CN102406607A - 一种硫普罗宁脂质体注射剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种硫普罗宁脂质体注射剂及其制法。该脂质体注射剂由特定重量配比的硫普罗宁、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、吐温65、PEG1000、海藻糖和谷胱甘肽制成。本发明的脂质体注射剂具有良好的制剂稳定性，冷冻过程中脂质体不会因融合、冰晶等发生破裂，长期储存后，脂质体同样保持良好的包封率；本发明提高了硫普罗宁的稳定性，提高了制剂产品的质量，减少了毒副作用，增加了药物在体循环中的保留时间，提高了药物的生物利用度，明显提高了疗效。

Description

一种硫普罗宁脂质体注射剂

技术领域

本发明涉及一种硫普罗宁注射剂及其制法，具体涉及一种硫普罗宁脂质体注射剂及其制法，属于医药技术领域。

背景技术

硫普罗宁(tiopronin，MPG)又名凯西莱，其分子式为：C₅H₉NO₃S，分子量163.20，结构式为：

是一种新型的含巯基甘氨酸药物，化学名称为N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸，通过侧链的游离活性巯基在体内发挥多种的药理疗效。

临床上硫普罗宁主要用于改善各类急、慢性肝炎的肝功能、脂肪肝、酒精肝、药物性肝损伤及重金属的解毒、降低放、化疗的不良反应和预防放、化疗所致的白细胞减少症等。近年，随着对硫普罗宁的研究不断深入，其临床应用也日益广泛。

目前国内已有硫普罗宁注射液和粉针剂销售，但是注射液长期放置后澄明度不合格，pH值降低，稳定性较差；粉针剂复溶性不好，复溶后硫普罗宁的含量下降。

US3246025A公开硫普罗宁的合成方法，专利CN1732912A公开了一种不含辅料的硫普罗宁静脉注射用冻干制剂及制备工艺，其制剂中只含有药物硫普罗宁，而不含有任何的添加剂；一个剂量的冻干制剂中硫普罗宁的剂量可以从10mg-1000mg；冻干工艺中药物和水的比例可以为1∶100到1∶1；药物硫普罗宁的纯度可以为85％-100％。先制备药液，再采用一次或多次预冷升华法冻干技术工艺进行制备。

专利CN1927198A公开了一种不需要专用溶剂、可直接用输液溶解后静脉滴注的硫普罗宁冻干粉针的组成和制备方法。本发明硫普罗宁冻干粉针含有活性成分硫普罗宁和药物附加剂精氨酸、右旋糖酐和依地酸盐，优选组分为：硫普罗宁、L-精氨酸、右旋糖酐20和依地酸钙钠，四组分的最优重量比为1∶1.1∶1∶0.002，制备方法是将硫普罗宁剂药物附加剂精氨酸、右旋糖酐和依地酸盐溶于适量的注射用水，经搅拌溶解、除菌、分装，按常规方法冷冻干燥。

专利CN100389764C公开了一种含硫普罗宁的冻干组合物及其制备方法，以硫普罗宁为活性成分，加入适量的碱性药用辅料组成的冻干组合物，硫普罗宁与碱性药用辅料的重量比为1∶0.5-1.5。

专利CN100356912C公开了一种硫普罗宁冻干制剂及其制备方法。本发明含有活性成分硫普罗宁化合物和药物赋形剂，他们的重量之比为1-10∶1，其中的药物赋形剂或是麦芽糖或/和蔗糖或/和果糖。

专利CN101143139A公开了一种稳定的硫普罗宁注射液及其制备方法，它包括含有效剂量的硫普罗宁、注射用水和氨基酸抗氧剂，其中氨基酸抗氧剂的质量浓度为0.1-0.64％。

专利CN100393310C公开了一种新的保肝药物硫普罗宁冻干粉针及其制备方法，该冻干粉针含有药物活性成硫普罗宁与药物赋形剂氨基酸、氨基酸盐、磷酸盐，优选甘氨酸或者甘氨酸钠，制备方法是将活性成分硫普罗宁、药物赋形剂分别溶于注射用水，再将上述两种溶液混合，搅拌均匀，加注射用水至规定量，除菌，灌装。

然而上述方法制备的硫普罗宁注射剂仍然不能解决注射液长期放置澄明度不合格，pH值降低，稳定性较差；粉针剂复溶性不好，复溶后硫普罗宁含量下降的问题。

在药物载体输送系统中，微乳、微球、纳米粒、脂质体、药质体等亚微粒的研究已经成为药物新剂型研究中非常活跃的领域。将药物包封于这些亚微粒中可以改变药物在体内的分布，增加药物在靶器官的分布量，从而提高疗效，减轻毒副作用。

在靶向给药系统中，脂质体的研究较为广泛，脂质体在体内具有良好的靶向性和生物相容性。

作为一种新型药物制剂，脂质体制剂具有以下优点：

(1)具有缓释作用：活性成分缓慢释放，延缓肾排泄和代谢，从而延长作用时间，提高质量效果；

(2)降低药物毒性；

(3)增加药物的溶解性，提高制剂质量；

(4)具有靶向性：脂质体所载的药物在肝、脾网状内皮系统脏器局部维持高浓度，从而起到药物器官靶向性作用；

(5)具有对活性药物成分的保护作用。

脂质体(Liposome)最初是由英国学者Bangham和Standlish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均未脂质的双分子层；囊泡中央和各层之间被水相隔开，双分子层厚度约为4nm。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子小囊称为脂质体。脂质体可分为多室脂质体和单室脂质体。单室脂质体又分为小单室脂质体和大单室脂质体。小单室脂质体为球形，尺寸一般为20-50纳米；大单室脂质体的尺寸为微米数量级。

1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体，主要作用机理是将药物粉末或溶液包裹在脂质体双层脂质膜所封闭的水相中或嵌入脂质体双层脂质膜中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主药被网状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性。

近年来，随着生物技术的不断进展，脂质体制备工艺逐步完善，脂质体作用机制进一步阐明，加之脂质体适合体内降解、无毒性和无免疫原性，特别是大量试验数据证明脂质体作为药物载体可以提高药物治疗指数、降低药物毒性和减少药物副作用，并减少药物剂量等优点。

专利CN101062024A公开了一种硫普罗宁组合药物及其制备方法，其由如下重量份数的原料制备而成：硫普罗宁100-300；抗氧化剂1-4；脂质体100-400；维生素C100-300；谷氨酸钠400-100。该专利提供的硫普罗宁组合药物中，脂质体包裹的硫普罗宁占硫普罗宁药物总重量的20-30％，主要是还是以未包裹的硫普罗宁的形式存在，脂质体只是该组合物的小部分，原因在于该专利应用的膜材卵磷脂或大豆磷脂不合适，所用的制备脂质体方法也不能使硫普罗宁有效包封。因此该专利没有完全克服硫普罗宁药物容易发生氧化的缺陷，也不是常规意义的脂质体制剂。

由于上述硫普罗宁注射剂的不足，目前对于硫普罗宁脂质体注射剂依然存在需求。

发明内容

本发明人经过锐意研究发现，通过选用特定重量配比的硫普罗宁、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、吐温65、PEG1000、海藻糖和谷胱甘肽，可以形成品质优异的硫普罗宁脂质体注射剂，从而完成本发明。

本发明的目的是提供一种硫普罗宁脂质体注射剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶1-1∶4。

所述冻干保护剂为海藻糖、甘露糖或葡萄糖，抗氧剂为谷胱甘肽、赖氨酸、亮氨酸或精氨酸。

本发明的目的是提供一种硫普罗宁脂质体注射剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶1-1∶4，优选1∶2-1∶3。

优选地，根据本发明的硫普罗宁脂质体注射剂由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶2-1∶3。

本发明的另一目的是提供上述硫普罗宁脂质体注射剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、PEG1000和吐温65溶于有机溶剂中，搅拌使其溶解，然后将上述溶液置于茄形瓶中，30～60℃水浴减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明薄膜；

(2)在氮气保护下，向茄形瓶中加入pH7.0～7.8的缓冲溶液，加入硫普罗宁，在40-50℃水浴常压旋转，使薄膜溶胀水合；然后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得硫普罗宁脂质体；

(3)在氮气保护下，将步骤(2)制得的硫普罗宁脂质体，用pH调节剂调节pH值至4.0～5.0，在60℃水浴10～15分钟，然后将温度降至20～30℃在不断搅拌下加入谷胱甘肽和海藻糖，并使其充分溶解，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，冷冻干燥或者快速冷冻，然后恢复到室温，定容，灌装，即得硫普罗宁脂质体注射剂。

本发明的脂质体注射剂减少了毒副作用，提高了制剂产品质量，具有良好的制剂稳定性，冷冻过程中脂质体不会因脱水、融合、冰晶等发生破裂，长期储存后，脂质体同样保持良好的包封率。

通过本发明方法制得的硫普罗宁脂质体注射剂，提高了硫普罗宁的稳定性，提高了制剂产品的质量，减少了毒副作用，增加了药物在体循环中的保留时间，提高了药物的生物利用度，疗效明显提高；并且制备方法简单，适合于工业化大生产。

附图说明

图1是实施例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂、对比例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂和市售硫普罗宁注射剂的血药浓度与时间的关系曲线，时间单位为小时，血药浓度单位为μg/ml。

具体实施方式

下通过具体实施方式本发明进行进一步说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚。

为了形成品质优良的硫普罗宁脂质体注射剂，重要的是寻找能与硫普罗宁良好相容从而将其良好包封且不渗漏的成膜材料，以及寻找能使脂质体形成稳定注射剂的赋形剂成分。

为了实现上述目的，本发明人进行的大量研究和实现，发现特定重量配比的硫普罗宁、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、吐温65、PEG1000、海藻糖和谷胱甘肽能制成硫普罗宁脂质体注射剂，其中，作为药物活性成分的硫普罗宁的包封率高，脂质体粒径小且分布均匀，与现有技术中的硫普罗宁注射剂相比，本发明制剂的药物活性成分在体循环中的保留时间显著延长，药物的生物相容性高，生物利用度明显提高，疗效明显提高。本发明克服了硫普罗宁药物容易发生氧化的缺陷，并且由于由于脂质体药物存在，减少了游离药物经肾脏的排泄，减少了药物对肾脏的毒害引起的蛋白尿的发生，减少了游离药物在肠胃道的分布量，降低了药物引起的腹泻的发生率。

一方面，本发明提供一种硫普罗宁脂质体注射剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶1-1∶4。优选为1∶2-1∶3。

优选地，根据本发明的硫普罗宁脂质体注射剂由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶2-1∶3。

作为用于形成脂质体的磷脂，可以使用天然磷脂和合成磷脂。天然磷脂包括磷脂酰乙醇胺、蛋黄卵磷脂、氢化蛋黄磷脂、蛋黄磷脂酰甘油、蛋黄磷脂酰丝氨酸、蛋黄磷脂酰肌醇、大豆卵磷脂、氢化大豆磷脂、大豆磷脂酰甘油、大豆磷脂酰丝氨酸、和大豆磷脂酰肌醇等。合成磷脂为二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二油酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二月桂酰磷脂酰甘油等。

在本发明中，作为药物活性成分的硫普罗宁，其分子量小，脂溶性差，水溶性好。针对硫普罗宁的特点，本发明人通过研究发现二硬脂酰磷脂酰胆碱特别适于作为其基础磷脂成膜材料。在大量的筛选实验时，发现当使用其他常规磷脂时，难以形成其品质优良的脂质体，所得脂质体在高温40℃、相对湿度75％±5％的加速试验下，包封率、稳定性、和渗漏率等性质较差。

二硬脂酰磷脂酰胆碱作为一种合成磷脂，其含量非常高，容易获得，价格低廉。二硬脂酰磷脂酰胆碱的相变温度较高，易于形成稳定的脂质体膜。为了改善脂质体的稳定性等性质，所用二硬脂酰磷脂酰胆碱的纯度为98％以上，优选99％以上。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，相对于1重量份的硫普罗宁而言，二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量为4-10重量份。如果二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量低于4重量份，则无法形成稳定的脂质体，包封率下降；反之，如果二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量的用量高于10重量份，则作为药物活性成分的硫普罗宁的载药量低，注射剂的品质以及疗效降低。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，胆固醇用于调节脂质体的膜稳定性。胆固醇是一种双亲性分子，与二硬脂酰磷脂酰胆碱相结合，阻止其凝聚成晶体结构。胆固醇掺入二硬脂酰磷脂酰胆碱双层，类似于“缓冲剂”一样起到调节膜结构“流动性”的作用。当低于相变温度时，胆固醇可以使膜减少有序排列，增加流动性；当高于相变温度时，胆固醇可以增加膜的有序排列，从而降低膜的流动性。胆固醇能使脂质体双分子层膜固化，从而减少自由基的生成，降低氧化水平，使脂质体稳定性显著增强。

本发明人经过研究发现，当胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱重量比为1∶1-1∶4时，能形成稳定的硫普罗宁脂质体。当胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱重量比高于1∶1时，硫普罗宁脂质体膜流动性过高，被包裹在脂质体内的硫普罗宁易于释放；当胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱重量比低于1∶4时，膜稳定性降低，硫普罗宁易于渗漏。此外，研究发现，当胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱重量比为1∶1-1∶4时，所形成的脂质体毒性低。

研究表明，脂质体的稳定性与生物利用度有密切的对应关系。稳定性越高，生物利用度越高。因此，本发明的硫普罗宁脂质体注射剂的稳定性高，是导致药物生物利用度高的因素之一。

另一方面，本发明人研究发现，在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，相对于1重量份的硫普罗宁而言，二硬脂酰磷脂酰胆碱的用量为4-10重量份，胆固醇为1-4重量份，且胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱重量比为1∶1-1∶4时，所形成的硫普罗宁脂质体注射剂的包封率高。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，使用吐温65来进一步改进脂质体膜的稳定性和药物的包封率。吐温65(聚山梨酯65)是一种非离子表面活性剂，当用于二硬脂酰磷脂酰胆碱双层膜中时，能改善硫普罗宁的溶解性，从而提高包封率，而且能提高该双层膜之间的化学能，从而提高脂质体在水性液体中的化学稳定性，进而提高硫普罗宁脂质体注射剂的稳定性。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，相对于1重量份的硫普罗宁而言，吐温65的用量为0.6-2重量份。如果吐温65的用量低于0.6重量份，则由于其用量过低导致对硫普罗宁脂质体注射剂的稳定性改进不够，反之，如果吐温65的用量高于2重量份，则用于其用量过高而导致脂质体膜易于硫普罗宁泄露。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，PEG1000用于进一步调节脂质体的膜稳定性和通透性。

不受理论限制，本发明人令人惊奇地发现，加入PEG1000可以改变硫普罗宁脂质体的药学性质，聚乙二醇1000有一定粘度和表面活性作用，可降低脂质体与胃肠道黏液之间的表面张力，促进药物进入胃肠黏膜，从而提高生物利用度和治疗效果。经研究，发明人发现PEG1000优于PEG600、PEG800或PEG2000等其他聚乙二醇。在本发明的硫普罗宁脂质体中，相对于1重量份的硫普罗宁而言，PEG1000的用量为0.5-3份，用量过低则对脂质体的稳定性、包封率和释放改进不够，其用量过高也得不到预期的优良脂质体。

研究发现，当使用上述特定量的硫普罗宁、二硬脂酰磷脂酰胆碱、胆固醇、吐温65和PEG1000时，可以得到品质优良的硫普罗宁脂质体，其包封率和稳定性都很高，毒性低，生物利用度高。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，使用冻干保护剂和抗氧剂作为赋形剂，优选使用海藻糖和谷胱甘肽作为赋形剂，用于形成稳定的注射剂。

冻干保护剂为下列一种或两种以上任意比例的组合：海藻糖、甘露糖或葡萄糖，最优选为海藻糖。

在本发明的硫普罗宁脂质体注射剂中，海藻糖能有效保护脂质体颗粒的形态和稳定性，进一步提高脂质体注射剂的稳定性。海藻糖为海藻糖是由两个葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷键构成的非还原性糖，自身性质非常稳定，它最明显的性质是在无水的条件下有保护生物膜的能力，使脂质体即使在脱水的情况下也保持形态完整。

一般而言，本发明可以使用抗氧剂作为赋形剂，合适的抗氧剂选自巯甲丙脯酸、半胱胺、麦角硫因、巯基丙酰甘氨酸、N-乙酰基半胱氨酸、S-乙酰基半胱氨酸、N，S-二乙酰基半胱氨酸、N，S-二乙酰基半胱氨酸酰胺、半胱氨酸乙酯、N-乙酰基半胱氨酸乙酯、S-乙酰基半胱氨酸乙酯、N，S-二乙酰基半胱氨酸乙酯、硫代乙醇酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽、硫代甘油、硫羟苹果酸、2-巯基丙酸、3-巯基丙酸、硫二甘醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(dithioreitol)、硫代水杨酸、硫羟乳酸、硫代丙酸、亚硫基二乙酸、硫辛酸、赖氨酸、亮氨酸或L-精氨酸。

本发明优选抗氧剂谷胱甘肽作为赋形剂。谷胱甘肽(GSH)是一种含有巯基的三肽，在水和有机溶剂中的溶解性均良好，毒性低，生理相容性良好，它具有抑制脂质过氧化的作用，使脂质体的二硬脂酰磷脂酰胆碱双层膜的稳定性增加，提高药物的包封率，并且使药物在储存中稳定。

本发明的硫普罗宁脂质体注射剂，其中单位剂量的硫普罗宁的规格可以为0.1g、0.2g或2ml:0.1g、2ml:0.2g、5ml:0.2g(注射液体积：硫普罗宁重量)。

另一方面，本发明还提供一种硫普罗宁脂质体注射剂的制备方法，具体包括如下制备步骤：

(1)将胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、PEG1000和吐温65溶于有机溶剂中，搅拌使其溶解，然后将上述溶液置于茄形瓶中，30～60℃水浴减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明薄膜；

(2)在氮气保护下，向茄形瓶中加入pH7.0～7.8的缓冲溶液，加入硫普罗宁，在40-50℃水浴常压旋转，使薄膜溶胀水合；然后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得硫普罗宁脂质体；

(3)在氮气保护下，将步骤(2)制得的硫普罗宁脂质体，用pH调节剂调节pH值至4.0～5.0，在60℃水浴10～15分钟，然后将温度降至20～30℃在不断搅拌下加入谷胱甘肽和海藻糖，并使其充分溶解，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，冷冻干燥或者快速冷冻，然后恢复到室温，定容，灌装，即得硫普罗宁脂质体注射剂。

上述所述的制备方法，其中所述的缓冲盐溶液是选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液中的一种，优选为磷酸盐缓冲溶液，最优选如药典记载的pH值为7.0～7.8的磷酸盐缓冲溶液。

上述所述的制备方法，特别适合应用高压匀质法，使脂质体高度分散以利于硫普罗宁包封不泄漏，本发明使用高压匀质法，得到均一高包封的硫普罗宁脂质体。

上述所述的制备方法(3)中，所述pH调节剂为盐酸、碳酸、乙酸、磷酸和硫酸中的一种，优选盐酸。

在本发明的方法中，还可以根据需要对脂质体和/或脂质体制剂进行灭菌。灭菌方法没有特殊要求，可以使用制药领域中常用的脂质体灭菌方法，如过滤除菌、辐射灭菌或无菌操作等。

制备脂质体的挑战在于如何使脂质体膜形成适当大小、适当结构材料的包封率高的囊泡。而且这些材料在形成脂质体时药物不漏出。

本发明人通过选择适当的材料成分、采用合适的制备工艺，获得了品质优良的硫普罗宁脂质体注射剂，脂质体粒径小，粒径分布均匀，包封率高，稳定性高。

研究发现，脂质体的大小是影响脂质体在体内分布和停留时间的主要因素，脂质体的粒径越小，体内停留时间越长。通过本发明方法制备的硫普罗宁脂质体颗粒小，粒径大小分布均匀，这是其在体内代谢率低、生物利用度高的因素之一。

实施例

以下通过具体优选的实施例对本发明进行进一步说明。这些实施例仅是说明性的，并不应理解为对本发明的限制。

实施例1硫普罗宁脂质体冻干粉针剂的制备

所用原辅料成分及其重量如下：

采用以下制备工艺制备硫普罗宁脂质体冻干粉针剂

(1)将20g胆固醇、40g二硬脂酰磷脂酰胆碱、10g PEG1000和10g吐温65溶于4000ml体积比为1∶1的二氯甲烷和异丙醇的混合溶剂中，搅拌使其溶解，然后将上述溶液置于茄形瓶中，46℃水浴减压除去二氯甲烷和异丙醇，在瓶壁上形成均匀透明薄膜；

(2)在氮气保护下，向茄形瓶中加入400ml pH值为7.0的磷酸盐缓冲溶液，加入10g硫普罗宁，在42℃水浴常压旋转，使薄膜溶胀水合；然后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得硫普罗宁脂质体；

(3)在氮气保护下，将步骤(2)制得的硫普罗宁脂质体，用HCl调节pH值至4.0，在60℃水浴10分钟，然后将温度降至20℃在不断搅拌下加入20g海藻糖和10g谷胱甘肽，并使其充分溶解，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，冷冻干燥，压盖，制得100瓶硫普罗宁脂质体冻干粉针剂。

实施例2硫普罗宁脂质体注射液的制备

所用原辅料成分及其重量如下：

采用以下制备工艺制备硫普罗宁脂质体注射液：

(1)将50g胆固醇、120g二硬脂酰磷脂酰胆碱、30g PEG1000和24g吐温65溶于10000ml体积比为1∶1的二氯甲烷和异丙醇的混合溶剂中，搅拌使其溶解，然后将上述溶液置于茄形瓶中，54℃水浴减压除去二氯甲烷和异丙醇，在瓶壁上形成均匀透明薄膜；

(2)在氮气保护下，向茄形瓶中加入450ml pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液，加入20g硫普罗宁，在46℃水浴常压旋转，使薄膜溶胀水合；然后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得硫普罗宁脂质体；

(3)在氮气保护下，将步骤(2)制得的硫普罗宁脂质体，用HCl调节pH值至4.5，在60℃水浴12分钟，然后将温度降至25℃在不断搅拌下加入80g海藻糖和30g谷胱甘肽，并使其充分溶解，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，快速冷冻，然后恢复到室温，加无菌水定容至500ml，灌装，制得100支硫普罗宁脂质体注射液。

实施例3硫普罗宁脂质体注射液的制备

所用原辅料成分及其重量如下：

采用以下制备工艺制备硫普罗宁脂质体注射液：

(1)将25g胆固醇、75g二硬脂酰磷脂酰胆碱、20g PEG1000和15g吐温65溶于6000ml体积比为1∶1的二氯甲烷和异丙醇的混合溶剂中，搅拌使其溶解，然后将上述溶液置于茄形瓶中，60℃水浴减压除去二氯甲烷和异丙醇，在瓶壁上形成均匀透明薄膜；

(2)在氮气保护下，向茄形瓶中加入450ml pH值为7.8的磷酸盐缓冲溶液，加入10g硫普罗宁，在50℃水浴常压旋转，使薄膜溶胀水合；然后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得硫普罗宁脂质体；

(3)在氮气保护下，将步骤(2)制得的硫普罗宁脂质体，用HCl调节pH值至5.0，在60℃水浴15分钟，然后将温度降至30℃在不断搅拌下加入60g海藻糖和20g谷胱甘肽，并使其充分溶解，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤，快速冷冻，然后恢复到室温，加无菌水定容至500ml，灌装，制得100支硫普罗宁脂质体注射液。

对比例1-3硫普罗宁脂质体注射剂的制备

分别采用与实施例1-3中相同的生产工艺，将如下表1中所示的对比例1-3中的原料成分分别制成对比例1-3的硫普罗宁脂质体注射剂：

表1对比例1-3中所用原料成分

其中，“/”表示未使用。

试验例1脂质体粒径的测定

室温条件下，取实施例1-3和对比例1-3中的硫普罗宁脂质体注射剂，置于Submicron Particle Sizer Model 370粒径检测仪的样品管中，测定粒径大小分布及平均粒径；用投射电子显微镜观察粒子形态。结果示于下表2中。

表2脂质体粒径检测结果

从表2可知，实施例1-3制得的固体脂质纳米粒粒径均匀，显球形，大小均一；对比例1-3制得的固体脂质纳米粒粒径不均匀，形状不定，大小不一。

具体而言，即使在采用同样的生产工艺时，实施例1-3中所得硫普罗宁脂质体的颗粒外观及其平均粒径明显优于对比例1-3中所得的硫普罗宁脂质体。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得硫普罗宁脂质体的外观劣于本发明，平均粒径明显大出很多。

试验例2包封率的测定

将实施例1-3和对比例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂以10000r/min的转速高速离心，离心5分钟，取上清液，用甲醇溶解，HPLC法测硫普罗宁含量，计算包封率，结果示于下表3中。

表3包封率测定结果

由表3可知，实施例1-3制备的脂质体制剂的包封率显著的高于对比例1-3的脂质体制剂的包封率。说明当使用本发明所用成分以外的成分时，或者当成分用量在本发明限定的成分用量范围外时，所得脂质体的脂质体包封率低于本发明。

试验例3稳定性考察

将本发明实施例1-3制备的样品和上市注射用硫普罗宁(上市制剂1，批号：20100316，上海复旦复华药业有限公司)以及上市的硫普罗宁注射液(上市制剂2，批号：20100208，江苏神龙药业有限公司)分别置于高温40℃、相对湿度75％的条件下6个月，进行加速试验考察，实验结果示于下表4中。

表4加速试验结果

由表4可知，加速6月时，上市制剂含量降低，有关物质升高；而本发明的样品性状、含量和有关物质变化均不明显，说明本发明的产品稳定性好。

试验例4渗漏率试验

取试验例1-3和对比例1-3制备的样品，在室温条件下，分别于0天、30天、60天、90天和180天，定期检查，测定包封率，与0天包封的药量比较，计算渗漏率，结果示于下表5中。

表5渗漏率试验结果

由表5可知，长期储存时，本发明实施例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂渗漏率变化不大，而对比例1-3中制备的注射剂渗漏率逐渐增大，脂质体渗漏严重，这说明本发明制备的硫普罗宁脂质体注射剂具有更高的稳定性。因此，特定重量配比的硫普罗宁、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、吐温65、PEG1000、海藻糖和谷胱甘肽能制成硫普罗宁脂质体注射剂取得了意外的令人惊奇的效果。

试验例5血药浓度的测定

将56只大鼠随机分成7组，每组分别静脉注射给药实施例1-3及对比例1-3中制备的注射剂，以及市售注射用硫普罗宁(批号：20090316，上海复旦复华药业有限公司)，注射量为20mg硫普罗宁。给药后分别于0.5h、1h、1.5h、2h、3h、6h、8h、12h和24h，采血，血样经处理后，以HPLC-MS法测定血药浓度。绘制实施例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂、对比例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂和市售硫普罗宁注射剂(上市例)的血药浓度与时间的关系曲线，示于附图1中。

由图1可知，与对比例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂和市售硫普罗宁注射剂相比，本发明实施例1-3中制备的硫普罗宁脂质体注射剂具有以下优点：在体内的消除速度减缓，在体循环中分布时间延长，达到了的缓释效果，生物利用度增加。因此，特定重量配比的硫普罗宁、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、吐温65、PEG1000、海藻糖和谷胱甘肽能制成硫普罗宁脂质体注射剂取得了意外的令人惊奇的效果。

工业实用性

由上述实施例以及实验例的结果可知，本发明的硫普罗宁脂质体具有良好的外观，颗粒小，粒径均匀，包封率高，稳定性高，渗漏率低，在体内的停留时间长，生物利用度高，具有良好的工业应用价值。

以上通过具体实施方式和实施例对本发明进行了详细说明，不过应理解，这些说明并不对本发明的范围构成任何限制，在不偏离本发明的精神和保护范围的情况下，可以对本发明的技术方案及其实施方式进行多种修饰、改进和替换，这些均因落入本发明的保护范围内。

本申请中提及或引用的各个参考文献，在此全文引入作为参考。

Claims (9)

1.一种硫普罗宁脂质体注射剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶1-1∶4，冻干保护剂为海藻糖、甘露糖或葡萄糖，抗氧剂为谷胱甘肽、赖氨酸、亮氨酸或精氨酸。

2.根据权利要求1所述的硫普罗宁脂质体注射剂，条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶2-1∶3。

3.根据权利要求1所述的硫普罗宁脂质体注射剂，其由包括以下重量配比的药物和赋形剂成分制成：

条件是胆固醇与二硬脂酰磷脂酰胆碱的重量之比为1∶2-1∶3。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的硫普罗宁脂质体注射剂，其中单位剂量的硫普罗宁的规格为0.1g、0.2g或2ml:0.1g、2ml:0.2g、5ml:0.2g(注射液体积：硫普罗宁重量)。

5.一种制备硫普罗宁脂质体注射剂的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱、PEG1000和吐温65溶于有机溶剂中，搅拌使其溶解，然后将上述溶液置于茄形瓶中，30～60℃水浴减压除去有机溶剂，在瓶壁上形成均匀透明薄膜；

(2)在氮气保护下，向茄形瓶中加入pH7.0～7.8的缓冲溶液，加入硫普罗宁，在40-50℃水浴常压旋转，使薄膜溶胀水合；然后在100bar到600bar做梯度均质4～6遍，0.22μm微孔滤膜过滤，制得硫普罗宁脂质体；

(3)在氮气保护下，将步骤(2)制得的硫普罗宁脂质体，用pH调节剂调节pH值至4.0～5.0，在60℃水浴10～15分钟，然后将温度降至20～30℃在不断搅拌下加入谷胱甘肽和海藻糖，并使其充分溶解，混匀，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，冷冻干燥或者快速冷冻，然后恢复到室温，定容，灌装，即得硫普罗宁脂质体注射剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于其中，步骤(1)中所述的有机溶剂选自乙醇、氯仿、二氯甲烷、甲醇、正丁醇、异丙醇、丙酮、苯甲醇、叔丁醇、正己烷中的一种或几种；

步骤(2)中所述的缓冲盐溶液选自磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和碳酸盐缓冲液中的一种；

步骤(3)中所述pH调节剂为盐酸、碳酸、乙酸、磷酸和硫酸中的一种。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的缓冲盐溶液为pH为7.0～7.8的磷酸盐缓冲溶液。

8.根据权利要求6-7中任一项所述的硫普罗宁脂质体注射剂的制备方法，其特征在于有机溶剂优选体积比为1∶1的二氯甲烷和异丙醇的混合溶剂。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的硫普罗宁脂质体注射剂的制备方法，其特征在于pH调节剂为盐酸。