CN102408455A - 植物源固锌化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物源固锌化合物：为从东南景天的茎叶中提取的化合物，浅黄色粉末，空气中极易吸潮成棕色粉末，易溶于水；红外光谱(KBr压片)：3355cm^-1处为-OH的特征峰；2929cm^-1处为-CH₂的特征峰；1515cm^-1和749cm^-1处为苯环特征峰，830cm^-1处为对位取代苯环的特征峰；1384cm^-1处为-NO₂的特征峰；1075cm^-1处为C-O(H)的特征峰；1619cm^-1处为样品中吸附的水的特征峰。本发明还同时提供了上述植物源固锌化合物的制备方法。该植物源固锌化合物的用途为：用于促进东南景天的茎叶中锌的积累。

Description

植物源固锌化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种植物源固锌化合物及其制备方法和用途，属于环境保护技术领域。

背景技术

东南景天(S.alfredii Hance)，生长在中国南方的一个古老铅/锌矿区，由于其地上部具有能够超积累20g/kg以上的锌的特性，已被确定为一个我国原生的新的锌超积累生态型植物[Yang XE，Long XX，Ni WZ，Fu CX.Sedum alfredii H：a new Zn hyperaccumulating plantfirst found in China.Chin.Sci.Bull.2002，47(19)：1634-1637]；与模式植物锌超积累遏蓝菜相比，因为其在一个生长季节具有更大的生物量，为1800kg/hm²，而且一年可以收获2-3次，因而更具有植物修复污染土壤的潜力。稳定的金属螯合剂可以在植物体内充当配位金属离子的络合物，对植物地上部金属离子的吸收、运输和积累非常重要。植物体内已有的低分子量有机螯合剂，如草酸、组氨酸、苹果酸、柠檬酸、谷胱甘肽和烟草胺等，可以作为金属配合物。首次发现一个特定的配体可能参与了镍超积累植物中的转运Ni到地上部，镍超积累植物的叶片提取物中镍的化学形态是与苹果酸和柠檬酸的螯合物，在木质部渗液中组氨酸螯合物占总镍约40％[U，Cotter-Howells JD，Charnock JM，Baker AJM，SmithJAC.Free histidine as a metal chelator in plants that accumulate nickel.Nature 1996，379：635-638]。另一个发现是，中国江西耐铝荞麦品种，响应铝胁迫时其根系迅速分泌草酸，叶细胞中铝以无毒的铝-草酸复合物存在，其中铝∶草酸以1∶3的比例形成铝-草酸复合物[Ma JF，Zheng SJ，Matsumoto H，Hiradate S.Detoxifying aluminium with buckwheat.Nature.1997.390，569-570]。锌超积累植物遏蓝菜中烟草胺并不是锌的主要存储配体，相反，可能参与了超积累植物中的锌向地上部的转运。

蛋白质和其他生物分子，如金属硫蛋白和植物螯合肽，可能作为金属离子的配体。已有研究表明，镉的富集导致镉超积累植物S.alfredii H中谷胱甘肽的增加，而不是植物螯合肽的增加[Sun Q，Ye ZH，Wang XR，Wong MH.Cadmium hyperaccumulation leads to anincrease of glutathione rather than phytochelatins in the cadmium hyperaccumulator Sedumalfredii.Journal of Plant Physiology.2007.164：1489-1498]，而且超积累植物S.alfredii H中植物螯合肽的合成与非超积累S.alfredii H中起着类似的作用。专利(201010298902.X，利用超积累植物持续提取农田土壤锌的方法)中的公开方法是：在每千克锌污染土壤中施入50～800mg可溶性磷肥，并配施0.2g氮和0.2g钾作为基肥；将东南景天带腋芽茎段先用营养液预培养3-4周，将株高6-8cm，根系生长旺盛的东南景天幼苗移栽到经上述处理的锌污染土壤中，按传统农耕法管理生长，每四个月收割东南景天地上部，收割时地上部留茎2-3cm高。定期重复收割东南景天地上部，能持续降低土壤中的锌浓度。说明锌超积累植物东南景天可以用于锌污染土壤的持续植物修复。然而，目前还没有关于报道锌超积累植物S.alfredii H中特定的植物源固锌化合物的制备方法和用途。

开发特定的植物源固锌化合物及其制备方法和用途，有利于发展锌超积累植物东南景天对污染土壤中锌的植物提取的环境保护技术。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种植物源固锌化合物及其制备方法，用于提高锌超积累东南景天对锌的植物提取的能力。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种植物源固锌化合物，其为从东南景天(为锌超积累植物，即锌超积累东南景天)的茎叶中提取的化合物，浅黄色粉末，空气中极易吸潮成棕色粉末，易溶于水；

红外光谱(KBr压片)：3355cm^-1处为-OH的特征峰；2929cm^-1处为-CH₂的特征峰；1515cm^-1和749cm^-1处为苯环特征峰，830cm^-1处为对位取代苯环的特征峰；1384cm^-1处为-NO₂的特征峰；1075cm^-1处为C-O(H)的特征峰；1619cm^-1处为样品中吸附的水的特征峰。

核磁共振氢谱¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ10.941(s，1H)，7.576(d，J＝8Hz，1H)，7.357(d，J＝8Hz，1H)，7.225(s，1H)，7.076(t，J＝7.5Hz，1H)，6.987(t，J＝7.5Hz，1H)，3.517(m，3H)，2.985(m，4H)，2.380(s，1H)，1.246(s，1H)，1.083(d，J＝7.5Hz，1H)，0.863(m，3H).核磁共振碳谱¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ136.790，127.875，124.558，121.368，118.819，118.745，111.773，63.397，60.647，56.472，55.340，55.125，53.913，53.252，29.432，27.533，25.083，18.994。

本发明还同时提供了上述植物源固锌化合物的制备方法，依次包括以下步骤：

1)、将东南景天(锌超积累东南景天)的茎叶(亦称地上部)，采用体积浓度为35～45％的乙醇溶液浸提、热回流、或者超声提取；所得的提取液经真空浓缩后得到粗提取物；

2)、将粗提取物用水溶解后，按1∶1的体积比加入石油醚萃取，弃石油醚层以除去非极性和低极性杂质，得到深红色水溶液；

3)、将深红色水溶液上样于装有弱极性AB-8型大孔树脂的层析柱，充分吸附后，依次用水以及10％、20％、30％、40％体积浓度的乙醇溶液以1.5BV/h梯度进行洗脱分离(BV指树脂床体积)；收集30％体积浓度的乙醇溶液对应的洗脱液；

将所述30％体积浓度的乙醇溶液对应的洗脱液先减压浓缩挥去乙醇，再冷冻干燥，得黄褐色粉末状的植物源固锌化合物的粗提物。

作为本发明的植物源固锌化合物的制备方法的改进：将黄褐色粉末状的植物源固锌化合物的粗提物用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜后，用制备型高效液相色谱纯化，流动相为甲醇/水＝30∶70(0～30min)～40∶60(30～75min)，收集到纯度为99.0％的组分，真空冷冻干燥后，得到浅黄色粉末状的植物源固锌化合物(纯度99.0％)。

作为本发明的植物源固锌化合物的制备方法的进一步改进：制备型液相色谱条件为WATERS 600P-HPLC，色谱柱规格XTerra，RPC₁₈ 250×25mm，粒径10μm，柱温25℃，流速8ml/min，进样量1.5ml，波长278nm，流动相为甲醇∶水＝30∶70(0～30min)～40∶60(30～75min)，时间75min，保留时间75min，柱压力10～15mbar。

本发明还同时提供了上述植物源固锌化合物的用途，其特征在于：用于促进东南景天(锌超积累东南景天)的茎叶中锌的积累。

在本发明中，东南景天选用锌超积累东南景天，在其茎叶中含有0.788％～0.956％(质量比)的植物源固锌化合物，该植物源固锌化合物为该植物体内的主要代谢产物之一。

在本发明的步骤1)中，每1KG的东南景天茎叶(干重)配用10～30L的乙醇溶液(体积浓度为35～45％)。

本发明的显著优点和效果如下：

a)本发明以植物修复锌污染的锌超积累植物--东南景天为原料，锌超积累的东南景天已经被国内很多单位(浙江慈溪、广东等地)采用，建立了污染土壤的植物修复基地。国外已经开始温室气体CO₂固持降低的市场交易。碳固持补助在欧共体、美国、新西兰、澳大利亚等已实施。CO₂固持补助是指固持1吨CO₂由政府所提供的补助，如美国固定1吨CO₂补助10-40美元。有些国家对生物质能源植物CO₂固持补助价格更高一些，如意大利用每100公斤生物能源原料补助22欧元。按每100公斤生物能源原料补助30美元计，预计每公顷污染土壤可生产东南景天植物生物量5.4吨/年(干重)，此项每公顷污染土壤每年从温室气体CO₂固持补助费中收益：5.4×1000kg×$30/100kg＝1620美元。

b)本发明具有工艺简单、安全、成本低、污染小的特点。采用本发明从锌超积累东南景天中提取的一种固锌化合物，是一种植物源固锌化合物，可以用作锌超积累东南景天叶面喷施的固锌剂。本发明充分开发利用了锌超积累东南景天中的植物源固锌化合物，用于促进锌超积累东南景天对锌的植物提取的能力。

c)采用35～45％的乙醇溶剂浸泡和超声波处理的方式进行提取，提高了植物源固锌化合物的含量，减少了杂质的含量。所用到的纯化精制方法是非极性大孔树脂和制备型液相色谱两步法，保证了植物源固锌化合物的高纯度，纯度为99.9％。

本发明的植物源固锌化合物实际使用时，可配制成浓度为5～20g/L的溶液，然后涂抹在东南景天的叶面上(单面涂抹和双面涂抹均可，叶面湿润即可)。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为基于锌超积累东南景天的植物源固锌化合物的制备方法的流程图。

图2为实施例2中超积累东南景天40％乙醇提取液(A)、实施例2中AB-8大孔树脂层析-30％乙醇洗脱液(B)、实施例3中制备型高效液相色谱纯化后流出液(C)的液相色谱图；保留时间9.5min处的化合物，是锌超积累东南景天茎叶中的一种固锌化合物。

图3为实施例3中制备型高效液相色谱纯化后的固锌化合物的红外光谱。

图4为实施例3中制备型高效液相色谱纯化后的固锌化合物的核磁共振氢谱(A)和碳谱(B)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：一种植物源固锌化合物的制备方法

采集成熟期的锌超积累植物--东南景天的茎叶(亦称地上部)，洗净后，65℃烘干(含水率≤0.5％，重量比)，磨样机研磨成干粉末，过100目筛。取500g锌超积累东南景天地上部干粉，置于15L的容器中，加入15倍体积的40％乙醇-水(V/V)溶液7.5L，充分搅匀后，进行溶剂浸提(磁力搅拌3天，常温)，得到的浸提液过滤。将过滤所得的残渣重复上述过程共3次(即以残渣替代干粉末，重复上述浸提)。合并4次浸提所得的提取液，通过布氏漏斗抽滤。得到的抽滤液于30℃经双泵抽气减压，浓缩，得到69.82g的粗浸膏，用超纯水溶解，定容至250mL后，配制成浓度为0.28g干样/ml的溶液。

在层析柱(直径3cm)中装好已洗净的AB-8型大孔树脂，静置后柱高31cm，体积219ml。在其上端加入50ml浓度为0.28g干样/ml的溶液，用滴管慢慢从上部沿管壁均匀加入。分别用超纯水、10％、20％、30％、40％的乙醇-水溶液各219ml从树脂上端慢慢加入，进行梯度洗脱，流速约每秒钟1滴，收集20％、30％乙醇洗脱液，每1/3BV的洗脱液收集1管，平均每梯度接3管，每管73ml。保持液面高度稳定在高于树脂床10cm的位置。每管取2ml，过0.22μm滤膜过滤，用HPLC检测洗脱液中的成分(Agilent 1200：EclipseXDB-C₁₈柱，4.6mm×250mm，粒径：5μm，温度25℃；流速1ml/min；进样量10μl；波长278nm；甲醇/水＝15/85的体积比；流出时间20min；压力：0～3mbar)。

表1超积累东南景天干粉浸提液大孔树脂分离时用20％乙醇洗脱后的HPLC分析结果

表2超积累东南景天干粉浸提液大孔树脂分离时用30％乙醇洗脱后的HPLC分析结果

由表1～2可知，在30％乙醇洗脱液的第1个、第2个1/3BV的组分(即30-1和30-2)中，有高纯度物质(9.5min出峰的化合物)存在，纯度为90.0％以上；通过收集30％乙醇洗脱液的30-1和30-2组分，可以得到高纯度的9.5min出峰的化合物。上述30-1和30-2组分合并，45℃减压浓缩除去其中的乙醇，然后-40℃冰箱中冰透，冷冻真空干燥，除去水分，得粗产物为黄褐色粉末0.07262g，得率为0.01452％，HPLC检测纯度为92.0％。

实施例2：一种植物源固锌化合物的制备方法

采集成熟期的锌超积累植物--东南景天的茎叶，洗净，-80℃冰箱中冷冻后，置于冷冻干燥机干燥2-3天；样品充分干燥后(含水率≤0.5％，重量比)取出，磨样机研磨，过100目筛。取200g上述锌超积累东南景天地上部干粉，置于5L的容器中，加入10倍体积的40％乙醇-水(V/V)溶液2L，充分搅匀后，40KHz超声强度20℃超声1h，得到的浸提液过滤。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次(即以残渣替代干粉末，重复上述浸提)。合并4次浸提所得的提取液，通过布氏漏斗抽滤。得到的抽滤液于30℃经双泵抽气减压，浓缩后得到27.35g的粗浸膏(粘稠液体)，用超纯水定容到浓度为0.5g干样/ml。按1∶1的体积比加入石油醚充分混匀，静置分层萃取，所得的水层用石油醚重复萃取共3次(石油醚的用量同上)，弃掉石油醚层中的非极性和弱极性物质，保留水层，即为含有9.5min出峰化合物的粗提取液，为深红色水层。经45℃真空浓缩后，得到的浸膏用超纯水溶解，定容50mL后，配制成浓度为0.25g干样/ml的深红色水溶液。

上述浓度为0.25g干样/ml的深红色水溶液，通过已洗净的AB-8型大孔树脂层析柱，分别用1BV的水、10％、20％、30％、40％的乙醇-水溶液通过树脂柱，进行梯度洗脱，蠕动泵控制加液的流速为1.5BV/h，保持液面高度稳定在高于树脂床10cm的位置。收集洗脱液，每1/3BV的洗脱液收集1管，用HPLC检测洗脱液中的成分(检测条件同上)。

结果显示，在30％乙醇洗脱液的第1个1/3BV的组分中，有9.5min出峰的化合物，其纯度为91.8％(图2B)，在30％乙醇洗脱液的第2个1/3BV的组分中，有9.5min出峰的提取物，其纯度为100％，收集以上30％乙醇洗脱液的两个组分，45℃减压浓缩除去其中的乙醇等有机溶剂，然后-40℃冰箱中冰透，冷冻真空干燥，除去水分，即得粗产物为黄褐色粉末0.02962g，得率为0.01481％，HPLC检测其纯度为91.8％(图2B)。

实施例3：一种植物源固锌化合物及其性质

将实施例2中的9.5min出峰的化合物粗品(黄褐色粉末)，分别经色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜后，采用制备型液相色谱柱精制(WATERS 600P-HPLC，色谱柱规格XTerra，RPC₁₈ 250×25mm，粒径10μm，柱温25℃，流速8ml/min，进样量1.5ml，波长278nm，流动相为甲醇∶水＝30∶70(0～30min)～40∶60(30～75min)，时间75min，保留时间75min，柱压力10～15mbar)，分离除去少量的杂质；HPLC检测到9.5min出峰化合物的纯度高于99.9％(图2C)，收集此馏分，经45℃减压浓缩，除去有机溶剂(甲醇)，然后-40℃冰箱中冰透，冷冻真空干燥，除掉水分，得到浅黄色粉末的植物源固锌化合物(纯度99.0％)。

用KBr压片时，浅黄色粉末样品极易吸潮成棕色粉末。红外光谱数据(图3)：棕色粉末(纯度99.9％)，3355cm^-1处为-OH的特征峰；2929cm^-1处为-CH₂的特征峰；1515cm^-1和749cm^-1处为苯环特征峰，830cm^-1处为对位取代苯环的特征峰；1384cm^-1处为-NO₂的特征峰；1075cm^-1处为C-O(H)的特征峰；1619cm^-1处为样品中吸附的水的特征峰。

浅黄色粉末用氘代DMSO溶解，做核磁共振氢谱和碳谱(图4)。核磁共振数据：¹HNMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ10.941(s，1H)，7.576(d，J＝8Hz，1H)，7.357(d，J＝8Hz，1H)，7.225(s，1H)，7.076(t，J＝7.5Hz，1H)，6.987(t，J＝7.5Hz，1H)，3.517(m，3H)，2.985(m，4H)，2.380(s，1H)，1.246(s，1H)，1.083(d，J＝7.5Hz，1H)，0.863(m，3H)。¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ136.790，127.875，124.558，121.368，118.819，118.745，111.773，63.397，60.647，56.472，55.340，55.125，53.913，53.252，29.432，27.533，25.083，18.994。

以下方法1-4用于说明锌超积累植物东南景天地上部生物量的粗提方法。

方法1

将成熟期采集的锌超积累植物东南景天的茎叶(即地上部)，65℃烘干后(含水率≤0.5％，重量比)，磨样机研磨成干粉末，过100目筛。取100g上述地上部烘干干粉置于2L的容器中，加入10倍体积的40％乙醇-水(V/V)溶液1L，进行超声波提取(超声波强度40KHz，20℃超声1h)，得到的浸提液过滤。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次(即，在残渣中加入40％乙醇-水溶液1L，于超声波强度40KHz、20℃的条件下超声波提取1h)。合并4次浸提所得的滤液；再经45℃真空浓缩至恒重，得13.667g的粗浸膏，产率为13.67％。

方法2

将成熟期采集的锌超积累植物东南景天的茎叶(即地上部)，65℃烘干后(含水率≤0.5％，重量比)，磨样机研磨成干粉末，过100目筛。取100g上述地上部烘干干粉置于2L的容器中，加入10倍体积的40％乙醇-水(V/V)溶液1L，进行溶剂浸提(磁力搅拌3天，常温)，得到的浸提液过滤。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次。合并4次浸提所得的滤液；再经45℃真空浓缩至恒重，得11.254g的浸膏，产率为11.25％。

方法3

将成熟期采集的锌超积累植物东南景天的茎叶(即地上部)，65℃烘干后(含水率≤0.5％，重量比)，磨样机研磨成干粉末，过100目筛。取100g上述地上部烘干干粉置于5L的容器中，加入20倍体积的40％乙醇-水(V/V)溶液2L，进行溶剂热回流(浸提1.5h)，得到的浸提液过滤。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次。合并4次浸提所得的滤液；再经45℃真空浓缩至恒重，得13.058g的浸膏，产率为13.06％。

方法4

将成熟期采集的锌超积累植物东南景天的茎叶(即地上部)，-80℃真空冷冻干燥后(含水率≤0.5％，重量比)，磨样机研磨成干粉末，过100目筛。取100g上述地上部真空冷冻干燥干粉置于1L的容器中，加入10倍体积的40％乙醇-水(V/V)溶液1L，进行溶剂浸提(磁力搅拌3天，常温)，得到的浸提液过滤。将抽滤所得的残渣重复上述过程共3次。合并4次浸提所得的滤液；再经45℃真空浓缩至恒重，得13.359g的浸膏，产率为13.36％。

采用方法1～方法4后得到的植物浸提液分析

采用上述方法1～方法4提取超积累植物东南景天干粉后得到的浸提液，抽滤，吸取2ml过0.22μm滤膜，用HPLC分析浸提液中的各成分(检测条件同上)。由表3可知，与超声提取、磁力搅拌浸提相比，热回流提取得到的提取液中成分较多。与烘干样品相比较，冷冻干燥样品的提取液成分要少，易于简化纯化工艺，而且冷冻干燥本身最能够保持植物中的活性成分不受损失。

表3锌超积累植物东南景天干粉浸提液的HPLC分析结果

^＊料液比：100g/1000ml(超声法提取、磁力搅拌浸提)100g/2000ml(热回流法提取)

以下用于说明锌超积累植物东南景天浸提液的溶剂萃取方法。

方法5：

成熟期采集的锌超积累植物--东南景天，取400g茎叶(即地上部)的烘干干粉，采用方法1得到的粗浸膏，加水配成浓度为0.5g干样/ml的溶液100ml，加入分液漏斗中，倒入100ml石油醚，充分混匀后至两相体系成均一的乳浊液，静置2h后，进行分层萃取，弃掉石油醚层(位于上层)中的非极性和弱极性物质，水层(位于下层)重复萃取共3次(每次均用100ml石油醚)，为深红色。所得的水层浓缩后得到浸膏，用超纯水溶解定容100ml后，取200μl稀释到2ml，用HPLC分析浸提液中的各成分(检测条件同上)。

取上述经石油醚萃取后的深红色水层100ml，再用水饱和的正丁醇100ml萃取，得到水层，该水层用水饱和的正丁醇100ml再萃取2次。合并3次所得的正丁醇层。

将合并所得的正丁醇层和最终所得的水层进行如下操作：正丁醇层经70℃旋转蒸发，冰水冷凝，真空完全蒸干后，用去离子水定容到50ml，取500μl稀释到2ml，用HPLC分析浸提液中的各成分(检测条件同上)。水层取200μl稀释到2ml，用HPLC分析浸提液中的各成分(检测条件同上)。

表4锌超积累植物东南景天干粉浸提液的溶剂萃取后的HPLC分析结果

由表4可知，与方法1相比，采用方法5得到的浸提液，经石油醚萃取后，其中保留时间为9.5min的化合物含量有较大幅度提高，为8.01％(图2A)，尤其是经过正丁醇饱和后水层中保留时间为9.5min的化合物含量可达到19.3％。

以下用于说明锌超积累植物东南景天浸提液的大孔树脂静态吸附条件的优化。

方法6：

大孔树脂预处理：按照上样量(方法5中石油醚萃取后的水层)与树脂体积比为1∶10的用量，取40g的AB-8型大孔树脂放在烧杯中，加入5BV去离子水冲洗，冲洗后没有明显的小颗粒漂浮，大颗粒沉降后上层的水澄清。此时，将树脂用水上柱，然后依次用体积比为10％、20％、30％……80％乙醇溶液各约0.5BV冲洗树脂，流速约1滴/秒。当梯度洗脱至90％乙醇溶液时，取流出液按1∶5的体积加入去离子水，直至洗到流出液加水振荡后无浑浊。经乙醇洗过的树脂再经90％、80％、70％……10％乙醇梯度冲洗，最后用去离子水冲洗直到去离子水流出液中无醇味。此时洗净的树脂可用来上样。暂时不用的树脂放置冰箱保存，以免长菌。

大孔树脂吸附液最佳浓度的确定：称上述预处理洗净的大孔树脂25g分成5份，每份5g。取5份0.25g/ml的提取液(实施例5中石油醚萃取后的水层)各5ml，分别稀释到10ml、15ml、20ml、25ml、30ml，分别向5份树脂中加入上述不同浓度(0.250g/ml、0.167g/ml、0.125g/ml、0.100g/ml、0.083g/ml)的提取液，恒温振荡10h后，取出树脂过滤备用。吸附后的5份树脂分别加入40％乙醇10ml进行洗脱，振摇2h，过滤后收集到的上清液分别用HPLC分析上清液中化合物的变化。由表5可知，以保留时间为9.491min的化合物含量最高时作为参考，吸附液浓度为0.25g/ml时大孔树脂吸附的量最多。

表5不同吸附液浓度对超积累植物东南景天干粉浸提液的HPLC分析结果

大孔树脂吸附时间的考察：上述预处理洗净的大孔树脂400ml中，准确加入0.25g/ml的石油醚萃取后的水层100ml，于215rpm恒温振荡(30℃)后，分别于2h、4h、6h、8h、10h、48h，取上清液各2ml，离心(12000r/min)后过0.22μm滤膜，用HPLC分析上清液中化合物的变化。由表6可知，以保留时间为9.525min的化合物含量最高时作为参考，充分吸附时间以10h为好。

表6不同吸附时间对超积累植物东南景天干粉浸提液的HPLC分析结果

大孔树脂洗脱液浓度的选择：取上述吸附饱和的树脂(吸附时间为10h)分成10份树脂：2.715g、2.703g、2.714g、2.715g、2.707g、2.708g、2.700g、2.751g、2.716g、2.702g，分别加入0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％乙醇各10ml，于215rpm恒温振荡(30℃)2h后，取上清液各2ml，离心(12000r/min)后过0.22μm滤膜，用HPLC分析上清液中化合物的变化。由表7可知，以保留时间为9.524min的化合物含量最高时作为参考，30％和40％的乙醇洗脱液对保留时间为9.524物质的洗脱效果最强。

表7不同洗脱液浓度对超积累植物东南景天干粉浸提液的HPLC分析结果

以下实施例4用于说明超积累东南景天茎叶中植物源固锌化合物与体内锌的相关性。

实施例4：

分别取自浙江诸暨铅锌矿区的超积累东南景天S.alfredii种子、九溪的非超积累东南景天S.alfredii种子，消毒，于27℃在暗室中发芽后，幼苗播种到水饱和的珍珠岩∶蛭石(3∶1的体积比)混合基质中，转移至人工气候室(12h光照/12h黑暗，昼/夜温度为25℃/20℃，昼/夜湿度为70/80％)中生长，两种S.alfredii幼苗用水浸湿，直至生长至其高度约2-3cm。取株高及生长状况基本一致的超积累东南景天和非超积累东南景天种苗若干株，分别转移到1/8，1/4，1/2的基础营养液，依次生长1周后，进行3种外源锌水平处理(0.5μM、50μM、500μM)。基础营养液采用实验室的Hoagland营养液，用于东南景天的水培生长，营养液pH控制在5.5±0.5，5天更换一次，保持营养液持续通气及植物生长光照状态良好。植物生长3个月后，测定3种外源锌水平时的超积累东南景天、非超积累东南景天的叶绿素荧光参数、茎叶中的植物源固锌化合物含量、锌含量；分析植物源固锌化合物与体内锌的相关性。

叶绿素荧光参数：取生长旺盛期的超积累东南景天、非超积累东南景天的第5片叶(从上数)，暗适应30min后，采用叶绿素荧光仪ImagePAM测定叶绿素荧光参数。测定时作用光为1200μmol/(m²·s)，饱和脉冲光为4000μmol/(m²·s)，闪光为[0.9μmol/(m²·s)]2s，间隔30s，3次重复，测定结果均为3次平行样的平均值。

茎叶中的植物源固锌化合物含量：东南景天茎叶收获后，洗净，充分冷冻干燥后研磨，过100目筛。分别称取超积累东南景天、非超积累东南景天干粉各1g，用20ml体积浓度为40％的乙醇在40KHz的超声波下提取1h，10000r/min转速下离心10min，过0.22μm水相滤膜，得到的浸提液，取1ml稀释到2ml后，用HPLC分析东南景天茎叶中植物源固锌化合物的含量变化(仪器条件同上)。

茎叶中的Zn含量：东南景天茎叶收获后，洗净，充分冷冻干燥后研磨，过100目筛。分别称取超积累东南景天、非超积累东南景天干粉各1g，用硝酸：高氯酸(85％∶15％)的混合酸消煮，ICP-OES分析消煮液中的Zn含量。

表8不同锌水平时超积累/非超积累东南景天叶绿素荧光参数的测定结果

由表8可知，叶绿素荧光参数(F₀、F_m、F_v/F_m)表明，非超积累东南景天在0.5μmol/L锌处理时，处于正常生长状况，在外源锌浓度为50μmol/L和500μmol/L时，F₀和F_m显著升高而F_v/F_m急剧下降，表明此时的非超积累东南景天处于高锌毒害的胁迫状态，PSII活性中心受损或者失活。然而，与0.5μmol/L的锌处理相比，50μmol/L和500μmol/L锌处理时的超积累东南景天叶绿素荧光参数F_v/F_m略有升高，高于0.8，但是500μmol/L锌处理时的F₀和F_m急剧下降。表明超积累东南景天在50μmol/L锌处理时处于最佳的生理生长状态，而且适应了500μmol/L的高锌浓度。与非超积累东南景天相比，超积累东南景天是喜锌的植物生态型。

表9不同锌水平时超积累/非超积累东南景天茎叶中锌含量和固锌化合物含量

由表9可知，与0.5μmol/L锌处理相比，50μmol/L锌处理时的超积累东南景天茎叶中锌含量显著增加，9.5min出峰的“植物源固锌化合物”含量大大增加，而且茎部增加幅度远大于叶部；而500μmol/L锌处理时茎叶中该化合物含量无显著变化。与0.5μmol/L锌处理相比，50μmol/L和500μmol/L锌处理时，非超积累东南景天茎叶中锌含量显著增加，9.5min出峰的“植物源固锌化合物”含量也增加，但是其茎部增加幅度低于超积累东南景天的茎部。

实施例4中检测到，水培实验中50μmol/L锌处理时，超积累生态型植物东南景天茎叶中的“植物源固锌化合物”含量提高，对其茎叶中锌含量有促进作用；而且“植物源固锌化合物”与体内锌呈现显著正相关性：y＝-6651.11+782.76x(茎部)，y＝-1896.46+740.77x(叶部)，其中y为体内的锌含量”含量，x为体内的“植物源固锌化合物，相关系数r＝1.0。

因而可以采用专利(201010298902.X，利用超积累植物持续提取农田土壤锌的方法)中的公开方法，通过提高农艺措施等，促使锌超积累东南景天茎叶中“植物源固锌化合物”的含量提高，从而更有利于茎叶固定更多的锌。当锌超积累东南景天茎叶中的锌含量大于20000mg/kg时，超积累东南景天已经具备超量积累锌的能力了；那么，及时将超积累东南景天植物作割除处理，实现本发明的工业实用性。

本发明最终所得的一种植物源固锌化合物，是超积累东南景天茎叶中的固锌化合物。其应用效果还可通过如下实验得到验证：

实施例5：植物源固锌化合物的应用

将本发明所得到的植物源固锌化合物2.0克，用去离子水配制成浓度为10.0g/L的含有这种特定的植物源固锌化合物的溶液。

取实施例4中的对照生长的锌超积累东南景天植物若干株，分别进行叶面涂抹(单面涂抹，叶面湿润即可)。

在人工气候室的条件(12h光照/12h黑暗，昼/夜温度为25℃/20℃，昼/夜湿度为70/80％)下，开展叶面涂抹上述浓度的植物源固锌化合物的溶液对新超积累东南景天地上部固定锌的实验，植物生长3个月后，收获超积累东南景天，分析茎叶中的锌含量。具体结果如下：

进行叶面涂抹后，取超积累东南景天的茎叶用ICP-OES检测，结果Zn含量为399.64mg/kg(茎)，318.57mg/kg(叶)；

而没有进行叶面涂抹后，取超积累东南景天的茎叶用ICP-OES检测，相应的检测结果Zn含量为364.78mg/kg(茎)，273.15mg/kg(叶)。

从而证明：植物源固锌化合物具有可以提高超积累东南景天的地上部中锌含量的作用，促使超积累东南景天地上部固定锌。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (5)

1.植物源固锌化合物，其特征在于：

为从东南景天的茎叶中提取的化合物，浅黄色粉末，空气中极易吸潮成棕色粉末，易溶于水；

红外光谱(KBr压片)：3355cm^-1处为-OH的特征峰；2929cm^-1处为-CH₂的特征峰；1515cm^-1和749cm^-1处为苯环特征峰，830cm^-1处为对位取代苯环的特征峰；1384cm^-1处为-NO₂的特征峰；1075cm^-1处为C-O(H)的特征峰；1619cm^-1处为样品中吸附的水的特征峰；

核磁共振氢谱¹H NMR(500MHz，DMSO-d₆)：δ10.941(s，1H)，7.576(d，J＝8Hz，1H)，7.357(d，J＝8Hz，1H)，7.225(s，1H)，7.076(t，J＝7.5Hz，1H)，6.987(t，J＝7.5Hz，1H)，3.517(m，3H)，2.985(m，4H)，2.380(s，1H)，1.246(s，1H)，1.083(d，J＝7.5Hz，1H)，0.863(m，3H).核磁共振碳谱¹³C NMR(125MHz，DMSO-d₆)：δ136.790，127.875，124.558，121.368，118.819，118.745，111.773，63.397，60.647，56.472，55.340，55.125，53.913，53.252，29.432，27.533，25.083，18.994。

2.如权利要求1所述的植物源固锌化合物的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：

1)、将东南景天的茎叶，采用体积浓度为35～45％的乙醇溶液浸提、热回流、或者超声提取；所得的提取液经真空浓缩后得到粗提取物；

2)、将粗提取物用水溶解后，按1∶1的体积比加入石油醚萃取，弃石油醚层以除去非极性和低极性杂质，得到深红色水溶液；

3)、将深红色水溶液上样于装有弱极性AB-8型大孔树脂的层析柱，充分吸附后，依次用水以及10％、20％、30％、40％体积浓度的乙醇溶液以1.5BV/h梯度进行洗脱分离；收集30％体积浓度的乙醇溶液对应的洗脱液；

将所述30％体积浓度的乙醇溶液对应的洗脱液先减压浓缩挥去乙醇，再冷冻干燥，得黄褐色粉末状的植物源固锌化合物的粗提物。

3.根据权利要求2所述的植物源固锌化合物的制备方法，其特征在于：将黄褐色粉末状的植物源固锌化合物的粗提物用色谱甲醇溶解，过0.22μm滤膜后，用制备型高效液相色谱纯化，流动相为甲醇/水＝30∶70(0～30min)～40∶60(30～75min)，收集到纯度为99.0％的组分，真空冷冻干燥后，得到浅黄色粉末状的植物源固锌化合物。

4.根据权利要求3所述的植物源固锌化合物的制备方法，其特征在于：所述制备型液相色谱条件为WATERS 600P-HPLC，色谱柱规格XTerra，RPC₁₈ 250×25mm，粒径10μm，柱温25℃，流速8ml/min，进样量1.5ml，波长278nm，流动相为甲醇∶水＝30∶70(0～30min)～40∶60(30～75min)，时间75min，保留时间75min，柱压力10～15mbar。

5.如权利要求1所述的植物源固锌化合物的用途，其特征在于：用于促进东南景天的茎叶中锌的积累。

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