CN102580594B - 双水力聚焦微混合装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双水力聚焦的微混合装置，包括底片和键合在其上的PDMS层，PDMS层上加工有相连通的四个入口通道和出口通道，其中第一、第四入口通道和出口通道呈Y型，第二、第三入口通道与出口通道平行且关于出口通道对称，第一、第二入口通道相邻且通道夹角小于90度，第三、第四入口通道相邻且通道夹角小于90度，第一与第二入口通道的液体交汇，第三与第四入口通道的液体交汇，两交汇液体再汇聚流入出口通道。本发明能实现两种大分子的快速混合，整个装置结构简单，加工简易，样品损耗量小，可用于生物大分子间相互作用的动力学研究。
Description
技术领域
本发明涉及一种双水力聚焦微混合装置，能让两种目标样品溶液间的扩散距离缩小至纳米水平从而实现快速混合，可广泛用于生物大分子间相互作用的动力学检测。
背景技术
微流控芯片(Microfluidic chip)或称“芯片实验室(Lab-on-a-chip)是在上世纪90年代初由A.Manz等人提出的微全分析系统的基础上发展起来的新概念平台技术。该技术以微型化、集成化、自动化和高通量作为其特色，强调将化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米的芯片上，从而让分析时间大幅缩短，检测分辨率/灵敏度显著提高，同时消耗及成本也大幅降低。芯片实验室的诞生是一个巨大的理念创新，目前它已经涉及到关乎人类生存质量的各个领域，如疾病诊断、食品安全、环境监测甚至反恐、航天等。
微流体领域的快速混合一直是一个非常重要的课题，微混合器作为微流控芯片中一个主要组成部分，被认为是研究快速生化反应(如蛋白质或核酸的折叠动力学过程)的一个有效工具。然而，在微通道中，雷诺数很小(＜2300)，流体以层流的方式流动，混合主要依赖于分子间的扩散，所以微流体的快速混合一直以来是一个具大的挑战。根据扩散理论，扩散时间T＝L2/D，其中L为通道的宽度，D为溶液的扩散系数。为达到1μs的混合时间，则样品带需被夹挤成30nm。为实现溶液的快速混合，Brody等人(Brody，J.P.and Yager，P.(1996)Biotechnology at low Reynolds numbers，Biophys.J.，71，3430-3441)最早设计出基于水力聚焦的微装置，使样品带溶液聚焦约为0.1μm，混合时间约为10μs。其后，又有许多学者对水力聚焦混合器装置进行改进，使得混合时间大幅缩短至1μs(Yao，S.andBakajin，O.(2007)Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformityin Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics，Anal.Chem.，79，5753-5759)。该基于水力聚焦的微流控芯片是目前已报道的混合器中混合时间最短的微装置，但其只能实现一种样品带的聚焦，它的快速混合只局限于缓冲液中的小分子扩散至中间样品带(一般是一种大分子样品)，是一种单水力聚焦微混合装置，它只能实现小分子与大分子间的快速混合，若要实现两种大分子(如蛋白质与蛋白质)的快速混合，则该装置所需的混合时间将大大延长(因为大分子的扩散系数一般仅为小分子的十分之一)且其带来的样品损耗将会成倍增加。
蛋白质与蛋白质间的相互作用是影响细胞生理活动的重要过程，研究此过程使人们对生物调控机制的认识取得了巨大的进展(Drewes，G.，Bouwmeester，T.(2003)Global approaches to protein-proteininteractions，Curr.Opin.Cell Biol.，15，199-205.)。为对蛋白质间相互作用的动力学进行检测，必然会涉及到两种大分子的快速混合，而目前的单水力聚焦微混合装置难以满足此要求。
发明内容
本发明的目的是克服现有单水力聚焦微装置难以实现两种大分子的快速混合，提供一种结构简单，加工简易，样品消耗量少且能实现两种大分子快速混合的双水力聚焦微混合装置。
一种双水力聚焦微混合装置，包括底片和键合在其上的PDMS层，其特征在于，PDMS层上加工有相连通的四个入口通道和一个出口通道，其中第一、第四入口通道和出口通道呈Y型，第二、第三入口通道与出口通道平行且关于出口通道对称，第一、第二入口通道相邻且通道夹角小于90度，第三、第四入口通道相邻且通道夹角小于90度，第一与第二入口通道的液体交汇，第三与第四入口通道的液体交汇，两交汇液体再汇聚流入出口通道。
本发明的技术效果体现在：
本发明提出了一种能实现两种大分子快速混合的双水力聚焦微混合装置，通过两边路缓冲液及微通道边壁的辅助对中间两样品带进行夹挤，实现中间两样品带纳米水平的聚焦。由于两种大分子样品带的宽度都被挤压到纳米水平(即上述公式中的扩散距离L为纳米水平)，使得二者实现混合的时间(即上述公式中的混合时间T)大幅缩短，从而能用于监测大分子间反应的快速动力学过程。该装置在生物大分子间相互作用的动力学过程检测领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为不同水力聚焦微混合装置的微通道结构图，图1(a)为单水力聚焦微通道结构示意图，图1(b)为双水力聚焦微通道结构示意图。
图2为双水力聚焦微混合装置荧光染料表征图，图2(a)～2(f)为夹流比V边路∶V中间依次为为30∶5，30∶3，30∶1，40∶1，50∶1，70∶1的效果示意图。
图3双水力聚焦微混合器上化学发光实验示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实例对本发明作进一步的详细说明。
一种三维聚焦微混合装置，包括含有微通道的聚二甲基硅氧烷(PDMS)层与作为底片的盖玻片。如图1b所示，所述微通道结构包括相连通的五通道，其中第一和第四通道1，4作为边路入口通道，第二和第三通道2，3作为中间入口通道，第五通道5作为出口通道，第一、第四和第五通道1、4和5呈Y型，两中间入口通道与出口通道平行且关于出口通道对称，两边路入口通道关于出口通道对称。中间入口通道与边路入口通道的夹角小于90度。
中间入口通道作为要混合的大分子液体的流入通道，边路入口通道作为辅助混合的液体流入通道。
上述双水力聚焦微混合装置的加工步骤包括具有微通道结构的SU-8阳模的加工、微通道结构复制到PDMS层及PDMS层与盖玻片的键合。
下面给出一个实例的加工过程，具体为：
1.SU-8阳模的加工。先将负光刻胶SU-8甩于洗净烘干的硅片上(700r 18s，2100r 60s)，前烘除去SU-8胶中的溶剂之后(65℃15min，95℃40min)，进行光刻(70s，3.5mJ/cm2)，然后置于热平板上进行后烘(65℃15min，95℃40min)，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃120min)，即可得到具有微通道结构的阳模，其通道结构示意图见图1b，其中1，4为边路入口通道，宽为50μm；2，3为中间入口通道，宽为30μm；两边路入口通道与两中间入口通道的夹角均为45度；5为出口通道，宽为40μm；6，9为边路通道入口孔，半径为40μm；7，8为中间路通道入口孔，半径为40μm；10为出口孔，半径为40μm。
2.微通道结构复制到PDMS层。采用快速成型方法将微通道复制到PDMS层。即将PDMS与其固化剂按10∶1混匀后置于真空干燥器中，用真空泵除气得到前聚体，将PDMS前聚体倒于阳模上，烘箱中65度固化4小时，将固化后的PDMS揭起、切边并用外径为0.7mm的不锈钢针管打上孔即得到含有微通道的PDMS层。
3.PDMS层与盖玻片键合。得到含有微通道的PDMS层后，将之与洗净的盖玻片一起至于等离子体清洗器中处理(电压800v，氧气量600-800mL/min，2min)，让PDMS层有通道的一面朝上。取出处理后的PDMS层与盖玻片将之键合在一起(等离子体处理过的两表面相对)并至于真空烘箱中，65℃120min加热。取出键合好的微芯片，再插上连有聚四氟乙烯管的不锈钢针管用于将外界溶液引入芯片之中。至此，双水力聚焦微混合装置得以制作完成。
双水力聚焦微混合装置完成后，本发明先用荧光素与磺酰罗丹明B作为样品，采用微量注射泵将二者从混合器两中间入口通道分别通入，两边路入口通道所通溶液为超纯水，改变边路入口通道与中间入口通道的流量比，以共聚焦显微成像系统(FV1000，Olympus，Japan)对中间两荧光染料进行图像采集。图2为双水力聚焦混合器在不同流量比下的夹流效果图。在夹流比V边路∶V中间路为70∶1时，中间样品带的聚焦宽度为～400nm。
其后，本发明又采用三种大分子体系对双水力聚焦微混合器进行了评价，分别为：单链DNA-单链DNA结合蛋白体系、DNA-DNA互补链体系及luminol(鲁米诺)-HRP(辣根过氧化物酶)化学发光体系。下面以luminol-HRP化学发光体系作为示例进行简单描述。用微量注射泵将发光剂(即S1，包括鲁米诺，双氧水，对碘苯酚)与不同浓度HRP(S2)分别从混合器两中间入口通道通入，而pH为11.0的0.1M碳酸缓冲液(B1，B2)从两边路入口通道通入。边路通道和中间通道的流量比为50∶1(单位为μl/min)，将不同浓度下的表观反应动力学参数对HRP浓度作图(图3b)，得到其反应动力学常数为1.13144×109M-1·S-1(γ＝0.995)。
本发明应用不局限于生物大分子液体的混合，一般的小分子液体之间、大分子与小分子液体之间的混合均可实现。
Claims (2)
1.一种双水力聚焦微混合装置，包括底片和键合在其上的PDMS层，其特征在于，PDMS层上加工有相连通的四个入口通道和一个出口通道，其中第一、第四入口通道和出口通道呈Y型，第二、第三入口通道与出口通道平行且关于出口通道对称，第一、第二入口通道相邻且通道夹角小于90度，第三、第四入口通道相邻且通道夹角小于90度，第一与第二入口通道的液体交汇，第三与第四入口通道的液体交汇，两交汇液体再汇聚流入出口通道；第一和第四入口通道作为边路入口通道，第二和第三入口通道作为中间入口通道，中间入口通道作为要混合的大分子液体的流入通道，边路入口通道作为辅助混合的液体流入通道；通过两边路入口通道的缓冲液及微通道边壁的辅助对中间两样品带夹挤到纳米水平，实现中间两样品带纳米水平的聚焦。
2.一种如权利要求1所述双水力聚焦微混合装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)SU-8阳模的加工：先将负光刻胶SU-8甩于洗净烘干的硅片上，700r 18s或2100r 60s，前烘65℃15min或95℃40min除去SU-8胶中的溶剂之后，进行光刻70s,3.5mJ/cm2，然后置于热平板上进行后烘65℃15min或95℃40min，之后经显影液显影后，再进行坚膜(135℃120min，即可得到具有微通道结构的阳模；
(2)微通道结构复制到PDMS层：将PDMS与其固化剂按10:1混匀后置于真空干燥器中，用真空泵除气得到前聚体，将PDMS前聚体倒于阳模上，烘箱中65度固化4小时，将固化后的PDMS揭起、切边并用外径为0.7mm的不锈钢针管打上孔即得到含有微通道的PDMS层；
(3)PDMS层与盖玻片键合：得到含有微通道的PDMS层后，将之与洗净的盖玻片一起至于等离子体清洗器中处理，电压800v，氧气量600–800mL/min,2min，让PDMS层有通道的一面朝上；取出处理后的PDMS层与盖玻片将之键合在一起，等离子体处理过的两表面相对，并至于真空烘箱中，65℃120min加热；取出键合好的微芯片，再插上连有聚四氟乙烯管的不锈钢针管用于将外界溶液引入芯片之中；至此，双水力聚焦微混合装置得以制作完成。
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