CN102415355A - 制备转基因动物的新方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备转基因动物的新方法。本发明是一种操作简单，外源基因整合率较高的转基因动物制备方法，具体而言是采用卵泡及卵巢注射法将外源基因注射到雌性哺乳动物的成熟卵泡和卵巢中，经人工受精得到了转基因动物的新方法。本发明为动物育种提供了新方法。

Description

制备转基因动物的新方法

技术领域

本发明涉及一种制备转基因动物的新方法。具体而言，将含有外源基因的真核表达载体，制备成转染液。采用卵泡及卵巢注射法将转染液注射到雌性哺乳动物的成熟卵泡及卵巢中，在雌性哺乳动物发情时进行人工受精，得到子代转基因绵羊。

背景技术

转基因技术是近年来研究最热门、发展最快的领域之一。所谓转基因动物就是指用试验的方法将人们所需要的外源基因导入到动物体内，使这种外源基因与动物本身的染色体整合在一起，这样外源基因就能随着细胞的分裂而增殖，在动物体内得到表达，并且能够稳定遗传给后代的动物。

1976年，Jaenisch首次利用反转录病毒感染胚胎的方法获得了转基因小鼠[Jaenisch R.Germ line integration and Mendelian transmission of exogenousMonloney leukemia virus.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1976，(73)：1260.]。1980年Gordon等人采用受精卵原核显微注射的方法，将外源基因导入小鼠受精卵，获得了转基因小鼠[Gordon J W，et al.Genetic transformation of mouse embryos bymicroinjection of purified DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1980，77(12)：7380-7384.]。1997年，克隆羊Dolly的诞生[Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，et al.Viableoffspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature，1997，385(6619)：810-813.]，开创了哺乳动物体细胞核移植技术的先河，随后乳腺中表达人凝血因子IX的转基因克隆羊Polly培育成功。2005年抗乳房炎转基因牛的诞生，标志着转基因动物育种进入了新的发展历程，转基因动物技术自从诞生以来就在改良家畜生产性状、提高家畜抗病力以及生产非常规畜牧产品(如人药用蛋白和工业用酶)等方面显示了广阔的应用前景。随着基因工程技术的不断发展，转基因动物技术将会不断得到完善，从而在未来的动物育种中将发挥巨大的作用。

生产转基因动物的常用方法有：原核期胚胎显微注射法、胚胎干细胞介导法、精子介导法、慢病毒载体法等。

原核内显微注射是由美国人Gordon发明的，是发展最早、目前应用最广泛的方法之一。这种方法的优点是外源基因易整合入染色体，导入的基因大，可使用任何载体承载基因片段，也可注射无载体的基因片段，外源基因的长度可达100kb，实验周期相对比较短。其缺点是：由于基因整体进入染色体的随机性，使外源基因整合位点和拷贝数无法控制，外源基因随机整合到基因组内常导致宿主DNA中的染色体序列丢失、重排、插入、突变，有的甚至造成严重生理缺陷，而且设备昂贵、操作复杂。该方法的外源基因转移整合率较低，如：小鼠为6％～10％，猪和羊分别为0.98％和1％。

胚胎干细胞是早期胚胎的内细胞团或原始性腺中分离出来的一类细胞，它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性，具有全能性，在一定条件下可发育成完整个体。因此，把外源基因导入干细胞后，经过选择，再把阳性细胞注入另一胚胎囊胚腔中，或与另一胚胎卵裂球聚合，再经过选育即可得到转基因动物。在转基因领域，胚胎干细胞是公认的研究基因转移、基因定点整合极有前途的实验材料，利用这种方法制作转基因小鼠的阳性率接近100％，遗憾的是第一代一般是嵌合体，要通过杂交繁育才能得到纯合目的基因的个体。另外截至目前世界范围内只有小鼠干细胞的建系方法比较成熟，大鼠、兔、猪、牛的胚胎干细胞系虽有建立，却尚未得到应用。

精子介导法是利用动物精子具有自发结合和内化转运外源DNA能力的特点，使其在受精时导入卵母细胞，获得转基因动物。1989年Lavitrano[LavitranoM，Camaioni A，Fazio V M，et al.Sperm cells as vector for introduction foreign DNAinto eggs：genetic transformation of mice.Cell，1989，57：717-723.]等首次报道把PSV2-CAT质粒与小鼠的附睾精子共育后进行体外受精，移植后获得了阳性鼠。目前利用精子载体法已获得了猪、牛、羊、兔、小鼠以及鱼等转基因动物后代，其中小鼠、猪、兔都建立了表达外源基因的转基因株系。以精子作载体的最大优点是克服了人为机械操作给胚胎造成的损伤；且简单、易行，不需昂贵的显微操作设施及复杂的操作技巧，该方法在转基因家畜生产中具有技术和效率上的优势；主要缺点是实验结果不稳定，可重复性差。

慢病毒载体感染法可以将外源基因有效地整合到宿主细胞的染色体上并长期稳定表达。慢病毒载体法用于制作转基因动物的优点是方法简单，不受胚胎发育阶段的影响，而且外源基因多位点，单拷贝整合效率高，特别适用于转基因家禽的生产，缺点是携带的外源基因片段小、表达率低，有潜在致病性。

多不饱和脂肪酸(PUFAs)指含有两个或两个以上双键且碳链长度为18～22个碳原子的直链脂肪酸。在多不饱合脂肪酸分子中，距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上的称为ω-3PUFAs，在第六个碳原子上的，则称为ω-6PUFAs。越来越多的研究证明[Chen W X，Chen D G，Cheng X F，etc.Effects ofω-3Polyunsaturated Fatty Acids And Taurine on Rat Brain Development.ActaNutrimenta Sinica，1998，20(4)：25-30.]，PUFAs具有广泛的生物学功能，它们参与细胞膜的构成并作为许多细胞应答过程中的信号分子，与人类的多种疾病的发生紧密相关，其适宜的含量对于人类及其他哺乳动物的正常发育和保持良好的健康状况极其重要。

脂肪酸脱氢酶一类催化脂肪酸酰基链特定位置C-C脱氢形成C＝C的酶，是多不饱和脂肪酸合成途径关键酶。脂肪酸脱氢酶的分布很广泛，除了少数微生物外，如E.coli几乎所有生物体中都有脂肪酸脱氢酶存在[Dmitry A Los，NorioM.Structure and expression of fatty acid desaturases.Biochimica et Biophysica Acta，1998，1394：3～15]。生物膜脂中都含有特定的不饱和脂肪酸，恒温动物或某些变温动物，能通过对膜脂的脱饱和来适应外界环境温度的降低。细胞改变膜脂物理特性的能力主要通过脂肪酸脱氢酶对脂肪酸的脱饱和作用来实现，因此脂肪酸脱氢酶在生物膜的形成和物理性质、调节膜脂中脂肪酸的组成与不饱和度等方面起主要调节作用。在生物体脂类代谢的过程中，可以利用基础原料合成机体所需的脂肪酸(脂肪酸合成)；或将脂肪酸分解得到一些小的成分(脂肪酸分解)；还能把脂肪酸从一种形式变成另外一种形式(脂肪酸转换)，机体正是通过这种方式来调节脂肪酸的比例，以满足自身需要。

脂肪酸脱氢酶具有脂肪酸转换功能，它能将脂肪酸碳链上特定位置的碳碳单键氧化，变成一个碳碳双键，形成不饱和脂肪酸或更高级的多不饱和脂肪酸。在植物体内有完整的脂肪酸脱氢酶体系，但在动物体内则缺乏一些高级别的脂肪酸脱氢酶，这主要是由于大部分动物处于生态中的消费者行列。

1997年，Spychalla等从C.elegans中克隆得到了fat-1基因，它位于四号染色体上，其编码的不饱和脂肪酸脱氢酶能够识别18和20碳的脂肪酸，并在ω-3位置上催化氧化反应，生成一个碳碳双键，得到ω-3PUFAs，这也是人类最早克隆的来源于动物的ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因。2004年，首例转fat-1基因的哺乳动物诞生，这些转fat-1基因小鼠各组织中相应的ω-3PUFAs含量增加，ω-6/ω-3比值也明显下降；经过连续4代，成功建立了一个可稳定遗传fat-1基因的转基因小鼠系。

由于上述转基因动物制备方法存在的不足，如：原核期胚胎显微注射法实验设备昂贵、操作复杂、外源基因转移整合率较低，胚胎干细胞法只在制备转基因小鼠中比较成熟，逆转录病毒感染法携带的外源基因片段小、表达率低，有潜在致病性。本发明公开了一种操作简单，实验设备廉价，外源基因整合率较高的转基因动物制备方法，具体而言是采用卵泡注射法将脂质体包被的外源基因注射到雌性哺乳动物的卵巢中，经人工受精得到了转基因动物的新方法。

发明内容

本发明公开了一种制备转基因动物的新方法，包括：

1)雌性哺乳动物在进行实验前空腹，将实验雌性哺乳动物注射氯前列烯醇，使已怀孕的雌性哺乳动物流产，成为空载雌性哺乳动物，并在其阴道内放置阴道栓。

2)将雌性哺乳动物进行麻醉处理，打开腹腔取出卵巢，对雌性哺乳动物卵泡及卵巢注射转染液。

3)注射完转染液后，将雌性哺乳动物卵巢送回腹腔，并对腹腔开口进行缝合。

4)待实验雌性哺乳动物手术伤口愈合后，对雌性哺乳动物注射促性素进行发情处理，并在雌性哺乳动物撤栓后进行人工授精。

本发明所述的转染液包含目的基因的真核表达质粒。

本发明所述方法可以应用于转基因动物新品种的培育。

本发明所述的转基因动物的方法，方法简便，成功率高。

本发明详细公开了卵泡注射法制备转基因绵羊的新方法，包括：

1)将实验母羊注射氯前列烯醇，使已怀孕的母羊流产，成为空载母羊，并在其阴道内放置阴道栓。

2)术前空腹：母羊在进行手术的前一天晚上不进食，以避免在手术时，由于食物蓄积对腹部造成过大的张力。

3)转染液制备：将包含特定基因的真核表达质粒制备成转染液。

4)对母羊进行麻醉处理，待母羊站立不稳继而卧地不起后，将其固定在手术架上，打开腹腔取出卵巢。

5)对母羊卵泡注射：每成熟卵注射0.01-0.02ul；卵巢注射0.3ml左右的转染液，两侧卵巢各注射约0.15ml。

6)注射完转染液后，将母羊卵巢送回腹腔，并对腹腔开口进行缝合。缝合完毕后，为手术母羊依次注射氨苄西林钠注射液和苏醒灵注射液。

7)术后母羊应避免立即采食大量青草，及时补充水分，最好补充精料或鸡蛋。术后每天对母羊注射氨苄西林钠，连续注射4～5天。

8)待实验母羊手术伤口愈合后，对母羊注射促性素进行发情处理。

9)在母羊撤栓后第3天、第4天、第5天的早晨和傍晚连续进行3次人工授精。

附图说明

图1pEASY-Blunt-Simple-sFat-1和pcDNA3.1的KpnI/NotI双酶切电泳图。

1：pcDNA3.1，KpnI、Not I酶切；2：1Kb marker；3：DL2000 marker；

4：pEASY-Blunt-Simple-sFat-1KpnI、NotI酶切。

图2提取的细胞总RNA琼脂糖电泳。检测样品中有明显的3条RNA带，说明提取的RNA完整。

图3内参扩增曲线图。扩增前期曲线重合性好且未出现杂峰，扩增曲线呈现典型的S型荧光定量动力学曲线，为理想扩增曲线。

图4内参溶解曲线图。溶解曲线只有一个单峰，说明扩增产物单一，引物特异性好。

图5sFat1扩增曲线图。扩增前期曲线重合性好且未出现杂峰，扩增曲线呈现典型的S型荧光定量动力学曲线，为理想扩增曲线。

图6sFat1溶解曲线图。溶解曲线只有一个单峰，说明扩增产物单一，引物特异性好。

图7卵泡及卵巢注射法制备转基因绵羊流程图。实验母羊为卵泡及卵巢被注射了含有目的基因转染液的母羊。

具体实施方式

实施例一真核表达载体的构建与功能评价

一、材料

1细胞株、表达载体和感受态细胞

CHO细胞和真核表达载体pcDNA3.1均购自Invitrogen公司；pEASY-BluntSimple购自北京全式金生物技术有限公司；感受态细胞Trans1-T1PhageResistant Cell和DH_5a购自Invitrogen公司。

2主要仪器设备

YJ-8755超净工作台苏州净化设备公司

HX-1050恒温水浴仪北京博医康试验仪器有限公司

Milli-Q超纯水净化装置Biocell公司

气相色谱仪6890N Agilent公司

荧光定量PCR仪7500ABI公司

CO2培养箱Thermo公司

Centrifuge 5415D台式高速离心机Eppendorf Germany

UV-2102PC紫外分光光度计Nikon CMF-500z Japan

DDY-2C电泳仪 北京六一仪器

DYC-31D电泳槽 北京六一仪器

SIM-F122制冰机SANYO Japan

MDF-192-80℃超低温冰箱SANYO Japan

TOMY SS-325自动灭菌锅SANYO Japan

外科手术器械一套

3主要试剂及配制

3.1主要试剂

限制性内切酶Kpn I、XbaI、HindIII、XhoI和Not I、T4DNA Ligase购自Takara公司；胰化蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；pfx50 DNApolymerase、1640+10％FBS、转染试剂lipofectamine 2000、Opti MEM培养液、0.05％Trypsin、HQ高纯度质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、Trizol、氯仿、无水乙醇、逆转录试剂盒、RNase H、氨苄青霉素、G418均购自Invitrogen公司；无内毒素质粒大提试剂盒购自天根生物公司。

3.2试剂配制

(1)LB液体培养基：在950mL蒸馏水加入细菌培养用胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器至完全溶解用5mol/L NaOH(约0.2mL)调pH值至7.0，定容到1000mL，高压灭菌。

(2)LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCI 10g，800mL ddHzO溶解，用5mol/L NaOH(约0.2mL)调pH值至pH7.4后，加入1.5％琼脂粉，高压灭菌，待培养基温度降至60℃左右，加入氨苄(Ampicilin)，超净工作中倒平板，冷却后封口膜封好，4℃保存备用。

(3)氨苄青霉素(100g/L)：1g氨苄青霉素钠溶于10mL超纯水中，过滤除菌，-20℃保存。

(4)1％琼脂糖凝胶溶液：称取琼脂糖1g加入1×TBE溶液100mL、Goldenview5μL。

(5)30％聚丙烯酰胺：29g丙烯酰胺溶于80ml三蒸水(加温至37℃)，再缓慢加入1.0g亚甲双丙烯酰胺，边加边搅拌，加水至100ml，滤纸过滤，棕色瓶保存。

(6)10％SDS：称取10gSDS溶于80mL超纯水中，然后定容至100mL。室温保存。

(7)1M Tris-CL：称取12.14g Tris-Base溶于80mL超纯水中，用浓盐酸调整PH值至6.8，然后定容至100mL，保存于4℃。

1.5M Tris-CL：称取18.171g Tris-Base溶于80mL超纯水中，用浓盐酸调整PH值至8.8，然后定容至100mL，保存于4℃。

(8)10％APS：称取2.282g过硫酸铵溶于8mL超纯水中，定容至10mL。每0.5mL分装保存于-20℃。

(9)Running Buffer：称取3.03克Tris-Base，18.8g Glycine，1克SDS溶解定容至1000mL，室温保存。

(10)1×SDS上样缓冲液：0.05M Tris-HCL，100mM β-巯基乙醇，2％(m/V)SDS，0.1％(m/V)溴酚蓝，10％(V/V)甘油。称取0.788g Tris-HCL，SDS 2g，溴酚蓝0.1g，量取5mL β-巯基乙醇10mL甘油。溶解定容至100mL，保存于4℃。

(11)染色液：0.1％(m/V)考马斯亮蓝R-250，25％(V/V)甘油，10％(V/V)冰醋酸。称取0.5g考马斯亮蓝R-250，量取125mL甘油、50mL冰醋酸溶于300mL超纯水中，定容至500mL，用化学滤纸过滤除去杂质，室温保存。

(12)脱色液：10％(V/V)醋酸，5％(V/V)乙醇。量取100mL醋酸、50mL乙醇溶于800mL超纯水中，定容至1000mL。室温保存。

二、试验方法

1sFat-1基因的合成与克隆测序

1)SP163-sFat-1基因的合成与克隆测序

根据Genbank中报道的线虫Caenorhabditis Briggsae的ω-3脂肪酸脱氢酶sFat-1基因序列，对其密码子进行优化，同时在sFat-1基因的上游引入增强子SP163序列，命名为SP163-sFat-1。

SP163-sFat-1基因的引物由上海Invitrogen公司合成。

2)SP163-sFat-1基因的克隆测序

将人工合成的SP163-sFat-1克隆入pEASY-Blunt Simple载体，将重组子命名为pEASY-Blunt Simple-sFat1。分别将pEASY-Blunt Simple-sFat1转化DH_5a，提取质粒，分别采用KpnI和NotI进行酶切鉴定，酶切结果见图1，结果正确后，送至上海Invitrogen公司进行测序。

2真核表达载体pCDNA3.1(+)-sFat-SP163的构建

1)目的基因和载体的准备

分别用KpnI/NotI对pEASY-Blunt Simple-sFat1和pcDNA3.1进行双酶切。酶切体系为pEASY-Blunt Simple 5μl，KpnI 1μl，NotI 1μl，10×H 1μl，ddH₂O 2μl，总体积10μl。

用1％琼脂糖凝胶电泳对酶切产物进行电泳，回收目的片段SP163-sFat-1和线性化的pcDNA3.1。参照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：

a)电泳后，在紫外灯下切取含有目的片段的凝胶片段，尽量切除多余凝胶。

b)切取胶块称重，并加入3倍体积的QG缓冲液到1.5mL的无色离心管中。

c)50℃共孵育10min(直到胶完全溶解)。

d)凝胶完全溶解后，检查溶液的颜色是否是黄色，如果是进行下一步，如果不是，加入10μL 3M的乙酸钠，混匀，颜色会变为黄色。

e)加入1倍体积的异丙醇，混匀。

f)转移溶液到DNA分离管中(试剂盒提供)，12000r/min离心3min。

g)加0.75mL PE缓冲液到分离管中，再12000r/min离心3min。

h)把分离管中的柱子转到1.5mL的干净的离心管中，17900r/min离心1min。

i)再把柱子放到1.5mL的干净的离心管中，加入双蒸去离子水适量，17900r/min离心1min，即得到纯化的目的DNA。

2)SP163-sFat-1基因与pcDNA3.1的连接

应用T4DNA ligase将SP163-sFat-1与线性化的pcDNA3.1进行连接.。连接体系为：SP163-sFat-13.5μl，pcDNA3.1 0.5μl，SolutionI 5μl，ddH₂O 1μl，总体积10μl。16℃过夜连接。

将连接产物转化至感受态细胞DH_5a，提取质粒，命名为pCDNA3.1(+)-sFat-SP163。

3pCDNA3.1(+)-sFat-SP163在CHO细胞中的表达与检测

1)采用脂质体介导法，分别将pCDNA3.1(+)-sFat-SP163和pCDNA3.1(+)瞬时转染CHO细胞。将获得的细胞系分别命名为3.1-sFat-1和3.1。转染具体步骤如下：

a)将状态良好，处于对数生长期的细胞用0.05％胰酶消化，用完全培养基悬浮成单细胞悬液，细胞计数后，按照每孔5×10⁵个细胞接种于六孔板的每个孔中。

b)培养过夜，观察细胞生长状态。在细胞覆盖率80％左右时，进行转染试验。

c)用无血清Opti-MEM轻洗细胞两次，加入1.5ml Opti-MEM。

d)分别用250ul Opti-MEM稀释3ug干扰质粒pcDNA3.1、pcDNA3.1-sFat1-SP163轻轻混匀。

e)用250ul Opti-MEM稀释10ul lipofectamine 2000试剂，轻轻混匀，室温孵育5min。

f)轻轻混合已稀释质粒和lipofectamine 2000稀释液，室温放置20分钟。

g)将每管500ul脂质体-质粒复合物慢慢加入到各细胞孔中，轻轻混匀；在37℃，5％的CO₂的培养箱中培养4～6小时后，换上完全培养液(不含抗生素)，放置在37℃，5％的CO₂的培养箱中继续培养过夜。

h)转染后48小时收集细胞进行Q-PCR检测。

2)通过荧光定量RT-PCR方法(简称Q-PCR)检测目的基因

(1)细胞样品总RNA的提取，具体步骤如下：

a)轻轻吸净培养液，用PBS将细胞洗两遍，每孔细胞(六孔板)样品中各加入1ml Trizol液，用枪头吹吸混匀，尽量让细胞全部裂解，室温放置5分钟。

b)将(a)中裂解液转入离心管，每管中各加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，反复颠倒混匀15秒，12000g，4℃离心10分钟。

c)取上层水相于一新的离心管中，每管中各加0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温放置10分钟，12000g，4℃离心10分钟。

d)弃去上清液，每管中加入1ml的75％的酒精轻轻洗涤沉淀，12000g，4℃离心10分钟。

e)小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，55℃-60℃水溶10分钟。

2)总RNA的鉴定

a)紫外分光光度法分析RNA的纯度及浓度：吸取1μl RNA样品，加49μl DEPC处理水至50μl混匀，转入100μl的eppendorf微量比色皿中，用50μl DEPC处理水校正紫外分光光度计的零点；在紫外分光光度仪测定RNA在A260/A280的比值及其浓度。

b)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性：制备1％的琼脂糖凝胶，吸取2μl提取的总RNA与Loading Buffer混匀后加入点样孔进行电泳(220V，10min，150mA)，然后在紫外透射仪上观察电泳结果(图2)，检测RNA的完整性。

3)反转录

a)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管，每个样本加入如下组分得到Mix 1，见表1。

b)将Mix165℃水浴5分钟后，立即放置冰上2分钟。

c)将如下组分加入到Mix1中，得到Mix2(见表2)，共20ul反转录体系。

d)50℃水浴50分钟后，85℃水浴5分钟，立即放置到冰上2分钟。

e)每管Mix2中加入1μl的RNase H，37℃处理20分钟，所得到的cDNA保存在-20℃备用。

表1Mix1体系

表2Mix2体系

4)Q-PCR检测

(1)Q-PCR引物的设计合成

用GAPDH基因作为内参基因，针对GAPDF设计的引物见Sequence NO.2和Sequence NO.3，针对sFat-1基因设计的引物见Sequence NO.4和Sequence NO.5。引物均由上海Invitrogen公司合成。GAPDH、sFat-1基因扩增产物的大小分别为107bp，112bp。

(2)Q-PCR反应体系和条件如表3：

表3转基因细胞系的PCR检测体系

PCR总反应体系为25μl，按照TaKaRa公司的荧光定量试剂盒说明书加入各反应试剂，每个样品做三个重复。

两步法PCR扩增标准程序：

①Stage 1：预变性        Reps：1

95℃  30s

②Stage 2：PCR反应       Reps：40

95℃  5s

60℃  34s，60℃检测荧光信号。

(3)Q-PCR检测目的基因的表达

用GAPDH基因作为内参基因，分别对样本进行RT-PCR荧光定量检测，记录CT值。

5)数据分析

根据Q-PCR反应曲线得到各样品目的基因和内参基因的Ct值(thresholdcycle number.域值循环数)，采用比较CT法进行相对定量。使用转染阴性载体(pCDNA3.1(+))的样品作为对照样品，比较各转染表达载体(pcDNA3.1-sFat1-SP163)的sFat1基因的表达。

ΔΔct＝(待测样品的目的基因的ct平均值-待测样本的内参基因的ct的平均)-(对照样品的目的基因的ct的平均值-对照样本的看家基因的ct的平均值)

基因的表达量F＝2^-ΔΔct表示的是试验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。

三、试验结果

1、基因的合成与克隆测序分析

1)双酶切鉴定结果

将pcDNA3.1和pEASY-blunt-simple-sFat-1以KpnI和NotI进行双酶切鉴定，载体和目的片段与理论值大小相符，结果见图1。

2)克隆测序结果

pEASY-blunt-simple-sFat-1测序结果表明SP163-sFat-1基因序列正确，见序列表Sequence NO.1。

2、转染CHO细胞及检测

1)总RNA的完整性及纯度检测

紫外分光光度仪测定提取的总RNA的光密度比值A₂₆₀/A₂₈₀均在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较好，DNA及蛋白污染较少；总RNA经1％琼脂糖凝胶电泳检测(图2)可见：28s和18s条带明亮、清晰，且5s条带比28s和18s两条带弱，表明提取的总RNA降解较少、完整性好，可以进行反转录试验。

2)熔解和扩增曲线分析

内参扩增曲线见图3，sFat-1基因的扩增曲线见图5，扩增前期曲线重合性好且未出现杂峰，扩增曲线呈现典型的S型荧光定量动力学曲线，为理想扩增曲线。从图上看，曲线基线平整，说明无引物二聚体等；指数区较明显斜率大且固定(平行线)，线性范围广；说明该Q-PCR检测具有较好的敏感性。熔解曲线是实时荧光定量PCR反应的后期产物经融解、冷却后得到的，内参熔解曲线见图4，sFat-1基因的熔解曲线见图6，由图可见扩增产物单一，特异性很好。这些曲线可以说明，该Q-PCR方法具有较好灵敏性、特异性和可靠性。

3)瞬转细胞Q-PCR方法检测目的基因

pcDNA3.1、pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒瞬时转染CHO细胞，转染48小时后收集样品Q-PCR检测目的基因的表达情况，内参定量结果见表4，sFat-1基因定量结果见表5。目的基因表达含量有大幅提升，结果如下：3.1-sFat1细胞sFat-1基因表达提升31000倍。

表4内参定量结果

表5sFat-1基因定量结果

上述实验结果表明实施例一构建的pcDNA3.1-sFat1-SP163质粒能在哺乳动物细胞中转录和表达，所述的质粒可以用于实施例二的动物实验。

实施列二母羊卵泡及卵巢注射法制备转基因绵羊的研究

一、材料

1、实验动物

实验用小尾寒羊购自山东郓城小尾寒羊保种基地，其中试验用母羊(12-18月龄)15只，公羊(12-20月龄)10只。

2、主要试剂

3、主要器械

手术器械(手术刀、手术针、手术线，创巾、医用纱布、止血钳、持针钳、手术剪、眼科剪、大镊子、小镊子，2ml、5ml、10ml注射器等)购自中国农业大学实验供应科；羊人工授精器械(采精管、集精杯、固定架、绳等)、手术台、高压灭菌锅(北京维欣仪奥科技发展有限公司)、普通光学显微镜(日本Olympus公司)、智能恒温水浴锅(HW.SY2-P6)、酒精温度计、4℃普通冰箱(山东青岛海尔公司)等由青岛奥特种羊场提供；10ml真空离心管、一次性PE手套、乳胶手套、一次性手术服等耗材购自北京冬歌生物科技有限公司；加样枪(德国Eppendorf公司)、LD24-08型台式低速离心机、TGL-16G型台式高速离心机等为本实验室固定资产。

二、实验方法

2.对母羊进行同期发情处理

母羊进行同期发情处理之前，先进行空载处理，方法是对所有母羊注射2ml氯前列烯醇，使已怀孕的母羊流产，成为空载母羊。

1)放置阴道栓

a)将密封放置的海绵栓取出，放入无菌生理盐水中浸泡，同时在生理盐水中加入氨苄西林钠，使其浓度为5000单位/ml。

b)将上述准备好的海绵栓，放38℃水浴中放置一段时间，以防止冷水对羊的刺激作用。

c)用新洁尔灭消毒液或高锰酸钾消毒液对母羊外阴进行消毒，尤其要洗净母羊外阴部的秽物，以防止其随海绵栓进入母羊阴道，对其造成感染。

d)温浴后的海绵栓取出后，用止血钳夹持，放入母羊的阴道中，在放置的过程中应注意力度，不可用力过猛，对母羊造成伤害；正确的方法是不断调整止血钳用力的方向，以便顺势将海绵栓放入。

e)放栓时，一旦对母羊造成伤害，应在海绵栓放置完成后，对母羊注射4×80万单位氨苄西林钠/天，连续注射4～5天。

2)撤栓

a)母羊放置海绵栓10天后，将其取出，在取出海绵栓后1～5天母羊处于发情期。

b)两人将母羊固定好，另一人拽住海绵栓露在母羊阴道外面的绳子末端，用力将海绵栓从母羊阴道中取出，在取海绵栓的时候不宜用力过猛，以使其海绵部分留在母羊体内。

c)一旦海绵栓的绳子在母羊阴道内被扯断，海绵栓无法用手取出，应在开膣器的辅助下用止血钳将残留在母羊阴道内的海绵栓取出。

d)海绵栓取出后，如发现绵羊阴道部有炎症反应，应立即对母羊注射4×80万单位氨苄西林钠/天，连续注射4～5天。

e)取出海绵栓的同时，对每只母羊注射促性素(PMSG)1000单位。

f)母羊撤栓后每天上午对其进行试情，记录母羊发情情况，以便在适当时机进行配种。一般母羊撤栓后第3～5天发情比较集中。

3.母羊卵泡及卵巢注射

1)将所有实验母羊注射2ml氯前列烯醇，使已怀孕的母羊流产，成为空载母羊，并在其阴道内放置阴道栓。

2)术前空腹：母羊在进行手术的前一天晚上不进食，以避免在手术时，由于食物蓄积对腹部造成过大的张力。

3)转染液制备：将实施例1中获得的真核表达质粒pcDNA3.1-sFat1-SP163，制备成转染液。

4)母羊卵泡注射手术器材的灭菌：将手术器械(手术刀、手术针、手术线、创巾、医用纱布、止血钳、持针钳、手术剪、眼科剪、大镊子、小镊子等)在103.4kPa的压力下高压蒸汽灭菌15～20分钟。

5)母羊的麻醉处理：对每只将要进行卵泡注射手术的母羊肌肉注射5ml速眠新，待母羊站立不稳继而卧地不起后，将其固定在手术架上。

6)打开母羊的腹腔(开口约3cm左右)，将食指和中指伸入，把母羊的卵巢取出，先摸到母羊子宫角，然后顺藤摸瓜将卵巢取出。

7)对母羊卵泡及卵巢注射：每成熟卵泡注射0.01-0.02ul；卵巢注射0.3ml左右的转染液，两侧卵巢各注射约0.15ml。

8)注射完转染液后，将母羊卵巢送回腹腔，并对腹腔开口进行缝合。在缝合之前向手术开口处撒2×80万单位氨苄西林钠粉末，缝合时应按腹膜、肌肉、皮肤的顺序依次缝合，其中腹膜和肌肉要连续缝合，而皮肤需结节缝合。

9)缝合完毕后，为手术母羊依次注射2×80万单位氨苄西林钠注射液和3ml苏醒灵注射液。

10)术后母羊应避免立即采食大量青草，及时补充水分，最好补充精料或鸡蛋。

11)术后每天对母羊注射4×80万单位氨苄西林钠，连续注射4～5天。

12)由于母羊撤栓后第3～5天发情比较集中，故选母羊撤栓后第3天、第4天、第5天的早晨和傍晚连续进行3次人工授精。

上述母羊卵泡注射实验(其流程见图7)，其中实验组8只为注射包含真核表达质粒pcDNA3.1-sFat1-SP163的转染液，对照组的7只母羊只注射同实验组相同体积的脂质体和台酚蓝混合的转染液。

三、试验结果

实验组8只母羊产仔9只，存活5只，对照组7只母羊产仔8只存活6只。通过PCR技术，用sFat1基因的特异性引物检测子代动物sFat基因的表达。通过Southern印迹检测排除假阳性。利用实时定量PCR的方法检测阳性动物目的基因的表达。采用气相色谱法，对仔羊肌肉组织进行脂肪酸分析。

初步的实验结果显示实验组存活的5只仔羊中有2只仔羊其sFat1基因表达量显著高于另外9只仔羊，且其肌肉组织的ω-3PUFAs的含量较高，ω-6/ω-3比值也明显下降。为通过转基因羊生产自合成长链多不饱和脂肪酸奠定了基础。

Claims (3)

1.一种制备转基因动物的新方法，包括：

1)雌性哺乳动物在进行实验前空腹，将实验雌性哺乳动物注射氯前列烯醇，使已怀孕的雌性哺乳动物流产，成为空载雌性哺乳动物，并在其阴道内放置阴道栓。

2)将雌性哺乳动物进行麻醉处理，打开腹腔取出卵巢，对雌性哺乳动物卵泡及卵巢注射转染液。

3)注射完转染液后，将雌性哺乳动物卵巢送回腹腔，并对腹腔开口进行缝合。

4)待实验雌性哺乳动物手术伤口愈合后，对雌性哺乳动物注射促性素进行发情处理，并在雌性哺乳动物撤栓后进行人工授精。

2.根据权利要求1所述的一种制备转基因动物的新方法，其特征在于，所述的转染液包含目的基因的真核表达质粒。

3.根据权利要求1所述的一种制备转基因动物的新方法，其特征在于，所述方法可以应用于转基因动物新品种的培育。

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