CN102401760A - 十字型三维水力聚焦微混合装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于三维水力聚焦的微混合装置，括键合为一体的基片和盖片，基片和盖片上内表面加工有相同的微通道结构，所述微通道结构包括相连通的四通道，其中第一和第三通道作为边路入口通道，第二通道作为中间入口通道，第四通道作为出口通道，中间入口通道与出口通道在同一直线上，两边路入口通道关于中间入口通道对称，中间入口通道的高度低于另外三个通道，出口通道的截面为十字型。本发明还提供了该装置的加工方法。本发明实现样品带在XY方向被聚焦成亚微米水平，在YZ方向聚焦成微米水平，整个装置结构简单，加工简易，三维聚焦效果好。

Description

十字型三维水力聚焦微混合装置
技术领域
本发明涉及一种基于三维水力聚焦的微混合装置，能将样品溶液在三维角度聚焦成微米束，实现溶液的快速混合，广泛用于生物大分子的动力学研究领域。
背景技术
微流控芯片实验室又称微流控芯片(microfluidics)或芯片实验室(lab-on-a-chip)，指的是在一块几平方厘米的芯片上构建的化学或生物实验室。这种分析系统尺寸微小，可以集成进样、预处理、混合、反应、检测等操作单元，从而让分析时间大幅缩短，检测分辨率/灵敏度显著提高，同时消耗及成本也大幅降低。现阶段，微流控芯片已经涉及到的领域包括疾病诊断、药物筛选、环境检测、食品安全、司法鉴定、体育竞技以及反恐、航天等事关人类生存质量的方方面面。
快速而有效的混合是化学或生物化学分析的前提。生化反应，如RNA或蛋白质的折叠过程通常发生在亚毫秒级别，若研究此类反应必须在微秒级时间内启动它们。微混合器作为微流控芯片中一个重要组成部分，由于其能使溶液实现快速混合且所耗样品在纳升级，因此已经成为研究快速生化反应的一个有效工具。
由于微通道中雷诺数一般较低(＜2300)，难于引起湍流，溶液的混合一般都基于扩散。根据扩散理论，扩散时间T＝L2/D，其中L为通道的宽度，D为溶液的扩散系数。为达到1μs的混合时间，则样品带需被夹挤成30nm。为实现溶液的快速混合，Brody等人(Brody，J.P.and Yager，P.(1996)Biotechnology at lowReynolds numbers，Biophys.J.，71，3430-3441)最早设计出基于水力聚焦的微装置，使样品带溶液聚焦成～0.1μm，混合时间为～10μs。其后又有大量科研学者将水力聚焦混合器装置进行改进，使得混合时间缩短至～1μs(Yao，S.andBakajin，O.(2007)Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in DevicesDesigned for Studies of Protein Folding Kinetics.Anal.Chem.79，5753-5759))。该基于水力聚焦的微流控芯片是目前已报道的混合器中混合时间最短的微装置，但其样品带只是从二维角度(XY平面)进行挤压聚焦，在Z轴方向仍然没有实现聚焦，即实现的是二维水力聚焦(2D hydrodynamic focusing)。二维水力聚焦的不足之处在于，样品带的流速在Z轴方向并不均一，靠近通道壁的流速接近为零，远小于Z轴中间面的流速，这种情况非常不利于对样品进行真实的分析(如分析蛋白质等大分子在折叠过程中其折叠态随时间的变化)。为解决二维水力聚焦所存在的问题，有人提出三维水力聚焦(3D hydrodynamic focusing)的概念。Pabit等人在2002年较早设计了一种三维水力聚焦装置(Pabit，S.and Hagen，S.(2002)Laminar-Flow Fluid Mixer for Fast Fluorescence Kinetics Studies，Biophys.J.，83，2872-2878)，即将直径大小不同的两毛管对接实现三维聚焦，但这种对接操作困难，且由于对样品带的侧向夹流有限难以将样品带聚焦成纳米级条带。Gambin等人在2010年报道了一种用聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料加工的三维水力聚焦微芯片(Gambin，Y.and Simonnet，C.(2010)Ultrafast microfluidic mixerwith three-dimensional flow focusing for studies of biochemical kinetics，Lab Chip，10，598-609)，其混合时间为～10μs。但是该装置通道结构复杂，仅入口数量就有五个之多，给进样过程带来诸多麻烦，且会影响到实验过程中聚焦样品带的稳定性。
发明内容
本发明的目的是克服现有三维水力聚焦微装置结构复杂，加工难度大且实验操作过程繁琐的缺点，提供一种结构简单，加工简易，三维聚焦效果好的十字型微混合装置。
本发明的另一目的是提供上述微混合装置的加工方法。
一种三维聚焦微混合装置，包括键合为一体的基片和盖片，基片和盖片上内表面加工有相同的微通道结构，其特征在于，所述微通道结构包括相连通的四通道，其中第一和第三通道作为边路入口通道，第二通道作为中间入口通道，第四通道作为出口通道，中间入口通道与出口通道在同一直线上，两边路入口通道关于中间入口通道对称，中间入口通道的高度低于另外三个通道，出口通道的截面为十字型。
进一步地，所述中间入口通道与边路入口通道的夹角小于90度。
进一步地，所述两边路入口通道靠近通道交叉处的部分截面呈十字型。
所述的三维聚焦微混合装置的加工方法，包括：
双层阳模加工步骤：在硅片上同一位置处先后软光刻两层微通道结构，其中第一层微通道结构包括两边路入口通道、中间入口通道和出口通道，第二层微通道结构包括两入口通道和出口通道，第二层微通道结构的出口通道宽度小于第一层结构的出口通道宽度；
基片和盖片加工步骤：利用所述双层阳模分别加工PDMS基片和PDMS盖片；
基片与盖片键合步骤：将基片与盖片的微通道结构相对进行键合。
进一步地，在双层阳模上匀上一层液态PDMS，再将盖玻片贴于液态PDMS表面固化。
进一步地，第二层微通道结构的两边路入口通道靠近通道交叉处的部分宽度小于第一层通道对应位置的宽度。
本发明提出了一种形成三维水力聚焦效果的微混合装置。先加工出通道高度不一样的双层阳模结构，其第一层通道宽度大于与之位置对应的第二层通道宽度；其后将具有相同微通道结构的PDMS基片与盖片键合，从而得到边路入口通道高度和中间入口通道高度不同且出口通道截面为十字型的三维结构，可以实现边路入口样品对中间入口样品的三维包裹，即形成三维聚焦。该装置能实现样品带在XY方向被聚焦成亚微米水平，在YZ方向聚焦成微米水平。装置结构简单，加工简易，三维聚焦效果好，在研究生物大分子折叠动力学领域具有广泛的应用前景，并为溶液的三维聚焦提供了一种新的途径。
附图说明
图1两层通道结构尺寸示意图，1(a)为第一层通道结构示意图，1(b)为第二层通道结构示意图，1(c)双层层通道平面结构示意图。
图2双层通道结构示意图，2(a)为双层通道立体结构示意图，2(b)为2(a)中L所指出口通道的“倒T型”截面示意图，2(c)为基片与盖片键合后其出口通道的“十字型”截面示意图。
图3基片PDMS微通道加工示意图。
图4水力聚焦微混合器夹流效果示意图，4(a)三维水力聚焦混合器XY平面上的夹流效果图，4(b)不同夹流比下常规二维水力聚焦混合器的重建纵切面聚焦效果图，4(c)不同夹流比下三维水力聚焦混合器的重建纵切面聚焦效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明作进一步的详细说明。
一种三维聚焦微混合装置，包括键合为一体的基片和盖片，基片和盖片内表面加工有相同的微通道结构。如图3所示，所述微通道结构包括相连通的四通道，其中第一和第三通道1，3作为边路入口通道，第二通道2作为中间入口通道，第四通道4作为出口通道，中间入口通道与出口通道在同一直线上，两边路入口通道关于中间入口通道对称，中间入口通道的高度低于另外三个通道。出口通道的截面为十字型。
所述中间入口通道与边路入口通道的夹角小于90度。
上述三维聚焦微混合装置的加工方法，包括：
双层阳模加工步骤：在硅片上同一位置处先后软光刻两层微通道结构，其中第一层微通道结构包括两边路入口通道、中间入口通道和出口通道，第二层微通道结构包括两边路入口通道和出口通道。第二层微通道结构中，两边路入口通道靠近通道交叉处的部分宽度小于第一层通道对应位置，出口通道宽度小于第一层微通道结构中的出口通道。两层通道宽度不一致，可以较好地改善靠近通道上下表面溶液速度接近为零的问题，从而能形成更好的三维聚焦效果。
基片和盖片加工步骤：利用所述双层阳模分别加工PDMS基片和PDMS盖片。
基片与盖片键合步骤：将基片与盖片的微通道结构相对进行键合。
所述基片加工步骤具体为：在双层阳模上匀上一层液态PDMS，再将盖玻片贴于液态PDMS表面进行固化。
下面给出一个实例的加工过程，具体为：
1.第一层SU-8阳模加工。先将SU-8甩于洗净烘干的硅片上(700r 18s，4500r60s)，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min，95℃40min)，进行第一次光刻(40s，3.5mJ/cm2)，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min，95℃40min)，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃120min)，即可得得到第一层阳模(高度为15μm)，其通道结构示意图见图1a，两边路入口通道与中间入口通道的夹角为45度，其中A.边路通道入口孔，半径为40μm；B.边路入口通道，宽为60μm；C.中间通道入口孔，半径为40μm；D.中间入口通道，宽为30μm；E.出口通道，宽为60μm；F.出口孔，半径为40μm。
2.第二层SU-8阳模加工。得到第一层SU-8阳模结构后，在其上再进行第二次匀胶(700r 18s，1500r 60s)、前烘(65℃15min，95℃120min)、光刻(330s，1mJ/cm2)。经过对准并曝光后，再进行后烘、显影、坚模，即得到总高度为45μm的双层阳模。第二层阳模通道具体结构及尺寸见图1b，G.边路通道入口孔，半径为40μm；H.边路入口大通道，宽为60μm；I.边路入口小通道，宽为30μm，J.出口通道，宽为30μm；K.出口孔，半径为40μm。双层阳模结构的平面图见图1c，粗线条表示经第二次曝光后第一层和第二层通道重叠部分；图2(a)为双层阳模的立体结构示意图，图2(b)为图2(a)中L所指截面示意图，呈倒T型，其中W为第一层通道宽度(60μm)，X为第一层通道高度(15μm)，Y为第二层通道宽度(30μm)，Z为第二层通道高度(30μm)，即双层通道总高度为45μm。
第二次光刻在德国Karl-Suss MA6型光刻机上进行，其光刻具体操作过程为，先在显微镜下将掩膜上目标位置移至视野中央，然后卸载掩膜，将甩了第二次SU-8胶的硅片至于载物托盘上，将硅片上目标位置移至视野中央，使其与之前掩膜上的目标处在大致相同的位置。然后将掩膜重新装上仪器，设定掩膜与硅片间的间隔(gap)为10μm，使托盘抬起，让掩膜与硅片靠近。经过显微镜聚焦后，通过前后、左右及旋转调节杆让掩膜上的目标与硅片上的目标达到精确对准，即可进行曝光。
3.含有微通道的PDMS盖片与基片制作。盖片采用快速成型方法将微通道复制到PDMS层上。即将PDMS与其固化剂按10∶1混匀并除气得到前聚体，将PDMS前聚体倒于阳模上，热平板上65度固化4小时，将固化后的PDMS揭起、切边并用外径为0.7mm的不锈钢针管打上孔，此法得到的PDMS作为盖片。基片的加工略有不同(见图3)。其加工方法为：将硅片(图3中N所指为硅片)上的阳模(图3中M所指为阳模)表面用三甲基氯硅烷蒸汽进行处理之后(该试剂可减小硅片和PDMS之间的吸附)，倒2gPDMS(图3中P所指为PDMS)前聚体于阳模之上，在匀浆机上铺平甩薄(700r18s)，将洗净的盖玻片(图3中Q所指为盖玻片)用等离子体清洗器处理(电压800v，氧气量600-800mL/min，2min)，然后用镊子将盖玻片被处理过的一面小心贴于PDMS上，用镊子轻压盖玻片以排除产生的气泡并让盖玻片尽量与硅片上的阳模靠近，之后至于热平板上固化(100℃1h)。固化完成后，用钻石刃口刀片将盖玻片和PDMS薄层一起小心剥起(剥离过程中可滴加乙醇于PDMS和硅片之间减小表面吸附力)。此法得到的PDMS薄层，其上有通道，且与盖玻片紧贴在一起，被用作该装置的基片。
4.基片与盖片键合。得到基片与盖片后，将之一起至于等离子体清洗器中处理(电压800v，氧气量600-800mL/min，2min)，让有通道的一面朝上。取出处理后的基片与盖片，将基片至于一次性培养皿中(等离子体处理过的表面朝上)，在盖片被处理表面滴加几滴超纯水，在立式显微镜下进行精确对准。之后，将对准的基片和盖片至于真空烘箱中，抽真空至-0.9个大气压，65℃120min加热后取出即得到键合好的芯片。芯片上的微结构其出口通道截面示意图如图2(c)所示，呈“十字型”结构。在键合得到的芯片上再插上连有聚四氟乙烯管的不锈钢针管用于将外界溶液引入芯片之中。至此，三维水力聚焦微混合装置得以制作完成。
三维水力聚焦微混合装置完成后，我们先用荧光素标记的多糖分子(分子量为10,000Da)作为样品，采用微量注射泵从混合器中间入口通道通入，两边路入口通道所通溶液为超纯水，改变边路入口通道与中间入口通道的流速比，以共聚焦显微成像系统(FV1000，Olympus，Japan)对通道Z轴方向上不同层面荧光进行图像采集。图4(a)为三维水力聚焦混合器在V边路∶V中间路∶V边路＝0.06∶0.001∶0.06(单位mL/min)时，XY平面上的夹流效果图，中间样品带的聚焦宽度为～400nm。作为对照，我们同时也在常规的三路水力聚焦混合器(二维聚焦)上进行了此实验。在不同的流量比下(V边路∶V中间路，单位mL/min)，将不同层面采集到的荧光图像用Matlab软件进行纵截面重建，其重建效果图见图4b，可见常规的三路水力聚焦混合器只能实现二维的聚焦，其重建纵截面荧光分布类似凹透镜；而本发明所设计的三维水力聚焦混合器其重建纵截面荧光分布(图4c)类似一个小椭圆，即样品带主要分布在通道正中央，实现了三维聚焦，其在XY平面样品带被聚焦的宽度约为400nm(图4a)，YZ平面样品带宽度为5～10μm(通道在YZ平面的总高度为～90μm)。

Claims (6)

1.一种三维聚焦微混合装置，包括键合为一体的基片和盖片，基片和盖片上内表面加工有相同的微通道结构，其特征在于，所述微通道结构包括相连通的四通道，其中第一和第三通道作为边路入口通道，第二通道作为中间入口通道，第四通道作为出口通道，中间入口通道与出口通道在同一直线上，两边路入口通道关于中间入口通道对称，中间入口通道的高度低于另外三通道，出口通道的截面为十字型。
2.根据权利要求1所述的三维聚焦微混合装置，其特征在于，所述中间入口通道与边路入口通道的夹角小于90度。
3.根据权利要求1所述的三维聚焦微混合装置，其特征在于，所述两边路入口通道靠近通道交叉处的部分截面呈十字型。
4.权利要求1所述的三维聚焦微混合装置的加工方法，包括：
双层阳模加工步骤：在硅片上同一位置处先后软光刻两层微通道结构，其中第一层微通道结构包括两边路入口通道、中间入口通道和出口通道，第二层微通道结构包括两入口通道和出口通道，第二层微通道结构的出口通道宽度小于第一层结构的出口通道宽度；
基片和盖片加工步骤：利用所述双层阳模分别加工PDMS基片和PDMS盖片；
基片与盖片键合步骤：将基片与盖片的微通道结构相对进行键合。
5.根据权利要求4所述的加工方法，其特征在于，所述基片加工步骤具体为：在双层阳模上匀上一层液态PDMS，再将盖玻片贴于液态PDMS表面，固化将二者一起揭起即得到基片。
6.根据权利要求4所述的加工方法，其特征在于，所述双层阳模加工步骤中，第二层微通道结构的两边路入口通道靠近通道交叉处的部分宽度小于第一层通道对应位置的宽度。
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