主细胞中生长的支原体质粒DNA的能力，如下。使用Wilson和Hoffman，Anal Biochem 191，370(1990)描述的缓冲液条件进行使用粗提物的甲基化试验。
c.评估蕈状支原体LC提取物对CCATC、GANTC、CCTTC和GCATC的甲基化
为了评估蕈状支原体LC提取物对CCATC、GANTC、CCTTC和GCATC位点的甲基化(并因此保护)，在37℃下，在100μl体积中进行反应。反应混合物包含100mM Tris-HCl，pH 7.5、10mM EDTA、3μM DTT、200μM S-腺苷甲硫氨酸(SAM)(在对照样品中不存在，如所指出的)，3μg从大肠杆菌中分离的pMYCO1质粒DNA(SEQ ID NO：149))，和20μg蕈状支原体LC提取物。
以0、2、4和16小时时间间隔，从每个反应混合物中移出20μl等分试样并添加至2×终止缓冲液(2％SDS、20mM EDTA)中。对每个等分试样，使用40μl苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)进行DNA提取，接着在室温下，以18,000×g离心2分钟。每个水相放入新管中，且通过添加80μl冰冷100％乙醇和1μl Ambion 
Figure BPA00001462307601061
GlycoBlueTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)并在-20℃下温育过夜，沉淀DNA。每个样品接着在4℃下以18,000×g离心15分钟且用100μl冰冷的70％乙醇漂洗每个所得沉淀物。在4℃下以18,000×g离心15分钟之后，丢弃每个上清液，并干燥每个沉淀物，和重悬浮在20μl TE pH 8.0中。
为了评估DNA是否已经被各自的II型甲基转移酶甲基化，使用购买自NewEngland Biolabs，适合被评估的特定序列的限制酶同切点酶，根据制造商的说明，切割4μl每个样品(BccI(识别位点，CCATC)、HinfI(GANTC)、HpyAV(CCTTC)、SfaNI(GCATC)。样品在1％的48-孔琼脂糖E-凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA)上，以70V电泳25分钟。凝胶在GE Typhoon 9410图像仪中扫描。
d.评估蕈状支原体LC提取物甲基化GATC位点
当测试蕈状支原体LC提取物对GATC甲基化时，通过使用在第一步骤中的3μg从山羊支原体中分离的pMYCO1质粒DNA和用MboI限制同切点酶切割，改进上面的方案。
e.评估山羊支原体LC提取物甲基化CCATC位点
如上测试通过山羊支原体提取物甲基化CCATC位点，除了使用3μg的从大肠杆菌分离的pSmart-pMYCO1质粒DNA(酵母-大肠杆菌-支原体三穿梭载体和从山羊支原体和蕈状支原体LC分离的pMYCO1)的每一个，且在S-腺苷甲硫氨酸存在或不存在情况下进行4小时反应。接着通过与BccI温育，检查甲基化的DNA，如上。
f.结果
山羊支原体粗提物能够完全甲基化从大肠杆菌分离的2个质粒，其由下列事实证明：相应的限制酶同切点酶BccI，不能切割已经与粗提物和SAM温育的质粒(凝胶数据未显示)。
对于通过蕈状支原体LC提取物甲基化(并因此保护)CCATC、GANTC、CCTTC、GCATC和GATC位点的研究实验的结果如下：在4个限制-修饰系统的情况下，蕈状支原体LC提取物能够完全甲基化支原体质粒DNA，且在1个系统的情况下(GATC限制修饰系统)只部分甲基化(凝胶结果未显示)。因为内源蕈状支原体LC GATC甲基转移酶在蕈状支原体LC提取物中显示低活性，商业上可得的大肠杆菌dam甲基转移酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)用于成功地补充它的活性。
通过两种粗提物甲基化支原体质粒DNA显著提高了在山羊支原体中的转化效率(数据未显示)，这表明在所提供的方法中与粗提物温育可帮助克服在酵母细胞中增殖的将被移植进入山羊支原体受体的供体基因组的潜在的不相容性。III型甲基转移酶的效力在蕈状支原体LC粗提物中未评估，因为它的位点特异性未知。
iii.用甲基化增加转化效率
未甲基化的质粒和如上述的用蕈状支原体LC提取物甲基化的质粒，被转化入山羊支原体细胞并比较。结果指示甲基化的质粒增加转化效率，表明转化之前DNA修饰的积极效果。
iv.甲基化之后另外的分析、构象作用和DNA的处理
尽管粗提物保护供体质粒DNA免受宿主限制修饰系统的影响并增加转化效率，但是粗提物也完全抑制基因组移植实验，其包括在琼脂糖插块中分离的天然蕈状支原体LC基因组DNA和山羊支原体细胞(见下面实施例3)。
为了更详细地研究抑制，在不存在或存在山羊支原体或蕈状支原体LC支原体粗提物(如在上面实施例2E(ii)(a)中制备)情况下，在琼脂糖插块中分离的内源性蕈状支原体LC基因组DNA(如在上面实施例2B(ii)中描述制备的)，通过荧光显微镜分析。如上述(实施例2C(ii))蕈状支原体LC基因组DNA琼脂糖插块用β-琼脂糖酶I熔解。2μl稀释的(1/2000)SYBR
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Gold核酸凝胶染色剂(Invitrogen，Carlsbad，CA)接着温和地与5μl熔解的琼脂糖混合，并在室温中放置5分钟。将混合物滴在载玻片上并用盖子覆盖。
接着使用配备AxioCam
Figure BPA00001462307601072
MRc5彩色摄影机(Carl Zeiss，Inc，Thorn wood，NY)的正立Axioskop
Figure BPA00001462307601073
2显微镜(Carl Zeiss，Inc)(物镜(100×)；若丹明过滤器(rhodaminefilter))显现蕈状支原体LC基因组DNA。获得荧光显微镜图像并用来自Carl Zeiss，Inc.的AxioVision 4.7.1版本软件分析。图7A图解了初始处理琼脂糖插块和未处理的琼脂糖插块的结果。甲基化和去蛋白步骤的结果分别在图7B-7C中给出，其中样品和处理指示在上面图中。
如在图7B中显示的，在不存在粗提物情况下处理的天然基因组DNA(显示允许移植入受体细胞)呈现点状图案(右图)，而在存在粗提物情况下处理的内源基因组DNA(显示抑制移植)形成大的聚集体(左侧两图)。该结果表明DNA构象对于移植实验是重要的。
为了确认构象是重要的，用蛋白酶K处理样品以在处理之后移出细胞提取物如下。每个酵母插块在补充有40μl蛋白酶K的1mL蛋白酶K反应缓冲液[100mM EDTA；0.2％脱氧胆酸钠；1％月桂酰肌氨酸钠；pH8.0]中，在50℃下温育4小时。接着，用1ml 1×TE缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8；50mM EDTA)漂洗插块4次、每次45分钟，并在0.1×TE缓冲液中，在室温下温和搅动，2次，每次30分钟。除去最终漂洗缓冲液之后，插块用β-琼脂糖酶I熔解并通过荧光显微镜分析，如上述。结果在图7C中给出，其显示与在琼脂糖插块中的基因组DNA一起温育之后，通过蛋白酶K处理除去粗提物，恢复最初用未处理的基因组DNA观察到的点状图案。此外，如下面所描述(实施例3)，蛋白酶K处理在某种程度上恢复了已经用粗提物处理的天然基因组DNA的移植效率。因此，在细胞粗提物中除去蛋白质(例如，通过蛋白酶K处理)提供了如此手段，通过其从酵母宿主细胞中分离的蕈状支原体LC供体基因组DNA可使用粗提物甲基化并仍然成功地移植入受体细胞。
实施例2F
突变R-M系统(生成山羊支原体ΔRE)
采用另一种方法作为克服宿主细胞和受体细胞之间限制障碍的手段。在该方法中，在山羊支原体中鉴定的单限制酶(见上面实施例2D(i)和表3)通过中断基因编码区失活。限制酶基因通过整合嘌呤霉素抗性标记进入基因编码区域被中断。
异源pSD4柠檬螺旋原体oriC质粒(SEQ ID NO：150)已经被显示转化山羊支原体(Lartigue，C.等，Neuclic Acids Res.31：6610-8(2003))。该质粒对于整合外源序列和在山羊支原体基因组靶向诱变是有效的。为了失活在山羊支原体中潜在的限制酶基因(MCAP0050)，使用包括XbaI位点的寡核苷酸RE-Mcap-F(5’-gatctctagactaatgttcaattggatgatata G-3’(SEQ ID NO：157))和RE-Mcap-R(5’-gatctctagactcaagtcttgtaggagaatc-3’(SEQ ID NO：158))，从山羊支原体基因组DNA扩增基因的内部片段。片段接着被XbaI切割并克隆入XbaI切割的pSD4质粒(SEQID NO：150)，产生pSD4-ΔMcap0050.1(SEQ ID NO：159)。使用在上面实施例2C中描述的5％PEG介导的方案，10微克的该质粒用于转化野生型山羊支原体细胞。在包含4μg/mL四环素的固体SP4平板上选择转化体。在37℃下温育7天之后，在包含10μg/ml四环素的液体培养基中挑选数个集落并且细胞被增殖进行15次传代(15P)。接着通过DNA印迹分析克隆以验证质粒的存在和通过单交换同源重组在靶基因处的可能整合。
一个克隆，山羊支原体ΔRE克隆10 15P，被选择，因为(如被DNA印迹证明的)它的杂交模式表明通过质粒中断MCAP0050基因。没有检测到游离的质粒。离心机澄清的裂解提取物也按在2D(ii)(b)中描述制备，并用在实施例2D(ii)中描述的限制酶试验中。结果显示与野生型山羊支原体比较，克隆10 15P完全不存在限制酶活性(数据未显示)。
使用在上面实施例2E(ii)中描述的方法，山羊支原体ΔRE克隆10用作为体外甲基化实验制造天然山羊支原体细胞提取物的来源。但是山羊支原体ΔRE克隆10不是用于移植蕈状支原体LC的好的候选受体细胞，因为它和在酵母中存在的蕈状支原体LC供体基因组DNA包含相同的抗性标记基因(tetM)。因此，使用上述克隆策略，构建另一种携带YCp和嘌呤霉素抗性基因而不是tetM基因的山羊支原体ΔRE突变体。从山羊支原体ΔRE克隆17.5 15P，如在2D(ii)(b)中所描述制备离心机澄清的裂解提取物，并用在在实施例2D(ii)中描述的限制酶试验。结果显示与野生型山羊支原体相比，克隆17.5 15P中完全不存在限制酶活性。因此，选择该克隆用于移植。
这些结果表明从受体细胞中除去山羊支原体限制活性允许从酵母中分离的蕈状支原体LC供体基因组DNA，在山羊支原体细胞质中存活。可选地，如上述，所提供的甲基化方法可用于在移植前处理供体DNA以保护它。
实施例3
从酵母宿主细胞移植蕈状支原体LC-YCp基因组DNA进入山羊支原体
上面实施例1，描述了在酵母宿主细胞中成功克隆完整的细菌基因组(包括这些支原体)。该实施例描述了成功移植已经在酵母宿主细胞中增殖的支原体供体全基因组(蕈状支原体LC(Genbank获取号：NZ_AAZK00000000；GI：149364883))DNA，进入不同种类(山羊支原体)的支原体受体细胞。根据它们的迅速生长，选择供体和受体。但是，还可以使用其他支原体供体和受体，比如上面描述的生殖器支原体基因组/细胞，进行该方法。此外，在该实施例中描述的方法可与用于当在宿主细胞中在体内修饰供体基因组的步骤(例如，在细菌供体基因组增殖期间使用所有酵母工具)结合使用，然后转移。因此，该方法可用于遗传改造供体基因组，比如来自具有相对弱开发遗传系统的细菌的基因组。
例如，该方法可用于生成包含合成改造的基因组的合成细胞。已经合成了生殖器支原体的非病原性菌株的完全合成基因组(Gibson等，Science 319：1215-20(2008)；Gibson等，PNAS USA 105：20404-9(2008))。在那研究中，在最后一步中，在酵母中作为着丝粒质粒装配基因组。
使用提供的方法，比如在该实施例中描述的那些，在宿主细胞中(例如，酵母宿主细胞)增殖的这种合成产生的和天然的基因组(例如，支原体或其他细菌基因组)可被移植入受体细胞质以生成合成细胞。例如，为了在细菌受体中表达细菌合成供体基因组(在酵母中增殖的)，可使用该方法将它从酵母移植入细菌(例如，支原体)受体。
如在上面实施例2中所描述的，当从增殖供体细胞基因组的宿主细胞中移植供体基因组到不同种类的受体细胞时，不同的限制-修饰系统出现不相容性问题。特别是，可以确定，当引入蕈状支原体LC基因组并在酵母宿主细胞中增殖时(见上面实施例1)，被这些支原体内源表达的甲基转移酶(见上面实施例2B)不太可能在酵母宿主细胞中表达。该确定基于这样的事实：甲基转移酶基因包含被真核酵母宿主细胞作为终止密码子处理的UGA色氨酸密码子。该确定表明从酵母中分离的蕈状支原体LC供体基因组DNA将未被甲基化，并一旦转移入山羊支原体受体细胞可遭受山羊支原体受体细胞限制修饰系统的影响。一旦移植之后表达，一个或多个蕈状支原体LC限制酶也有可能切割供体基因组。所提供方法的用于克服R-M不相容性问题的各个方面描述在上面实施例2中。选择这些方面并在下面的研究中使用，以实现成功将在酵母中增殖的供体支原体基因组移植进入不同种类的支原体受体细胞。
实施例3A
移植方法
该实施例描述了使用这些技术以成功地从酵母宿主细胞中移植供体支原体基因组到支原体受体细胞。图8显示了3个可选移植方法，其可用于移植全基因组DNA。这3种方法的变型被用在下面描述的实施例中。第一方法(在图8中用数字“1”标注箭头指示)，包括消化包含基因组DNA的琼脂糖插块(例如，用β-琼脂糖酶(熔解步骤))，然后直接移植入受体细胞。如在图8中所示，该方法典型地用于从一种细胞(例如，供体支原体细胞)中移植供体基因组或核酸进入类似的细胞，比如从支原体供体细胞进入支原体受体细胞。
第二方法(用数字“2”指示)与第一方法相同，除了修饰受体细胞以突变限制酶基因(ΔRE；如在上面实施例2F中所描述生成的)。利用该方法，如在图8中指示，在酵母宿主细胞中生长并在在酵母插块中分离的支原体基因组DNA可被成功移植入支原体受体细胞。利用第三方法(在图8中用数字“3”指示)，样品被甲基化和进行去蛋白步骤(用蛋白酶K处理)，然后熔解步骤(β-琼脂糖酶消化)并移植入受体细胞。如在图中指示的，甲基化和去蛋白步骤还帮助有效移植在酵母中增殖后分离的供体支原体基因组进入支原体受体细胞。如下面所描述，对照研究包括与第三方法类似的条件，其中样品在相同的条件下、不存在甲基化酶情况下平行处理(“模拟甲基化(mock methylation)”)。这些方法和用每个方法获得的结果在下面详细描述。
i.制备琼脂糖插块
在每个方法中，蕈状支原体LC基因组DNA在琼脂糖插块中从酵母菌株VL6-48N分离(Larionov等，PNAS USA 94：7384-7(1997)所描述)，如下。
包含蕈状支原体LC基因组DNA的酵母细胞(如在实施例1A中描述生成)在30℃下在选择性培养基中生长，直到OD达到大约1.5；不包含供体基因组的对照细胞在相同的条件下生长。使用CHEF哺乳动物基因组DNA插块试剂盒(Bio-RadLaboratories，Valencia，CA)，按照制造商推荐的用于酵母(真核生物的)DNA提取的说明，具有下面的改进，制备每个琼脂糖插块。每插块使用6×109个酵母细胞(而不是试剂盒推荐的6×108个细胞)，以产生每插块6×108个细胞，以便增加每个插块可得的蕈状支原体LC基因组DNA的量。将细胞包埋在琼脂糖插块中之后，为了消化细胞壁，使用ZymolyaseTM 100T酶(USB Corporation，Cleveland，OH)代替溶细胞酶(Bio-Rad Laboratories，Valencia，CA)。ZymolaseTM酶以5mg/mL的浓度添加到插块的里面或外面，并在37℃下放置2小时。
在1×TE缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8；50mM EDTA)中漂洗之后，通过与补充有每ml插块200μl蛋白酶K的5ml蛋白酶K反应缓冲液[100mM EDTA；0.2％脱氧胆酸钠；1％月桂酰肌氨酸钠；pH 8.0]在50℃下温育两次24小时，裂解包埋的酵母细胞并消化蛋白质。琼脂糖插块接着在室温下用40ml 1×TE缓冲液搅动漂洗4次，每次1小时，并在4℃下保存在相同的缓冲液中。对于在随后用限制酶消化的酵母插块(见下面)，在第二次漂洗清理期间添加1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)。
清理
在这些研究之前，不知道连同从酵母中提取的蕈状支原体LC供体基因组DNA一起分离的酵母基因组DNA是否会影响或废除移植反应。因此，利用该方法，制备了2组供体基因组DNA，其中之一在消化细胞壁和蛋白酶K处理之后经历任选的“清理”步骤。设计“清理”步骤以从样品中除去酵母基因组DNA。
“清理”样品用特异性消化酵母基因组DNA的限制酶混合物处理并接着通过电泳清理小的酵母DNA片段，或直接加样至脉冲场琼脂糖凝胶以分开保留在加样孔中的环状基因组和被电泳到加样孔外面的线性酵母染色体(Lartigue等，Science317，632(2007))。
为了用酶混合物清理，酵母插块在1ml 0.1×TE缓冲液(2mM Tris-HCl pH 8.0，5mM EDTA)中漂洗2次，每次1小时，在1ml补充有BSA的1×NEB缓冲液2(NewEngland Biolabs，Ipswich，MA)中平衡1小时，且在插块中存在的基因组DNA用50单位限制酶混合物(AsiSI、RsrII和FseI)在100μl反应体积中消化过夜。酵母插块在室温下用1mL 1×TE缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0，50mM EDTA)漂洗1小时并加样到1％TAE琼脂糖凝胶中(120分钟，120伏特)。琼脂糖插块从加样孔中移出并在4℃下保存。
为了仅通过电泳清理，其他酵母插块在TAE 1×中1％LMP凝胶内，用钳位均匀电场(6)(CHEF DR III；Bio-Rad)进行电泳。脉冲时间从60缓升到120秒，在3.5V/cm下24小时。迁移之后，插块从加样孔中移出，在4℃下保存在1×TE缓冲液中。
ii.一般移植方法
对于每种方法，移植进行如下，除了对于第三方法，用β-琼脂糖酶熔解之前，样品进行甲基化和蛋白酶K处理，如在下面实施例3A(iii)中所描述。
a.受体细胞
十二(12)mL山羊支原体受体细胞(野生型或ΔRE(如在实施例2F中所生成))在补充有胎牛血清(17％)、葡萄糖(10g/L)、2ml苯酚红(1％)和100μl青霉素G(5mg/ml))的SOB(+)培养基(Bacto SOB培养基(Becton Dickinson；Franklin Lakes，NJ)中生长，直到培养物的pH达到pH 5.7到5.85(大约5×107个细胞/ml)。受体细胞在10℃下，在4575×g离心15分钟，在6mL S/T缓冲液中(10mM Tris-HCl、pH 6.5；和250mM NaCl)中漂洗一次，重悬浮在400μl CaCl2(0.1M)中并在冰上温育30分钟。
b.在琼脂糖插块中制备分离的供体基因组DNA
移植之前，如在上面实施例3A(i)(a)中所描述，从酵母制备包含蕈状支原体LC基因组DNA的琼脂糖插块在室温下温和搅动，在0.1×TE缓冲液[2mM Tris-HCl、pH 8.0，5mM EDTA]中漂洗2次，每次30分钟。完全除去缓冲液并在65℃下，用1/10体积的10×β-琼脂糖酶缓冲液[10mM Bis Tris-HCl pH 6.5；1mM Na2EDTA]熔解琼脂糖插块10分钟。熔解的琼脂糖冷却至42℃，持续10分钟，并在该温度下，每100μl插块与3单位的β-琼脂糖酶I(New England Biolabs，Ipswich，MA)一起温育过夜。如在下面实施例3A(i)(c)中所描述的，在第三方法中β-琼脂糖酶处理之前进行甲基化和蛋白酶K处理(图8(“3”))。
c.在存在5％PEG情况下移植
在冰上30分钟之后，400μl受体细胞与800μl包含100μl溶解的供体基因组DNA琼脂糖插块——如在上面实施例2B(ii)中生成——的SP4(-)培养基[0％胎牛血清，0.45％NaCl]温和地混合。如下面，刚好在进行下一步骤之前，添加插块。
一千三百(1300)μl 2×融合缓冲液(20mM Tris-HCl pH6.5、250mM NaCl、20mMMgCl2、10％来自Fluka的PEG-6000]立即添加到SP4(-)、基因组DNA和细胞的混合物中并通过温和地摇动管30秒使混合物均匀。在37℃下，50分钟之后，添加10ml预暖的SP4并温和地混合细胞。在37℃下，另3小时之后，在10℃下，以4,575×g离心细胞15分钟，重悬浮在1.2ml SP4中并铺板在包含4μg/ml四环素和150μg/ml X-gal的SP4平板上(每个样品2个平板)。3-4天之后，挑选各个集落并在包含10μg/ml四环素的肉汤培养基中生长。
iii.甲基化和蛋白酶K消化(第三方法的细节)
对于第三方法(图8，“3”)，在用β-琼脂糖酶熔解之前，甲基化来自酵母琼脂糖插块的蕈状支原体LC基因组DNA，接着去蛋白步骤。对于该过程，插块在200mM Tris-HCl pH 7.5；50mM EDTA中漂洗2次，30分钟，并在甲基化缓冲液(100mM Tris-HCl pH 7.5；10mM EDTA，3μM DTT，200μM S-腺苷甲硫氨酸)中温和搅动平衡2次30分钟。平衡之后，酵母插块被分成4块，并添加到100μl甲基化反应(1×甲基化缓冲液加甲基转移酶)并在37℃下温育16小时。对于100μl反应，5μl野生型蕈状支原体LC细胞提取物，或者7.5μl山羊支原体ΔRE(克隆10 15P)细胞提取物(大约125μg蛋白)或2.5μl每个纯化的蕈状支原体LC特异性甲基转移酶(M.GANTC、M.CCATC、M.GCATC、M.CCTTC、M.III型)。每个细胞提取物如在上面实施例2E(ii)中描述地制备，且纯化的甲基转移酶如在上面实施例2E(i)中描述地制备。包含蕈状支原体LC细胞提取物或纯化的甲基转移酶的甲基化反应也补充有5μl dam甲基转移酶(New England Biolabs，Ipswich，MA)。
甲基化之后，每个酵母插块在补充有40μl蛋白酶K的1mL蛋白酶K反应缓冲液[100niM EDTA；0.2％脱氧胆酸钠；1％月桂酰肌氨酸钠；pH8.0]中在50℃下温育4小时。插块接着用1ml 1×TE缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8；50mM EDTA)漂洗4次45分钟并在室温下在0.1×TE缓冲液中温和搅动漂洗2次30分钟。除去最终漂洗缓冲液之后，插块用β-琼脂糖酶I熔解，如在上面(b)部分所描述，然后移植。
实施例3B
表明使用所提供的方法成功移植的研究
使用在上面实施例3A中描述的一般方法，在下面表11中列出的条件下，进行从酵母宿主细胞中移植蕈状支原体LC基因组供体DNA进入野生型和限制酶-缺陷山羊支原体受体细胞。“未处理的”样品在熔解之前，既未被甲基化，也未用蛋白酶K处理。“模拟-甲基化”样品在与甲基化样品的相同条件下温育，没有酶或细胞提取物。甲基化处理包括用供体或受体细胞提取物甲基化和用纯化的甲基化酶甲基化。
表11：移植条件
Figure BPA00001462307601141
通过在37℃下，选择在包含四环素的SP4培养基上生长蓝色集落，给结果记分，并提供在下面表12A中。如在该表中指出的，为了用蕈状支原体提取物甲基化并移植入野生型细胞(样品2)，通过用酵母特异性酶(b)消化或通过电泳(c)，一些样品被清理以除去酵母DNA，如上述。
表12A：用供体表型量化移植集落
a至少3个实验的平均。报告的误差是平均偏差。
b使用AsiSI、RsrII、FseI混合物限制酶方案，酵母插块已经被清除酵母基因组DNA。
c使用脉冲场凝胶电泳方案，酵母插块已经被清除酵母基因组DNA。
如在上面表12A中所显示的，在样品中获得与蕈状支原体LC表型相似(根据类似的外观和生长速率)的集落(如Lartigue等，(2007)Science 317 632-8(6)所描述)，所述样品使用蕈状支原体LC提取物或纯化的甲基化酶甲基化并移植入野生型或者ΔRE受体细胞中(样品2、3、7和8)。该结果确认已经在酵母中增殖的蕈状支原体LC供体基因组抗由蕈状支原体LC产生的限制酶和由受体细胞系统产生的酶二者。
相反，模拟-甲基化和未处理的蕈状支原体LC基因组移植只在山羊支原体ΔRE受体细胞(样品6和10)的情况下产生供体-表型集落，且在野生型受体细胞(样品1和5)的情况下不产生。例如，当模拟处理的和未处理的供体基因组DNA被移植入山羊支原体ΔRE受体细胞(样品6和10)时，分别获得34和37个集落。但是，当模拟处理的或未处理的蕈状支原体LC基因组DNA被移植入野生型山羊支原体受体细胞(表12A)时，没有获得集落。
类似地，在具有用山羊支原体提取物处理的供体基因组的两种受体细胞类型(样品4和9)中得到集落(32和9集落，表12A)。因为山羊支原体提取物提供抗山羊支原体限制酶的保护，该结果表明避开山羊支原体受体限制系统对于成功转化在酵母中增殖的蕈状支原体LC供体基因组是重要的。下列事实：失活山羊支原体限制系统(山羊支原体ΔRE受体细胞)足够允许成功移植并活化蕈状支原体供体基因组，表明失活该受体细胞限制系统对于这些事件也是足够的。因此，供体蕈状支原体LC限制系统(当移植入受体细胞时，其已经被活化)不表现构成对从酵母移植供体基因组到山羊支原体受体细胞的障碍。
在移植实验中回收集落取决于山羊支原体受体细胞的存在，如当受体细胞从反应中被省略时，观察不到集落。而且，移植实验还取决于来自酵母的蕈状支原体LC基因组，如当只有来自酵母的酵母基因组DNA或YCp质粒被用作供体DNA时，观察不到集落。DNA印迹确认已经从酵母中接收供体基因组的受体细胞集落是山羊支原体和蕈状支原体LC基因型。
没有“清理”，酵母DNA在包含基因组DNA的样品中存在。从酵母基因组DNA中纯化供体基因组DNA(在上面表12A中由“b”和“c”指示)不足以改变移植结果，表明受体山羊支原体细胞能够容忍非特异性或载体DNA的存在(表12)。另外，用从2个不同酵母菌株(VL6-48N和W303a)分离的供体基因组DNA获得积极的移植结果，表明宿主酵母菌株的基因型和/或表型对于移植实验可能不重要。
这些结果一起表明了山羊支原体细胞活化来自酵母的表型上休眠的蕈状支原体LC基因组、导致生成活的蕈状支原体LC细胞的能力，以及因此提供的方法可用于移植在真核宿主细胞中生长的原核全基因组进入与供体或宿主不同种类的受体原核细胞。
从酵母中移植非甲基化的蕈状支原体LC基因组进入山羊支原体ΔRE受体细胞确认转化、选择的受体细胞包含供体基因组且由于缺少一些蕈状支原体LC组分而不是基因组DNA而没有被选择。该确认是由于下列事实：在转化期间除了基因组DNA不存在蕈状支原体LC细胞或组分。
在另一种实施例中，YCpMmyc1.1，以及改造的YCp基因组(YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres::URA3和YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres)，也是从酵母菌株W303a中分离的。移植所有3个YCp基因组进入山羊支原体受体细胞产生相似数量的四环素抗性蓝色集落(表12B)。上面提到的大的缺失克隆(YCpMmyc1.1-Δ500kb)作为合适的对照，因为它缺少许多推测的必需基因但是仍然保留YCp元件和tetM。如预期的，当该基因组移植入山羊支原体受体细胞时，没有回收集落。
在所有这些移植实验中回收集落依赖于山羊支原体受体细胞和蕈状支原体基因组二者的存在。这里描述的实验使用包括酵母基因组DNA的供体YCp基因组。但是，从酵母基因组DNA中纯化供体YCp基因组DNA不足以改变移植结果，其表明受体山羊支原体细胞能够容忍非特异性或载体DNA的存在(表12B)。使用从菌株V16-48N的4个独立的转化体培养物和4个W303a菌株分离的供体YCp基因组DNA，获得积极的移植结果。因此，细菌基因组可在两个酵母菌株中稳定地克隆。通过使用蕈状支原体特异性IS 1296元件作为探针进行DNA印记分析(数据未显示)，进行确认回收的集落是蕈状支原体。显示，通过使用III型限制基因序列作为探针的DNA印迹分析(数据未显示)和通过测序基因座(图17)，III型限制基因通过PCR在工程细菌中被缺失。
表12B
Figure BPA00001462307601171
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*通过用Asi SI、RsrII和FseI的混合物消化，随后通过脉冲凝胶电泳，酵母插块清除酵母基因组DNA。
Figure BPA00001462307601182
通过使用脉冲凝胶电泳酵母插块清除酵母基因组DNA。
表12B提供了从酵母移植蕈状支原体YCp基因组进入野生型和RE(-)山羊支原体受体细胞的结果。计数从酵母移植蕈状支原体YCp基因组进入山羊支原体受体之后获得的抗四环素蓝色集落。使用在图8中描述的方法进行野生型山羊支原体和山羊支原体RE(-)移植。对于未处理的样品，用β-琼脂糖酶消化酵母插块(熔解步骤)并移植入两种受体细胞。处理的样品在熔解步骤之前被甲基化并用蛋白酶K处理。模拟-甲基化样品与甲基化样品相同处理，除了不添加提取物或纯化的甲基转移酶。在该实验中使用的VL6-48N酵母琼脂糖插块携带YCpMmyc1.1。W303酵母琼脂糖插块携带YCpMmyc1.1或YCpMmyc1.1-Δ500kb，YCpMmyc1.1在酵母(YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres::URA3或YCpMmyc1.1-ΔtypeIIIres)中改造。移植体的数量至少是3个实验的平均。报告的误差是绝对平均偏差。
实施例4
在酵母宿主细胞中修饰供体基因组
该实施例描述了用于将无缝修饰引入已经被克隆入酵母宿主细胞的支原体供体基因组的方法的使用。
酵母——酿酒酵母——已经被开发为能够克隆大的DNA片段如线性和环状酵母人工染色体(YAC)二者的宿主。一旦克隆入酵母，这些YAC可使用标准的遗传工具操作。转移这些修饰的DNA到适合表达的宿主细胞，允许基因和他们调控的功能研究。在酵母中克隆细菌全基因组和随后移植这样的基因组回到它们初始细胞环境，已经使该应用从基因水平扩展到基因组水平。
利用反选择标记的两步重组方案可用于在酵母中修饰YAC(Tucker和Burke(1996)Nucleic Acids Res，24，3467-3468)。在这些方法中，首先反选择标记被重组入YAC并选择。接下来，新的包含期望改变的DNA片段被重组替换标记，其再次被选择。在这些过程中最常使用的标记是URA3基因，其在缺陷菌株中恢复尿嘧啶自养。通过用5-氟乳清酸(5-FOA)处理进行URA3基因置换的反选择(Boeke等，(1984)Mol Gen Genet，197，345-346)。第一，该方法恢复尿嘧啶营养缺陷型，其可接着被再次用于进一轮的修饰。第二，该方法产生了无缝修饰。用于无缝修饰的该基本方法在许多方面已经被改善。delitto perfetto方法通过利用核酸内切酶I-SceI在靶基因座附近引入双链断裂(DSB)(Storici等(2001)Nat Biotechnol，19，773-776)。DSB的形成提高同源重组修复效率数个数量级(Storici等(2003)PNASUSA，100，14994-14999)。另一种方法，称作串联重复突出，在靶位点侧翼制造串联重复序(Akada等(2006)Yeast，23，399-405)。该方法仅需要一次转化，接着5-FOA反选择，而其他方法需要2次转化。这些方法可适合缺失、点突变或基因置换。
在酵母中装配和克隆作为环状YAC的合成生殖器支原体基因组已经被Gibson等(Science，319，1215-1220；和Gibson等(PNAS USA，105，20404-20409(2008))描述。酵母可用作直接改造或重新设计体内合成细菌基因组的平台。
如在下面各个章节所描述的，进行5个不同的位点特异性修饰方法，以修饰在已经被引入并保留在酵母宿主细胞中的合成sMgTARBAC37生殖器支原体基因组的CDS139基因座中包含单碱基胞苷缺失(309，388)的靶区域(靶基因座)，如Gibson等，Science 319，1215(2008)和Gibson等的美国公开号20090275086所描述，和如在上面实施例1C中所描述。
酿酒酵母菌株VL6-48N(MATαhis3-Δ200 trp1-Δl ura3-52 lys2 ade2-101 metl4)和W303a(MATa ade2-1 ura3-1 his3-1 1，15 trpl-1 leu2-3，112 canl-100 RAD5)携带如Gibson等，Science Id描述和在上面实施例1提供中的合成基因组。酵母细胞在标准丰富培养基(YEPD)和合成葡萄糖(SD)或合成半乳糖(SG)最小培养基中生长(Amberg等，(2005)，“酵母遗传学中的方法：冷泉港实验室过程手册(Methods inyeast genetics：A cold Spring Harbor Laboratory Course Manual)”，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.230)。
贯穿该实施例(实施例4)描述的各种研究中使用的引物核酸序列在表13中列出。引物序列中的破折号表示引物的结构是嵌合的。与生殖器支原体部分同源的引物序列部分以小写字母类型列出。不与生殖器支原体同源的引物序列部分以大写字母类型列出。I-SceI切割位点(见下面)以下划线文本列出。在该实施例描述的方法中，所有引物是定制合成的(Integrated DNA Technologies(IDT))。长度大于60bp的引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
根据公开的方法(Gietz等，Nucleic Acids Res，20，1425(1992))使用乙酸锂整合转化，使用2-3μg PCR产物和25μg载体DNA(Salmon testis DNA，Sigma)，将PCR构建体引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株中。
表13：在诱变研究中使用的引物
Figure BPA00001462307601201
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Figure BPA00001462307601221
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实施例4A
使用常规两步同源重组方法的修饰
使用常规两步同源重组方法(Rothstein，R.Methods Enzymol，194，281-301(1991))引入位点特异性突变，以校正已经在酵母中保留的合成生殖器支原体基因组中的单碱基胞苷缺失。该方法示意性图解在图12A中。
i.通过同源重组——传统序列置换引入URA3基因
使用在表13中列出的引物，如下进行常规方法(传统序列置换)。在包括两个连续转化的第一步骤中，使用引物URA-F和URA-R——其序列在表上面13中列出——从质粒pRS306中(描述在R.S.Sikorski和P.Hieter，Genetics 122，19(1989)中)PCR扩增URA3基因(1,066bp)。该扩增的URA3基因包含两个与用于突变靶的部分生殖器支原体基因组区域的部分相同的50-bp末端序列。使用DNA聚合酶(Takara，Madison，WI)，在制造商推荐的条件下进行PCR反应。使用乙酸锂整合转化，将PCR产物引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株中。
选择单独的Ura+转化体，并通过使用在上面表13中列出的诊断引物Seq-F和Seq-R进行PCR分析，以确认扩增的URA3基因已经在供体基因组中正确的位置处插入。Seq-F和Seq-R引物在靶基因座(被修饰的靶基因组区域)侧翼，并沿着基因组隔开0.4kb，因此从包含URA3标记置换的基因组扩增将产生1.35kb PCR产物(示意性显示在图12A中)。PCR反应的产物在琼脂糖凝胶上分开，其被可视化以验证正确插入URA3基因。
ii.第二轮转化：引入野生型片段并选择
对于第二轮转化，通过使用在上面表13中列出的引物Amp-F和Seq-R的PCR扩增，产生328bp野生型DNA片段(与靶区域的部分同源但不包含CDS 139基因座单碱基缺失)。该片段被引入从第一轮使用乙酸锂整合转化方法获得的URA3置换菌株。
第二轮转化之后，细胞在30℃下在SD-HIS平板生长过夜，以耗尽在已经丢失URA3基因的任何酵母细胞中残留的乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(由URA3基因编码)。使用补充有5-氟乳清酸(FOA)的SD培养基(包含FOA的SD-HIS平板)对URA3基因丢失进行选择(Boeke等，Mol Gen Genet，197，345-346(1984))。
使用诊断引物Seq-F和Seq-R(上面描述并在表13中列出)，通过来自选择的克隆的基因组DNA的PCR，评价突变的校正(正确性)。使用Takara DNA聚合酶(Takara，Madison，WI)，在制造商推荐的条件下，进行PCR反应。PCR产物在琼脂糖凝胶上分开。使用这些引物，扩增包含CDS 139基因座(或者具有单碱基缺失的初始基因座或者具有置换的野生型序列)的基因组DNA将产生0.4kb DNA片段的PCR产物(数据未显示)。
通过该方法测试97个FOA抗性集落。全部结果总结在表14的第一行中；如在表14中所示的，通过PCR扩增基因组DNA，没有FOA抗性集落产生正确的0.4kb片段。该结果表明在进入的野生型DNA片段和靶位点之间没有发生精确的同源重组(HR)。而是，不期望的缺失已造成这些FOA抗性集落中URA3标记的丢失。考虑到在酵母中作为环状YAC增殖的生殖器支原体基因组，除了组氨酸原养型，对它的宿主没有功能的补充，这种可能性是可能的。因此，供体细菌基因组中的缺失和重排对宿主细胞的生存可能是中性的。
iii.多重PCR
为了通过评估在选择酵母中生殖器支原体基因组的完整性检测该可能性，按照Gibson等，PNAS USA，105(51)：20404-9(2008)和Gibson等，Science 319，1215(2008)描述的，进行多重PCR(MPCR)。根据公开的方案(Kouprina和Larionov，Nat.Protoc.3，371(2008))，如在上面实施例3中描述，从酵母中进行总DNA分离用于PCR分析。设计用于MPCR的引物组(组3)以产生10个扩增子(范围从125bp到1025bp，以0.1kb递增)，其围绕生殖器支原体基因组大约每60kb DNA分布(Gibson等，PNAS USA，105(51)：20404-9(2008))。使用Qiagen(Valencia，CA)的多重PCR试剂盒进行多重PCR。在每个10-μl反应中包含1/50体积(2μl)DNA提取物和1μl包含每种5μM的20种寡聚物的10×引物原料。循环参数是94℃，15min，接着35个循环94℃，30秒、52℃，90秒和72℃，90秒，接着在72℃下进行单次3分钟温育。接着2μl每个反应加样至2％E-凝胶(Invitrogen)并施加72V 30分钟。使用Amersham Typhoon 9410荧光图像仪显像条带。
结果显示对于22个FOA-抗性集落的每个，总DNA的扩增不产生所有10个扩增子。任何FOA-抗性克隆的MPCR不产生长度0.55和0.65kb的2个扩增子(在生殖器支原体基因组中它们聚簇在一起)。CDS 139靶基因座位于0.65kb扩增子上游3kb处(凝胶结果未显示)。
该结果表明在酵母中增殖的生殖器支原体基因组中已经发生了非特异性缺失或重排。在这些克隆中URA3标记的丢失(通过它们用FOA的选择证明)可能源于生殖器支原体基因组中重复序列之间的同源重组。由于该重组，其中URA 3标记缺失的细胞能够在FOA培养基上生存。因此，利用该非常规方法，非特异性URA3基因丢失，比通过利用引入的野生型DNA片段意图的重组事件置换URA3，具有更高的概率。
常规修饰方法的该问题在图9中示意性图解，其中将野生型片段引入携带具有URA3插入的生殖器支原体的酵母中(图9A)(如在上面实施例4A中生成的)，接着在包含FOA的SD-HIS平板上选择，产生选择2个不同类型的重组事件(P1(野生型片段和基因组之间的重组)和P2(基因组中重复之间的重组))(图9B)。这些事件将产生携带图解在图9C中的可选产物的细胞。因为生殖器支原体基因组包含多个重复，所以URA3基因非特异性丢失(P2)的概率比由于意图的重组(P1)丢失的概率更大。普遍的非特异性丢失可能由于使用该常规方法引起的包含意图序列的任何克隆观测到的缺失。这些结果表明对于在酵母宿主细胞中修饰供体基因组需要改进的方法。
表14：FoA+克隆中正确序列置换和完整生殖器支原体扩增子的数量
Figure BPA00001462307601261
实施例4B
可选无缝修饰方法
两种据报道更加有效的其他无缝修饰方法被使用，以试图修饰在酵母中合成生殖器支原体供体基因组的相同靶区域，如上述。
i.Delitto perfetto
两种据报道有效的方法的第一种，delitto perfetto(Storici，F.等，Nat Biotechnol，19，773-776(2001))示意性图解在图10A中。在该方法中，在靶DNA位点引入双链断裂提高重组数个数量级。
本文使用的delitto perfetto方法使用如此构建体：其在CORE盒侧翼具有与靶基因座上游区域同源的50bp序列和与靶基因座下游区域同源的50bp序列，所述CORE盒包括：被特定核酸内切酶识别的核酸序列、诱导型启动子、诱导型启动子控制下编码特定核酸内切酶的基因和选择/反选择标记(图10A)。因此，设计该盒，以便一旦诱导核酸内切酶表达，核酸内切酶在盒中它的识别位点处切割，生成双链断裂并在期望的位点处增加重组效率。
a.生成dellitto perfetto盒
通过融合PCR以使包含GAL1启动子(诱导启动子)和I-SceI基因(核酸内切酶-编码基因)的第一片段，与URA3(选择/反选择标记)基因片段融合生成delitto perfetto诱变盒。使用在上面表13中列出的引物URA-F和URA-R，如在上面实施例4A中描述从质粒pRS306中扩增URA3基因片段(1,066bp)。使用在表13中列出的引物GaI-F和GaI-R，从质粒pGSKU(描述在Storici等，PNAS USA，100，14994-14999(2003)中)扩增包含GAL1启动子和I-SceI基因(GAL1 II-SceI基因片段)的1,184bp片段。使用基本上如在Shevchuk等，Nucleic Acids Res，32，e19(2004)中描述的重组PCR技术进行融合PCR。
b.第一轮转化
使用乙酸锂整合转化，将盒引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株中。选择单独的Ura+转化体并使用在上面表13中列出的诊断引物Seq-F和Seq-R(在图10A中在插入位点侧翼的小的单箭头所示)，通过PCR分析，以确认基因已经在供体基因组正确的位置处插入。使用这些引物PCR包含插入盒的基因组将产生2.5kb的产物。来自PCR反应的产物在琼脂糖凝胶上分开，其被显现以验证正确插入URA3基因。
c.诱导核酸内切酶表达和第二轮转化
在用诊断引物的PCR反应中测试阳性的克隆在SD/半乳糖/-HIS培养基中生长4小时，以诱导表达I-SecI核酸内切酶，其被GAL1启动子控制并因此当在包含半乳糖作为唯一碳源的培养基中生长时表达。诱导的核酸内切酶表达拟通过在盒中切割就在与基因组同源的区域下游的18bp识别序列，产生双链断裂。诱导之后，野生型DNA片段被转化入细胞，如在上面实施例4A中所描述的。
细胞在包含FOA的SD-HIS平板上生长，以选择已经丢失URA3标记的细胞，如在实施例4A中所描述的。进行使用Seq-F和Seq-R引物的诊断PCR，以确定选择的FOA抗性细胞是否包含其中盒已经被野生型片段(其将已经产生400碱基对的PCR产物)置换的基因组。如在上面表14中所指示的，60个测试的FOA抗性分离物中没有一个产生正确大小的扩增子。结果显示来自60个FOA抗性分离物的生殖器支原体基因组包含不精确的CDS 139基因座缺失。
ii.串联重复突出
第二种报道的无缝缺失方法，串联重复突出，基于通过两条串联重复序列之间同源重组(HR)的核酸片段的精确切除，并在Akada等，Yeast，23，399-405(2006)中描述。该技术可适合用于基因置换。利用该方法，在包含生殖器支原体基因组的相同酵母菌株中进行CDS 139基因座的无缝缺失，而不是校正单碱基缺失。
a.通过融合PCR生成串联重复盒
生成融合产物，其包含URA3标记和与就在靶基因座的上游的部分同源的358bp片段(“重复”片段)(在图10B中标注为“重复”的大箭头)。使用在实施例4A中描述的相同方法，使用Ura-F和Ura-R引物(表13)，通过PCR产生1,066bp URA3标记片段。用在表13中列出的Amp-F和Seq-R引物，通过PCR扩增产生358bp重复片段。
使用如在上述实施例4B(i)中描述的重组PCR技术，通过融合PCR，如下连接两部分。首先，在上面表13中列出的每个包含与URA3基因和“重复”片段同源的部分的嵌合融合引物Fus1和Fus2，被用在PCR中以扩增URA3基因并在另一PCR中以扩增重复片段。来自每个反应的产物包括与其他反应产物同源的区域，因为在两个扩增产物之间共享总共40碱基对的重叠同源序列。产物接着进行PCR循环，没有引物，利用低的退火温度连接产物，产生包括连接片段的融合产物。
为了生成最终诱变盒(见图10B)，融合产物使用在上面表13中列出的嵌合引物UM2-70和MUT-70进行PCR再扩增。如在那表中所显示，这些引物的每一个包含融合产物的同源物和靶区域的50碱基对(bp)同源物(5’末端；小写字母)。所得盒(图解在图10B中)按下列顺序包含靶区域的5’部分的50bp同源物(单碱基缺失的上游)、URA3标记、重复盒和靶区域3’部分的50bp同源物。以这种方向设计盒，以便一旦转化入酵母宿主细胞，用该盒置换(通过HR)生殖器支原体基因组的CDS139基因座中450碱基对靶区域可在基因组中在URA3选择标记的侧翼产生包含两个串联重复序列的区域(在图14B中标注为“重复”的大箭头)。包括串联重复序列以通过两个重复序列之间的同源重组帮助缺失(突出)盒。这种事件可除去URA3标记并可通过在包含FOA的培养基中生长进行选择。
b.转化和分析
使用乙酸锂整合转化，将盒引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株中。选择单独的Ura+转化体并使用在上面表13中列出的诊断引物Seq-F和M2-detl-R(在图10B中在插入位点侧翼的小的单箭头所示)，通过PCR分析，以确认基因已经在供体基因组正确的位置处插入。利用这些引物的野生型基因组的PCR将产生1kb产物。另一方面，包含插入盒的基因组PCR产生1.973kb产物。来自PCR反应的产物在琼脂糖凝胶上分开，其被显现以验证正确插入URA3基因。
通过对正确插入的PCR检测阳性的细胞在包含FOA的SD-HIS平板上生长，以选择丢失URA3标记的细胞，如在实施例4A中所描述。进行使用引物Seq-F和M2-detl的诊断PCR，以确定选择的FOA抗性细胞是否包含其中盒已经缺失留下靶区域的450碱基对部分的无缝缺失。利用这些引物，对其中已经发生精确缺失的基因组PCR将产生0.55kb产物。如在上面表14中指示的，在该PCR扩增中，38个FOA抗性分离物中没有一个产生产物。
如在实施例4A中描述，对来自9个FOA抗性分离物的DNA进行MPCR。如在上面表14中指示的，这9个分离中只有1个产生完整复制子(所有10个产物)。不存在完整复制子表明，在供体基因组自身中的重复序列之间发生了重组。该结果表明在URA3标记侧翼的串联重复序列之间的重组频率比在生殖器支原体基因组中重复序列间的重组低得多。
总的来说，来自在实施例4A和该实施例(4B)所描述研究的结果表明，基于URA3/FOA系统的已知方法在该特定系统中不足以在这些酵母宿主细胞中操作并改造生殖器支原体供体基因组，且在这些研究中回收的大部分FOA抗性集落在操作过程期间通过不希望的重组事件非特异性丢失URA3标记，表明需要用于在酵母宿主细胞中修饰供体基因组的改进方法。
实施例4C
使用串联重复和核酸内切酶切割(TREC)的修饰方法
基于在实施例4A和4B中所描述研究的结果，可推断在突出方法中(实施例4B(ii))希望的串联重复之间的重组频率可通过在靶基因座附近引入双链断裂而提高。提供的是这样的方法(TREC)，其使用串联重复和核酸内切酶切割(TREC)并可用于在酵母宿主细胞中修饰供体核酸。该实施例描述了使用该提供的方法在酵母中修饰在生殖器支原体供体基因组中相同靶基因座。研究结果确认通过在该系统中的串联重复在靶位点附近引入ds断裂增加了重组效率。
设计方法以当对URA3标记反选择时减少非特异性本底丢失，并在靶位点附近制造串联重复序列和双链断裂二者，其大大提高了靶特异性重组的效率和特异性。该TREC方法在酵母中足够有效地无缝改造生殖器支原体基因组。
i.生成TREC盒
在另一实施例中，通过使(GAL1/I-SceI)-URA3融合产物(如在实施例4B(i)中描述生产的)与358bp位于靶基因座的上游的“重复”片段(在实施例4B(ii)中描述)融合，生成TREC诱变构建体。如下通过融合PCR进行(GAL1/I-SceI)-URA3产物和重复片段的融合。每个具有与(GAL1A-SceI)-URA3融合产物和重复片段同源的部分的嵌合引物Fus1和Fus2(列在上面表13中)，被用在利用(GAL1 A-SceI)-URA3融合产物作为模板的PCR扩增中和在另一利用“重复”片段作为模板的PCR扩增中。产物接着进行无引物PCR，如在上面实施例4A和4B中所描述的，以生成((GAL1/I-SceI)-URA3)-重复融合产物。
((GAL1A-SceI)-URA3)-重复融合产物接着使用列在上面表13中的Sce-Intl和MUT-70引物扩增。如在那表中所显示，这些引物的每个包含((GAL1/I-SceI)-URA3)-重复融合产物的同源物和在靶区域的末端部分(5’小写部分)的5’50碱基对(bp)同源物。Sce-Intl引物还包括I-SceI识别位点(下划线)。
所得到的TREC盒(图解在图10C中)按下列顺序包含：靶区域的5’部分的50bp同源物(单碱基缺失的上游)、CORE盒(由18bp I-SceI识别位点、GAL1启动子、编码I-SceI核酸内切酶的基因和URA3标记)、“重复”(与恰好靶野生型基因座上游基因组序列同源的358bp部分)和靶区域3’部分的50bp同源物(被校正的单碱基缺失的下游)。
因此，设计该盒以便一旦转化入酵母宿主细胞，用该盒置换(通过HR)在生殖器支原体基因组CDS 139基因座中450碱基对靶区域，将在基因组中产生包含2个在URA3选择标记侧翼的串联重复序列(在图10B中标注为“重复”的大箭头)和核酸内切酶切割位点的区域，所述切割位点可通过在半乳糖中生长促进核酸内切酶表达而被诱导切割。如在串联重复突出方法中，包括串联重复序列，以允许通过两个重复序列之间的同源重组无缝缺失。如在delitto perfetto方法中，包括诱导核酸内切酶基因和核酸内切酶识别位点以允许在期望重组的位点处诱导产生双链断裂。通过在包含FOA的培养基上生长，选择通过重组的无缝缺失。
ii.转化和选择
使用乙酸锂整合转化，将TREC盒引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株。选择单独的Ura+转化体并使用在上面表13中列出的诊断引物Seq-F和M2-detl(在图10C中在插入位点侧翼的小的单箭头所示)，通过PCR分析，以确认基因已经在供体基因组正确的位置处插入。使用这些引物PCR包含插入TREC盒的基因组将产生2.884kb产物。来自PCR反应的产物在琼脂糖凝胶上分开，其被显现以验证正确插入URA3基因。
iii.诱导核酸内切酶表达、FOA选择和评估
克隆接着在包含SG(合成的半乳糖)-His和SD-HIS(包含葡萄糖)的平板上影印培养，并生长24小时。在包含半乳糖作为唯一碳源的SG培养基上进行生长，以诱导GAL1启动子控制的I-SecI核酸内切酶的表达。在相同的条件下在SD-HIS平板上进行生长，作为对照。核酸内切酶表达拟通过切割在盒中恰好位于与基因组同源区域的下游的18bp识别序列，产生双链断裂。温育24小时以后，诱导的和对照(未诱导的)细胞在包含FOA(SD-HIS+FOA)的SD-HIS平板上影印培养，以选择已经丢失URA3标记的细胞，如在实施例4A中描述的。
已经经历半乳糖诱导的细胞当在SD-HIS+FOA上生长时产生大量集落。另一方面，对照细胞，产生很少的集落。细胞被再划线(restreak)以获得源于诱导和未诱导细胞的FOA抗性单集落。使用Seq-F和M2-detl诊断引物(列在上面表13中)进行诊断PCR以确定选择的FOA抗性细胞是否包含其中TREC盒已被除去产生靶基因座的部分无缝缺失的基因组。包含无缝缺失的基因组的PCR产生0.55kb产物。所有来自半乳糖诱导细胞检测的24个集落包含具有希望修饰的生殖器支原体基因组。从未诱导的细胞中只分离到2个阳性克隆。
通过MPCR对诊断PCR分析检测的前10个诱导的和未诱导的克隆进一步分析生殖器支原体基因组的完整性，如在上面实施例4A和4B中所描述的。来自所有10个检测的半乳糖诱导集落的DNA的PCR产生完整复制子(所有10扩增子)；对来自未诱导细胞DNA进行PCR不生成全部的复制子(数据未显示)。这些结果总结在上面表14中。结果表明在酵母宿主细胞中部分细菌供体基因组被成功高效进行无缝缺失。
iv.示例性TREC
装配完全合成的生殖器支原体基因组(大约583kb)并作为环状质粒克隆在酵母——酿酒酵母中。通过标准的包括URA3/5-氟乳清酸(5-FOA)反选择的遗传方法改造克隆基因组的尝试已经显示了源于在酵母中保持的细菌基因组自发缺失的高本底5-FOA抗性克隆。这里，我们报道一种可在酵母中高效精确地修饰细菌基因组的方法。该方法包括两个连续同源重组事件。首先，靶区域用诱变盒置换，所述诱变盒由敲除CORE(18-bp I-SceI识别位点、在GAL1启动子控制下的I-SceI基因和URA3基因)和与靶位点上游的序列相同的DNA片段组成。该置换生成在CORE侧翼的串联重复序列。第二，半乳糖诱导表达I-SceI，其在I-SceI位点生成双链断裂(DSB)。该DSB帮助重复序列之间的细胞内同源重组，导致CORE的切除。结果，它形成无缝修饰。该方法可适合各种基因组修饰，并因此提供了在酵母中修饰和设计合成基因组的可选途径。
材料和方法
酵母菌株和培养基
如之前所描述(Lartigue等(2009)Science，325，1693-1696；和Gibson等(2008)PNAS USA，105，20404-20409)，构建包含0.6Mb生殖器支原体全基因组YAC的酿酒酵母菌株VL6-48N(MATα his3-Δ200 trp1-Δl ura3-52 lys2 ade2-101met14)和W303a(MATa ade2-1 ura3-1 his3-11，15 trp1-1 leu2-3，112 can1-100 RAD5)。酵母细胞在标准丰富培养基(YEPD)和合成的葡萄糖(SD)或合成的半乳糖(SG)最小培养基中生长(Amberg等(2005)酵母遗传中的方法：冷泉港实验室过程手册 (Methods in yeast genetics；A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual).ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，pp.230)。用补充有5-氟乳清酸(5-FOA)的SD培养基对URA3基因丢失进行选择(Boeke等(1984)Mol Gen Genet，197，345-346)。
产生诱变盒
所有引物定制合成(Integrated DNA Technologies)。长度大于60bp的引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。用于构建所有诱变盒的引物总结在表13中。从质粒pRS306中扩增URA3基因(1,066bp)(描述在R.S.Sikorski和P.Hieter，Genetics 122，19(1989)中)；从质粒pYES2(Invitrogen)中扩增GAL1启动子(450bp)；从质粒pGSKU中扩增包含GAL1启动子和I-SceI基因的1,184bp片段(Storici等(2003)PNAS USA.，100，14994-14999)；和从质粒pBS185扩增Cre重组酶基因(1,032bp)(Sauer和Henderson(1990)New Biologist 2，441-449)。
用Takara Ex Taq DNA聚合酶(Takara Bio Inc.)，使用制造商推荐的条件进行所有PCR。通过具有微小改进的重组PCR技术(Shevchuk等(2004)Nucleic Acids Res，32，e19)进行基因融合。在每个基于PCR的融合情况下，互补末端重叠40bp(表13)。为了生成每个最终的诱变盒，融合产物通过每个包含靶位点的50bp同源物的嵌合引物(表13)进行PCR-再扩增。
在中间包含破折号的引物的结构是嵌合的；小写字母指示生殖器支原体同源序列；大写字母指示非同源序列；和加下划线的是I-SceI切割位点。
转化和PCR分析
根据公开的方法(Gietz等(1992)Nucleic Acids Res，20，1425)进行醋酸锂整合转化。在常规实验中使用2到3μg整合构建体DNA和25μg载体DNA(salmon testisDNA，Sigma)。根据公开的方案(Kouprina和Larionov，Nat.Protoc.3，371(2008))，如在上面实施例3中描述，从酵母中进行分离总DNA用于PCR分析。使用位于靶位点上游和下游的引物(表13)，通过PCR验证每个诱变盒的正确整合。多重PCR用于确认生殖器支原体克隆的完整性，如之前在(Gibson等(2008)PNAS USA，105，20404-20409)中描述。设计用于MPCR的引物组(组3)以产生10个扩增子(范围从125bp到1025bp，以0.1kb递增)，其围绕生殖器支原体基因组大约每60kb DNA进行分布(Gibson等，PNAS USA，105(51)：20404-9(2008))。
结果
通过传统方法改造在酵母中保持的合成生殖器支原体基因组中MG259基因座中的点突变涉及2个同源重组事件(图12A)。第一同源重组之后，通过PCR确认用URA3基因精确置换合成基因组中的靶区域。但是，第二轮同源重组之后，我们不能通过从5-FOA抗性集落PCR筛选鉴定URA3基因被DNA片段正确置换(图12B和表15)。
表15：数种酵母DNA修饰方法在酵母中改造生殖器支原体基因组的效率
Figure BPA00001462307601331
单一PCR引物组用于分析FOA+克隆的正确置换。10个引物对用于多重PCR分析。产生所有10个扩增子被认为是完整的基因组。
这些结果表明，在进入的DNA片段和靶位点之间不发生精确的同源重组。URA3标记的丢失可能是由于不期望的缺失。在酵母中作为环状YAC增殖的生殖器支原体基因组，除了组氨酸原养型，对它的宿主没有功能上的补充。细菌基因组的任何缺失和重排对于酵母宿主生存可能是中性的。多重PCR用于在酵母中评估生殖器支原体基因组的完整性。设计引物组以产生10个扩增子(范围从125bp到1025bp，以0.1kb递增)，其围绕生殖器支原体基因组大约每60kb分布。从22个5-FOA-抗性集落制备的总DNA不产生所有10个扩增子(图12C)。在所有克隆中丢失了两个扩增子，0.525和0.625kb(在生殖器支原体基因组中邻近)。MG259基因座位于0.65kb扩增子的上游3kb处。该结果表明在酵母中增殖的生殖器支原体基因组中发生了一些自发缺失或重排。URA3标记的丢失可能由于在生殖器支原体基因组中重复序列之间的同源重组。结果，具有URA3标记缺失的细胞可在5-FOA培养基上生存。URA 3基因非特异性丢失的概率比URA3被进入的DNA片段置换的概率更高(图12D)。我们还采用两种其他方法改造相同的基因座并产生点突变或450bp缺失，分别通过delitto perfetto或串联重复突出方法进行(策略描绘在图10A和10B中)。但是，我们不能通过PCR筛选5-FOA抗性集落，鉴定任何正确的修饰(表15)。从而，我们得出结论，大部分5-FOA-抗性集落源于在操作过程期间非特异性丢失URA3标记的细胞。
通过在靶位点附近引入DSB，两个串联重复之间的重组频率可能会大大提高。因此，我们结合两个策略——串联重复突出方法和delitto perfetto方法。通过融合CORE盒与靶位点上游358bpDNA，产生诱变构建体。用该构建体置换450bp靶区域将产生两个围绕CORE的重复序列，所述CORE包含I-SceI识别位点(图13)。接着，重复之间的同源重组将产生无缝缺失。转化诱变构建体进入酵母之后，在SG-负HIS琼脂上诱导I-SceI核酸内切酶表达。24-小时温育之后，细胞在SD-负HIS+5-FOA琼脂上影印培养。在SD-HIS+5-FOA琼脂上用半乳糖诱导细胞比未诱导的细胞明显产生更多的集落(数据未显示)。源于诱导细胞和未诱导细胞的5-FOA抗性细胞被再划线并选择和分析单集落。通过PCR鉴定具有正确缺失的转化体。具有精确除去CORE盒的DNA将导致生成0.55kb扩增子。源于半乳糖诱导细胞的所有24个集落包含生殖器支原体基因组正确的修饰；从源于未诱导细胞的集落中只分离2个阳性克隆(数据未显示)。通过多重PCR进一步评估生殖器支原体基因组完整性。被检测的来自10个诱导克隆的DNA产生全部10个扩增子组。来自未诱导细胞的DNA不生成全部的10个扩增子组(数据未显示)。因此，来自两个PCR分析的结果表明TREC方法可对克隆入酵母的细菌基因组进行高效的无缝缺失(表15)。
最后，比较了在酵母中克隆的细菌基因组的缺失方面，TREC方法的效率和Cre-LoxP系统的效率。Cre-LoxP系统是高效位点特异性重组方法。它已经成功地在宽范围的生物中用于除去选择标记和大的基因组DNA片段(Gueldener等(2002)Nucleic Acids Res，30，e23)。通过两轮PCR制造诱变构建体(材料和方法)。它由URA3标记、在GAL1启动子控制下的Cre基因和以与靶位点同源的两个末端序列为侧翼的两个突变体LoxP位点组成(图15)。突变体LoxP位点防止反向重组事件(Araki等(1997)Nucleic Acids Res，25，868-872)。
之前被修饰的相同区域被该构建体靶向。进行类似的过程和分析以产生和检测位点特异性缺失。PCR分析显示93％(28/30)的5-FOA抗性分离物包含期望的缺失，且多重PCR结果表明100％(4/4)具有正确缺失的分离物包含完整的生殖器支原体基因组(表15)。综上所述，在改造在酵母中克隆的生殖器支原体基因组方面，TREC方法的效率与Cre-LoxP系统的效率相当。
无缝基因组改造通常需要可被选择并随后被除去的反选择标记。几种现有适合反选择URA3/5-FOA系统的方法已经成功地表明用于在酵母染色体中修饰(Rothstein(1991)Methods Enzymol，194，281-301)。但是，我们已经指出这些方法不适合改造游离地(episomally)保持在酵母中的生殖器支原体基因组。显示合成的生殖器支原体基因组稳定地保持在酵母中，即使基因组包含达到4％的重复序列(Peterson等(1995)PNAS USA，92，11829-11833)。因此，当保持在酵母中时，自发缺失或重排仍可以以低频率发生。这将在操作过程期间潜在地生成不需要的URA3-负克隆并从而使5-FOA选择位点特异性诱变复杂化。
我们证明TREC方法可有效地在酵母中生成生殖器支原体基因组的无缝修饰。它是一种简单的方法，只需要一次转化并适合其他种类的修饰(插入、基因置换或点突变)。诱变构建体的制备少于一天。事实上，不进行融合反应，我们发现共转化CORE盒和彼此重叠的50bp重复片段足够获得正确的置换(数据未显示)。当使用TREC方法时高频率的同源重组主要归因于事实：原则上，在诱导DSB期间每个细胞参与修复且修复底物(重复序列和DSB)非常接近。TREC的性能与Cre/LoxP系统相当。但是，因为TREC不留下痕(scar)，它比Cre/LoxP系统对于基因组改造方面更加有价值。最近，一种新的方法，称作MIRAGE，被显示高效产生酵母基因组的无缝修饰。该方法基于在以两个短串联重复为侧翼的靶位点附近引入反向重复。不稳地反向重复大大促进了两个串联重复之间的切除。但是，由于复制滑动，反向重复序列也引入了不精确缺失的潜在问题(Gordenin等(1992)PNAS USA，89，3785-3789)。使用MIRAGE方法的另一种缺点是产生敲除构建体耗费时间，因为它需要两天制备。
输送携带作为YAC的工程细菌基因组回到它的初始细胞可确定基因和基因簇的功能和调节(Vrancic等(2008)Food Tech Biotechnol 46，237-251)。无缝修饰是改造YAC有利的方式，因为在改造位点保留额外的序列可潜在地产生预料不到的结果。另外，许多高等真核细胞染色体包含很大部分重复序列。这里描述的方法对于修饰克隆入酵母的它们的基因(一种或多种)是有益的。我们也已经应用该方法在克隆入酵母的蕈状支原体大集落(蕈状支原体LC)基因组中生成III型限制酶的无缝缺失。通过测序确认精确的缺失。随后的基因组移植制造了具有基因组缺失的蕈状支原体LC菌株，其由于在该生物中有限的遗传工具，在宿主细胞中难以制造(Lartigue等(2009)Science，325：1693)。酵母已经成功地表明作为用于装配生殖器支原体全基因组的宿主。TREC提供了设计可用于制造合成细胞的合成基因组的补充方式。
酵母的使用比大肠杆菌提供了优势，因为在大肠杆菌中克隆大于300kb的外源DNA不常见，其限制了它的应用。另一方面，酵母细胞提供了百万碱基对克隆的能力。
实施例4D
Cre-LoxP修饰系统
为了比较，已知的用于细菌基因组修饰的修饰系统Cre-LoxP系统，用于在酵母宿主细胞中修饰相同的细菌基因组。Cre-LoxP系统是已知有效的位点特异性重组方法，其已经成功地在大量不同生物中用于除去选择标记和大的基因组DNA片段。见Gueldener等，Nucleic Acids Res，30，e23(2002)。
通过两轮PCR反应，产生具有突变体LoxP基因的Cre-LoxP诱变构建体，如在之前实施例中所描述的。突变体LoxP防止反向重组事件，如在Araki，K.等，Nucleic Acids Res，25，868-872(1997)中所描述的。
i.生成Cre-LoxP盒
使用Cre-F和Cre-R引物(表13)，从质粒pBS185(Sauer和Henderson.NewBiologist 2，441-449(1990))扩增Cre重组酶基因ORF片段(1,032bp)，使用引物Gal-F和Gal-R(表13)，从质粒pYES2(Invitrogen，Carlsbad，CA)扩增GAL1启动子(450bp)，和如在之前实施例中描述的，通过使用Ura-F和Ura-R引物(表13)的PCR产生1066bp URA3基因片段，产生loxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE诱变盒。
使用Cre-Fus2和Cre-Fus4引物(表13)的PCR融合生成GAL1-Cre-URA3融合产物，并通过使用嵌合引物Lox-F和Lox-R(表13)扩增融合产物，引入突变体LoxP位点，所述嵌合引物包含与GAL1-Cre-URA3融合产物和突变体LoxP位点同源的部分。该扩增生成LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-LoxP-LE融合产物。该融合产物接着使用在上面表13中列出的Int-F2和Int-R2引物扩增。如在那表中所显示，这些引物的每个包含LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-LoxP-LE融合产物的同源物和5’50碱基对(bp)靶区域同源片段(小写字母类型)。
所得LoxP-RE-GAL1-Cre-URA3-LoxP-LE诱变盒(在图10D中图解)按下列顺序包含：靶区域的5’部分的50bp同源物(单碱基缺失的上游)、第一LoxP位点(LoxP-RE)、GAL1启动子、Cre重组酶基因ORF、URA3标记、第二LoxP位点(LoxP-LE)和靶区域3’部分的50bp同源物(单碱基缺失的下游)。因此，设计该盒以便一旦转化入酵母宿主细胞，用该盒置换(通过HR)在生殖器支原体基因组CDS139基因座中450碱基对靶区域，将在基因组中产生包含loxP位点的区域，可通过在半乳糖中生长诱导从相同盒的表达Cre，诱导地靶向该位点进行重组和缺失。可通过在FOA培养基上生长，选择包含URA3标记的盒的缺失。
ii.转化和选择
使用乙酸锂整合转化，将LoxP-Cre盒引入包含生殖器支原体基因组的酵母菌株。选择单独的Ura+转化体并使用诊断引物Seq-F和M2-detl(在图10D中在插入位点侧翼小的单箭头示出并在表13中列出)，通过PCR分析，以确认基因已经在供体基因组正确的位置处插入。包含插入LoxP-Cre盒的基因组的这种PCR可产生3.068kb产物。来自PCR反应的产物在琼脂糖凝胶上分开，其被显现以验证正确插入盒。
iii.诱导核酸内切酶表达、FOA选择和评估
克隆接着在包含SG(合成的半乳糖)-His和SD-HIS(包含葡萄糖)的平板上影印培养并生长24小时。在包含半乳糖作为唯一碳源的SG培养基上进行生长，以诱导GAL1启动子控制的Cre重组酶的表达。意图表达重组酶以在盒内LoxP位点诱导重组。诱导之后，细胞在包含FOA(SD-HIS+FOA)的SD-HIS平板上影印培养以选择已经丢失URA3标记的细胞，如在实施例4A中描述的。
使用Seq-F和M2-detl引物(表13)，对5-FOA抗性集落进行诊断PCR(如在实施例4A-C中所描述的)，以确定选择的FOA抗性细胞是否包含其中盒已经被除去、产生部分靶基因座的无缝缺失的基因组。如在表14中所提供的，结果表明93％所测试的5-FOA-抗性分离物(28/30)包含期望的缺失。
通过对4个通过诊断PCR分析检测为阳性的克隆进行MPCR，进一步分析生殖器支原体基因组的完整性，如在上面实施例4A和4B中所描述的。如在上面表14中所显示的，100％(4/4)这些集落包含所有10个扩增子，证明基因组的完整性。
来自在实施例4C和4D中提供的研究结果表明，对于在酵母宿主细胞中修饰支原体基因组，所提供TREC方法(其是简单的方法，可用1次转化进行，并适合缺失、插入、基因置换和点突变)的效率，如果不大于的话，那么等于熟知的cre-LoxP修饰方法的效率。但是，不像Cre-LoxP方法，TREC方法产生无缝修饰，使得它格外有优势。
实施例5
转移供体基因组进入宿主细胞、在宿主细胞中通过TREC修饰并移植进入受体细胞
该实施例描述了使用所提供的用于转移供体基因组进入宿主细胞、在宿主细胞中修饰供体基因组(TREC修饰)和移植供体基因组进入受体细胞的方法的组合，操作供体基因组。该方法用于在酵母中成功地改造之前在实验室或自然中不存在的蕈状支原体LC基因组。如下面所描述，从在已经被克隆入酵母宿主细胞的供体蕈状支原体LC基因组，缺失III型限制酶基因。选择III型限制酶基因，因为预期它对于生存和移植不是必需的。修饰的基因组接着被移植入山羊支原体受体细胞，产生包含修饰的全基因组的新细胞。
实施例5A
转移供体基因组进入宿主并修饰基因组
将蕈状支原体LC-YCp基因组转移到酵母菌株W303a并在其中增殖，如在上面实施例1A中所描述的。
在一种实施例中，使用在上面实施例4C中描述的TREC方法，用包含URA3标记的盒置换III型限制酶基因，URA3标记随后通过5-氟乳清酸(5-FOA)选择被除去。对于示意性图解在图11中的该过程，通过如在上述实施例4C中所描述的PCR融合生成TREC敲除盒，细节如下。首先生成CORE盒(按顺序包含GAL1基因、SceI基因和URA3标记)。
还通过PCR生成串联重复序列(TRS)片段。该片段包含与III型限制酶靶基因座上游的蕈状支原体LC基因组的部分的同源物。TRS片段和在靶区域上游的基因组中对应的同源部分在图11中用大的水平箭头标注。包括TRS片段，以便通过同源重组将盒整合进入基因组之后在基因组中存在串联重复，以通过重组促进盒突出。
CORE盒通过在上面实施例4中描述的融合PCR与TRS片段融合。融合引物接着在使用CORE盒作为模板的PCR和使用TRS片段作为模板的另一个PCR中使用。产物接着被结合并进行无引物PCR以连接产物。所得融合产物接着使用另外的包含与CORE-TRS融合产物同源和与靶区域同源的50bp区域的引物进行扩增。该引物还包括18bp I-SceI识别位点。因此，TREC敲除盒按下列顺序包括：靶区域的5’部分的50bp同源物、18bp I-SceI识别位点、CORE盒(按该顺序由：GAL1启动子、编码I-SceI核酸内切酶的基因和URA3标记组成)、TRS重复片段(与刚好在靶基因座上游的基因组序列同源的部分；在图10A中用大的水平夹头指示)和靶区域3’部分的50bp同源物。
为了在酵母W303a宿主中修饰蕈状支原体LC-YCp供体基因组，使用乙酸锂整合转化，将TREC敲除盒转化入宿主细胞，如在上面实施例4C(ii)中所描述。为了选择用TREC敲除盒置换TypeR III ORF(靶基因座)(通过在盒的末端与靶位点50-bp同源的区域)，生长细胞，选择单独的URA+转化体并分析。该过程产生其中III型限制酶基因已经被盒置换的基因组(在图11中标注为typeIIIres::URA3)。
细胞接着在包含SG-His培养基的平板上生长，以便半乳糖是唯一的碳源。该步骤诱导受GAL1启动子控制下的I-SceI核酸内切酶的表达，以促进切割18-bpI-SceI位点(图11中星号)，制造双链断裂。双链断裂接着可促进串联重复序列(水平大箭头)之间的同源重组，通过双链断裂促进。
为了选择该重组事件，细胞在SD-HIS 5-FOA培养基上生长以选择丢失URA3标记的细胞，其被推测已经丢失TREC盒。进行该过程以选择其中已经无缝缺失typeIIIres基因的基因组(在图11中标注为ΔtypelllR)。
在另一种实施例中，以3个步骤构建敲除盒。第一，通过使用引物RCO293(
Figure BPA00001462307601391
TAGGGATAACAGGGTAATACGGAT；SEQ ID NO：152)和引物RCO294(ATCTTGTCTATTTAATTCTAAAACAGGGTAATAACTATATAATTAA ATTGAAG：SEQ ID NO：153)的PCR，产生被称作敲除核心(KOC)的2.3kb DNA片段。所得PCR产物从5’末端开始包含与5’靶位点上游同源的50bp片段(在引物RCO293中用黑体突出)、18bp I-SceI识别位点、GAL1启动子、编码I-SceI回归核酸内切酶的基因和URA3标记。第二，通过引物RCO295(AATTTAATTATATCAGTTATTACCCTGTTTTAGAATTAAATAGACA AGATAATGG；SEQ ID NO：154)和引物RCO296(
Figure BPA00001462307601393
Figure BPA00001462307601394
GCACTACAAATTCTTGTTTATTAGTTA；SEQ ID NO：155)，使用蕈状支原体LC基因组DNA作为模板扩增靶位点上游的400-bp。被称作串联重复序列(TRS)的PCR产物包含与3’靶位点下游同源的50bp片段(在引物RCO296中用黑体突出)。第三，彼此重叠50bp的两个PCR产物KOC和TRS(在引物RCO294和RCO295中加下划线)，通过基于PCR的融合方法连接在一起。融合产物——敲除盒——通过来自Qiagen的凝胶提取试剂盒凝胶-纯化，且通过引物RCO293和引物RCO296再扩增。最终2.7kb片段接着使用如(Gietz等，Nucleic Acids Res 20，1425(Mar 25，1992))描述的乙酸锂(LioAc)方法，转化入包含蕈状支原体LC基因组的酵母303a菌株(Benders等，Science，submitted(2009))，并且选择尿嘧啶和组氨酸原养型二者。如(Kouprina和Larionov，Nat Protoc 3，371(2008))描述，从转化体中制备总DNA。通过使用位于靶位点上游的引物5(GATTTTTATGCTGGATCTGGAACA；SEQ ID NO：192)，和处在敲除盒内的引物6(TCCGTATTACCCTGTTATCCCTA；SEQ ID NO：193)的PCR筛选，确认用III型RE基因座置换敲除盒。为了制造III型RE的无标记缺失，PCR阳性菌株在包含半乳糖作为唯一碳源的培养基上生长，接着5-FOA反选择，如在实施例4中所描述。上述所有PCR扩增实验使用Phusion DNA聚合酶(NewEngland Biolabs)进行。使用引物5和位于靶位点下游的引物7(CTACTTCAAATAGTATTCTTTTAAGCG；SEQ ID NO：194)，通过PCR扩增来自转化体的纯化的蕈状支原体LC基因组。通过试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物并用于使用引物5和7测序。
因此，设计修饰方法以在酵母宿主细胞中产生两个修饰的蕈状支原体LC基因组。第一修饰的基因组是插入TREC盒之后但是在通过I-secI核酸内切酶消化促进的重组和在5-FOA上选择之前获得的基因组。该第一基因组包含包括URA3的(TREC)盒，其已经在III型限制酶基因座置换野生型基因(ΔtypeIIIres::URA)。第二基因组是除去盒之后获得的最终产物，其包含III型限制酶基因的无缝缺失(ΔtypeIIIres)。
为了表明在该研究中产生的修饰基因组(ΔtypeIIIres::URA，ΔtypeIIIres)为正确的大小，分离的基因组DNA在CHEF凝胶上如下电泳，以比较它们的大小和未修饰蕈状支原体LC基因组的大小。对于该过程，漂洗酵母插块并用50单位AsiSI、RsrII和FseI限制酶(如上所述，其特异性切割酵母基因组DNA)消化过夜。DNA插块接着加样到1％的TAE琼脂糖凝胶中以通过使消化的酵母基因组DNA片段电泳到外面纯化供体DNA。插块从孔中移出且残留的基因组DNA用PspXI限制酶消化，其使蕈状支原体LC基因组DNA线性化。该消化之后，漂洗所有插块并加样至脉冲场凝胶。凝胶用SYBR Gold(稀释1∶10,000)染色。用GE Typhoon 9410图像仪扫描凝胶之后观察PFGE图案(数据未显示)。
设计具有ΔtypeIIIres::URA和ΔtypeIIIres修饰基因组的样品正确地展示具有与未修饰基因组相当大小的基因组。该过程进一步显示在研究过程期间已经产生了另一克隆(Δ500kb)。基于从该克隆回收的带的大小，它的基因组包含500kb缺失。该克隆在后面研究中用作对照，因为推测它缺少许多必需基因但是保留YCp(酵母着丝粒质粒)元件和tetM选择标记。
生成III型限制酶缺失的另一实施例在图19中图解。通过在非必需III型限制性内切酶基因中制造无缝缺失，在酵母中改造YCpMmyc1.1。简单地，YCpMmyc1.1酵母克隆首先用包含URA3标记和受GAL1启动子控制的SCEI核酸内切酶基因的盒转化。盒插入III型基因用作选择标准；5个克隆的4个包含完整的基因组，和1个包含具有大缺失的基因组(YCpMmyc1.1-Δ500kb)(图11)。通过在靠近盒一端的I-SceI识别位点切割，除去URA3盒(图19)。用5-氟乳清酸(5-FOA)反选择产生已经丢失URA3盒的克隆。因此，获得两个蕈状支原体YCp基因组：一个包含URA3盒和另一个包含III型限制酶基因的无缝缺失(图19)。通过PCR验证基因组的该变化(数据未显示)。
实施例5B
将修饰的基因组移植入供体细胞
使用在上面实施例3中描述的方法，使这些蕈状支原体LC修饰的基因组(包括Δ500kb对照)和未修饰的蕈状支原体LC基因组移植入山羊支原体受体细胞。使用在上面实施例3中描述的、图解在图8中用数字“3”指示的第三方案进行移植。如在实施例3中所描述的，该方法在移植反应之前，包括甲基化步骤、去蛋白步骤(用蛋白酶K处理)和熔解步骤。移植是进入野生型受体细胞。对于该过程，按照在实施例3A(i)中描述的，制备琼脂糖插块，并用限制酶混合物和凝胶电泳二者清理，如在上面实施例5A中所描述(也参见实施例3A(i))。如在实施例3A(ii)和3A(iii)中所描述的，在存在5％PEG情况下，进行移植，用无细胞蕈状支原体LC提取物甲基化并蛋白酶K消化。如在上面实施例3中所描述的，将基因组被移植入野生型(非RE-缺陷)山羊支原体细胞。通过在37℃下，在包含四环素的SP4培养基上选择蓝色集落的生长，评估成功移植。结果在下面表17中提供。
表17
移植修饰的蕈状支原体LC基因组进入野生型山羊支原体受体细胞
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移植体的数量代表至少3个研究的平均。报告的误差是平均偏差。
如在表17中显示，两个意图修饰的基因组(ΔtypeIIIres::URA3和ΔtypeIIIres)的移植产生四环素-抗性蓝色集落的数量(每个插块的集落平均分别为28和33)与当移植未修饰的蕈状支原体LC基因组时所观察到的数量(每个插块的集落平均为28)相似。如所预料的，移植包含500kb缺失(并推测缺少必需支原体基因但保留YCp元件和tetM)的对照克隆进入山羊支原体受体细胞不产生集落。
为了验证所选择的包含移植修饰基因组的集落的序列，对在这些基因组中的III型基因座测序。测序结果显示，在两种修饰的菌株(ΔtypeIIIres::URA3和ΔtypeIIIres)中都存在预期的修饰。例如，验证在ΔtypeIIIres基因组中typeIIIres基因的缺失，其具有包含邻近野生型基因组中typeIIIres基因的typeIIImod基因和天然typeIIIres基因下游的DNA连接(见图11)的核酸序列，这证明那基因在这些细胞中无缝缺失。
为了验证回收集落的基因型是蕈状支原体LC，通过DNA印迹分析来自所选择蓝色集落的基因组DNA，其使用IS1296元件作为探针。IS1296插入序列的拷贝分散在整个蕈状支原体LC(供体)基因组，但是不存在于山羊支原体(受体)基因组。为了验证在修饰的基因组中III型限制酶序列的全部丢失，进一步用包含蕈状支原体LC typeIIIres基因序列的探针探测印迹。如下进行DNA印迹。
从10ml移植有修饰的或未修饰的蕈状支原体基因组的山羊支原体受体细胞簇中提取支原体总DNA。来自天然蕈状支原体LC克隆1.1供体细胞的基因组DNA和来自山羊支原体受体细胞的基因组DNA用作对照。使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega)进行提取。为了DNA印迹杂交，用HindIII或EcoRV消化1.5μgDNA且所得样品通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分开。通过碱转移(alkali transfer)将来自凝胶的DNA片段转移到带正电的尼龙薄膜(Nytran Super Charge，Schleicher和Schuell)。将二十(20)ng/ml洋地黄毒苷标记的DNA探针(IS 1296插入序列和typeIIIres基因序列)与薄膜杂交，以分别验证蕈状支原体基因型和供体基因组修饰。
薄膜用与碱性磷酸酶连接的抗洋地黄毒苷抗体的Fab片段温育。接着用荧光底物HNPP(2-羟基-3-萘甲酸-2’-苯基苯胺(phenylanilide)磷酸盐)(Roche MolecularBiochemicals)检测杂交。在UV下，用照相机和为获取图像设计的Quantity One软件(Bio-Rad Laboratories，Inc.)检测化学荧光。
所选择的移植集落的每个在用IS1296探针探测的印迹(数据未显示)中产生相同的图案(8条带)。如所预期的，在包含来自受体细胞(r)的泳道中没有检测到IS1296图案。该结果强烈表明，回收的集落的确是蕈状支原体LC基因型。此外，包含来自蕈状支原体供体基因组的对照样品的泳道包含被typeIIIres探针识别的带。但是，包含来自移植修饰的基因组样品的泳道中，没有检测到该带。
这些结果表明，在酵母宿主细胞中修饰的供体基因组被成功地移植入与供体是不同种类的受体细胞种。结果进一步表明两个修饰的基因组都包含意图的修饰(丢失TypeIIIres基因)。因此，提供的方法成功地用于生成两种合成受体细胞，其包含之前在实验室或自然中不存在的移植合成的供体蕈状支原体LC基因组。这些结果表明了在酵母中遗传操作细菌全基因组并安装它进入受体细胞以产生新细菌的第一个实例。
从前述描述中，本领域技术人员可确定本公开实施方式的基本特性，并在不背离其精神和范围的情况下，可做出改变和改进，以使其适应各种应用和条件，并且以最大限度地利用本系统和发明。前述具体实施方式被理解为仅仅是示意性的，不以任何方式限制本申请的范围。上面和图中所引用的所有申请、专利、公开(包括参考手册)的整体公开内容通过引用以其整体并入本文。
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Claims (29)

1.用于克隆供体基因组的方法，其包括：
作为一条或多条片段，从供体细胞获得供体基因组或合成供体基因组；和
将所述供体基因组和宿主载体引入异源宿主细胞，其中任选地所述供体基因组和所述宿主载体在引入所述宿主细胞之前连接，从而生成包含所述供体基因组的宿主细胞，所述供体基因组包含所述宿主载体，并且进一步其中所述供体基因组是基本上完整的细胞、病毒或细胞器基因组，其至少是最小基因组，且长度大于大约300kb。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体基因组是基本上全细胞、病毒或细胞器基因组。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体基因组和所述宿主载体被同时或相继引入所述宿主细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述宿主载体转化入包含所述供体基因组的供体细胞，将所述宿主载体与所述供体基因组连接，然后引入所述宿主细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或藻类细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述宿主载体是着丝粒质粒。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述宿主载体是酵母着丝粒质粒且所述宿主细胞是酵母细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主载体是可用于同源重组的载体。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述供体基因组在引入所述宿主细胞之前被线性化或断裂。
11.根据权利要求1所述的方法，其中供体基因组是细菌基因组、真菌基因组、酵母基因组、古细菌基因组、蓝细菌基因组、藻类基因组、噬菌体基因组、线粒体基因组、叶绿体基因组、病毒基因组、细胞器基因组或合成基因组。
12.根据权利要求1所述的方法，其中宿主细胞是真核细胞或原核细胞。
13.根据权利要求1-12任一项所述的方法，还包括在所述宿主细胞内修饰所述供体基因组。
14.根据权利要求1-13任一项所述的方法，还包括从所述宿主细胞回收包含所述宿主载体的所述供体基因组。
15.根据权利要求14所述的方法，还包括将回收的供体基因组引入受体细胞。
16.根据权利要求15所述的方法，还包括降解或除去所述受体细胞的内源基因组。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述回收的供体基因组在引入所述受体细胞之前被甲基化。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述受体细胞的限制性内切酶功能是不存在的、被除去的或失活的。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述受体细胞是细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞或藻类细胞。
20.根据权利要求1所述的方法，还包括将第二供体基因组引入所述宿主细胞，其中所述第二供体基因组与所述第一供体基因组不同，从而产生包含两种不同供体基因组的宿主细胞。
21.根据权利要求20所述的方法，其中引入所述第二供体基因组包括将包含所述第一供体基因组的所述宿主细胞与包含所述第二供体基因组的第二宿主细胞交配。
22.根据权利要求15-19任一项所述的方法，其中将所述回收的供体基因组引入所述受体细胞表型上将所述受体细胞转化成与并入任何修饰的所述供体基因组对应的表型。
23.通过权利要求1-22任一项所述方法产生的细胞。
24.用于在靶核酸分子中无缝引入修饰的方法，其包括：
(a)将诱变构建体和宿主载体引入宿主细胞，由此所述宿主载体与所述诱变构建体在所述宿主细胞中重组，
其中所述诱变构建体包含在修饰上游的靶核酸分子的5’部分的第一同源部分；核酸内切酶识别位点、启动子、编码所述核酸内切酶的基因和选择标记；第二同源重复部分，其与在靶基因座上游的基因组序列同源；和第三同源部分，其与在所述修饰下游的靶区域的3’部分同源；和
(b)在一定条件下温育所述细胞：(1)由此在所述第一同源部分和上游或下游部分之间发生重组，从而无缝除去所述构建体的一部分，和(2)在所述核酸分子中包含所述构建体的靶位点附近促进一个或多个双链断裂切割，
由此修饰被无缝引入所述靶核酸分子。
25.用于制造细胞的方法，所述细胞展示由供体基因组编码的表型，所述方法包括：
(a)将所述供体基因组和适合在宿主细胞中克隆所述供体基因组的宿主载体引入所述宿主细胞，这样获得包含所述供体基因组的产物，所述供体基因组包含所述宿主载体；
(b)从所述宿主细胞回收在步骤(a)中获得的所述包含供体基因组的产物，所述供体基因组包含所述宿主载体；
(c)在一定条件下，将(b)的所述产物引入受体细胞，以便所述受体细胞展示由所述产物编码的表型；和
(d)回收从步骤(c)得到的细胞；
其中所述供体基因组是基本上完整的细胞、病毒或细胞器基因组，其至少是最小基因组，且长度大于大约300kb并包含核酸物质的最小组分，所述最小组分对于所述受体细胞展示由所述供体基因组编码的表型是必需的。
26.根据权利要求25所述的方法，进一步包括在所述宿主细胞内修饰(a)的所述供体基因组。
27.根据权利要求25所述的方法，进一步包括降解或除去所述受体细胞的内源基因组。
28.细胞，其展示由供体基因组编码并且否则不会由所述细胞展示的期望表型，其中所述细胞通过权利要求25-27任一项所述的方法产生。
29.细胞，其包含供体基因组并展示由所述供体基因组编码并且否则不会由所述细胞展示的期望表型，其中所述供体基因组包含大于300kb的外源基因组核酸物质和对于所述细胞展示所述期望表型必需的最小的基因组组分。
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