JP6467460B2 - ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 - Google Patents
ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6467460B2 JP6467460B2 JP2017105163A JP2017105163A JP6467460B2 JP 6467460 B2 JP6467460 B2 JP 6467460B2 JP 2017105163 A JP2017105163 A JP 2017105163A JP 2017105163 A JP2017105163 A JP 2017105163A JP 6467460 B2 JP6467460 B2 JP 6467460B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- genome
- donor
- cell
- nucleic acid
- host
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 412
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 854
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 314
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 311
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 251
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 99
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 94
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 94
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 84
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 64
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 62
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 62
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 58
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 58
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 54
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 51
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 claims description 50
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 50
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 50
- 241000204051 Mycoplasma genitalium Species 0.000 claims description 48
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 47
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 30
- 210000002230 centromere Anatomy 0.000 claims description 27
- 230000006870 function Effects 0.000 claims description 15
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 13
- 241000204025 Mycoplasma capricolum Species 0.000 claims description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 12
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 claims description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims description 8
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 4
- 239000000592 Artificial Cell Substances 0.000 claims description 3
- 230000001035 methylating effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 543
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 426
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 426
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 139
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 139
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 132
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 95
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 62
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 62
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 58
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 57
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 57
- 239000000047 product Substances 0.000 description 57
- 241000202936 Mycoplasma mycoides Species 0.000 description 56
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 55
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 55
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 47
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 44
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 41
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 35
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 35
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 33
- 241000894007 species Species 0.000 description 33
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 31
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 31
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 31
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 31
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 31
- 230000008569 process Effects 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 30
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 30
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 29
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 28
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 28
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 28
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 25
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 25
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 24
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 24
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 24
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 24
- 108010044289 DNA Restriction-Modification Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 102000006465 DNA Restriction-Modification Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 22
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 22
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 22
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 22
- 101100246753 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) pyrF gene Proteins 0.000 description 21
- 241000202934 Mycoplasma pneumoniae Species 0.000 description 21
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 description 21
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 20
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 20
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 20
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 20
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 19
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 19
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 18
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 18
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 18
- 239000002585 base Substances 0.000 description 17
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 17
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 17
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 16
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 16
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 15
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 15
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 15
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 15
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 15
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 15
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 241000204003 Mycoplasmatales Species 0.000 description 14
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 14
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 14
- 108010020764 Transposases Proteins 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 13
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 13
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 13
- 101150015970 tetM gene Proteins 0.000 description 13
- 102000008579 Transposases Human genes 0.000 description 12
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 11
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 11
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 11
- 239000000446 fuel Substances 0.000 description 11
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 11
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 11
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 11
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 5-fluoroorotic acid Chemical compound OC(=O)C=1NC(=O)NC(=O)C=1F SEHFUALWMUWDKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 10
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 10
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 10
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 10
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 10
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 10
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 9
- 241000514008 Oocystis Species 0.000 description 9
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 9
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 9
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 9
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 9
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 8
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 8
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 8
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 8
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 8
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 8
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 8
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 8
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 7
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 7
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 7
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 7
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 7
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 7
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 7
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 7
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 101710110830 Beta-agarase Proteins 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- -1 IGR Proteins 0.000 description 6
- 241000899717 Itaya Species 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 101150073130 ampR gene Proteins 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 108010080909 spiralin Proteins 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 6
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 5
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 5
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 5
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 5
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 5
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 229960002181 saccharomyces boulardii Drugs 0.000 description 5
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 5
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000508318 Chlorogonium Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000204022 Mycoplasma gallisepticum Species 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 description 4
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 4
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 4
- 241000192137 Prochlorococcus marinus Species 0.000 description 4
- 241000606697 Rickettsia prowazekii Species 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- SHUMEODPCRJUBC-UHFFFAOYSA-N Spiraline Natural products C1OC(=O)C(C(C)C)(O)C(C)OC(=O)C(O)C(O)(C(C)C)C(=O)OC2CCN3C2C1=CC3 SHUMEODPCRJUBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 4
- SHUMEODPCRJUBC-JLWRCLLRSA-N ac1mj5iv Chemical compound C1OC(=O)[C@@](C(C)C)(O)[C@@H](C)OC(=O)[C@H](O)[C@](O)(C(C)C)C(=O)O[C@@H]2CCN3[C@@H]2C1=CC3 SHUMEODPCRJUBC-JLWRCLLRSA-N 0.000 description 4
- 108700021044 acyl-ACP thioesterase Proteins 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000002485 combustion reaction Methods 0.000 description 4
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000002816 fuel additive Substances 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 4
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 4
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 4
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 4
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 229940046939 rickettsia prowazekii Drugs 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QPRQEDXDYOZYLA-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutan-1-ol Chemical compound CCC(C)CO QPRQEDXDYOZYLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 102000011802 Beta-ketoacyl synthases Human genes 0.000 description 3
- 108050002233 Beta-ketoacyl synthases Proteins 0.000 description 3
- 241000531074 Chroococcidiopsis Species 0.000 description 3
- 241000206751 Chrysophyceae Species 0.000 description 3
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 241000722208 Pleurochrysis Species 0.000 description 3
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 3
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 3
- 101150026685 RAD54 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000192707 Synechococcus Species 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 3
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 3
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 description 2
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 102000004539 Acyl-CoA Oxidase Human genes 0.000 description 2
- 108020001558 Acyl-CoA oxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000192542 Anabaena Species 0.000 description 2
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 2
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 2
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 2
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 2
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 2
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 2
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000191368 Chlorobi Species 0.000 description 2
- 241001142109 Chloroflexi Species 0.000 description 2
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 2
- 241000193401 Clostridium acetobutylicum Species 0.000 description 2
- 241001644925 Corynebacterium efficiens Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108010031746 Dam methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 241000200106 Emiliania Species 0.000 description 2
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000354295 Eremosphaera Species 0.000 description 2
- GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N Geraniol Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCO GLZPCOQZEFWAFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 2
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 2
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000203054 Mesoplasma florum Species 0.000 description 2
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 2
- 241000205284 Methanosarcina acetivorans Species 0.000 description 2
- 241000192701 Microcystis Species 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 241000999862 Mycoplasma genitalium G37 Species 0.000 description 2
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 2
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 2
- 241000238413 Octopus Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 2
- 108091093037 Peptide nucleic acid Proteins 0.000 description 2
- 241000199919 Phaeophyceae Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 2
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 2
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 2
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 241000218976 Populus trichocarpa Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 2
- 241000206572 Rhodophyta Species 0.000 description 2
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 2
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 2
- 241000235072 Saccharomyces bayanus Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 241000192584 Synechocystis Species 0.000 description 2
- 241000192593 Synechocystis sp. PCC 6803 Species 0.000 description 2
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 2
- 241001491687 Thalassiosira pseudonana Species 0.000 description 2
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000192118 Trichodesmium Species 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 2
- 241000604957 Wolbachia pipientis Species 0.000 description 2
- 241000206764 Xanthophyceae Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 2
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 2
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 2
- 108010031100 chloroplast transit peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 239000000295 fuel oil Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N isobutanol Chemical compound CC(C)CO ZXEKIIBDNHEJCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101150109301 lys2 gene Proteins 0.000 description 2
- 210000000723 mammalian artificial chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 2
- ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[dodecyl(methyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCN(C)CC([O-])=O ADWNFGORSPBALY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 2
- 108091035539 telomere Proteins 0.000 description 2
- 210000003411 telomere Anatomy 0.000 description 2
- 102000055501 telomere Human genes 0.000 description 2
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 2
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 2
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-benzamido-3-(4-hydroxy-3-nitrophenyl)propanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C(O)C([N+]([O-])=O)=C1 CYNAPIVXKRLDER-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150088569 85 gene Proteins 0.000 description 1
- 108030002854 Acetoacetyl-CoA synthases Proteins 0.000 description 1
- 241001607836 Achnanthes Species 0.000 description 1
- 241000701242 Adenoviridae Species 0.000 description 1
- 241000567139 Aeropyrum pernix Species 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241000590031 Alteromonas Species 0.000 description 1
- 241000091673 Amphiprora Species 0.000 description 1
- 241000611184 Amphora Species 0.000 description 1
- 241000149144 Anabaenopsis Species 0.000 description 1
- 241000196169 Ankistrodesmus Species 0.000 description 1
- 241000256182 Anopheles gambiae Species 0.000 description 1
- 241000192660 Aphanizomenon Species 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 241000893512 Aquifex aeolicus Species 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 241000205042 Archaeoglobus fulgidus Species 0.000 description 1
- 241001495180 Arthrospira Species 0.000 description 1
- 240000002900 Arthrospira platensis Species 0.000 description 1
- 235000016425 Arthrospira platensis Nutrition 0.000 description 1
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 241001467606 Bacillariophyceae Species 0.000 description 1
- 241000206761 Bacillariophyta Species 0.000 description 1
- 241000006382 Bacillus halodurans Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 241000606124 Bacteroides fragilis Species 0.000 description 1
- 241000606123 Bacteroides thetaiotaomicron Species 0.000 description 1
- 241001518086 Bartonella henselae Species 0.000 description 1
- 241000606108 Bartonella quintana Species 0.000 description 1
- 241000604931 Bdellovibrio bacteriovorus Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241001495658 Bornetella Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241001536324 Botryococcus Species 0.000 description 1
- 241000589174 Bradyrhizobium japonicum Species 0.000 description 1
- 241000589567 Brucella abortus Species 0.000 description 1
- 241001509299 Brucella canis Species 0.000 description 1
- 241001148111 Brucella suis Species 0.000 description 1
- 241000894010 Buchnera aphidicola Species 0.000 description 1
- 241000722910 Burkholderia mallei Species 0.000 description 1
- 241001136175 Burkholderia pseudomallei Species 0.000 description 1
- 241000244201 Caenorhabditis briggsae Species 0.000 description 1
- 241000244203 Caenorhabditis elegans Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000192685 Calothrix Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 241001181533 Candidatus Blochmannia floridanus Species 0.000 description 1
- 241001468265 Candidatus Phytoplasma Species 0.000 description 1
- 241001426758 Candidatus Protochlamydia amoebophila Species 0.000 description 1
- 241001353878 Canine parainfluenza virus Species 0.000 description 1
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000218459 Carteria Species 0.000 description 1
- 241000863012 Caulobacter Species 0.000 description 1
- 108010084185 Cellulases Proteins 0.000 description 1
- 102000005575 Cellulases Human genes 0.000 description 1
- 241001611009 Chamaesiphon Species 0.000 description 1
- 201000006082 Chickenpox Diseases 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241001647371 Chlamydia caviae Species 0.000 description 1
- 201000005019 Chlamydia pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241001647372 Chlamydia pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241001647378 Chlamydia psittaci Species 0.000 description 1
- 241000195585 Chlamydomonas Species 0.000 description 1
- 241000191382 Chlorobaculum tepidum Species 0.000 description 1
- 241000180279 Chlorococcum Species 0.000 description 1
- 241000192703 Chlorogloeopsis Species 0.000 description 1
- 241000196319 Chlorophyceae Species 0.000 description 1
- 241000195628 Chlorophyta Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- 241000588881 Chromobacterium Species 0.000 description 1
- 229920000887 Chrysolaminarin Polymers 0.000 description 1
- 241000391097 Chrysosphaera Species 0.000 description 1
- 102100023336 Chymotrypsin-like elastase family member 3B Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 241000186227 Corynebacterium diphtheriae Species 0.000 description 1
- 241000606678 Coxiella burnetii Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 108010051219 Cre recombinase Proteins 0.000 description 1
- 241000973888 Crinalium Species 0.000 description 1
- 241000065719 Crocosphaera Species 0.000 description 1
- 241000199913 Crypthecodinium Species 0.000 description 1
- 241000195618 Cryptomonas Species 0.000 description 1
- 241000673115 Cryptosporidium hominis Species 0.000 description 1
- 241000223936 Cryptosporidium parvum Species 0.000 description 1
- 241000186427 Cutibacterium acnes Species 0.000 description 1
- 241000190106 Cyanidioschyzon merolae Species 0.000 description 1
- 241001464430 Cyanobacterium Species 0.000 description 1
- 241000414116 Cyanobium Species 0.000 description 1
- 241001353641 Cyanocystis Species 0.000 description 1
- 241000380046 Cyanospira Species 0.000 description 1
- 241000159506 Cyanothece Species 0.000 description 1
- 241001147476 Cyclotella Species 0.000 description 1
- 241001299740 Cylindrospermopsis Species 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 241000721041 Dactylococcopsis Species 0.000 description 1
- 241000192091 Deinococcus radiodurans Species 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 241000530784 Dermocarpella Species 0.000 description 1
- 241001662504 Desulfotalea psychrophila Species 0.000 description 1
- 241000605762 Desulfovibrio vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000199914 Dinophyceae Species 0.000 description 1
- 208000000655 Distemper Diseases 0.000 description 1
- 241000255601 Drosophila melanogaster Species 0.000 description 1
- 241000195634 Dunaliella Species 0.000 description 1
- 102100021587 Embryonic testis differentiation protein homolog A Human genes 0.000 description 1
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 1
- 241001465321 Eremothecium Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000195620 Euglena Species 0.000 description 1
- 241000195623 Euglenida Species 0.000 description 1
- 241000224472 Eustigmatophyceae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000192601 Fischerella Species 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241001466505 Fragilaria Species 0.000 description 1
- 241000589601 Francisella Species 0.000 description 1
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 description 1
- 241000605986 Fusobacterium nucleatum Species 0.000 description 1
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241001494297 Geobacter sulfurreducens Species 0.000 description 1
- 239000005792 Geraniol Substances 0.000 description 1
- GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N Geraniol Natural products CC(C)=CCC\C(C)=C/CO GLZPCOQZEFWAFX-YFHOEESVSA-N 0.000 description 1
- 241001517276 Glaucocystophyceae Species 0.000 description 1
- 241001464795 Gloeobacter violaceus Species 0.000 description 1
- 241001134702 Gloeothece Species 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000543540 Guillardia theta Species 0.000 description 1
- 206010069767 H1N1 influenza Diseases 0.000 description 1
- 101100342821 Haemonchus contortus GAL-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000205062 Halobacterium Species 0.000 description 1
- 241001106237 Halocafeteria Species 0.000 description 1
- 241000549847 Halospirulina Species 0.000 description 1
- 241000206759 Haptophyceae Species 0.000 description 1
- 241000589989 Helicobacter Species 0.000 description 1
- 241001453258 Helicobacter hepaticus Species 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700739 Hepadnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101000907951 Homo sapiens Chymotrypsin-like elastase family member 3B Proteins 0.000 description 1
- 101000898120 Homo sapiens Embryonic testis differentiation protein homolog A Proteins 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000046923 Human bocavirus Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000342334 Human metapneumovirus Species 0.000 description 1
- 241000702617 Human parvovirus B19 Species 0.000 description 1
- 241001037825 Hymenomonas Species 0.000 description 1
- 241000257303 Hymenoptera Species 0.000 description 1
- 208000004467 Infectious Canine Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241001501885 Isochrysis Species 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000235651 Lachancea waltii Species 0.000 description 1
- 241001468157 Lactobacillus johnsonii Species 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000611348 Leifsonia xyli subsp. xyli Species 0.000 description 1
- 241000936931 Lepocinclis Species 0.000 description 1
- 241000215457 Leptolyngbya Species 0.000 description 1
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 241000913084 Limnothrix Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000186805 Listeria innocua Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001134698 Lyngbya Species 0.000 description 1
- 241001344131 Magnaporthe grisea Species 0.000 description 1
- 241000220225 Malus Species 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000520876 Merismopedia Species 0.000 description 1
- 241000589195 Mesorhizobium loti Species 0.000 description 1
- 241001148031 Methanococcoides burtonii Species 0.000 description 1
- 241000897229 Methanogenium frigidum Species 0.000 description 1
- 241000204641 Methanopyrus kandleri Species 0.000 description 1
- 241000205274 Methanosarcina mazei Species 0.000 description 1
- 241001302042 Methanothermobacter thermautotrophicus Species 0.000 description 1
- 241000589346 Methylococcus capsulatus Species 0.000 description 1
- 241000586743 Micractinium Species 0.000 description 1
- 241001139348 Microchaete Species 0.000 description 1
- 241000179980 Microcoleus Species 0.000 description 1
- 241001478792 Monoraphidium Species 0.000 description 1
- 208000005647 Mumps Diseases 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 1
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 1
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 1
- 241000202964 Mycoplasma mobile Species 0.000 description 1
- 241001135743 Mycoplasma penetrans Species 0.000 description 1
- 241000432072 Mycoplasma pneumoniae M129 Species 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000511380 Myxosarcina Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196305 Nannochloris Species 0.000 description 1
- 241000323142 Nanoarchaeum equitans Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 1
- 241000195644 Neochloris Species 0.000 description 1
- 241001442227 Nephroselmis Species 0.000 description 1
- 241000605122 Nitrosomonas Species 0.000 description 1
- 241000180701 Nitzschia <flatworm> Species 0.000 description 1
- 241001503673 Nocardia farcinica Species 0.000 description 1
- 241000059630 Nodularia <Cyanobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000192656 Nostoc Species 0.000 description 1
- 241000243387 Nostochopsis Species 0.000 description 1
- 241001072247 Oceanobacillus iheyensis Species 0.000 description 1
- 241000199478 Ochromonas Species 0.000 description 1
- 241000546131 Oedogonium Species 0.000 description 1
- 102100037214 Orotidine 5'-phosphate decarboxylase Human genes 0.000 description 1
- 108010055012 Orotidine-5'-phosphate decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000192497 Oscillatoria Species 0.000 description 1
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 1
- 241001036353 Parachlorella Species 0.000 description 1
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 241000206766 Pavlova Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000588701 Pectobacterium carotovorum Species 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 241000206731 Phaeodactylum Species 0.000 description 1
- 241000222393 Phanerochaete chrysosporium Species 0.000 description 1
- 241000192608 Phormidium Species 0.000 description 1
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 description 1
- 241001632455 Picrophilus torridus Species 0.000 description 1
- 241000530769 Planktothrix Species 0.000 description 1
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 241000223830 Plasmodium yoelii Species 0.000 description 1
- 241000196317 Platymonas Species 0.000 description 1
- 241000179979 Pleurocapsa Species 0.000 description 1
- 241000996896 Pleurococcus Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 description 1
- 241000605862 Porphyromonas gingivalis Species 0.000 description 1
- 241000192138 Prochlorococcus Species 0.000 description 1
- 241000192141 Prochloron Species 0.000 description 1
- 241000192144 Prochlorothrix Species 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000196250 Prototheca Species 0.000 description 1
- 241000192511 Pseudanabaena Species 0.000 description 1
- 241000894422 Pseudochlorella Species 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 241000589615 Pseudomonas syringae Species 0.000 description 1
- 241001509341 Pyramimonas Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 241000205226 Pyrobaculum Species 0.000 description 1
- 241000195604 Pyrobotrys Species 0.000 description 1
- 241000205156 Pyrococcus furiosus Species 0.000 description 1
- 241000522615 Pyrococcus horikoshii Species 0.000 description 1
- 241000531138 Pyrolobus fumarii Species 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000589771 Ralstonia solanacearum Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241000190950 Rhodopseudomonas palustris Species 0.000 description 1
- 241000606699 Rickettsia conorii Species 0.000 description 1
- 241000606695 Rickettsia rickettsii Species 0.000 description 1
- 241001495397 Rickettsia sibirica Species 0.000 description 1
- 241000606726 Rickettsia typhi Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000195663 Scenedesmus Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 101100523527 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) rhp54 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000970913 Schizothrix Species 0.000 description 1
- 241000192120 Scytonema Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- 241001223867 Shewanella oneidensis Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000202915 Spiroplasma citri Species 0.000 description 1
- 241001464990 Stanieria Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 1
- 241000973891 Starria Species 0.000 description 1
- 241000243446 Stigonema Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 241000194019 Streptococcus mutans Species 0.000 description 1
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241001468227 Streptomyces avermitilis Species 0.000 description 1
- 241000187432 Streptomyces coelicolor Species 0.000 description 1
- 101100043717 Streptomyces griseus aphD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000160715 Sulfolobus tokodaii Species 0.000 description 1
- 241001512067 Symploca Species 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001441722 Takifugu rubripes Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710099760 Tetracycline resistance protein Proteins 0.000 description 1
- 241000422914 Tetraodon nigroviridis Species 0.000 description 1
- 241000196321 Tetraselmis Species 0.000 description 1
- 241001491691 Thalassiosira Species 0.000 description 1
- 241000204673 Thermoplasma acidophilum Species 0.000 description 1
- 241000489996 Thermoplasma volcanium Species 0.000 description 1
- 241001313699 Thermosynechococcus elongatus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- 241000233675 Thraustochytrium Species 0.000 description 1
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 1
- 241000157473 Tolypothrix Species 0.000 description 1
- 206010044248 Toxic shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 231100000650 Toxic shock syndrome Toxicity 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 241000589892 Treponema denticola Species 0.000 description 1
- 241000589884 Treponema pallidum Species 0.000 description 1
- 241000203826 Tropheryma whipplei Species 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046980 Varicella Diseases 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 241000607272 Vibrio parahaemolyticus Species 0.000 description 1
- 241000607265 Vibrio vulnificus Species 0.000 description 1
- 241001411205 Viridiella Species 0.000 description 1
- 241000195615 Volvox Species 0.000 description 1
- 239000004164 Wax ester Substances 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 241000498987 Wigglesworthia glossinidia Species 0.000 description 1
- 241000520892 Xanthomonas axonopodis Species 0.000 description 1
- 241000589636 Xanthomonas campestris Species 0.000 description 1
- 241000511385 Xenococcus Species 0.000 description 1
- 241000204362 Xylella fastidiosa Species 0.000 description 1
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 1
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 description 1
- 241000607477 Yersinia pseudotuberculosis Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222126 [Candida] glabrata Species 0.000 description 1
- 241000193453 [Clostridium] cellulolyticum Species 0.000 description 1
- 241000606834 [Haemophilus] ducreyi Species 0.000 description 1
- 241000029538 [Mannheimia] succiniciproducens Species 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700010877 adenoviridae proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010045649 agarase Proteins 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 229940126575 aminoglycoside Drugs 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 229940092524 bartonella henselae Drugs 0.000 description 1
- 229940092523 bartonella quintana Drugs 0.000 description 1
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 1
- 239000003139 biocide Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 229940056450 brucella abortus Drugs 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 229940074375 burkholderia mallei Drugs 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150039352 can gene Proteins 0.000 description 1
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 1
- 208000032343 candida glabrata infection Diseases 0.000 description 1
- 208000014058 canine distemper Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000013373 clone screening Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 208000037933 contagious bovine pleuropneumonia Diseases 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000007797 corrosion Effects 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000002283 diesel fuel Substances 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 210000001840 diploid cell Anatomy 0.000 description 1
- UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L disodium;[4-chloro-3-[(3r,5s)-1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl]phenyl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].O1OC2([C@@H]3CC4C[C@H]2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC(OP([O-])([O-])=O)=CC=C1Cl UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 229940096118 ella Drugs 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 150000002192 fatty aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000002803 fossil fuel Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 229940118764 francisella tularensis Drugs 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N gamma-cyhalothrin Chemical compound CC1(C)[C@@H](\C=C(/Cl)C(F)(F)F)[C@H]1C(=O)O[C@H](C#N)C1=CC=CC(OC=2C=CC=CC=2)=C1 ZXQYGBMAQZUVMI-GCMPRSNUSA-N 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 238000013412 genome amplification Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 229940113087 geraniol Drugs 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 108010052221 glucan synthase Proteins 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 229940045808 haemophilus influenzae type b Drugs 0.000 description 1
- 210000003783 haploid cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000000688 human artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002029 lignocellulosic biomass Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108010056929 lyticase Proteins 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical group 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000006078 metal deactivator Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000010805 mumps infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 235000019520 non-alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 101150111388 pac gene Proteins 0.000 description 1
- 235000012162 pavlova Nutrition 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 238000005504 petroleum refining Methods 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 208000030773 pneumonia caused by chlamydia Diseases 0.000 description 1
- 108010010718 poly(3-hydroxyalkanoic acid) synthase Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 241000196307 prasinophytes Species 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940055019 propionibacterium acne Drugs 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000001853 pulsed-field electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 108010045647 puromycin N-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940075118 rickettsia rickettsii Drugs 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 101150098466 rpsL gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940082787 spirulina Drugs 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N ulipristal acetate Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1[C@@H]1C2=C3CCC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@H](CC[C@]2(OC(C)=O)C(C)=O)[C@]2(C)C1 OOLLAFOLCSJHRE-ZHAKMVSLSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000005172 vertebrate brain Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
- 235000019386 wax ester Nutrition 0.000 description 1
- 235000014101 wine Nutrition 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
- 239000004711 α-olefin Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
- C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1031—Mutagenizing nucleic acids mutagenesis by gene assembly, e.g. assembly by oligonucleotide extension PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
Description
本出願は、2009年3月6日に提出した、「Methods for Cloning and Manipulating Genomes」との表題の米国仮特許出願第61/158,320号の恩典を主張する。上記出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本出願は、2010年3月3日に作成した配列表テキストファイル「616872004140.txt」(ファイルのサイズ106,298バイト)として、MPEP § 1730 II.B.2(a)(C)のもとで承認され、示されるとおりに、EFS-Web経由で本明細書と同時に提出するアミノ酸配列および/または核酸配列への参照を含む。上記配列表は、37C.F.R.§1.52(e)(5)に従ってその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
様々な種から単離された核酸分子のための宿主として、高度な遺伝子システムを持つ生物を使用することにより、該単離された核酸配列を該宿主中で操作することができる。しかし、外因性の宿主中で染色体およびゲノムをクローニングならびに修飾することにより生物を変更する能力は、扱いやすい遺伝学を持つ酵母のような種に移入することができる核酸分子についてサイズの制限があることにより限定される。
ドナー核酸の宿主細胞への移入(クローニング)のための、ドナー核酸の(例えば、宿主細胞内での)操作(例えば、修飾)のための、および修飾したドナー核酸のレシピエント細胞への移植のための方法、核酸、ならびにシステムを本明細書中で提供する。本提供の方法および他の組成物は、真核生物宿主細胞中での原核生物核酸の操作、およびその核酸を原核生物レシピエントに移植して戻すことのような、生命の分岐(branches of life)を超えた核酸の移入ならびに操作に有用である。
[本発明1001]
一つまたは複数の断片としてドナーゲノムを合成するか、またはドナー細胞からドナーゲノムを得る工程;および
ドナーゲノムと宿主ベクターとを異種宿主細胞に導入する工程であって、該宿主細胞への導入の前に該ドナーゲノムと該宿主ベクターとが任意で連結され、それにより、該宿主ベクターを含む該ドナーゲノムを含む宿主細胞が作製され、さらに、該ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さである、工程
を含む、ドナーゲノムをクローニングするための方法。
[本発明1002]
ドナーゲノムが、本質的に、全細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
ドナーゲノムと宿主ベクターとが、同時に、または連続して宿主細胞に導入される、本発明1001の方法。
[本発明1004]
宿主細胞への導入の前に、宿主ベクターが、ドナーゲノムを含むドナー細胞を該宿主ベクターで形質転換することによりドナーゲノムと連結される、本発明1001の方法。
[本発明1005]
宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
宿主細胞が酵母細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1007]
宿主ベクターがセントロメアプラスミドである、本発明1004の方法。
[本発明1008]
宿主ベクターが酵母セントロメアプラスミドであり、かつ宿主細胞が酵母細胞である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
宿主ベクターが、相同組換えに有用なベクターである、本発明1001の方法。
[本発明1010]
宿主細胞への導入の前に、ドナーゲノムが直線化されるか、または断片化される、本発明1001の方法。
[本発明1011]
ドナーゲノムが、細菌ゲノム、真菌ゲノム、酵母ゲノム、古細菌ゲノム、シアノバクテリアゲノム、藻類ゲノム、バクテリオファージゲノム、ミトコンドリアゲノム、葉緑体ゲノム、ウイルスゲノム、細胞小器官ゲノム、または合成ゲノムである、本発明1001の方法。
[本発明1012]
宿主細胞が真核細胞または原核細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1013]
ドナーゲノムを宿主細胞内で修飾する工程をさらに含む、本発明1001〜1012のいずれかの方法。
[本発明1014]
宿主ベクターを含むドナーゲノムを宿主細胞から回収する工程をさらに含む、本発明1001〜1013のいずれかの方法。
[本発明1015]
回収したドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程をさらに含む、本発明1014の方法。
[本発明1016]
レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程をさらに含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
レシピエント細胞への導入の前に、回収したドナーゲノムがメチル化される、本発明1015の方法。
[本発明1018]
レシピエント細胞の制限エンドヌクレアーゼ機能が、存在しないか、除去されているか、または不活化されている、本発明1015の方法。
[本発明1019]
レシピエント細胞が、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、または藻類細胞である、本発明1015の方法。
[本発明1020]
第2のドナーゲノムを宿主細胞に導入する工程であって、該第2のドナーゲノムは第1のドナーゲノムとは異なり、それにより、2種類の異なるドナーゲノムを含有する宿主細胞が産生される、工程
をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1021]
第2のドナーゲノムを導入する工程が、第1のドナーゲノムを含有している宿主細胞と該第2のドナーゲノムを含有している第2の宿主細胞とを接合させることを含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
回収したドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程により、該レシピエント細胞の表現型が、任意の修飾を組み入れている該ドナーゲノムに対応する表現型へと形質転換される、本発明1015〜1019のいずれかの方法。
[本発明1023]
本発明1001〜1022のいずれかの方法により産生された細胞。
[本発明1024]
(a)突然変異誘発構築物と宿主ベクターとを宿主細胞に導入し、これにより、該宿主細胞中で該宿主ベクターと該突然変異誘発構築物との組換えが生じる工程であって、該突然変異誘発構築物は、該修飾の上流にある標的核酸分子の5'部分に対する第1の相同部分;エンドヌクレアーゼ認識部位、プロモーター、エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、および選択マーカー;標的遺伝子座の上流にあるゲノムの配列に対して相同である第2の反復相同部分;ならびに該修飾の下流にある標的領域の3'部分に対して相同である第3の相同部分を含む、工程;ならびに、
(b)(1)該第1の相同部分と上流もしくは下流部分との間で組換えが起こり、それにより、該構築物の一部分をシームレスに除去し、かつ
(2)該構築物を含む標的部位の近くで該核酸分子における一つまたは複数の二本鎖の断裂切断(break cleavage)を促進する
条件下で、該細胞をインキュベーションする工程であって、それにより、該標的核酸分子中に修飾がシームレスに導入される、工程
を含む、標的核酸分子中に修飾をシームレスに導入するための方法。
[本発明1025]
(a)宿主ベクターを含むドナーゲノムを含む産物が得られるように、ドナーゲノムと、宿主細胞中での該ドナーゲノムのクローニングに適している宿主ベクターとを宿主細胞に導入する工程;
(b)工程(a)で得た宿主ベクターを含むドナーゲノムを含む産物を、宿主細胞から回収する工程;
(c)(b)の産物を、レシピエント細胞が該産物によりコードされる表現型を示すようになる条件下で、レシピエント細胞に導入する工程;ならびに、
(d)工程(c)により得られた細胞を回収する工程
を含む、ドナーゲノムによりコードされる表現型を示す細胞を作製するためのプロセスであって、
該ドナーゲノムは、本質的に、インタクトな細胞ゲノム、ウイルスゲノム、または細胞小器官ゲノムであり、これは、少なくとも最小ゲノムであり、かつ約300kbを上回る長さであり、かつ該ドナーゲノムは、該ドナーゲノムによりコードされる表現型を該レシピエント細胞が示すのに必要な核酸材料の最小限の構成要素を含む、前記プロセス。
[本発明1026]
宿主細胞中で前記(a)のドナーゲノムを修飾する工程をさらに含む、本発明1025のプロセス。
[本発明1027]
レシピエント細胞の内因性ゲノムを分解するかまたは除去する工程をさらに含む、本発明1025のプロセス。
[本発明1028]
本発明1025〜1027のいずれかのプロセスによって産生された細胞であって、ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型を示す前記細胞。
[本発明1029]
300kbより大きい外来ゲノム核酸材料と、細胞が所望の表現型を示すのに必要なゲノムの最小限の構成要素とを含むドナーゲノムを含む細胞であって、該ドナーゲノムによりコードされ、そうでなければその細胞が示すことがない所望の表現型を示す前記細胞。
A.定義
特に明記しない限りは、本明細書中で使用する全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解する意味と同じ意味を有する。
ドナーゲノムと他のドナー核酸配列とを異種宿主細胞に導入するための、ドナーゲノムと核酸配列とを宿主細胞の中で修飾するための、ドナーゲノムと核酸配列とを宿主細胞から回収するための、および回収したドナーゲノムと核酸配列とをレシピエント細胞に導入するための、核酸、方法、ならびにシステムを本明細書中で提供する。ドナー、宿主、およびレシピエントの核酸配列、細胞、および遺伝子システムの間での不和合性、および/または例えば、それらの間での毒性を最小限にする局面が、提供する核酸配列、方法、およびシステムの範囲に含まれる。本提供の方法の一つの例示的な態様を図1に説明する。ここでは、上記方法を、酵母宿主細胞を細菌のドナーゲノムで形質転換するために、上記細菌のドナーゲノムを、酵母宿主ベクターと連結し、酵母宿主細胞の中でドナーゲノムを修飾し、そしてこの修飾したドナーゲノムを細菌のレシピエント細胞に移植し、それによって変更した細菌を作製することにより使用する。図1に示すように、変更した細菌中に存在する修飾したゲノムを単離し、これに続いて行う反復様式での一連の方法においてドナーゲノムとすることができる。この態様の多数のバリエーションを検討し、これらは本明細書中に記載するように、本出願の範囲に含まれる。本提供の方法の別の例示的な方法を図16に説明する。ここでは、上記方法を、宿主酵母ベクターを細菌のゲノムに挿入するため、組込み型酵母ベクターを用いてゲノムを単離するため、細菌のゲノム/酵母ベクターを用いて酵母宿主細胞を形質転換するため、細菌のゲノムを修飾するため、修飾したゲノムを単離するため、任意で、上記ゲノムをメチル化するため、そしてドナーゲノムをレシピエント細胞に移植するために使用する。
本提供の方法の最初の工程において、ドナーゲノムまたは他の核酸配列を、移入、修飾、および/または移植のために選択する。本明細書中に記載する方法により移入する、修飾する、移植する、そして作製する核酸配列は、任意の天然または合成の生物のものであり得る。したがって、ドナーゲノムは、任意の所望の細胞、またはその任意の核酸を含むサブユニットからの、単離または化学合成のいずれかに由来する。例えば、核酸配列としては、ゲノム(例えば、全ゲノム、全ゲノムの一部分(例えば、少なくとも最小ゲノムおよび/または少なくとも最小の複製性ゲノム、細胞ゲノム、細胞小器官ゲノム、およびウイルスゲノム))、染色体、および既知の生物および新しい生物由来の他の大きな核酸配列が挙げられる。ゲノムを含む核酸配列は、生物の中にある任意の供給源のものであり得、これには、細胞小器官ゲノム(例えば、ミトコンドリアゲノムおよび葉緑体ゲノム)、染色体、植物および動物、藻類である供給源のゲノムまたは染色体の一部分、ならびに、細胞の生存能力をサポートする任意の遺伝学的材料(細菌および他の原核生物および真核生物の全細胞ゲノムならびに最小の細胞ゲノムを含む)が含まれる。
本提供の方法で使用し、作製するゲノムおよび他の核酸配列(例えば、ドナー核酸)としては、真菌、酵母、細菌、他の原核生物、および藻類に由来するものが挙げられるが、そのような生物に限定されない。これらは、任意の生物の、天然のものであっても、合成のものであってもよい。例えば、原生生物界、古細菌界、真正細菌界、真菌界、植物界、および動物界の生物、ならびに、バクテリオファージを含むウイルスのものであり得る。
移入の前に、上記核酸配列を増幅させる、および/または細胞もしくは組織から単離することができる。ドナー核酸配列は、ドナー細胞もしくは組織(例えば、ドナー生物由来の細胞および組織)から単離することができるか、または、周知のクローニング、細胞、およびプラスミド技術と、システムとを使用して、他の細胞を形質転換し、その中で増殖させることができる。細胞の中の核酸配列は、天然のものであっても、また、合成のもの(一部が合成のものを含む)であってもよい。いくつかの場合には、核酸配列を、細胞または組織からの単離の後で、(例えば、PCRにより)増幅する。
上記核酸配列は、様々な供給源から単離することができる、遺伝学的に変更することができる、増幅することができる、および/または組換えにより発現させる/作製することができる。これらの核酸配列から作製した組換えポリペプチドを、個別に単離またはクローニングし、所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、真菌、酵母、昆虫、または植物細胞の発現システムを含む任意の組換え発現システムを使用することができる。
核酸配列は、損傷を最小限にするためにアガロースプラグの中で単離することができる。大きな核酸配列(例えば、数千塩基対〜10MBの範囲のDNA、およびそれより大きいDNA(例えば、ゲノム))は、従来の単離手順の間に機械力(例えば、ピペッティング)により剪断されることがあり、これによって損傷が生じる。そのような核酸配列のアガロース中での単離は、損傷を最小限にすることができる。この態様においては、ドナーDNAを含有している細胞をアガロースに包埋し、溶解させる。アガロース(例えば、低融点アガロース)中でゲノム核酸配列を単離するための方法もまた周知であり、市販されているキット(例えば、CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit(カタログ番号170-3591)、CHEF Bacterial Genomic DNA Plug Kit(カタログ番号170-3592)、およびCHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit(カタログ番号170-3593)(全て、Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)による)を使用して行うことができる。このようなキットを使用するDNAの調製は、供給業者が推奨する条件とプロトコールを使用して行うことができる。
ドナー核酸配列は、細胞小器官のゲノム(例えば、ドナー細胞から単離した細胞小器官のゲノム)であり得る。細胞小器官のゲノムを単離するための方法は当技術分野で公知である。細胞からの細胞小器官の単離のためのキットは、Pierce(Rockford, III.)、Sigma-Aldrich(St.Louis, Mo.)などを含む様々な製造業者から入手することができる。
中でも、例えば、宿主細胞の機構を使用する宿主細胞内での修飾のための、ドナー核酸(ドナーゲノムを含む)を宿主細胞に導入するための方法と核酸が、提供する態様である。上記宿主細胞は、ドナーゲノムの起源である細胞の中には通常存在しない所望の能力(例えば、組換え機構)を提供する異種宿主細胞である。上記のように、ドナー核酸は、移入の前に細胞もしくは組織から単離してもよく、またはインビトロで化学合成および/もしくはアセンブリしてもよく、ならびに/またはインビトロもしくはインビボでの方法により単離もしくは合成した核酸からコピーしてもよい。
宿主細胞は任意の宿主細胞であり得、かつ典型的には、研究室での核酸の修飾のために望ましい遺伝子システム(例えば、ドナー生物または細胞と比較して改良された遺伝子システム)を有している異種細胞である。所望される遺伝子システムの例示的な局面は、相同組換え(ダブル・クロスオーバー相同組換えおよびトランスポゾン突然変異誘発を含む)をサポートする能力、定義した十分に特性決定されている選択マーカーおよび他のマーカーのセット、ならびに、大きな核酸をクローニングする能力である。宿主細胞が、それを、宿主細胞内での核酸のクローニング、増殖、および修飾の際にドナー核酸と適合するようにする特性を有することもまた望ましい。
典型的には、宿主ベクターを使用してドナー核酸で宿主細胞を形質転換し、ドナー核酸を宿主細胞内で増殖させる。したがって、宿主細胞は一般的には、宿主細胞内でのドナー核酸の移入、維持、および修飾のための宿主ベクターを含むか、またはその導入をサポートすると考えられる。一つの態様においては、宿主ベクターは、ドナー細胞への、ならびにドナー細胞から宿主細胞、およびレシピエント細胞、および他の細胞(例えば、クローニングおよび増殖に使用する細菌細胞(例えば、大腸菌))への、ドナー核酸の移入を容易にするための核酸配列を含む(例えば、本明細書中の実施例に記載するトリ-シャトル(tri-shuttle)ベクター(例えば、図3を参照のこと))。
本提供の移入方法においては、ドナーゲノムまたは他の核酸を宿主核酸(典型的には、宿主ベクター)に連結して、宿主細胞の中で増殖させ、操作することができる、ドナー核酸と宿主核酸とを含む核酸を作製する。宿主核酸とドナー核酸の連結は、周知のクローニング方法を引用して、多数のアプローチを使用して行うことができる。3つの一般的アプローチを以下にさらに詳細に記載する。
本提供の方法を用いて、宿主細胞を形質転換させたドナー核酸を、本提供の修飾方法による宿主細胞内での修飾の前および後の両方で、単離し、分析することができる。ドナー細胞および他の細胞からの単離を用いる場合は、単離方法は、細胞のタイプに応じて異なると考えられる。いくつかの例においては、例えば、ドナー核酸を単離するかまたは富化させるために、天然の宿主核酸を、単離した核酸試料から除去するかまたは減少させる。このプロセスは、染色体宿主DNAを除去するためのプレ電気泳動により、または宿主核酸を消化するがドナー核酸は消化しない制限酵素での消化により行うことができる。
一つの態様においては、複数のドナー核酸(例えば、異なるドナーに由来する複数のゲノム)を、単一の宿主細胞に導入する。一つの局面においては、一つのドナーゲノムまたは他のドナー核酸を含有する宿主細胞を、異なるドナーに由来する核酸が導入された別のそのような宿主細胞と交配して、両方の核酸を含有する宿主細胞を作製する。例えば、異なるドナーに由来する2つのドナーゲノム(例えば、異なる種に由来する2つのマイコプラズマゲノム)を含有している二倍体酵母株は、それぞれが一つのドナーゲノムを持っている2つの異なる一倍体株同士を接合させることにより作製することができる。一倍体酵母株の接合は、周知の方法を使用して行うことができる。接合後に両方のゲノムを含有している細胞の選択ができるように、多数の異なる選択マーカーをそれぞれの一倍体において使用することができる。例えば、HIS3マーカーとTRPマーカーとを、異なるドナーゲノムを持っている2種類の異なる一倍体細胞にそれぞれ導入することができ、続いて、本明細書中で実施例に記載するように、ヒスチジンおよびトリプトファンを含まない培地上で二倍体細胞を選択することができる。
中でも、宿主細胞の中でドナーゲノムおよび他の核酸を修飾するための方法ならびに核酸が、提供する態様である。一つの態様においては、この方法は、一つまたは複数の標的化構築物をドナー核酸に導入することにより行う。上記構築物は、ドナー核酸に対する相同部分、耐性遺伝子、選択マーカー、酵素(例えば、制限酵素)をコードする核酸、制限酵素部位、ならびに/またはクローニングおよび相同組換えに使用する他の核酸を含む。典型的には、上記構築物を、ドナー核酸を含有している宿主細胞に導入する。
典型的には、上記方法の最初の工程は、ドナー核酸への対抗選択マーカーの導入を含む。典型的には、上記マーカーを相同組換えにより挿入し、これにより、標的領域の一部分を対抗選択マーカーで置き換える。対抗選択マーカーは、マーカーの有無の両方を選択できる点で有利である。1セットの増殖条件を用いて、上記マーカーの存在を選択し、一方、存在しないことは、異なるセットの増殖条件を用いて選択する。例として、周知の対抗選択マーカーはURA3酵母遺伝子である。酵母宿主中にURA3遺伝子が存在することにより、ウラシルを含まない培地上でのその増殖が可能となる。したがって、このマーカーによるドナー核酸の標的領域の置き換えの成功は、ウラシルマイナス培地上での増殖によって選択できる。対照的に、URA3遺伝子が存在しないこと(例えば、別の相同組換え事象による置き換えの後)は、5-フルオロオロチン酸(5-FOA)を含む培地上での対抗選択により選択することができる。
一つの態様においては、選択マーカーを導入した後、断裂(例えば、二本鎖の断裂(DSB))を、標的領域の近くに(例えば、標的領域に隣接して)または標的領域内に導入する。このプロセスは、典型的には、標的領域の近位もしくは標的領域内にあるヌクレオチド配列を認識し、切断する酵素(例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、I-SceI)を誘導により発現させることによって行う。典型的には、上記酵素は、エンドヌクレアーゼであるか、または二本鎖の断裂を生じる他の酵素である。相同組換えの部位付近への二本鎖の断裂の導入が、相同組換えの効率を約20倍増大させることが報告されている(Leem et al, Nucleic Acids Res 31, e29(2003))。したがって、標的領域付近での二本鎖の断裂の導入は、上記修飾方法の効率を高めるため、および望ましくないバックグラウンドの突然変異を減少させるために行う。
一つの態様においては、相同組換えによる選択マーカーの除去を、マーカーを含む領域の側方にあるタンデム反復領域の存在により促進する。一つの局面においては、マーカーを導入するための標的化構築物はさらに、その導入により、挿入されたマーカーを含む標的領域またはその一部分の側方にタンデム反復領域を生じる核酸配列を含む。上記構築物を最初に、標的領域またはその一部分の上流あるいは下流のいずれかに挿入する。そして上記構築物は、標的領域またはその一部分の下流あるいは上流部分に対してそれぞれ相同性を有している核酸部分を含む。標的核酸中のこの相同部分付近へのこの部分の挿入により、タンデム反復が生じる。
タンデム反復と標的領域付近での酵素による切断との両方を、選択マーカーの除去を促進するために使用することができる。「タンデム反復エンドヌクレアーゼ切断(TREC)」法と考える一つのそのような態様は、対抗選択マーカーを使用する従来の相同組換えによる置き換え、エンドヌクレアーゼの発現による標的領域付近または標的領域への二本鎖の断裂の誘導による導入、およびマーカーを含む核酸配列の側方にあるタンデム反復配列の導入と組み合わせる。上記方法は、高い効率で、酵母宿主細胞中にクローニングした細菌のドナーゲノムおよび大きな核酸を正確に修飾するために使用することができる。
上記修飾方法での使用のための核酸(例えば、標的化カセット)を設計し、作製するための方法を提供する。上記方法での使用のための構築物および他の核酸も提供する。典型的には、選択マーカーを導入するための標的カセットは、ドナー標的領域の一部分に対する相同部分(これは、任意で、上記相同部分と比較して、一つまたは複数の突然変異、欠失、挿入、置換、または他の修飾を含む)および選択マーカー(典型的には、URA3のような対抗選択マーカー)を含む。典型的には、上記カセットは、標的領域の5'部分に対して相同である部分と、標的領域の3'部分に対して相同である部分とを含む。
修飾のために、上記カセットにより、ドナーゲノム(例えば、本提供の方法に従って産生したもの)を含有している宿主細胞を形質転換する。形質転換方法は周知である。一つの例においては、上記カセットを、2μg〜3μgのPCR産物と25μgのキャリアDNA(サケの精巣DNA, Sigma, St.Louis, MO)とを用いて、公開されている方法(Gietz, D.et al., Nucleic Acids Res, 20, 1425(1992))にしたがって、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用してドナーゲノムを含有している酵母宿主細胞に導入する。
宿主細胞またはレシピエント細胞へのドナー核酸(ドナーの染色体および/またはドナーゲノムを含む)の移植のための方法を本明細書中で提供する。ドナー核酸は、宿主細胞からレシピエント細胞へと移植することができる。ドナー核酸には、宿主細胞内で修飾したものが含まれる。別の態様においては、上記ドナーゲノムを、例えば、レシピエント細胞への天然のゲノムの移植により、ドナー細胞からレシピエント細胞に直接移植する。複数の移植方法が、宿主細胞内で増殖させ、修飾したドナーゲノムを、遺伝子産物をゲノムから発現させることができる環境に移植により効率よく戻すために有用である。レシピエント細胞は、ドナー細胞または生物と比較して、同じ種の細胞であっても、また近い関係にある種の細胞であってもよい。
第1の工程において、ドナー核酸(例えば、ドナーゲノム)を宿主細胞またはドナー細胞から単離する。細胞からの核酸の単離のための方法は周知であり、これには、ゲノムDNA(全ゲノムを含む)の単離のための方法、および細胞小器官のゲノムを単離するための方法が含まれる。本明細書中に記載する方法を含む任意のそのような方法を、ドナー核酸を単離するために使用することができる。当業者は、方法の選択が、単離しようとする核酸のタイプ、およびそれを単離する細胞のタイプに依存することを理解すると考えられる。
ドナー核酸を宿主細胞から単離する場合は、ドナー核酸を、宿主細胞と適合するプロトコールを使用して、アガロースプラグ中で単離することができる。一つの局面においては、宿主細胞が酵母である場合は、アガロースプラグを、酵母DNAの抽出のために製造業者が推奨する説明書にしたがって、任意の改変を加えて、例えば、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit(Bio-Rad)を用いて調製することができる。一つの非限定的な例においては、細菌のドナー核酸を含有している酵母宿主細胞の培養物を、OD600がおよそ1.5に達するまで、選択培地中で30℃で増殖させる。一つの例においては、プラグあたりに利用できるドナー核酸の量を増大させるために、(製造業者が推奨する6×lO8個の細胞の代わりに)6×lO9個の酵母細胞を、1mLのプラグあたりに使用する。アガロースプラグ中に包埋した酵母宿主の細胞壁を消化する。細胞壁の消化は、CHEFキットの製造業者が推奨するように、リチカーゼ(lyticase)(Biorad)を使用して、または1OOT(β-1,3-グルカンラミナリペンタオヒドロラーゼ(β-1,3-glucan laminaripentaohydrolase);USB, Cleveland, OH)を使用して行うことができる。一つの例においては、Zymolase(商標)酵素を、5mg/mLの濃度でプラグの中および外に添加する。上記混合物を、37℃で2時間置いておくことができる。
宿主細胞からのドナー核酸の単離のためには、宿主核酸を除去することが所望される場合がある。一つの例においては、酵母宿主細胞からの細菌ドナーゲノムの単離のために、酵母のゲノムDNAもまた、宿主細胞から抽出する細菌の核酸とともに単離される。一つの局面においては、単離には「浄化」工程が含まれる。ここでは、混入している宿主核酸を、例えば、宿主核酸を認識するが、ドナー核酸は認識しない制限酵素を用いて除去する。一つの例においては、混入している酵母のゲノムDNAを除去するために、プラグを、酵母のゲノムDNAを特異的に消化する制限酵素のカクテルで処理する。
ドナー核酸(例えば、ドナーゲノム)を、ドナー細胞からレシピエント細胞に直接移植する別の態様においては、ドナー細胞と適合する単離方法を使用する。一つの例においては、ドナー細胞からのドナー細菌ゲノムの単離のために、ゲノムDNAを含有しているアガロースプラグを、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit(Bio-Rad)を改変を加えて使用して調製する。
単離したドナー核酸の量は、移植の前に定量化または推定することができる。一つの態様においては、宿主細胞から単離したドナー核酸をアガロースゲル上に泳動し、既知の量のドナー細胞から単離したドナー核酸と比較する。例を実施例2Bに記載する。別の態様においては、単離したドナー核酸の量を、例えば、UV分光光度法により定量化する。一つのそのような例を実施例2B(iv)に記載する。
本提供の方法は、宿主、ドナー、およびレシピエント細胞/核酸の間での不和合性の障害を克服するための工程を含む。このような障壁は、本明細書中に記載され、宿主細胞由来のドナーゲノムのような大きな核酸を、その中でドナーの遺伝子産物を発現させることができるレシピエント細胞へと移植することを制限し得る。これは特に、宿主細胞がドナーおよびレシピエント生物と近い関係にはない(例えば、異なる生命の分岐に由来する)場合にそうである。このような障壁は、真核生物宿主中で増殖させた原核生物のゲノムの、原核生物レシピエントへの移植に関係する。
インビトロでのアッセイを、宿主細胞、ドナー核酸、およびレシピエント細胞間に、例えば、様々な生物間での制限修飾システムの不一致が原因である不和合性の問題が存在するかどうかを決定するために利用することができる。ドナーゲノムにより、またはレシピエント細胞により発現される制限修飾システムは、宿主細胞へのドナーゲノムの移植および活性化の成功を損なう可能性を有し得る。
ドナー核酸は、ドナー細胞からの単離の後、レシピエント細胞への移植の前に、インビトロでメチル化することができる。ドナーゲノム(例えば、宿主細胞中で増殖させたもの)のメチル化により、宿主細胞の制限修飾システム、および/またはドナーゲノムによりコードされる制限修飾システムからそれらを保護することができる。一つの局面においては、レシピエントのR-MシステムおよびドナーによりコードされるR-Mシステムからの、宿主細胞中で増殖させたドナー核酸の保護の方法を提供する。他の局面においては、これらの生物のうちの一つのR-Mシステムからドナーゲノムを保護する方法を提供する。例えば、多くの場合は、レシピエントのR-Mシステムからドナーゲノムを保護するであろう酵素でドナーゲノムをメチル化することが可能である。これは、対応するドナー制限酵素の致死濃度に達する前に、ドナーのメチルトランスフェラーゼによりドナー核酸がメチル化される場合にそうである。
粗抽出物とともにインキュベーションすることにより、続いて、移植の際に不和合性を起こす可能性があるドナーDNAの立体構造を変化させることができる。このような立体構造の変化は、実施例2B(iv)に記載するように、細胞抽出物の存在下または非存在下でインキュベーションしたドナーゲノムDNAを視覚化することにより評価することができる。したがって、いくつかの態様においては、ドナー核酸について、メチル化の後、移植の前に、粗抽出物中のタンパク質を除去するための除タンパク質工程を行うことができる。一つの局面においては、タンパク質は、プロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼK)を使用して除去することができる。例示的な処理においては、メチル化反応を行ったアガロースプラグを、プロテイナーゼK反応緩衝液およびプロテイナーゼK中で、50℃で4時間、さらにインキュベーションすることができる。プラグは、そのプラグの融解および移植に進む前に洗浄することができる。実施例2B(iv)および3A(iii)を参照のこと。
いくつかの場合は、レシピエント細胞の制限修飾システムを、ドナー核酸またはゲノムの移植の前に不活化させることが必要であり得る。R-Mシステムの修飾は、インビトロまたはインビボで行うことができる。インビトロでのメチル化の代わりに、制限修飾システムを少なくともレシピエント細胞(およびおそらく、ドナーゲノムまたは核酸)から除去するか、または不活化させることができる。
単離および処理の後、ドナー核酸を、本明細書中に記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用して、レシピエント細胞にさらに移植することができる。一つの例示的な移植プロトコールを、以下の実施例3に記載する。ドナーからマイコプラズマレシピエントにマイコプラズマゲノムを移植するために使用する一つの方法は、Lartigue et al, Science 317, 632(2007)に記載されている。このような方法は、ドナーゲノムに特別な特性を付与するために、扱いにくい細胞もしくは生物に由来するゲノムまたは核酸を、別の宿主の中で修飾するために使用することができる。その後、この修飾したゲノムを、同じドナー細胞に、またはある一定のドナー細胞に移植して戻し、それにより、レシピエント細胞に修飾したゲノムの表現型を付与することができる。
本明細書中に記載する方法は、反復様式での多数回のゲノムまたは他の核酸の修飾に使用することができる。
本提供の方法および組成物を、環境、エネルギー生産、および医薬剤に関する問題を解決するために使用することができる。本提供の方法および組成物は、商業的使用(例えば、免疫原、生物学的タンパク質および化学物質、ワクチン、バイオ燃料、および酵素のような有用なタンパク質)のために、ゲノムおよび生物ならびに他の産物を産生する、変更する、ならびに修飾することにおいて有用である。例えば、本提供の方法を、任意の生物(特に、そのゲノムを従来の方法によっては容易には操作できない生物のような、乏しい遺伝子システムを有している生物)由来の核酸を操作および変更するために使用することができる。本提供の方法は、合成のゲノムを構築すること、および合成の細胞を作製するために上記ゲノムをレシピエント細胞に移植することにおいて有用である。したがって、上記方法を、医学的に有用なタンパク質(酵素、タンパク質、および核酸治療薬、抗体、免疫原、ワクチン、および他の細胞性の産物を含む)を産生するために使用することができる。
以下の実施例を、提供する態様を説明するために提供する。これらは、本出願の範囲を限定するようには意図されない。
酵母宿主細胞への細菌ドナーゲノムの移入
本実施例は、本明細書中に提供する3種類の様々なクローニングアプローチ(図2)を使用した、酵母宿主細胞中での細菌ゲノムのクローニングの成功を記載する。以下に記載するように、それぞれのアプローチにより、酵母宿主ベクターと連結したドナーである細菌ゲノムを含む核酸を有している宿主細胞が得られた。これらのアプローチによる宿主細胞へのドナーゲノムの移入は、宿主細胞中でのドナーゲノムの増殖および修飾、ならびに宿主細胞からレシピエント細胞へのドナーゲノムの移植のために、本提供の方法とともに使用することができる(図1)。
組込み型酵母ベクターを使用した、酵母宿主細胞へのマイコプラズマ全ドナーゲノムの移入
本実施例は、ドナーゲノムの宿主細胞への導入のための第1のアプローチを使用した、3種類の異なるマイコプラズマドナーゲノム(M.ゲニタリウム株MS5;M.ミコイデス亜種ミコイデス、ラージコロニー株GM12;およびM.ニューモニエ株M129-B170(ATCC 29343))の、宿主である酵母細胞へのクローニング(移入および増殖)の成功を記載する。M.ゲニタリウム株MS5は、M.ゲニタリウムG37(GenBank No.L43967)の派生株であった。これは、Dhandayuthapani et al., J Bacteriol 183, 5645(2001)に記載されているように、G37株の中での一つの遺伝子の割り込みにより作製した。M.ミコイデス亜種ミコイデス、ラージコロニー株GM12(Genbankアクセッション番号NZ_AAZK01000004.1(GI:149364882)を有しているゲノム配列)は、DaMassa et al, Am J Vet Res 44, 322(1983)およびLartigue et al., Science 317, 632(2007)に記載されている。M.ニューモニエ株M129-B170(ATCC 29343)は、M.ニューモニエM129, GenBankアクセッション番号U00089.2(GI:26117688)の派生株であった。
2つのトリ-シャトル酵母宿主ベクターを、図2Aに示す方法を使用する酵母宿主細胞へのマイコプラズマゲノムのクローニングのために設計した。これらのベクター(pmycYACTnとminiTn-Puro-JCVI-1.7)を、図3に模式的に示す。
ベクターpmycYACTn(図3A)は10kbの長さであり、これには以下を含めた:(i)大腸菌中での増殖のための、pUC19由来の高コピーの複製起点(ori)およびアンピシリン耐性マーカー;(ii)マイコプラズマゲノムへの転位のための、IS256トランスポザーゼ遺伝子および逆位反復配列;(iii)Lartigue et al., J Bacteriol 164, 1094(1985)に記載されているような、大腸菌およびマイコプラズマの中での選択とスクリーニングのための、tetMマーカーおよびlacZマーカー(いずれも、スピラリンプロモーターから発現される);ならびに(iv)酵母の中での複製および分離のための、自律複製配列(ARS)およびセントロメア配列(CEN);ならびに(v)HIS3(選択可能な酵母マーカー)。
miniTn-Puro-JCVI-1.7ベクター(図3B)は14kbの長さであり、これは、以下の例外はあるものの、pmycYACTnと同じであった:(i)これにはlacZを含めなかった;(ii)tetMマーカーの代わりに、これにはピューロマイシン耐性マーカーを含めた;そして、(iii)これには、細菌の人工染色体(BAC)ベクターを含めた。
a.M.ゲニタリウムMS5
M.ゲニタリウム株MS5のドナーゲノムの酵母宿主細胞への移入のための準備において、ベクターpmycYACTnベクターを、J.I.Glass et al, PNAS USA 103, 425(2006)に記載されているように、M.ゲニタリウムドナー細胞へのエレクトロポレーションによりドナーゲノムに挿入した。形質転換体を、テトラサイクリンの存在下での増殖により選択し、単一クローンをさらなる分析のために選択した。上記ベクターに対して内部にあるプライマーを使用した直接のゲノム配列決定(J.I.Glass et al., PNAS USA 103, 425(2006)に記載されている)を、ベクターの挿入部位を決定するために行った。選択したクローンは、pmycYACTnの2つのIS256逆位反復配列の間の配列と、pmycYACTnの2つのIS256逆位反復配列を含んでおり、これは、設計したとおりに、転位が起こったことを示していた(図3C)。トランスポザーゼ、pUC19複製起点、およびアンピシリン耐性遺伝子は、転位の際に失われた。宿主ベクターを、不可欠ではないMG411遺伝子(J.I.Glass et al., PNAS USA 103, 425(2006);C.A.Hutchison et al., Science 286, 2165(1999))内のドナーゲノムに挿入した。
M.ミコイデス亜種ミコイデス, ラージコロニー株GM12のゲノムの酵母宿主への移入のための準備において、マイコプラズマドナー細胞を、K.W.King and K.Dybvig, Plasmid 26, 108(1991)に記載されているように、PEGを使用してpmycYACTnで形質転換した。形質転換体を、テトラサイクリンを補充したプレート上での増殖により選択した。
M.ニューモニエ株M129-B170のドナーゲノムの酵母宿主細胞への移入のための準備において、マイコプラズマを、J.I.Glass et al, PNAS USA 103, 425(2006)に記載されているようにエレクトロポレーションによりMiniTn-Puro-JCVI-1.7で形質転換した。ピューロマイシン耐性形質転換体のプールを、液体培地中で選択した。
断裂を最小限にするために、酵母ベクターの挿入断片を含むドナーゲノムを、低融点アガロースとBio-Rad CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)とを使用し、製造業者により推奨されているプロトコールに従って、アガロースプラグ中で単離した。挿入断片を持つマイコプラズマゲノムを含有しているアガロースプラグを、10mMのTris(pH 8.0)(場合によっては、1mMのEDTA)に対して1時間透析した。その後、プラグを、S.Katsura et al, Electrophoresis 21, 171(2000)に記載されているように、10mM(6%)のPEG 6000(United States Biochemical)、0.6MのNaClに対して、数時間透析した。このPEG/NaCl処理は、W303a細胞への移入のためのベクターを含むM.ミコイデスLCゲノムの単離について(以下を参照のこと)、またはVL6-48N細胞への移入のためのベクターを含むM.ニューモニエゲノムの単離(以下を参照のこと)については、行わなかった。
ドナーゲノムの宿主細胞への導入のために、酵母スフェロプラストを、推奨されているOD未満にしか培養物を増殖させなかった場合があったことを除き、N.Kouprina and V.Larionov, Nat Protoc 3, 371(2008)に記載されている公開されている方法を使用して、プラグ由来のDNAで形質転換した。
形質転換した酵母宿主細胞のそれぞれに由来するDNAを、完全な宿主ベクターを含むドナーゲノムの宿主細胞への移入を確認するために分析した。酵母にクローニングしたマイコプラズマゲノムを、完全性を確認するためにマルチプレックスPCR(MPCR)によりスクリーニングした。MPCRは、IDT由来のプライマーを使用し、Qiagen(Valencia, CA)によるMultiplex PCR Kitを用いて、1セットまたは2セットの10種類のアンプリコンそれぞれを使用して行った。個々の反応を以下にさらに詳細に記載する。
酵母ベクターを含むM.ゲニタリウムcl16-2ゲノムを株VL6-48Nへと移入した後に回収した24個の個々のクローンに由来するゲノムDNAと、M.ゲニタリウムをW303a株へと移入した後に回収した8個の個々のクローンとを、アガロースプラグ中で単離し、完全性を確認するためにPCRによって分析した。M.ゲニタリウムの合成ゲノム(D.G.Gibson et al., Science 319, 1215(2008)に記載されているように作製した、sMgTARBAC37)およびM.ゲニタリウムの天然のゲノムを、ポジティブコントロールとして使用した。
VL6-48N株由来の完全なクローン中の酵母ベクターを含むM.ゲニタリウムcl16-2ゲノムが正確なサイズであることを確認するために、CHEFゲル分析を、MPCRにより完全であると考えた3つのクローン(11、16、および24)について行った。この目的のために、DNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグ中でクローンから単離した。染色体DNAを除去するために、プラグを、数時間、一定電圧でプレ電気泳動して、酵母染色体DNAを除去した。この工程の効率を高めるために、プラグを最初に、酵母染色体を切断するが、M.ゲニタリウム中には認識部位を持たないAsiSI、FseI、およびRsrIIで消化した。
酵母ベクター挿入断片を含むM.ミコイデスLC cl1.1ゲノムを株VL6-48Nへと移入した後に回収した48個の個々のクローンから単離したゲノムを、完全性を確認するために、上記のようなマルチプレックスPCRによって分析した。DNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグ中でクローンから単離した。
VL6-48N株由来の完全なクローンの中の酵母ベクターを含むM.ミコイデスcl1.1ゲノムが正確なサイズであることを確認するために、CHEFゲル分析のサザンブロット分析を、6つの完全なクローンについて行い、6つのうちの5つが正確な大きさであることを明らかにした。
酵母ベクターを含むM.ニューモニエゲノムを株VL6-48Nへと移入した後に回収した20個の個々のクローンから単離したゲノムを、完全性を確認するために、上記のようにマルチプレックスPCRによって分析した。2種類の異なるマルチプレックスPCRを行った。セット1およびセット2についてのプライマーと、それによって生じたアンプリコンのサイズとを、表4に列挙する(ゲルの結果は示さず)。図4Aに示すように、アンプリコン(黒色のバーと数字で示す;内側:セット1、外側:セット2)を、ベクター挿入断片を含むM.ニューモニエゲノムを取り囲むように均等な間隔をあけて配置した。結果は、20個の形質転換体のうちの13個が完全なものであることを示した。
CHEFゲル分析を、これらの完全な形質転換体のうちの9個について行った。この目的のために、これらのクローンに由来するDNAを、Bio-Rad CHEF-DR IIIマニュアルによるプロトコール「Preparation of Agarose Embedded Yeast DNA」を使用して、アガロースプラグの中で単離した。染色体DNAを除去するために、プラグを、数時間一定電圧でプレ電気泳動して、酵母の染色体DNAを除去した。その後、DNAを、NotIまたはSbfIで消化した。これらの酵素により生じたベクター挿入断片を持つM.ニューモニエゲノムの断片(番号1〜6)を、図4Bにおいてマップ上に示し、断片とそれらのサイズとを、マップの横に並べて列挙した。
全ゲノムおよび酵母宿主ベクターの相同組換えによる、酵母宿主細胞へのM.ゲニタリウムゲノムの移入
M.ゲニタリウムの直線化した全ゲノムを、図2Bに示した方法を使用して、宿主細胞内での酵母ベクターを用いたゲノムの相同組換えにより、酵母細胞に導入した。M.ゲニタリウムゲノムは、3つの、1箇所で切断される制限酵素部位を含み、そのうちの2つはそのrRNAオペロンの中にある。3つ目は、tRNAコード配列の3'末端にある。クローニングを、tRNAの完全性を保存するように設計することができたため、ベクターを、AscI部位に隣接するように相同組換えにより挿入した。
。これらのプライマーを用いたベクターのPCRにより、固有のClaI制限酵素部位とXhoI制限酵素部位の間の9bpを除くベクター全体を増幅し、6.5kbの産物を得た。
酵母宿主細胞中でのインビボでの組換えによる、重複しているゲノム断片と酵母宿主ベクターとのアセンブリによる酵母宿主細胞へのM.ゲニタリウムゲノムの移入
本実施例は、図2Cに説明する方法を使用した、酵母宿主細胞中へのM.ゲニタリウムドナーゲノムの導入と、その中でのその増殖の成功を記載する。この方法では、ゲノムを、多数の重複しているゲノム断片の相同組換えにより宿主細胞(酵母)の中でアセンブリする。
2種類のマイコプラズマ(M.ゲニタリウムおよびM.ミコイデス)ドナーゲノムを持つ二倍体酵母株の構築
本実施例は、図2Aに示す方法(上記実施例1Aを参照のこと)を使用して導入した2種類のマイコプラズマゲノムを持つ二倍体酵母宿主株の産生を記載する。このプロセスのために、それぞれが上記ゲノムのうちの一方を持つ2つの一倍体株同士を、D.C.Amberg et al., Methods in Yeast Genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, ed.2005, 2005), pp.230に記載されているように接合させた。
を用いた増幅により確認した。これらを用いた増幅により、HIS3がTRP1で置き換えられていれば1207bpの断片が、そして置き換えが起こっていなければ927bpの断片が生じた。結果は、正確な置き換えを明らかにした。
ARS配列の存在を伴わない酵母宿主細胞中でのマイコプラズマドナーゲノムの維持
Gibson et al., Science 319, 1215(2008)に記載されており、上記実施例1Cに記載するように作製した、合成のM.ゲニタリウムゲノム中の酵母ベクターを、RNaseP遺伝子内のそのもとの部位から、必須の遺伝子を遮断しないようにMG411中の新しい部位に移動させた。この目的のために、上記実施例1Cに記載したような、合成のM.ゲニタリウムを含む酵母クローンを、2つの断片で同時形質転換した。第1の断片は1842bpの長さであり、URA3、GAL1プロモーター、およびセントロメアを含む酵母ベクター配列をMG411に挿入した。この断片は、以下の配列を持つプライマーを使用して、PCRによって作製した:
(M.ゲニタリウム配列は太字体とする;NotI部位に下線をひく)。このPCRのための鋳型は、SEQ ID NO:137(表8)に提供する配列を有している構築物であった。
。この断片を、M.ゲニタリウム配列によりRNaseP中の酵母ベクター挿入断片を置き換えるために使用し、その結果、この遺伝子のコード領域を回復させた。この断片は、以下の配列を持つプライマーを使用して、M.ゲニタリウムDNAからPCRによって作製した。
。個々のプライマー中で、M.ゲニタリウムゲノムに対する相同部分を太字体で示す。TRP1遺伝子の挿入断片を、挿入断片が存在する場合には1739bpを増幅し、存在しない場合は680bpを増幅する1セットのプライマー
を使用して、PCRにより確認した。同時形質転換体(これは、His- Trp- Ura+であった)を選択した。RNasePの回復を、配列
を持つプライマーを使用して、513bpの産物のPCR増幅により確認した。酵母ベクター配列によるTRP1の置き換えを、配列
を持つプライマーを使用して、1841bpの産物のPCR増幅により確認した。
酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスMCpMmyc1.1ゲノムの安定性および評価
酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスYCPMmyc1.1ゲノムの安定性を評価した。図18Aは、YCpMmyc1.1ゲノムの概略図を提供し、組込まれたYCpの位置を示す。PCR増幅において使用した9個の個々のプライマー対を、ゲノム中にそれらのおおよその位置に示し、図18Bにおいてアンプリコンに対応する番号をつける。酵母の中での増殖の間のM.ミコイデスゲノムの安定性を、2つの方法によって試験した。第1の方法においては、ゲノムを含有しているクローンの酵母培養物を、ヒスチジンを含まない固体の合成培地上に2日間播種し、その後、個々のコロニーを新しいプレート上に継いだ。第2の方法においては、ゲノムを含有しているクローンの酵母培養物を飽和状態まで増殖させ、1/100の割合に希釈し、再び飽和状態まで増殖させた。次いで、この培養物を、ヒスチジンを含まない固体の合成培地上に2日間播種し、その後、個々のクローンを新しいプレート上に継いだ。いずれの方法においても、ゲノムDNAを単離し、図18Aに示す9個の個々のプライマー対を使用したマルチプレックスPCR増幅において鋳型として使用した。得られたアンプリコンをゲル電気泳動により分析した。ゲルの右側の数字は、図18Bに示す個々のプライマー対のアンプリコンに対応させた。レーンGはポジティブコントロールであり、レーンNはゲノムを含まないネガティブコントロールである。分子量マーカーをレーンMに示す。示す結果は、分析した40個の試料のうちの典型となるものである。40個のクローン全てが完全なゲノムを含むと見られ、このことは、上記細菌のゲノムが酵母の中での日常的な増殖の間、安定であることを示している(図18B)。
酵母宿主細胞中で増殖させたマイコプラズマの全ドナーゲノムの、マイコプラズマレシピエント細胞への移植
大きな核酸の移入のための方法を提供する。例えば、ゲノムを、様々な生物および様々なタイプの細胞(例えば、ドナー、宿主、およびレシピエント)(これは、異なる種、界、および/または目(例えば、真核生物である酵母細胞に対して、異なる細菌種および細菌)であり得る)に移入する。したがって、いくつかの態様においては、上記方法は、様々なタイプの細胞間で起こり得る不和合性を克服するための工程を含み、例えば、宿主細胞中で増殖させたドナーゲノムをレシピエント細胞にうまく移植するための方法を含む。
細菌株、培養条件、およびベクター
本実施例および以下の実施例3に記載する研究のために、大腸菌DH1OB[F--mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139Δ(ara, leu)7697 galU galKλ- rpsL nupG](Invitrogen, Carlsbad, CA)を、クローニング手順およびプラスミドの増幅のための宿主株とした。大腸菌細胞を、Luria-Bertani(LB)培養培地中またはLB寒天中で、37℃で増殖させた。所定のプラスミド中に存在する選択マーカーに応じて、大腸菌形質転換体を、50μg/mlのアンピシリン、5μg/mlのテトラサイクリン、または125μg/mlのピューロマイシンを補充したLB培地中で増殖させた。
宿主酵母細胞からのM.ミコイデスLCドナーゲノムの単離、回収した全ゲノムDNAの量の確認、および移植方法の開発
酵母細胞からインタクトなマイコプラズマドナーゲノムを単離し、分析するために、上記実施例1A(ii)bおよび1A(iv)に記載したようにマイコプラズマ・ミコイデスラージコロニー(M.ミコイデスLC)GM12、クローン1.1のゲノムで形質転換した酵母W303a細胞を、以下に記載するようにアガロースプラグ中に包埋した。このゲノムは、テトラサイクリン耐性遺伝子(tetM)とβ-ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)とを有していた。このプラグからDNAを単離し、評価した。単離した、ドナーゲノムを持たない天然の酵母由来のゲノムDNAおよび天然のドナーであるマイコプラズマ細胞由来のゲノムDNAを、比較のために同様の様式で評価した。
酵母培養物を、OD600がおよそ1.5に達するまで、選択培地中で30℃で増殖させた。酵母細胞をアガロースプラグ中に包埋し、DNAを、Bio-Rad Laboratories(Valencia, CA)によるCHEF mammalian Genomic DNA Plug Kitを使用し、以下の詳細/改変を用いて製造業者が推奨するプロトコールに従って、プラグから単離した。プラグ一つあたりの利用できるM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量を増大させるために、6×109個の酵母細胞(6×108個の細胞の代わりに)を、作製しようとするプラグ1mLあたりに使用して、一つのプラグあたり6×108個の細胞を得た。プラグ中への包埋の後、リチカーゼ(Bio-Rad Laboratories)での処理ではなく、Zymolyase(商標)1OOT酵素(USB Corporation, Cleveland, OH)での消化を、酵母の細胞壁を消化するために使用した。酵素を、5mg/mLの濃度で、プラグの中および外に添加した。この混合物を37℃で2時間置いておいた。1×TE緩衝液(20mMのTris-HCL(pH 8);50mMのEDTA)中での洗浄後、包埋した酵母細胞(スフェロプラスト)を溶解させ、タンパク質を、プラグ1mLあたり200μLのプロテイナーゼKを補充したプロテイナーゼK反応緩衝液(100mMのEDTA;0.2%のデオキシコール酸ナトリウム;1%のラウリルサルコシンナトリウム;pH 8.0)とともに、それぞれ50℃で24時間の2回のインキュベーションを使用して分解させた。その後、アガロースプラグを室温で4回、それぞれ1時間、1×TE緩衝液(20mMのTris-HCL(pH 8);50mMのEDTA)中で撹拌しながら洗浄し、同じ緩衝液中で4℃で保存した。制限酵素(下記を参照のこと)で消化する酵母プラグについて、フェニルメタンスルホニルフルオライド(PMSF)を、1mMの最終濃度となるように2回目の洗浄の際に添加した。
回収したDNAの量の比較のために、様々な量のゲノムDNAを含有している天然のドナーであるM.ミコイデスLCのアガロースプラグもまた、CHEF mammalian Genomic DNA Plug Kit from Bio-Rad(Valencia, CA)を使用してM.ミコイデス細胞から調製した。M.ミコイデスLCからのインタクトな全ゲノムDNAの単離は、特に、細胞を単離前に培養した点において、いくつかの改変を加えて、Lartigue et al, Science 317, 632(2007)に記載されているとおりに行った。500mLのM.ミコイデスLC(tetM、lacZ、YCp)細胞を、10μg/μlのテトラサイクリンと1Oμg/μlのストレプトマイシンを補充したSP4培地中で、培地のpHが6.5(およそ109個の細胞/mL)に達するまで増殖させた。細胞の収集の前に、100μg/μlのクロラムフェニコールを培地に添加し、進行中の回の染色体の複製を同調させて、さらなる回の複製を阻害するために、細胞を、この細胞濃度で37℃でさらに90分間インキュベーションした。
酵母細胞中のM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量は、アガロースプラグ中の酵母細胞に由来する単離したゲノムDNAの量と、アガロースプラグ中のM.ミコイデスLC細胞の2倍の段階希釈物から単離した天然のゲノムDNAの様々な量とを比較することにより概算した。このプロセスのために、酵母のアガロースプラグ(実施例2B(i)、プラグA1、B1、およびC1、ならびにA2、B2、およびC2)と、8個のM.ミコイデスLCのアガロースプラグ(実施例2B(ii))とを、TAE 1×中の1%の認証されている(certified)パルスフィールドアガロースゲル(Bio-Rad, Valencia, CA)の中で、外形クランプ均一電界電気泳動(contour-clamped homogeneous electric field)(Chu et al, Science 234, 1582(1986))(CHEF DR III;Bio-Rad)を用いて電気泳動した。パルス時間を、4.5V/cmで、27時間かけて60秒から120秒までの傾斜をつけた。電気泳動後、ゲルをSYBR(登録商標)GOLD核酸染色(Invitrogen, Carlsbad, CA)(1/10,000の希釈率)で染色し、PFGEパターンを、GE Typhoon 9410イメージャーでスキャンした。S.セレビジエCHEF DNAサイズマーカーを、DNAのサイズを評価するために使用した。このマーカーは、サッカロミセス・セレビジエの染色体を含んでおり、これを、0.2Mb〜2.2Mbの範囲のサイズ決定に使用する。
UV分光光度計を使用して、上記実施例2B(ii)に記載したように、天然のM.ミコイデス細胞から調製した融解させたプラグの中に存在する天然のM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量を決定した。結果を以下の表9に列挙する。この表に示すように、シリーズ7のプラグは、およそ12ng/μlのゲノムM.ミコイデスLC DNAを含んでいた(100μLのプラグあたり1.2μg)。上記のように、パルスフィールドゲルは、この試料を含むレーン(7)および酵母試料から回収したDNAを含有しているレーン(C2)において、比較可能な1.2Mbのバンドの強度を明らかにした(上記実施例2B(iii)を参照のこと)。これにより、ドナーゲノムを含有している宿主細胞から回収した100μLのプラグあたりのM.ミコイデスLCのゲノムDNAの量が1μgにほぼ等しいことを決定した。
プラグから回収したDNAの、レシピエント細胞への移植
融解させた天然のM.ミコイデスLCのアガロースプラグ(実施例2B(iv);表9)のシリーズからのそれぞれの試料について、プラグの1/5(20μL)を、以下のようないくつかの改変を加えて、Lartigue et al., Science 317, 632(2007)に記載されているプロトコールと類似するプロトコールを使用して、M.カプリコルムレシピエント細胞に移植した。
6mLのM.カプリコルムレシピエント細胞を、ウシ胎児血清(17%)、グルコース(10g/L)、2mLのフェノールレッド(1%)、および100μlのペニシリンG(5mg/ml))を補充したSOB(+)培地(Bacto SOB培地(Becton Dickinson;Franklin Lakes, NJ)中で、培養物のpHがpH 5.7〜5.85(およそ5×107個の細胞/ml)に達するまで増殖させた。レシピエント細胞を、10℃で15分間、4575gで遠心分離し、S/T緩衝液(10mMのTris-HCl(pH 6.5);および250mMのNaCl)中で1回洗浄し、200μlのCaCl2(0.1M)中に再度懸濁し、そして氷上で30分間インキュベーションした。
移植前に、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを含有しているアガロースプラグ(シリーズ1〜7)を、2回、それぞれ30分間、0.1×TE緩衝液[2mMのTRIS-HCl(pH 8.0)-5mMのEDTA]中で、室温で穏やかに撹拌しながら洗浄した。この緩衝液を完全に除去し、アガロースプラグを、1/10容量の1O×β-アガラーゼ緩衝液[10mMのBis Tris-HCl(pH 6.5);1mMのNa2EDTA]で、65℃で10分間融解させた。この融解させたアガロースを10分間かけて42℃に冷却し、この温度で、プラグ100μlあたり3ユニットのβ-アガラーゼI(New England Biolabs, Ipswich, MA)とともに一晩インキュベーションした。
氷上で30分の後、200μlのレシピエント細胞を、上記実施例2B(ii)において作製した20μlの融解させたドナーゲノムDNAのアガロースプラグ(プラグの1/5)を含有している400μlのSP4(-)培地[0%のウシ胎児血清、0.45%のNaCl]とともに穏やかに混合した。すぐにプラグを添加し、その後、以下のように次の工程で処理した。
制限修飾(R-M)システムの評価
ドナー細胞、宿主細胞、およびレシピエント細胞間での制限修飾システムの差異が、ゲノムの移植において問題を引き起こす可能性があるため、これらのシステムを調べた。本実施例は、本明細書中で移植に使用したマイコプラズマ細胞のいくつかの中に存在しその中で活性である制限修飾システムの成分を、明らかにし、かつ、移植の成功のためにこれらのシステムを妨害するように使用した本提供の方法の複数の局面を明らかにする。
M.ミコイデスLCゲノム(これは配列決定されている(Genbankアクセッション番号:NZ_AAZK00000000;GI:149364883))が、6種類の異なる制限修飾システム(5つのII型システムと一つのIII型システム)を含むと予想した。M.カプリコルムゲノム配列は、一つのII型システムの存在を示した。II型酵素の認識部位特異性を、遺伝子配列(R.Roberts博士、私信)から、Roberts RJ et al., Nucleic Acids Res.35(Database issue):D269-70(2007)に記載されているように予想した。World Wide Webアドレス:rebase.neb.com/rebase/rebase.html.で利用できるREBASE、The Restriction Enzyme Databaseもまた参照のこと。これらの認識部位と、これらの部位を切断する市販されている制限酵素を、以下の表10に列挙する。III型システムの特異性は予想しなかった。
a.制限部位のメチル化状態
予想したII型制限酵素システムに対応している市販されている制限酵素アイソシゾマーを、M.ミコイデスLCおよびM.カプリコルムの天然のゲノムが、表10に列挙した予想した部位でメチル化されるかどうかを確認するために使用した。アイソシゾマーでのM.ミコイデスLCのゲノムDNAおよびM.カプリコルムのゲノムDNAの消化は、天然のゲノムDNAが、予想される部位でメチル化されたことを示した(データは示さず)。これらの結果は、M.カプリコルムとM.ミコイデスLCがいずれも、CCATC制限修飾システムを含むことを示していた。
M.ミコイデスおよびLC M.カプリコルムから、細胞を含まない抽出物を、制限酵素がいずれの種においても活性であることを明らかにするために調製した。以下に記載するように、上記抽出物を、M.ミコイデスLC、M.カプリコルム、およびM.ゲニタリウムのゲノムDNAを切断するそれらの能力を試験するために、制限酵素アッセイにおいて使用した。
M.ミコイデスLCについては、SP4培地中の細胞の1リットルの培養物を、6.2〜6.3のpHに達するまで、37℃で増殖させた。細胞を5つの200mLの画分に分け、そしてSLA-1500 Sorvallローターの中で4℃で15分間、5,000×gで遠心分離することにより、培養物を回収した。その後、M.ミコイデスLCペレットをそれぞれ、200mLの8mM Hepes(pH 7.4)および272mMのスクロースで洗浄し、SLA-1500 Sorvallローターの中で4℃で15分間、5,000×gで遠心分離した。得られたペレットをそれぞれ、1mlの抽出緩衝液(20mMのTris-HCl(pH 7.5)、0.1mMのEDTA、150mMのNaCl、1mMのDTT、および10%のグリセロール)の中に再度懸濁し、その後、3の出力制御で、マイクロチップを使用して氷上で5回、10秒〜12秒のバーストを用いて超音波処理した。溶液それぞれを、4℃で30分間、18,000×gで微量遠心機により明澄化した。得られた各可溶性画分を合わせて一つにし、タンパク質濃度を試験し、200μlの画分にアリコートし、-80℃で保存した。この様式で調製した抽出物のタンパク質濃度は、典型的には、15mg/ml〜25mg/mlの範囲であった。
M.ミコイデスLC抽出物の制限酵素活性を以下のように試験した。WIZARD(登録商標)Genomic DNA精製キット(Promega Corporation, Madison, WI)を使用してM.カプリコルム、M.ミコイデスLC、およびM.ゲニタリウムから、別々の反応において個別に単離した2μgのゲノムDNAを、1×NEB制限酵素緩衝液4および100μMのデオキシヌクレオチドの中で、8μgの抽出物とともに、100μlの全容量の中で37℃でインキュベーションした。タンパク質を最後に添加し、0分、5分、10分、および15分の時間間隔で、20μlのアリコートを取り出し、20μlの2×停止緩衝液(2%のSDS、20mMのEDTA)に対して添加した。この溶液を、40μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)で抽出し、室温で2分間、18,000×gで遠心分離した。水相を、4μlの1O×Blue Juice(Invitrogen, Carlsbad, CA)とともに新しいチューブに入れ、18μlの各溶液を、0.8%の1×TAEアガロースゲル上に充填し、そして120V、0.1〜0.6の線形、および80V、0.1〜0.6の線形のFIGE条件下で16時間泳動させた。その後、このアガロースゲルを、SYBR(登録商標)GOLD核酸染色(Invitrogen, Carlsbad, CA)(1/10,000の希釈率)で30分間染色し、GE Typhoon 9410イメージャーでスキャンした。
2つのM.ミコイデスクローンを配列決定した。一方は、Science(317,362)に公開された2007年の論文「Genome transplantation in bacteria:changing one species to another」の中でLartigue et al.によって記載されたドナーゲノム(1,088,905bp、GenBank#CP001621)であった。他方は、III型制限酵素遺伝子欠失を含む移植されたM.ミコイデスクローン(ΔtypeIIIres;図17)(1,084,586bp、Genbank#CP001668)であった。2007年の論文で使用されたクローンを、Sanger DNA配列決定化学反応だけを使用して配列決定した。本明細書中に記載するIII型制限酵素遺伝子欠失クローンは、Sanger法により8倍の被覆率になるように、また、454 FLXペアード・エンド・リード・ピロシーケンシング化学反応(paired-end read pyrosequencing chemistry)を用いて配列決定した。
制限修飾システムの不和合性からドナーゲノムおよび核酸を保護するための方法
本実施例は、制限修飾システムによる切断からマイコプラズマ(例えば、M.ミコイデスLC)のドナーゲノムを保護するために使用した2種類のメチル化方法を記載する。メチル化アッセイは、効率を確認するために、それぞれの方法について行った。
最初に、以下に記載するように、M.ミコイデスLCゲノムの決定した配列を、同定したメチルトランスフェラーゼそれぞれ(上記表10を参照のこと)を外因的に発現させ、かつ精製するために使用した。M.カプリコルムにおいて同定したR-MシステムだけがM.ミコイデスLCにおいて同定したものと同じであったので、M.ミコイデスLCメチルトランスフェラーゼだけを、この研究のために精製した。
M.ミコイデスLC中の可能性がある制限修飾システムに由来する5つの同定したメチルトランスフェラーゼ(CCATC-M、CCTTC-M、TypeIII-M、GCATC-M、およびGANTC-M)のコード配列を、酵母の中での発現のためにコドン最適化した。その後、これらの配列を、Gibson et al., Nature Methods 6, 343-345(2009)、および2009年2月19日に提出された米国特許出願第12/371,543号に記載されている、1工程の等温DNAアセンブリ法を使用して、5'エキソヌクレアーゼ、DNAポリメラーゼ、およびDNAリガーゼの協働作用により、多数の重複している60bpのオリゴヌクレオチドから構築した。簡単に説明すると、この方法を用いる場合は、DNA断片に、最初に、5'エキソヌクレアーゼによって凹みを作り、これにより、一本鎖の突出を生じさせる。次に、これを特異的にアニーリングさせ、続いてギャップを埋め、ポリメラーゼとリガーゼを使用して共有結合させる。構築後、CCATC-M、CCTTC-M、およびbTypeIII-M配列を、pTYB1発現ベクター(New England Biolabs, Ipswich, MA;SEQ ID NO:156)にクローニングした。GCATC-M配列およびGANTC-M配列を、GATEWAY(登録商標)組換えクローニング技術(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてN末端Hisタグ発現ベクターにクローニングした。
CCATC-M、CCTTC-M発現プラスミド
CCATC-M発現プラスミドとCCTTC-M発現プラスミドとで、BL21(DE3)コドンプラス細胞(Stratagene, La Jolla, CA)を形質転換し、形質転換体を使用して、100mg/mlのカルベニシリンと34mg/mlのクロラムフェニコールを含有している250mLのZYM-505培地(Studier, FW, Protein Expr Purific 41:207-34(2005))に別々に接種し、激しく撹拌しながら(315rpm)37℃で増殖させた。およそ4時間後、培養物を16℃に移し、発現を、0.3mMのIPTGの添加により、一晩誘導した。細胞をペレット状にし、50mlのIntein溶解緩衝液(25mMのHEPES-NaOH(pH 7.2)、500mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤(Complete protease inhibitor cocktail, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN))に懸濁し、高圧ホモジナイザーに2回通過させることにより溶解させた。
Type III-Mタンパク質を、キチンカラム上での精製後に、このタンパク質をHiTrap MonoQカラム(GE Heathcare)を使用してさらに精製したことを除き、同じプロトコールを使用して精製した。このタンパク質を緩衝液A(50mMのHEPES-NaOH(pH 7.2)、50mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセロール)に充填し、0%〜100%までの緩衝液B(50mMのHEPES-NaOH(pH 7.2)、1MのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセロール)の線形勾配を用いて溶離させた。Type III-Mを含有している画分をプールし、100mMのNaClを含有している酵素緩衝液に透析し、そしてCCATC-Mタンパク質およびCCTTC-Mタンパク質について記載したように濃縮した。
M.GCATC発現プラスミドM.GANTC発現プラスミドでBL21(DE3)コドンプラス細胞を形質転換し、形質転換体を使用して、100mg/mlのカルベニシリンを含有している2mLのZYM-505培地に別々に接種し、激しく振盪させながら37℃で一晩増殖させた。一晩培養物のうちの1ミリリットルを使用して、250mLのZYM-5052培地(Studier, FW, Protein Expr Purific 41:207-34(2005))に接種した。その後、細胞を、激しく振盪させながら27℃で20時間増殖させた。細胞をペレット状にし、50mlのNickel溶解緩衝液(50mMのHEPES-NaOH(pH 7.2)、500mMのNaCl、30mMのイミダゾール、10%のグリセロール、およびプロテアーゼ阻害剤(Complete protease inhibitor cocktail, Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN))中に懸濁し、そして高圧ホモジナイザーに2回通すことにより溶解させた。この溶解物を、4℃で20分間の、20,000×gでの遠心分離によって明澄化させた。明澄化させた溶解物を、Nickel溶解緩衝液をランニングバッファーとして、そして300mMのイミダゾールを含むNickel溶解緩衝液を溶離緩衝液として用いて、5mlのHisTrapカラムを使用して精製した。M.GCATCタンパク質をプールし、100mMのNaClを含有している酵素緩衝液に透析し、そして上記のように濃縮した。M.GANTCタンパク質を、1mlのHiTrap MonoQヘパリンカラムを使用し、M.TypeIIIについての緩衝液AとBを利用してさらに精製した。M.GANTCを含有している画分をプールし、100mMのNaClを含有している酵素緩衝液に透析し、そして上記に記載するように濃縮した。
精製したメチルトランスフェラーゼを、これらが、マイコプラズマDNAを含有しているプラスミドをメチル化できるかどうかを決定するためのメチル化アッセイにおいて使用した。メチル化アッセイは、Wilson and Hoffman, Anal Biochem 191, 370(1990年12月)に記載されている緩衝液条件を使用して行った。反応は、100μlの容量の中で37℃で行った。反応混合物には、100mMのTris-HCl(pH 7.5)、10mMのEDTA、3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン(SAM)、3μgのpSmart-pMYCO1プラスミドDNA(酵母-大腸菌-マイコプラズマトリ-シャトルベクター)を含めた。
メチル化後のさらなる、ゲノム配列の中では同定されていない明らかになっていない制限修飾システム由来の酵素による(したがって、精製されたメチラーゼによっては行われない)切断の可能性を排除するために、M.カプリコルムおよびM.ミコイデスLCから調製した粗抽出物を使用してDNAをメチル化するための一つのプロトコールを開発した。上記抽出物は、10mMのEDTA(これはヌクレアーゼを阻害する)の添加により、メチルトランスフェラーゼ活性の供給源として使用することができる。
M.ミコイデスLCについては、SP4培地中の1リットルの細胞培養物を、6.2〜6.3のpHに達するまで、37℃で増殖させた。この培養物を、細胞を5×200mlの画分に分け、そしてSLA-1500 Sorvallローターの中で、4℃で15分間、5,000×gで遠心分離することにより回収した。その後、M.ミコイデスLCペレットをそれぞれ、200mLの8mMのHepes(pH 7.4)および272mMのスクロースで洗浄し、SLA-1500 Sorvallローターの中で4℃で15分間の、5,000×gでの遠心分離により明澄化した。得られたペレットをそれぞれ、1mlの抽出緩衝液(20mMのTris-HCl(pH 7.5)、0.1mMのEDTA、150mMのNaCl、1mMのDTT、および10%のグリセロール)の中に再度懸濁し、その後、3の出力制御で、マイクロチップを使用して氷上で5回、10秒〜12秒のバーストを用いて超音波処理した。溶液それぞれを、4℃で30分間、18,000×gで微量遠心機により明澄化した。得られた各可溶性画分を合わせて一つにし、タンパク質濃度を試験し、200μlの画分にアリコートし、-80℃で保存した。この様式で調製した抽出物のタンパク質濃度は、典型的には、15mg/ml〜25mg/mlの範囲であった。
メチル化アッセイを、以下のように、様々な宿主細胞の中で増殖させたマイコプラズマプラスミドDNAをメチル化する上記粗抽出物の能力を明らかにするために使用した。粗抽出物を使用するメチル化アッセイは、Wilson and Hoffman, Anal Biochem 191, 370(1990)に記載されている緩衝液条件を使用して行った。
M.ミコイデスLC抽出物によるCCATC、GANTC、CCTTC、およびGCATC部位のメチル化(およびそれによる保護)を評価するために、反応を、100μlの容量の中で37℃で行った。反応混合物には、100mMのTris-HCl(pH 7.5)、10mMのEDTA、3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン(SAM)(示すように、対照試料中には存在しない)、大腸菌から単離した3μgのpMYC01プラスミドDNA(SEQ ID NO:149)、および20μgのM.ミコイデスLC抽出物を含めた。
M.ミコイデスLC抽出物によるGATCのメチル化を試験した場合には、上記プロトコールを、最初の工程において、M.カプリコルムから単離した3μgのpMYC01プラスミドDNAを使用すること、およびMboI制限酵素アイソシゾマーを用いて切断したことにより改変した。
M.カプリコルム抽出物によるCCATC部位のメチル化を、それぞれ3μgの、大腸菌から単離したpSmart-pMYC01プラスミドDNA(酵母-大腸菌-マイコプラズマトリ-シャトルベクター)、ならびに、M.カプリコルムおよびM.ミコイデスLCから単離したpMYC01を使用したこと、そして反応を、S-アデノシルメチオニンの存在下または非存在下で4時間行ったことを除き、上記のように試験した。その後、メチル化されたDNAを、上記のようにBccIとともにインキュベートすることによりチェックした。
M.カプリコルム粗抽出物は、対応する制限酵素アイソシゾマーBccIが、粗抽出物およびSAMとともにインキュベーションしたプラスミドを切断できなかったという事実により実証されたように(ゲルのデータは示さず)、大腸菌から単離した2種類のプラスミドを完全にメチル化することができた。
メチル化されていないプラスミド、および上記のようにM.ミコイデスLC抽出物でメチル化したプラスミドで、M.カプリコルム細胞を形質転換し、比較した。結果は、メチル化されたプラスミドの形質転換効率の増大を示し、形質転換の前のDNA修飾のポジティブな効果を示していた。
粗抽出物は、宿主の制限修飾システムからドナープラスミドDNAを保護し、形質転換効率を増大させたが、粗抽出物はまた、アガロースプラグ中で単離した天然のM.ミコイデスLCのゲノムDNAおよびM.カプリコルム細胞を含むゲノムの移植実験を完全に阻害した(以下の実施例3を参照のこと)。
R-Mシステムの突然変異(M.カプリコルムΔREの作製)
宿主細胞とレシピエント細胞との間での制限の障壁を克服するための手段として、別の方法を利用した。この方法では、M.カプリコルムにおいて同定した一つの制限酵素(上記実施例2D(i)および表3を参照のこと)を、この遺伝子のコード領域への割り込みにより不活化した。制限酵素遺伝子を、この遺伝子のコード領域へのピューロマイシン耐性マーカーの組込みにより割り込ませた。
酵母宿主細胞由来のM.ミコイデスLC-YCpゲノムDNAのM.カプリコルムへの移植
上記実施例1は、酵母宿主細胞の中での完全な細菌ゲノムのクローニングの成功(これらのマイコプラズマを含む)を記載している。本実施例は、全マイコプラズマドナーゲノム(M.ミコイデスLC(Genbankアクセッション番号:NZ_AAZK00000000;GI:149364883))DNA(酵母宿主細胞の中で増殖させた)の、様々な種のマイコプラズマレシピエント細胞(M.カプリコルム)への移植の成功を記載する。ドナーおよびレシピエントは、それらの迅速な増殖に基づいて選択した。しかし、この方法はまた、他のマイコプラズマドナーおよびレシピエント(例えば、上記のM.ゲニタリウムゲノム/細胞)を使用して行うこともできた。さらに、本実施例に記載する方法は、インビボでドナーゲノムを修飾するための工程と組み合わせて、移入の前に、依然宿主細胞の中で使用することができる(例えば、細菌のドナーゲノムの増殖の間に酵母ツールのレパートリーを使用する)。したがって、上記方法は、ドナーゲノム(例えば、比較的あまり開発されていない遺伝子システムを持つ細菌由来のゲノム)を遺伝学的に変更するために使用することができる。
移植方法
本実施例は、ドナーであるマイコプラズマゲノムを酵母宿主細胞からマイコプラズマレシピエント細胞にうまく移植するためのこれらの技術の使用を記載する。図8は、全ゲノムDNAを移植するために使用することができる3種類の代替えの移植アプローチを示す。これらの3種類のアプローチのバリエーションを、以下に記載する実施例において使用した。第1のアプローチ(図8において番号「1」で示す矢印で示す)は、ゲノムDNAを含有しているアガロースプラグの消化(例えば、β-アガラーゼでの消化(融解工程))、これに続くレシピエント細胞への直接の移植を含む。この方法は、典型的には、一つの細胞(例えば、ドナーであるマイコプラズマ細胞)から類似する細胞への(例えば、マイコプラズマドナー細胞からマイコプラズマレシピエント細胞への)ドナーゲノムまたは核酸の移植のために、図8に示すように使用する。
個々のアプローチにおいて、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを、以下のように、酵母株VL6-48N(Larionov et al, PNAS USA 94:7384-7(1997)に記載されている)から、アガロースプラグの中で単離した。
これらの研究の以前には、酵母から抽出したM.ミコイデスLCドナーゲノムDNAとともに単離した酵母のゲノムDNAが、移植反応に影響を及ぼすか、または移植反応を無効にするかどうかは明らかではなかった。したがって、それぞれのアプローチを用いて、2セットのドナーゲノムDNAを調製した。これらのうちの一方は、細胞壁の消化およびプロテイナーゼKでの処理後の随意の「浄化」工程にし従った。この「浄化」工程は、試料から酵母のゲノムDNAを除去するように設計した。
それぞれのアプローチを用いて、第3のアプローチを用いた場合には、以下の実施例3A(iii)に記載したように、β-アガラーゼでの融解の前に試料をメチル化し、プロテイナーゼKでの処理を行ったことを除き、移植を以下のように進めた。
12mLのM.カプリコルムレシピエント細胞(野生型またはΔRE(実施例2Fに記載したように産生した))を、ウシ胎児血清(17%)、グルコース(10g/1)、2mLのフェノールレッド(1%)、および100μlのペニシリンG(5mg/ml))を補充したSOB(+)培地(Bacto SOB培地(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)中で、培養物のpHがpH 5.7〜5.85(およそ5×107個の細胞/ml)に達するまで増殖させた。レシピエント細胞を、10℃で15分間、4575×gで遠心分離し、6mLのS/T緩衝液(Tris-HCl 1OmM(pH 6.5);NaCl 25OmM)中で1回洗浄し、400μlのCaCl2(0.1M)中に再度懸濁し、氷上で30分間インキュベーションした。
移植の前に、酵母由来のM.ミコイデスLCのゲノムDNAを含有している上記実施例3A(i)(a)に記載したように調製したアガロースプラグを、2回、0.1×TE緩衝液[Tris-HCl 2mM(pH 8.0)、EDTA 5mM]中でそれぞれ30分間、室温で穏やかに撹拌しながら洗浄した。この緩衝液を完全に除去し、アガロースプラグを、1/10容量の1O×β-アガラーゼ緩衝液[10mMのBis Tris-HCl(pH 6.5);1mMのNa2EDTA]で、65℃で10分間融解させた。融解させたアガロースを、10分かけて42℃に冷却し、この温度で一晩、プラグ100μlあたり3ユニットのβ-アガラーゼI(New England Biolabs, Ipswich, MA)とともにインキュベーションした。以下の実施例3A(i)(c)に記載するように、メチル化とプロテイナーゼKでの処理を、第3のアプローチでのβ-アガラーゼでの処理の前に行った(図8(「3」))。
氷上で30分の後、400μlのレシピエント細胞を、上記実施例2B(ii)において作製した100μlの融解させたドナーゲノムDNAのアガロースプラグを含有している800μlのSP4(-)培地[0%のウシ胎児血清、0.45%のNaCl]とともに穏やかに混合した。このプラグを、以下のように、次の工程の直前に添加した。
第3のアプローチを用いた場合は(図8、「3」)、β-アガラーゼでの融解の前に、酵母のアガロースプラグ由来のM.ミコイデスLCのゲノムDNAをメチル化し、続いて、除タンパク質工程を行った。このプロセスのために、プラグを、2回、200mMのTris-HCl(pH 7.5);50mMのEDTA中で30分間洗浄し、メチル化緩衝液(100mMのTris-HCl(pH 7.5);10mMのEDTA、3μMのDTT、200μMのS-アデノシルメチオニン)中で2回、30分間、優しく撹拌しながら平衡化させた。平衡化後、酵母プラグをそれぞれ、4つの断片に切断し、100μlのメチル化反応(1×メチル化緩衝液とメチルトランスフェラーゼ)に添加し、37℃で16時間インキュベートした。100μlの反応について、5μlの野生型M.ミコイデスLC細胞抽出物または7.5μlのM.カプリコルムΔRE(クローン10 15P)細胞抽出物(およそ125μgのタンパク質)または2.5μlのそれぞれの精製したM.ミコイデスLC特異的メチルトランスフェラーゼ(M.GANTC、M.CCATC、M.GCATC、M.CCTTC、M.TypeIII)のいずれかを。細胞抽出物をそれぞれ、上記実施例2E(ii)に記載したように調製し、精製したメチルトランスフェラーゼを、上記実施例2E(i)に記載したように調製した。M.ミコイデスLC細胞抽出物または精製したメチルトランスフェラーゼを含有しているメチル化反応にもまた、5μlのdamメチルトランスフェラーゼ(New England Biolabs, Ipswich, MA)を補充した。
本提供の方法を使用した、移植の成功を明らかにしている研究
上記実施例3Aに記載した一般的方法を使用して、酵母宿主細胞由来のM.ミコイデスLCゲノムドナーDNAの、野生型および制限酵素欠損M.カプリコルムレシピエント細胞への移植を、表11に列挙する以下の条件下で行った。「未処理」の試料は、融解の前に、メチル化を行わず、プロテイナーゼKでの処理も行わなかった。「疑似メチル化」した試料を、メチル化した試料と同じ条件下で、酵素または細胞抽出物を含めずにインキュベーションした。メチル化処理には、ドナーまたはレシピエント細胞抽出物でのメチル化、および精製したメチラーゼでのメチル化を含めた。
a少なくとも3回の実験の平均。報告する誤差は、平均偏差である。
b酵母のプラグを、AsiSI、RsrII、FseIカクテル制限酵素プロトコールを使用して酵母のゲノムDNAの清浄を行った。
c酵母のプラグについて、パルスフィールドゲル電気泳動プロトコールを使用して酵母ゲノムDNAの清浄を行った。
*酵母プラグから、AsiSI、RrsII、およびFseIのカクテルでの消化、続いて、パルスフィールドゲル電気泳動を行うことにより、酵母のゲノムDNAを除去した。
†酵母のプラグから、パルスフィールドゲル電気泳動を使用することにより、酵母のゲノムDNAを除去した。
酵母宿主細胞内でのドナーゲノムの修飾
本実施例は、酵母宿主細胞にクローニングしたマイコプラズマドナーゲノムにシームレスな修飾を導入するための方法の使用を記載する。
従来の2工程の相同組換え法を使用した修飾
従来の2工程の相同組換え法(Rothstein, R.Methods Enzymol, 194, 281-301(1991))を、酵母の中で維持した合成のM.ゲニタリウムゲノムの中の1塩基のシチジン欠失を修正するための部位特異的突然変異誘発を導入するために使用した。これを、図12Aに模式的に説明する。
表13に列挙したプライマーを使用して、従来の方法(従来の配列の置き換え)を以下のように行った。最初の工程(これは、2回の連続する形質転換を含む)においては、URA3遺伝子(1,066bp)を、プラスミドpRS306(R.S.Sikorski and P.Hieter, Genetics 122, 19(1989)に記載されている)から、プライマーURA-FおよびURA-RによりPCR増幅した。これらの配列は、上記表13に列挙する。この増幅したURA3遺伝子は、突然変異のために標的化したM.ゲニタリウムゲノム領域の部分に同一である2つの50bpの末端配列を含んでいた。PCR反応は、DNAポリメラーゼ(Takara, Madison, WI)を使用して、製造業者が推奨する条件下で行った。PCR産物を、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に導入した。
2回目の形質転換のために、328bpの野生型DNA断片(標的領域の部分に対して相同であるが、CDS139遺伝子座の1塩基欠失を含まない)を、上記表13に列挙したプライマーAmp-FおよびSeq-Rを用いたPCR増幅により得た。この断片を、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換方法を使用した1回目の形質転換により得たURA3で置き換えた株に導入した。
選択した酵母の中でのM.ゲニタリウムゲノムの完全性を評価することによりこの可能性を試験するために、マルチプレックスPCR(MPCR)を、Gibson et al, PNAS USA, 105(51):20404-9(2008)、およびGibson et al., Science 319, 1215(2008)に記載されているように行った。PCR分析のための酵母からの全DNAの単離は、公開されているプロトコール(Kouprina and Larionov, Nat.Protoc.3, 371(2008))に従い、上記実施例3に記載したように行った。MPCRのためのプライマーセット(セット3)を、およそ60kbのDNAごとにM.ゲニタリウムゲノムを取り囲むように分布させた10種類のアンプリコン(0.1kbの増分で、125bpから1025bpまでの範囲)を生じるように設計した(Gibson et al., PNAS USA, 105(51):20404-9(2008))。マルチプレックスPCRは、Qiagen(Valencia, CA)によるマルチプレックスPCRキットを使用して行った。1/50容量(2μl)のDNA抽出物、およびそれぞれ5μMの20種類のオリゴを含有している1μlの1O×プライマーストックを、10μlの反応物の中に含めた。サイクルのパラメーターは、94℃で15分、その後、35サイクルの、94℃で30秒、52℃で90秒、および72℃で90秒、これに続き、1回の72℃で3分間のインキュベーションであった。その後、2μlの反応物をそれぞれ、2%のE-ゲル(Invitrogen)上に充填し、72Vを30分間かけた。バンドを、Amersham Typhoon 9410 Fluorescence Imagerを使用して視覚化した。
別のシームレスな修飾の方法
2種類の他のシームレスな修飾方法(これらは、より有効であることが報告されている)を、上記の酵母の中で合成のM.ゲニタリウムドナーゲノムの同じ標的領域を修飾する試みにおいて使用した。
2種類の報告されている効率的な方法のうちの第1のものである完全欠失(delitto perfetto)(Storici, F.et al, Nat Biotechnol, 19, 773-776(2001))を、図1OAに模式的に説明する。この方法では、標的DNA部位への二本鎖の断裂の導入が、組換えを桁違いに刺激する。
完全欠失(delitto perfetto)突然変異誘発カセットを、GAL1プロモーター(誘導性プロモーター)とI-SceI遺伝子(エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子)を含んでいる第1の断片をURA3(選択/対抗選択マーカー)遺伝子断片に対して融合させるための融合PCRにより作製した。URA3遺伝子断片(1,066bp)を、上記実施例4Aに記載したように、プラスミドpRS306から、上記表13に列挙したプライマーURA-FおよびURA-Rを使用して増幅させた。GAL1プロモーターとI-SceI遺伝子(GAL1/I-SceI遺伝子断片)を含むこの1,184bpの断片を、プラスミドpGSKU(Storici et al, PNAS USA, 100, 14994-14999(2003)に記載されている)から、上記表13に列挙したプライマーGal-FおよびGal-Rを使用して増幅させた。融合PCRは、原則としてShevchuk et al., Nucleic Acids Res, 32, e19(2004)に記載されているとおりに、組換えPCR技術を使用して行った。
上記カセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra+形質転換体を選択し、遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびSeq-R(図10Aの中で、挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示す)を使用してPCRによって分析した。これらのプライマーを使用した、カセットが挿入されたゲノムのPCRによって、2.5kbの産物が生じたと考えられる。PCR反応による産物をアガロースゲル上で分離し、これを、URA3遺伝子の正確な挿入を確認するために視覚化した。
診断用プライマーを用いたPCR反応においてポジティブと試験したクローンを、I-SecIエンドヌクレアーゼ(これは、GAL1プロモーターによって制御されており、これにより、唯一の炭素源としてガラクトースを含有している培地中で酵母を増殖させると発現される)の発現を誘導するために、SD/ガラクトース/-HIS培地中で4時間増殖させた。エンドヌクレアーゼの発現の誘導は、ゲノムに相同である領域のすぐ下流に位置するカセット内の18bpの認識配列を切断することにより二本鎖の断裂を生じるように意図した。誘導後、野生型DNA断片で、上記実施例4Aに記載したように細胞を形質転換した。
2種類の報告されているシームレスな欠失の方法の第2のものであるタンデム反復ポップアウトは、2つのタンデム反復配列間での相同組換え(HR)による核酸セグメントの正確な除去に基づき、これは、Akada et al, Yeast, 23, 399-405(2006)に記載されている。この技術は、遺伝子の置き換えでの使用に適応させることができる。この方法を用いて、1塩基欠失の修正の代わりに、CDS139遺伝子座のシームレスな欠失を、M.ゲニタリウムゲノムを持つ同じ酵母株において行った。
URA3マーカーと、標的遺伝子座(図10Bの中で「反復」として示す大きな矢印)のすぐ上流の部分に相同である358bpの断片(「反復」断片)を含む融合産物を作製した。1,066bpのURA3マーカー断片は、実施例4Aに記載した方法と同じ方法を使用して、Ura-FおよびUra-Rプライマー(表13)を使用してPCRにより産生した。358bpの反復断片は、表13に列挙したAmp-FおよびSeq-Rプライマーを用いて、PCR増幅により産生した。
上記カセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra+形質転換体を選択し、上記遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびM2-detl-R(図10Bの中で、挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示す)を使用して、PCRによって分析した。これらのプライマーを用いた野生型ゲノムのPCRによって、1kbの産物が生じたと考えられる。一方、カセットが挿入されたゲノムのPCRによっては、1.973kbの産物が生じた。PCR反応による産物をアガロースゲル上で分離し、これを、URA3遺伝子の正確な挿入を確認するために視覚化した。
タンデム反復とエンドヌクレアーゼによる切断を使用した修飾方法(TREC)
実施例4Aおよび4Bに記載した研究の結果に基づいて、ポップアウト法(実施例4B(ii))における意図したタンデム反復間での組換え頻度が、標的遺伝子座付近での二本鎖の断裂の導入により増強され得ると理由づけした。タンデム反復とエンドヌクレアーゼによる切断(TREC)を使用し、そして酵母宿主細胞の中でドナー核酸を修飾するために使用することができるそのような方法(TREC)を提供する。本実施例は、酵母の中でのM.ゲニタリウムドナーゲノム中の同じ遺伝子座を修飾するための本提供の方法の使用を記載する。この研究の結果により、標的部位付近への二本鎖の断裂の導入により、このシステムにおけるタンデム反復を介する組換え効率が増大することを確認する。
別の例においては、TREC突然変異誘発構築物を、(GAL1/I-SceI)-URA3融合産物(実施例4B(i)に記載したように産生した)を標的遺伝子座の上流に位置する358bpの「反復」断片(実施例4B(ii)に記載した)と融合させることにより作製した。(GAL1/I-SceI)-URA3産物と反復断片の融合は、以下のように、融合PCRにより行った。キメラプライマーFus1およびFus2(上記表13に列挙した)(それぞれが、(GAL1/I-SceI)-URA3融合産物および反復断片に対する相同部分を有している)を、(GAL1/I-SceI)-URA3融合産物を鋳型として用いたPCR増幅において、そして「反復」断片を鋳型として用いた別のPCR増幅において使用した。その後、これらの産物について、上記実施例4Aおよび4Bに記載したように、プライマーを用いないPCRを行って、((GAL1/I-SceI)-URA3)-反復融合産物を作製した。
TRECカセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra+形質転換体を選択し、上記遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、上記表13に列挙した診断用プライマーSeq-FおよびM2-det1(図10Cにおいて挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示した)を使用して、PCRによって分析した。これらのプライマーを使用した、TRECカセットが挿入されたゲノムのPCRによって、2.884kbの産物が生じたと考えられる。PCR反応の産物をアガロースゲルで分離し、これを、URA3遺伝子の正確な挿入を確認するために視覚化した。
その後、クローンを、SG(合成のガラクトース)-Hisを含有しているプレート、およびSD-HISを含有しているプレート(グルコースを含有している)上でレプリカ培養し、24時間増殖させた。唯一の炭素源としてガラクトースを含有しているSG培地上での増殖は、GAL1プロモーターにより制御されるI-SecIエンドヌクレアーゼの発現を誘導するために行った。同じ条件下でのSD-HISプレート上での増殖は、対照として行った。エンドヌクレアーゼの発現は、ゲノムに対する相同領域のすぐ下流に位置しているカセットの内部の18bpの認識配列を切断することにより二本鎖の断裂が生じるように意図した。24時間のインキュベーション後、誘導した細胞と対照(誘導しなかった)細胞を、実施例4Aに記載したように、URA3マーカーを喪失した細胞を選択するために、FOAを含有しているSD-HISプレート(SD-HIS+FOA)上でレプリカ培養した。
完全な合成のマイコプラズマ・ゲニタリウムゲノム(〜583kb)を、酵母サッカロミセス・セレビジエの中でアセンブリし、環状プラスミドとしてクローニングした。URA3/5-フルオロオロチン酸(5-FOA)対抗選択を含む標準的な遺伝学的方法によりクローニングしたゲノムを変更する試みは、酵母の中で維持した細菌ゲノムの自発的な欠失に由来する5-FOA耐性クローンの高いバックグラントを示した。ここでは、本発明者らは、高い効率で酵母の中で細菌ゲノムを正確に修飾することができる方法を報告する。この方法は、2回の連続する相同組換え事象を含む。最初に、標的領域を、ノックアウトCORE(18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーターの制御下にあるI-SceI遺伝子、およびURA3遺伝子)と標的部位の上流にある配列に同一であるDNA断片からなる突然変異誘発カセットで置き換える。この置き換えは、COREの側方にタンデム反復配列を生じる。2番目に、ガラクトースによりI-SceIの発現を誘導する。I-SceIは、I-SceI部位に二本鎖の断裂(DSB)を作製する。このDSBは、反復配列間での分子内相同組換えを促進し、COREの除去を導く。結果として、これはシームレスな修飾を作製する。この方法は、様々なゲノムの修飾に適応させることができ、したがって、酵母の中で合成のゲノムを修飾および設計するための代替え方法を提供する。
酵母株と培地
0.6Mbのマイコプラズマ・ゲニタリウム全ゲノムYACを収容しているサッカロミセス・セレビジエ酵母株VL6-48N(MATα his3-Δ200 trpl-Δ1 ura3-52 lys2 ade2-101 met14)およびW303a(MATa ade2-1 ura3-1 his3-11, 15 trp1-1 leu2-3, 112 can1-100 RAD5)を、以前に記載されたとおりに構築した(Lartigue et al.(2009)Science, 325, 1693-1696;およびGibson et al.(2008)PNAS USA, 105, 20404-20409)。酵母細胞を、標準的な富化培地(YEPD)および合成のデキストロース(SD)または合成のガラクトース(SG)最小培地(Amberg et al.(2005)Methods in yeast genetics:A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp.230)中で増殖させた。5-フルオロオロチン酸(5-FOA)を補充したSD培地を使用して、URA3遺伝子の喪失を選択した(Boeke et al.(1984)Mol Gen Genet, 197, 345-346)。
全てのプライマーは特注で合成した(Integrated DNA Technologies)。60bpより長いプライマーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製した。全ての突然変異誘発カセットの構築に使用したプライマーを表13にまとめる。URA3遺伝子(1,066bp)をプラスミドpRS306(Sikorski and Hieter(1989)Genetics, 122, 19-27)から増幅した。GAL1プロモーター(450bp)は、プラスミドpYES2(Invitrogen)から増幅した。GAL1プロモーターとI-SceI遺伝子を含む1,184bpの断片は、プラスミドpGSKU(Storici et al.(2003)PNAS USA., 100, 14994-14999)から増幅した。そして、Creリコンビナーゼ遺伝子(1,032bp)は、プラスミドpBS185(Sauer and Henderson(1990)New Biologist 2, 441-449)から増幅した。
酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を、公開されている方法に従って行った(Gietz et al.(1992)Nucleic Acids Res, 20, 1425)。2〜3μgの組込み型構築物DNAと、25μgのキャリアDNA(サケの精子DNA、Sigma)を、日常的に行う実験において使用した。PCR分析のための酵母からの全DNAの単離は、公開されているプロトコールに従って行った(Kouprina and Larionov.(2008)Nat Protoc, 3, 371-377)。それぞれの突然変異誘発カセットの正確な組込みを、標的部位の上流および下流に位置するプライマー(表13)を使用したPCRにより確認した。マルチプレックスPCRを、以前に記載されたとおりに(Gibson et al.(2008)PNAS USA, 105, 20404-20409)M.ゲニタリウムクローンの完全性を確認するために使用した。マルチプレックスPCRに使用したプライマーのセット(セット3)は、およそ60kbごとにM.ゲニタリウムゲノムを取り囲むように分布させた10種類のアンプリコン(0.1kbの増分で、125bp〜1025bpまでの範囲)を生じるように設計した(Gibson et al.(2008)PNAS USA, 105, 20404-20409)。
伝統的な方法により酵母の中で維持した合成のM.ゲニタリウムゲノムのMG259遺伝子座中の点変異の変更には、2つの相同組換え事象が関係していた(図12A)。最初の相同組換えの後、合成のゲノム中の標的領域のURA3遺伝子での正確な置き換えを、PCRにより確認した。しかし、2回目の相同組換え後は、本発明者らは、5-FOA耐性コロニーからのPCRスクリーニングによっては、DNAセグメントでのURA3遺伝子の正確な置き換えを同定することはできなかった(図12Bおよび表15)。
Cre-LoxP修飾システム
比較のために、細菌ゲノムの修飾のための公知の修飾システムであるCre-loxPシステムを、酵母宿主細胞中で同じ細菌ゲノムを修飾するために使用した。Cre-loxPシステムは、多数の様々な生物の中で選択マーカーおよび大きなゲノムDNAセグメントを除去するためにうまく使用されている、公知の効率的な部位特異的組換え方法である。Gueldener et al., Nucleic Acids Res, 30, e23(2002)を参照のこと。
loxP-RE-GAL1-Cre-URA3-loxP-LE突然変異誘発カセットを、Cre-FおよびCre-Rプライマー(表13)を使用してプラスミドpBS185(Sauer and Henderson.New Biologist 2, 441-449(1990))から増幅したCreリコンビナーゼ遺伝子のORF断片(1,032bp)、プライマーGal-FおよびGal-R(表13)を使用してプラスミドpYES2(Invitrogen, Carlsbad, CA))から増幅したGAL1プロモーター(450bp)、およびUra-FプライマーおよびUra-Rプライマー(表13)を使用して先の実施例に記載したようにPCRにより産生した1066bpのURA3遺伝子断片を使用して得た。
loxP-Creカセットを、M.ゲニタリウムゲノムを含有している酵母株に、酢酸リチウムを用いる組込み形質転換を使用して導入した。個々のUra+形質転換体を選択し、上記遺伝子がドナーゲノム内の正確な位置に挿入されたことを確認するために、診断用プライマーSeq-FおよびM2-det1(図10Dにおいて挿入部位の側方にある小さい一方向の矢印として示し、表13に列挙した)を使用して、PCRによって分析した。loxP-Creカセットが挿入されたゲノムのこのPCRによって、3.068kbの産物が生じたと考えられる。PCR反応の産物をアガロースゲルで分離し、これを、上記カセットの正確な挿入を確認するために視覚化した。
その後、クローンを、SG(合成のガラクトース)-Hisを含有しているプレート、およびSD-HISを含有しているプレート(グルコースを含有している)上でレプリカ培養し、24時間増殖させた。唯一の炭素源としてガラクトースを含有しているSG培地上での増殖は、GAL1プロモーターにより制御されるCreリコンビナーゼの発現を誘導するために行った。リコンビナーゼの発現は、カセットの内部のLoxP部位で組換えを誘導するように意図した。誘導後、実施例4Aに記載したように、URA3マーカーを喪失した細胞を選択するために、細胞を、FOAを含有しているSD-HISプレート(SD-HIS+FOA)上でレプリカ培養した。
宿主細胞へのドナーゲノムの移入、宿主細胞内でのTRECによる修飾、およびレシピエント細胞への移植
本実施例は、宿主細胞へのドナーゲノムの移入、宿主細胞内でのドナーゲノムの修飾(TREC修飾)、およびドナーゲノムのレシピエント細胞への移植のための、本提供の方法の組み合わせを使用するドナーゲノムの操作を記載する。上記方法を、研究室また自然界のいずれにもこれまで存在していなかった酵母の中でM.ミコイデスLCゲノムをうまく変更するために使用した。以下に記載するように、III型制限酵素遺伝子を、酵母宿主にクローニングしたドナーであるM.ミコイデスLCゲノムから欠失させた。III型制限酵素遺伝子を、これが生存能力および移植に必須ではないと予想したので選択した。その後、修飾したゲノムをM.カプリコルムレシピエント細胞に移植し、これにより、修飾された全ゲノムを含有している新しい細胞を作製した。
ドナーゲノムの宿主への移入およびゲノムの修飾
M.ミコイデスLC-YCpゲノムを、上記実施例1Aに記載したように、酵母株W303aに導入し、その中で増殖させた。
およびプライマーRCO294
を使用してPCRにより得た。得られたPCR産物は、5'末端から初めて、5'標的部位の上流に対して相同である50bpのセグメント(プライマーRCO293の中で太字体で強調した)、18bpのI-SceI認識部位、GAL1プロモーター、I-SceIホーミングエンドヌクレアーゼをコードする遺伝子、およびURA3マーカーを含む。2番目に、標的部位の上流の400bpを、プライマーRCO295
およびプライマーRCO296
によって、M.ミコイデスLCのゲノムDNAを鋳型として使用して増幅した。PCR産物(タンデム反復配列(TRS)と呼ぶ)は、3'標的部位の下流に対して相同である50bpのセグメント(プライマーRCO296の中で太字体で協調した)を含む。3番目に、互いに50bpが重複している(プライマーRCO294およびRCO295の中に下線をつけた)2つのPCR産物(KOCとTRS)を、PCRによる融合方法により互いに連結させた。融合産物であるノックアウトカセットを、Qiagenによるゲル抽出キットによりゲル精製し、プライマーRCO293およびプライマーRCO296により再度増幅した。その後、最終的な2.7kbの断片で、M.ミコイデスLCゲノム(Benders et al., Science, submitted(2009))を持つ酵母303a株を、記載されているような酢酸リチウム(LioAc)法(Gietz et al., Nucleic Acids Res 20, 1425(1992年3月25日))を使用して形質転換し、ウラシル栄養要求性およびヒスチジン栄養要求性の両方について選択した。全DNAを、記載されているとおりに(Kouprina and Larionov, Nat Protoc 3, 371(2008))形質転換体から調製した。III型RE遺伝子座によるノックアウトカセットの置き換えを、標的部位の上流に位置するプライマー5
およびノックアウトカセットの内部に位置するプライマー6
を使用したPCRスクリーニングにより確認した。III型REのマークレス(mark-less)欠失を作製するために、PCRポジティブ株を、唯一の炭素源としてガラクトースを含有する培地中で増殖させ、続いて、実施例4に記載したように5-FOA対抗選択を行った。上記に記載した全てのPCR増幅実験は、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)を使用して行った。移植体から精製したM.ミコイデスLCゲノムを、プライマー5と、標的部位の下流に位置するプライマー7
を使用したPCRにより増幅した。PCR産物をキット(Qiagen)により精製し、プライマー5とプライマー7を使用した配列決定に使用した。
修飾したゲノムのドナー細胞への移植
これらのM.ミコイデスLCの修飾したゲノム(Δ500kbの対照を含む)と未修飾のM.ミコイデスLCゲノムのそれぞれを、上記実施例3に記載した方法を使用してM.カプリコルムレシピエント細胞に移植した。移植は、数字「3」で示した上記実施例3に記載した、図8に説明する第3のプロトコールを使用して行った。実施例3に記載したように、この方法には、メチル化工程、除タンパク質工程(プロテイナーゼKでの処理)、および移植反応の前の融解工程を含めた。移植は、野生型レシピエント細胞への移植である。このプロセスのために、アガロースプラグを、実施例3A(i)に記載したように調製し、制限酵素カクテルとゲル電気泳動の両方を用いて、上記実施例5Aに記載したように清浄した(実施例3A(i)もまた参照のこと)。移植は、実施例3A(ii)および3A(iii)に記載したように、5%のPEGの存在下で、細胞を含まないM.ミコイデスLC抽出物を使用したメチル化とプロテイナーゼKでの消化を用いて行った。ゲノムを、野生型(RE欠失ではない)M.カプリコルム細胞に、上記実施例3に記載したように移植した。移植の成功は、テトラサイクリンを含有しているSP4培地上での、37℃での青色コロニーの増殖を選択することにより評価した。結果を以下の表17に示す。
Claims (21)
合成ドナーゲノムおよび酵母宿主ベクターを酵母宿主細胞に導入する工程;
それにより、酵母宿主ベクターを含む合成ドナーゲノムを含む酵母宿主細胞が作製される工程であって、さらに合成ドナーゲノムが、少なくとも最小ゲノムである本質的にインタクトなゲノムであり、かつ300 kbを上回る長さである、前記工程;
酵母宿主細胞中で合成ドナーゲノムを増殖させる工程;
宿主細胞から酵母宿主ベクターを含む合成ドナーゲノムを回収して、工程a)またはb)またはc)を実施することによって、酵母宿主ベクターを含む回収された合成ドナーゲノムをレシピエント細胞に導入する工程であって、
該工程a)、b)、およびc)が、
a)ドナーゲノムをメチル化することによって、細菌レシピエント細胞、シアノバクテリアレシピエント細胞、または微細藻類レシピエント細胞内への移植のためのドナーゲノムを調製する工程;
b)ドナーゲノムを切断するレシピエント細胞中に存在する制限エンドヌクレアーゼ機能を除去または不活性化することによって、細菌レシピエント細胞、シアノバクテリアレシピエント細胞、または微細藻類レシピエント細胞を調製する工程;
c)ドナーゲノムを切断する制限エンドヌクレアーゼ機能を欠く細菌レシピエント細胞、シアノバクテリアレシピエント細胞、または微細藻類レシピエント細胞を提供する工程
を含む、前記工程;
それにより、合成ドナーゲノムからの遺伝子発現をサポートしかつ合成ドナーゲノムによってのみ制御される、合成ドナーゲノムを含む自己複製性の合成の細胞を作製する工程
を含み、
合成ドナーゲノムが、合成の細胞の生存能力および連続的な自己複製を維持するのに十分なものである、自己複製性の合成の細胞を作製するための方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US15832009P | 2009-03-06 | 2009-03-06 | |
US61/158,320 | 2009-03-06 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015047192A Division JP2015128444A (ja) | 2009-03-06 | 2015-03-10 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018192236A Division JP6637140B2 (ja) | 2009-03-06 | 2018-10-11 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017140055A JP2017140055A (ja) | 2017-08-17 |
JP6467460B2 true JP6467460B2 (ja) | 2019-02-13 |
Family
ID=42145125
Family Applications (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011553154A Active JP5713925B2 (ja) | 2009-03-06 | 2010-03-05 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
JP2015047192A Pending JP2015128444A (ja) | 2009-03-06 | 2015-03-10 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
JP2017105163A Active JP6467460B2 (ja) | 2009-03-06 | 2017-05-29 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
JP2018192236A Active JP6637140B2 (ja) | 2009-03-06 | 2018-10-11 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011553154A Active JP5713925B2 (ja) | 2009-03-06 | 2010-03-05 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
JP2015047192A Pending JP2015128444A (ja) | 2009-03-06 | 2015-03-10 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018192236A Active JP6637140B2 (ja) | 2009-03-06 | 2018-10-11 | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9273310B2 (ja) |
EP (2) | EP2403944B1 (ja) |
JP (4) | JP5713925B2 (ja) |
CN (2) | CN102421897B (ja) |
AU (1) | AU2010221172B2 (ja) |
CA (1) | CA2754212C (ja) |
DK (1) | DK2403944T3 (ja) |
IL (2) | IL214828A0 (ja) |
SG (2) | SG10201400436PA (ja) |
WO (1) | WO2010102257A2 (ja) |
Families Citing this family (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9267132B2 (en) | 2007-10-08 | 2016-02-23 | Synthetic Genomics, Inc. | Methods for cloning and manipulating genomes |
CN102421897B (zh) | 2009-03-06 | 2015-12-16 | 合成基因组股份有限公司 | 用于克隆和操作基因组的方法 |
US20110269119A1 (en) | 2009-10-30 | 2011-11-03 | Synthetic Genomics, Inc. | Encoding text into nucleic acid sequences |
JP2013520989A (ja) * | 2010-03-05 | 2013-06-10 | シンセティック ジェノミクス インコーポレーテッド | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 |
US7919605B1 (en) * | 2010-08-30 | 2011-04-05 | Amyris, Inc. | Nucleic acids, compositions and methods for the excision of target nucleic acids |
WO2013066438A2 (en) | 2011-07-22 | 2013-05-10 | President And Fellows Of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US9234227B2 (en) * | 2011-09-26 | 2016-01-12 | Sample6 Technologies, Inc. | Recombinant phage and methods |
US9340817B2 (en) | 2013-03-27 | 2016-05-17 | Sample6 Technologies, Inc. | Methods of making recombinant phage, compositions and articles of manufacture of same for bacterial detection |
US9834747B2 (en) | 2013-07-31 | 2017-12-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and apparatus for transplantation of nucleic acid molecules |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US9228207B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-01-05 | President And Fellows Of Harvard College | Switchable gRNAs comprising aptamers |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
AU2014346559B2 (en) | 2013-11-07 | 2020-07-09 | Editas Medicine,Inc. | CRISPR-related methods and compositions with governing gRNAs |
NL2011912C2 (en) * | 2013-12-06 | 2015-06-09 | Univ Delft Tech | Novel genome alteration system for microorganisms. |
US9840699B2 (en) | 2013-12-12 | 2017-12-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for nucleic acid editing |
PT3083958T (pt) * | 2013-12-19 | 2019-06-27 | Amyris Inc | Métodos de integração genómica |
CN106029909B (zh) * | 2014-02-18 | 2021-02-02 | 生物纳米基因公司 | 测定核酸结构信息的改进方法 |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
CN113584015A (zh) | 2014-08-27 | 2021-11-02 | 新英格兰生物实验室公司 | 合成子的形成 |
US9963687B2 (en) | 2014-08-27 | 2018-05-08 | New England Biolabs, Inc. | Fusion polymerase and method for using the same |
CN108026566A (zh) | 2015-05-04 | 2018-05-11 | 特拉维夫大学拉莫特有限公司 | 用于使dna片段化的方法和试剂盒 |
US20190225955A1 (en) | 2015-10-23 | 2019-07-25 | President And Fellows Of Harvard College | Evolved cas9 proteins for gene editing |
DK3433354T3 (da) | 2016-03-23 | 2024-01-22 | Synthetic Genomics Inc | Generering af syntetiske genomer |
IL308426A (en) | 2016-08-03 | 2024-01-01 | Harvard College | Adenosine nuclear base editors and their uses |
CA3033327A1 (en) | 2016-08-09 | 2018-02-15 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
WO2018071868A1 (en) | 2016-10-14 | 2018-04-19 | President And Fellows Of Harvard College | Aav delivery of nucleobase editors |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
EP3592853A1 (en) | 2017-03-09 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
CN110914310A (zh) | 2017-03-10 | 2020-03-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 胞嘧啶至鸟嘌呤碱基编辑器 |
SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
US11560566B2 (en) | 2017-05-12 | 2023-01-24 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation |
US11066653B2 (en) * | 2017-07-21 | 2021-07-20 | Basf Se | Method of transforming bacterial cells |
US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
AU2018352592A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-06-04 | Beam Therapeutics, Inc. | Uses of adenosine base editors |
CN108949743A (zh) * | 2018-06-15 | 2018-12-07 | 翁炳焕 | 一种全基因组杂交克隆方法 |
WO2020191246A1 (en) | 2019-03-19 | 2020-09-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
AU2020253531C1 (en) * | 2019-04-04 | 2022-06-16 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors |
CN111154820B (zh) * | 2020-01-13 | 2021-12-21 | 上海韦翰斯生物医药科技有限公司 | 一种降低核酸扩增复制滑移率的方法 |
MX2022014008A (es) | 2020-05-08 | 2023-02-09 | Broad Inst Inc | Métodos y composiciones para la edición simultánea de ambas cadenas de una secuencia de nucleótidos de doble cadena objetivo. |
CN112626102B (zh) * | 2020-10-15 | 2023-01-20 | 天津科技大学 | 毕赤酵母定点dsb系统及应用 |
WO2023060351A1 (en) * | 2021-10-13 | 2023-04-20 | The University Of Western Ontario | Genetic engineering with deinococcus radiodurans |
WO2023156585A1 (en) * | 2022-02-18 | 2023-08-24 | Pulmobiotics, S.L. | Systems, tools, and methods for engineering bacteria |
Family Cites Families (27)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5721118A (en) | 1995-10-31 | 1998-02-24 | The Regents Of The University Of California, San Diego | Mammalian artificial chromosomes and methods of using same |
US5866404A (en) | 1995-12-06 | 1999-02-02 | Yale University | Yeast-bacteria shuttle vector |
US5976846A (en) * | 1996-01-13 | 1999-11-02 | Passmore; Steven E. | Method for multifragment in vivo cloning and mutation mapping |
US6025155A (en) | 1996-04-10 | 2000-02-15 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
AU6487196A (en) * | 1996-07-09 | 1998-02-02 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Transformation-associated recombination cloning |
US6670154B1 (en) | 1998-07-27 | 2003-12-30 | Ronald A. Hitzeman | Automatic eukaryotic artificial chromosome vector |
CA2336590A1 (en) * | 1999-06-07 | 2000-12-14 | Cell Genesys, Inc. | Hybrid yeast-bacteria cloning system and uses thereof |
US6692954B1 (en) | 2000-11-03 | 2004-02-17 | The Scripps Research Institute | Generation of human cytomegalovirus yeast artificial chromosome recombinants |
DE10131786A1 (de) * | 2001-07-04 | 2003-01-16 | Sungene Gmbh & Co Kgaa | Rekombinationssysteme und Verfahren zum Entfernen von Nukleinsäuresequenzen aus dem Genom eukaryotischer Organismen |
AU2002319696B2 (en) * | 2001-07-27 | 2007-11-01 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Systems for in vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides |
AU2002332027A1 (en) * | 2001-10-04 | 2003-04-14 | The Government Of The United States Of America, As | Tandem repeat markers |
EP1373473A4 (en) * | 2001-12-04 | 2005-02-16 | Genome Biosciences Llc | METHOD AND VECTORS FOR GENE TARGETING |
US20030175968A1 (en) * | 2002-10-30 | 2003-09-18 | Golic Kent G. | Gene targeting method |
CA2526648A1 (en) * | 2003-05-22 | 2004-12-29 | Richard H. Lathrop | Method for producing a synthetic gene or other dna sequence |
US9139849B2 (en) * | 2005-04-08 | 2015-09-22 | The United States of America as Represented by the Government of the Department of Health and Human Services | Rapid generation of long synthetic centromeric tandem repeats for mammalian artificial chromosome formation |
CA2618699C (en) | 2005-08-11 | 2012-10-02 | J. Craig Venter Institute, Inc. | In vitro recombination method |
MY144014A (en) | 2005-08-11 | 2011-07-29 | Synthetic Genomics Inc | Method for in vitro recombination |
JP4721868B2 (ja) * | 2005-10-24 | 2011-07-13 | 花王株式会社 | 宿主dnaの欠失対象領域の欠失方法 |
JP5106412B2 (ja) | 2005-12-06 | 2012-12-26 | シンセティック ゲノミクス、インク. | 合成ゲノム |
EP1963515B1 (en) * | 2005-12-23 | 2014-05-28 | Synthetic Genomics, Inc. | Installation of genomes or partial genomes into cells or cell-like systems |
CA2702676A1 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-27 | Synthetic Genomics, Inc. | Methods of genome installation in a recipient host cell |
US9267132B2 (en) * | 2007-10-08 | 2016-02-23 | Synthetic Genomics, Inc. | Methods for cloning and manipulating genomes |
CA2701923C (en) | 2007-10-08 | 2018-07-10 | Synthetic Genomics, Inc. | Assembly of large nucleic acids |
WO2009134814A2 (en) | 2008-04-28 | 2009-11-05 | Synthetic Genomics, Inc. | Identification of centromere sequences and uses therefor |
CN102421897B (zh) | 2009-03-06 | 2015-12-16 | 合成基因组股份有限公司 | 用于克隆和操作基因组的方法 |
-
2010
- 2010-03-05 CN CN201080020174.4A patent/CN102421897B/zh active Active
- 2010-03-05 JP JP2011553154A patent/JP5713925B2/ja active Active
- 2010-03-05 US US12/718,911 patent/US9273310B2/en active Active
- 2010-03-05 WO PCT/US2010/026434 patent/WO2010102257A2/en active Application Filing
- 2010-03-05 EP EP10708854.4A patent/EP2403944B1/en active Active
- 2010-03-05 SG SG10201400436PA patent/SG10201400436PA/en unknown
- 2010-03-05 EP EP17177614.9A patent/EP3249045A1/en active Pending
- 2010-03-05 AU AU2010221172A patent/AU2010221172B2/en active Active
- 2010-03-05 DK DK10708854.4T patent/DK2403944T3/da active
- 2010-03-05 CN CN201310011289.2A patent/CN105274004B/zh active Active
- 2010-03-05 CA CA2754212A patent/CA2754212C/en active Active
- 2010-03-05 SG SG10201704868RA patent/SG10201704868RA/en unknown
-
2011
- 2011-08-25 IL IL214828A patent/IL214828A0/en active IP Right Grant
-
2015
- 2015-03-10 JP JP2015047192A patent/JP2015128444A/ja active Pending
- 2015-10-27 IL IL242303A patent/IL242303A/en active IP Right Grant
-
2016
- 2016-02-29 US US15/056,796 patent/US20160177338A1/en not_active Abandoned
-
2017
- 2017-05-29 JP JP2017105163A patent/JP6467460B2/ja active Active
-
2018
- 2018-10-11 JP JP2018192236A patent/JP6637140B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL242303A (en) | 2017-06-29 |
CN105274004B (zh) | 2019-08-09 |
CN105274004A (zh) | 2016-01-27 |
CN102421897A (zh) | 2012-04-18 |
DK2403944T3 (da) | 2019-05-27 |
WO2010102257A2 (en) | 2010-09-10 |
CN102421897B (zh) | 2015-12-16 |
CA2754212C (en) | 2016-08-02 |
US20110053272A1 (en) | 2011-03-03 |
SG10201400436PA (en) | 2014-06-27 |
WO2010102257A3 (en) | 2011-01-20 |
JP5713925B2 (ja) | 2015-05-07 |
JP2019017391A (ja) | 2019-02-07 |
US20160177338A1 (en) | 2016-06-23 |
JP6637140B2 (ja) | 2020-01-29 |
IL214828A0 (en) | 2011-11-30 |
JP2015128444A (ja) | 2015-07-16 |
EP2403944B1 (en) | 2017-06-28 |
CA2754212A1 (en) | 2010-09-10 |
JP2017140055A (ja) | 2017-08-17 |
AU2010221172B2 (en) | 2015-06-04 |
US9273310B2 (en) | 2016-03-01 |
EP3249045A1 (en) | 2017-11-29 |
AU2010221172A1 (en) | 2011-09-22 |
SG10201704868RA (en) | 2017-07-28 |
JP2012519493A (ja) | 2012-08-30 |
EP2403944A2 (en) | 2012-01-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6467460B2 (ja) | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 | |
JP2013520989A (ja) | ゲノムのクローニングおよび操作のための方法 | |
US10975378B2 (en) | Methods for cloning and manipulating genomes | |
JP5618413B2 (ja) | 大型核酸のアッセンブリー | |
Abdel‐Banat et al. | Random and targeted gene integrations through the control of non‐homologous end joining in the yeast Kluyveromyces marxianus | |
AU2017238212B2 (en) | Generation of synthetic genomes | |
EP2890787B1 (en) | Crowding agent-induced nucleic acid transfer into a recipient host cell | |
Wightman | Exploring the Genome Rearrangement System, SCRaMbLE, to Introduce DNA into Saccharomyces cerevisiae | |
Gallagher | The Great Escape: How to Avoid Cheaters in Biological Containment, Directed Evolution, and Genome Engineering |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170627 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170627 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170724 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180822 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181011 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190108 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190111 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6467460 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |