CN102395380A

CN102395380A - 预靶向试剂盒、方法和其中使用的试剂

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Publication number: CN102395380A
Application number: CN2010800170074A
Authority: CN
Inventors: M.S.罗比拉尔德; R.罗辛; J.卢布; P.雷纳特弗柯克; D.伯丁斯基
Original assignee: Koninklijke Philips Electronics NV
Current assignee: Tek Wolcos Pharmaceutical Co ltd; Koninklijke Philips NV
Priority date: 2009-04-16
Filing date: 2010-04-12
Publication date: 2012-03-28
Anticipated expiration: 2030-04-12
Also published as: BRPI1006246A2; WO2010119389A2; EP2419142B1; EP2419142A2; ES2769538T3; RU2539915C2; DK2419142T3; CN102395380B; US20120034161A1; RU2011146322A; WO2010119389A3

Abstract

描述了用于靶向医学成像和/或治疗的预靶向方法和相关的试剂盒，其中使用彼此显示出生物正交反应性的非生物反应性化学基团。对于提供预靶向探针和效应物探针之间的耦合，本发明涉及[4+2]逆电子需求（逆）Diels-Alder化学的利用。为了该目的，这些探针之一包含缺电子四嗪或其它适合的二烯，并且另一个是环辛烯或环辛炔。

Description

预靶向试剂盒、方法和其中使用的试剂

技术领域

本发明涉及用于靶向的医学成像和/或治疗的预靶向方法（pretargeting method），其中使用彼此显示出生物正交（bio-orthogonal）反应性的非生物(abiotic)反应性化学基团。本发明还涉及含有至少一种预靶向探针(pre-targeting probe)和至少一种效应物探针(effector probe)的预靶向试剂盒(kit)，其中所述预靶向探针包含主要靶向部分和第一生物正交反应性基团，和其中所述效应物探针包含效应物部分，例如标记物或药学活性化合物，和第二生物正交反应性基团。本发明还涉及在上述方法和试剂盒中使用的预靶向试剂。本发明特别地涉及核成像和放射疗法。

背景技术

在医学诊断和治疗的许多领域，希望选择性地将试剂，例如治疗剂（药物）或诊断（例如成像）剂递送到受试者(subject)例如病人体内的特定位点或有限区域。

器官或组织的活性靶向通过所希望的活性部分（例如对比增强剂或细胞毒素化合物）对靶向结构的直接或间接结合实现，其与细胞表面结合或促进在感兴趣的靶位点处的细胞摄入。用于靶向此类试剂的靶向部分典型地是对细胞表面靶（例如膜受体）、结构蛋白（例如淀粉样斑）或细胞内靶（例如RNA、DNA、酶、细胞信号通路）具有亲和性的结构。这些部分可以是抗体（片段）、蛋白质、适体（aptamers）、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽、拟肽（peptoids）和已知在特定疾病或障碍处积累的有机药物化合物。作为选择，对比/治疗剂可以靶向代谢途径，其在疾病（例如感染或癌症）期间表达升高，例如DNA、蛋白质和膜合成和碳水化合物摄入。在患病组织中，上述标志物可以将患病细胞从健康组织区分并提供早期检测、特异诊断和（靶向的）治疗的独特可能性。

通常对于成功的分子成像/治疗剂和特别对于核成像/治疗剂一个重要标准是它们呈现高靶摄取，同时显示出从非靶组织和从血液的快速清除（通过肾脏和/或肝胆体系）。但是，这经常存在问题：例如，人中的成像研究已经显示，在肿瘤位置处经放射标记的抗体在24小时内可达到最大浓度，但需要另外几天在循环体系中的所述经标记的抗体的浓度才下降到低至足以发生成功成像的水平。

在靶组织中的缓慢或不充分积累以及从非靶区域缓慢清除所带来的这些问题（特别是对于核成像和治疗）已经导致预靶向方法的应用。

预靶向是指在靶向方法中的步骤，其中向主要靶（例如细胞表面）提供预靶向探针。后者包括次要靶，其最后将通过装备有次级靶向部分的进一步的探针（所述效应物探针）进行靶向。

这样，在预靶向中，将预靶向探针结合到主要靶。所述预靶向探针还携带次级靶，其促进对诊断（成像）和/或治疗剂，所述效应物探针，的特异性结合。在形成所述预靶向探针的结构已经定位在靶位点处之后（花费时间例如24小时），如果自然清除不充分，则可以使用清除剂从血液除去过量的部分。在第二培育步骤（优选采取较短的时间，例如1-6小时）中，所述效应物探针通过它的次级靶向部分结合到所述（预）结合的预靶向探针。所述次级靶（存在于所述预靶向探针上）和所述次级靶向部分（存在于所述效应物探针上）应该以高特异性和高亲和性快速结合，并且在体内应该是稳定的。

对于成像预靶向的一般概念在图1中绘出。在这里，所述效应物探针是包含用于成像模式的可检测标记物的成像探针。所述效应物探针通过其次级靶向基团结合到所述（预）结合的预靶向探针。

次级靶/次级靶向部分对的一般例子是生物素/抗生蛋白链菌素或抗体/抗原体系。为了有效，所述效应物探针必需快速从体内排出（例如通过肾脏）以提供所希望的具有相对低的非靶积累的高肿瘤积累。因此，这些探针通常很小。

在核成像和放射疗法中，预靶向的概念具有进一步的益处，因为花费时间的预靶向步骤可以不必使用放射性核素实施，而使用放射性核素的次级靶向步骤能够更快地实施。后者使得能够使用较短寿命的放射性核素，具有将对病人的放射剂量最小化的优点，例如使用PET试剂代替SPECT试剂。此外，通常该方法有利于通用对比剂的使用。

通常在生物学中（如抗体-抗原）和特别在预靶向中（生物素-抗生蛋白链菌素、抗体/半抗原、反义寡核苷酸）实施高度选择性相互作用的实体非常大。因此，使用肽和小有机部分作为主要靶向基团的预靶向，以及代谢成像和细胞内靶成像，由于次级靶的尺寸使得小主要基团的使用毫无意义而仍然无法实现。

而且，现有的预靶向体系被与它们的生物特性相关的因素所限制。生物素是内源分子，并且它的缀合物(conjugates)能够通过血清酶生物素酶断开。当使用反义预靶向时，所述寡核苷酸会受到RNAse和DNAse的攻击。蛋白质和肽也经历自然分解途径。这些相互作用可被它们的非共价和动态特性以及有限的靶上驻留时间进一步削弱。因此，预靶向中加入两种组分之间的时间是有限的，这可能导致并非最优的靶对非靶比。而且，内源性生物素与生物素缀合物竞争抗生蛋白链菌素结合。最后，抗生蛋白链菌素是高度免疫原性的。

近来的一个发展是避免与仅基于天然/生物靶向结构（即生物素/抗生蛋白链菌素、抗体/半抗原、反义寡核苷酸）的预靶向相关的缺点。

在这方面，可以参考作为用于靶向的医学成像和/或治疗的预靶向方法公开的WO 2006/038185，其中利用了对彼此显示出生物正交反应性的非生物反应性化学基团。在该参考文献中，生物正交反应基团是施陶丁格连接反应（Staudinger ligation）中的反应参与者，即叠氮化物和膦。所描述的在预靶向中作为耦合化学选择施陶丁格连接反应导致了可利用这样的反应性参与者：其是非生物的，在生理条件下形成稳定的加合物，以及仅彼此识别，同时忽略它们的细胞/生理环境（即它们是生物正交性的）。

在预靶向方法中，关于利用对彼此显示出生物正交反应性的非生物反应性化学基团的另一参考文献是WO 2007/039858。在这里，所述生物正交反应性基团是[3+2]叠氮化物-炔环加成中的反应参与者。

Neal K. Devaraj、Ralph Weissleder和Scott Hilderbrand在Bioconjugate Chem. 2008，19，2297-2299中描述了另一类型的耦合化学。这涉及到生物正交四嗪环加成对活细胞标记的应用。在这里，反应参与者是3-(对苄基氨基)-1,2,4,5-四嗪和降冰片烯，即（1S,2S,4S）-双环[2,2,1]庚-5-烯-2-基乙酸，其经历Diels-Alder环加成接着经历逆Diels-Alder反应，其中释放双氮（N₂）。这种耦合化学也称为逆电子需求(inverse electron-demond)Diels-Alder反应。提及的是通过用降冰片烯标记的单克隆抗体曲妥珠单抗（赫塞汀）预靶向人乳腺癌SKBR3细胞，接着用与近IR荧光探针VT680连接的四嗪标记所述细胞。

尽管有用，但上述类型的耦合化学仍在经历进一步的改进。尤其是需要相对高的反应物浓度的情况。特别地，这意味着为了充分地与预靶向探针结合，所述效应物探针需要相对长的循环时间和/或高浓度。希望能够降低所必需的效应物探针的浓度，同时保持上述生物正交预靶向方法的益处。

此外，特别地当涉及核成像和放射疗法中应用时，希望存在快速和有效的生物正交耦合化学。

发明内容

为了更好地满足上述愿望，本发明一方面提供了用于靶向的医学成像和/或治疗的试剂盒，其包含至少一种预靶向探针和至少一种效应物探针，其中所述预靶向探针包含主要靶向部分和第一生物正交反应性基团，和其中所述效应物探针包含效应物部分（例如标记物或药学活性化合物）和第二生物正交反应性基团，其中所述第一和第二生物正交反应性基团的任一个是亲双烯体，而所述第一和第二生物正交反应性基团中的另一个是二烯，其中所述亲双烯体是满足式（1）的8元环亲双烯体：

（1）

其中每个R独立地代表H，或至多六次代表选自由以下组成的组的取代基：烷基、O-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、SO₂、NO₂、NR’R”（其中R’和R”各自独立地是H或烷基）、C(=O)O烷基、C(=O)O芳基、CONR’R”（其中R’和R”各自独立地是H、芳基或烷基）、OCO烷基、OCO芳基、NR’CO烷基（其中R’是H或烷基）、NR’CO芳基（其中R’是或烷基）、NR’C(=O)O烷基（其中R’是H或烷基）、NR’C(=O)O芳基（其中R’是H或烷基）、OCONR’烷基（其中R’是H或烷基）、OCONR’芳基（其中R’是H或烷基）、NR’CONR”烷基（其中R’和R”各自独立地是H或烷基）、NR’CONR”芳基（其中R’和R”各自独立地是H或烷基）、NR’CSNR”烷基（其中R’和R”各自独立地是H或烷基）和NR’CSNR”芳基（其中R’和R”各自独立地是H或烷基）；其中至少一个R包含在，任选地通过间隔体，至所述预靶向探针或效应物探针的连接体部分中，并且其中X和Y各自独立地代表H或选自由以下组成的组的取代基：烷基、O-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、SO₂、NO₂和NRR’（其中R和R’各自独立地是H或烷基），或一起形成键；并且其中选择所述二烯从而能够通过经历Diels-Alder环加成接着经历逆Diels-Alder反应与所述亲双烯体反应。

另一方面，本发明提供了预靶向方法，以及在其中使用的预靶向试剂，和其中使用所述试剂盒的靶向的医学成像或疗法。

再一方面，本发明是满足式（1）的化合物，其用于动物或人类中的预靶向方法中。

将就特定的实施方案并参考某些附图描述本发明，但本发明并不受这些所限制而只由权利要求限制。权利要求中的任何附图标记都不应解释为限制范围。所描述的附图仅仅是示意性的而非限定性的。在所述附图中，出于说明目的一些要素的尺寸可能被夸大并且不按比例画出。在本说明书和权利要求中当使用术语“包含”时，其并不排除其它要素或步骤。当涉及单数名词使用不定冠词或定冠词例如“a”或“an”、“the”时，除非另外特别说明否则其包括多个（种）所述名词。

此外，还要注意说明书和权利要求中使用的术语“包含”不应被解释为限于随后列举的设备；其不排除其它要素或步骤。因此，表述“包含设备A和B的装置”的范围不应被限定为仅由组件A和B组成的装置。其表示就本发明而言，所述装置的仅有相关组件是A和B。

在几个化学式中涉及“烷基”和“芳基”。在这方面，“烷基”各自独立地表示不超过十个碳原子的脂肪族直链、支链或环状烷基基团，其可包括1-3个杂原子例如O、N或S，并且优选具有1-6个碳原子，和“芳基”各自独立地表示不超过十个碳原子的芳基或杂芳基，其可包括1-3个杂原子例如N或S。在几个化学式中，关于字母例如“A”、“B”、“X”、“Y”和各种编号的“R”基团表示了基团或取代基。这些字母的定义将参考各式进行解读，即在不同的式中，除非另外说明，否者这些字母可各自独立地具有不同的意义。

附图说明

图1描绘了如上所述的预靶向概念的一般方案；

图2提供了(3,6)-二-(2-吡啶基)-s-四嗪和E-环辛烯之间的[4+2]Diels-Alder反应接着是逆Diels Alder反应的反应方案，其中形成产物和氮气。由于反式环辛烯衍生物不像经典Diels Alder反应中那样含有吸电子基团，因此这种类型的Diels Alder反应区别于经典Diels-Alder反应，并且通常被称为“逆电子需求Diels Alder反应”。在下文中，将两个反应步骤序列即初始的Diels-Alder环加成（典型地是逆电子需求Diels Alder环加成）和后续的逆Diels Alder反应将简称为“逆Diels Alder反应”；

图3（a和b）描绘了使用逆Diels-Alder化学的预靶向的一般方案；

图4到图7示出了在实施例中使用的化合物的合成方案；

图8-9示出了在体内实施例中使用的化合物的合成方案；

图10-12示出了本发明的体内可行性。

具体实施方式

逆Diels-Alder反应

逆Diels-Alder耦合化学通常包括耦合以形成不稳定中间体的反应物对，所述中间体通过逆Diels-Alder反应消除作为唯一副产物的小分子（取决于起始化合物其可以是例如N₂、CO₂、RCN）以形成稳定产物。所述成对反应物包括作为一种反应物（即一种生物正交反应性基团）的适合的二烯，例如四嗪的衍生物，和作为另一种反应物（即另一种生物正交反应性基团）的根据式（1）的环辛烯或环辛炔。

所述逆Diels-Alder耦合化学通常包括耦合以形成不稳定中间体的反应物对，所述中间体通过逆Diels-Alder反应重排成为稳定的加合物。所述成对反应物包括作为一种反应物（即一种生物正交反应性基团）的二烯例如缺电子四嗪等，和作为另一种反应物（即另一种生物正交反应性基团）的根据式（1）的张力（strained）环辛烯或环辛炔。

例如缺电子（取代的）四嗪与例如张力E-环辛烯的异常快速的反应导致了连接反应中间体，所述中间体在[4+2]逆Diels-Alder环加成中通过消除作为唯一副产物的N₂重排为稳定的二氢哒嗪。这在图2中示出。

这两种反应性物类是非生物的，并且因此不经受快速的体内代谢。它们是生物正交的，例如它们在生理介质中彼此选择性地反应。

关于所述逆电子需求Diels Alder反应和反应性物类对的行为的参考文献包括：Thalhammer, F; Wallfahrer, U; Sauer, J, Tetrahedron Letters, 1990, 31 (47), 6851-6854; Wijnen, JW; Zavarise, S; Engberts, JBFN, Journal Of Organic Chemistry, 1996, 61, 2001-2005; Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM, Journal Of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19)。

应该理解，广义上，根据本发明上述耦合化学基本上能够应用于预靶向中能够使用的任何分子、基团或部分对。即这种对的其中之一将包含能够与主要靶结合的主要靶向部分，和进一步包含至少一个次级靶。另一个将是适合用于与所述次级靶结合的次级靶向部分，并且进一步包含适合施加治疗作用的部分（典型地是药学活性化合物），或适合被成像技术寻址(addressed)的部分（即标记物），或两者。

因此，根据本发明，所述预靶向探针和所述效应物探针中的任一被环辛烯或环辛炔官能化，而另一个被四嗪或其它适合的二烯官能化。这在图3中示出。上部的方案（图3a）示出了预靶向探针，含有通过连接体部分（优选包含柔性间隔体）与作为主要靶向部分的抗体连接的二吡啶基四嗪，和效应物探针，含有通过连接体（柔性间隔体）与可检测标记物连接的环辛烯（作为次级靶向部分）。下面的所述方案（图3b）示出了正好相反的方案，即包含环辛烯的预靶向探针和包含四嗪的效应物探针。

本领域技术人员知道在逆Diels-Alder反应中具有反应性的众多二烯。优选的二烯参照式（2）-（7）在下面给出。

（2）

其中R¹选自由烷基、芳基、O-烷基、C(=O)O-烷基、O-和NH₂组成的组；A和B各自独立地选自由烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N⁺O^-、N⁺R（其中R为烷基）组成的组，条件是A和B不都是碳；X选自由O、N-烷基和C=O组成的组，和Y是CR，其中R选自由H、烷基、芳基、C(=O)O烷基组成的组；

式（2）的二烯特别适合作为环辛炔亲双烯体，即根据式（1）的其中X和Y如式（1）中定义一起形成键的亲双烯体的反应参与者。

特别适合作为环辛烯的反应参与者的一种二烯是：

（3）

其中R¹和R²各自独立地选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃、C(=O)NH-烷基和NO₂组成的组；A选自由N-烷基、N-芳基、C=O和CN-烷基组成的组；B是O；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组。

特别适合作为环辛炔的反应参与者的一种相当的二烯是：

（4）

其中R¹和R²各自独立地选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃、C(=O)NH-烷基和NO₂组成的组；A选自由CO、C烷基-烷基、CN-烷基、N-烷基和N-芳基组成的组；B是O；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组。

特别适合作为环辛烯的反应参与者的另一种二烯是：

（5）

其中R¹和R²各自独立地选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃、C(=O)NH-烷基和NO₂组成的组；A选自由N、C-烷基、C-芳基和N⁺O^-组成的组；B是N；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组。

特别适合作为环辛炔的反应参与者的一种相当的二烯是：

（6）

其中R¹选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃和NO₂组成的组；R²选自由H、烷基、芳基、CN、OH、C(=O)O-烷基、CF₃和NO₂组成的组；

A选自由N、CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N⁺O^-组成的组；B是N；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、CCN、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组。

特别有用的四嗪衍生物是缺电子四嗪类，即被通常不被认为给电子的基团或部分取代并优选带有吸电子取代基的四嗪。

这些缺电子四嗪通常满足以下结构式：

（7）

在这里，R¹和R²各自独立地代表选自由以下组成的组的取代基：2-吡啶基、苯基或被一个或多个吸电子基团例如NO₂、CN、COOH、COOR、CONH₂、CONHR、CONR₂、CHO、COR、SO₂R、SO₂OR、NO、Ar取代的苯基，其中R是C₁-C₆烷基和Ar代表芳基，特别是苯基、吡啶基或萘基。

在根据式（2）-（7）的每一个的化合物中，所述R¹和R²基团（包括在X或Y上的那些）如下所述可以进一步带有适合的连接体或间隔体部分。与此类似并独立地，如下所述，式（1）的亲双烯体也可以进一步带有适合的连接体或间隔体部分。

所述亲双烯体优选地是E-环辛烯或环辛炔。更优选地，该E-环辛烯或环辛炔是未取代的（除所述连接体或间隔体之外），即根据式8的E-环辛烯或式9的环辛炔。

（8）

其中X和Y具有之前所述的含义，

Figure 2010800170074100002DEST_PATH_IMAGE017

（9）。

在预靶向策略中利用所述[4+2]逆Diels-Alder反应的一个益处在于所述二烯和所述环辛烯或环辛炔都是非生物的，并且基本上对细胞内或细胞表面上和所有其它区域如血清等中的生物分子都是不起反应的。因此，本发明的化合物和方法能够在活细胞、组织或有机体中使用。而且，所述反应性基团相对较小并且能够引入生物试样或活有机体中而不显著改变生物学尺寸。利用所述[4+2]逆Diels-Alder反应，可以利用小的反应参与者例如四嗪或环辛烯将大尺寸的主要靶向部分例如抗体与标记物或其它分子结合。甚至更有利地，利用（匹配的）相对小的反应参与者例如四嗪和环辛烯相对小的主要靶向部分例如肽可以与标记物或其它分子结合。所述预靶向探针和效应物探针的尺寸和性质不受所述次级靶和次级靶向部分的大影响，使得（预）靶向方案能够用于小靶向部分。因为这样，能够靶向其它组织，即所述探针的目的地不限于脉管系统（vascular system）和胞间隙（目前使用抗体-抗生蛋白链菌素的靶向通常是限于脉管系统和胞间隙）。根据一个实施方案，本发明被用于靶向的成像。

根据该实施方案，特定的主要靶的成像通过所述预靶向探针的主要靶向部分的特异性结合以及利用所述效应物探针中包含的可检测标记物检测这种结合来实现。

主要靶

本发明中使用的“主要靶”涉及在诊断和/或成像方法中待被检测，和/或待被药学活性化合物或其它治疗形式调整、结合或寻址的靶。

所述主要靶可以选自人类或动物体内或病原体或寄生物上的任何适合的靶，例如包含以下的组：细胞例如细胞膜和细胞壁、受体例如细胞膜受体、细胞内结构例如高尔基体或线粒体、酶、受体、DNA、RNA、病毒或病毒颗粒、抗体、蛋白质、碳水化合物、单糖、多糖、细胞活素、荷尔蒙、类固醇、生长抑素受体、单胺氧化酶、毒蕈碱性受体、心肌交感神经系统（myocardial sympatic nerve system）、白三烯受体（例如在白细胞上）、尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂受体（uPAR）、叶酸盐受体、细胞凋亡标志物、（抗）血管生成标志物、胃泌素受体、多巴胺能系统、serotonergic系统、GABA能系统（GABAergic system）、肾上腺素反应系统、胆碱能系统、阿片受体、GPIIb/IIIa受体和其它血栓相关受体、纤维蛋白、降钙素受体、促吞噬素受体、整合素受体、VEGF/EGF受体、基质金属蛋白酶（MMP）、P/E/L-选择素受体、LDL受体、P-糖蛋白、神经降压素受体、神经肽受体、P物质受体、NK受体、CCK受体、σ受体、白细胞介素受体、单纯疱疹病毒酪氨酸激酶、人酪氨酸激酶。

根据本发明的一个特定实施方案，所述主要靶是蛋白质例如受体。作为选择，所述主要靶可以是代谢途径，其在疾病例如感染或癌症期间表达上调，例如DNA合成、蛋白质合成、膜合成和碳水化合物摄取。在患病组织中，上述标志物能够不同于健康组织并提供早期检测、特异性诊断和治疗特别是靶向的治疗的独特可能。

预靶向探针

预靶向探针包含能够与感兴趣的主要靶结合的部分。

靶向部分典型地是对细胞表面靶（例如膜受体）、结构蛋白（例如淀粉样斑）或细胞内靶（例如RNA、DNA、酶、细胞信号通路）具有亲和性的结构。这些部分可以是抗体（片段）、蛋白质、适体、寡肽、寡核苷酸、寡糖以及肽、拟肽和已知在特定的疾病或障碍处积累的有机药物化合物。

本文描述了用于本发明试剂盒的适合主要靶向部分的特定实施方案，并包括受体结合性肽和抗体。本发明的一个特定实施方案涉及小靶向部分例如肽的使用，从而获得可透过细胞的靶向探针。

本发明中使用的“主要靶向部分”涉及结合到主要靶的靶向探针部分。主要靶向部分的特定例子是结合到受体的肽或蛋白质。主要靶向部分的其它例子是结合到细胞化合物的抗体或其片段。抗体可以针对非蛋白质化合物和蛋白质或肽生成。其它主要靶向部分可以由适体、寡肽、寡核苷酸、寡糖、以及拟肽和有机药物化合物构成。主要靶向部分优选以具有高特异性、高亲和力结合，并且与所述主要靶的结合优选在体内是稳定的。

为了能够特异性靶向以上列举的主要靶，所述靶向探针的主要靶向部分可以含有化合物，其包括但不限于：抗体、抗体片段例如Fab2、Fab、scFV、聚合物（通过EPR效应的肿瘤靶向）、蛋白质、肽例如奥曲肽和衍生物、VIP、MSH、LHRH、趋化肽、铃蟾肽、弹性蛋白、肽类似物、碳水化合物、单糖、多糖、病毒、药物、化疗剂、受体激动剂和拮抗剂、细胞活素、荷尔蒙、类固醇。在本发明的内容中设想的有机化合物的例子是或衍生自：雌激素类例如雌二醇、雄激素类、孕激素类、皮质类固醇类、紫杉醇、足叶乙甙、doxorubricin、甲氨喋呤、叶酸和胆固醇。

根据本发明的一个特定实施方案，所述主要靶是受体，并且适合的主要靶向部分包括但不限于此类受体的配体或仍结合到该受体的配体部分，例如在结合蛋白质配体的受体的情况下受体结合性肽。

蛋白质性质的主要靶向部分的其他例子包括干扰素，例如α、β和γ干扰素，白细胞介素和蛋白质生长因子，例如肿瘤生长因子，例如α、β肿瘤生长因子，血小板衍生生长因子（PDGF），uPAR靶向蛋白，载脂蛋白，LDL，膜联蛋白V，内皮抑素和血管生长抑制素。

主要靶向部分的可选择的例子包括DNA、RNA、PNA和LNA，其例如与所述主要靶互补。

根据本发明的一个特定实施方案，使用了小的亲脂性主要靶向部分，其能够结合到分子内主要靶。

根据本发明的一个进一步的特定实施方案，选择所述主要靶和主要靶向部分从而导致特异性的或增加的组织或疾病的靶向，所述组织或疾病例如癌症、炎症、感染、心血管疾病例如血栓、动脉粥样硬化病变、缺氧位置例如中风、肿瘤、心血管障碍、脑失调、细胞凋亡、血管生成、器官和报告基因/酶。这可以通过选择具有组织、细胞或疾病特异性表达的主要靶实现。例如，膜叶酸受体介导叶酸盐及其类似物例如甲氨喋呤的细胞内积累。正常组织内表达是有限的，但受体在各种肿瘤细胞类型中被过度表达。

根据一个实施方案，所述预靶向探针和所述效应物探针可以是多体化合物，其包含多个主要和/或次级靶和/或靶向部分。

所述预靶向探针进一步含有上述第一生物正交反应性基团。该基团充当“次级靶”，即作为提供用于所述逆Diels-Alder耦合化学的第一反应参与者的靶向探针部分。

如上所述，所述次级靶可以是所述耦合反应的任一参与者。即，在一个实施方案中，其是缺电子四嗪。在另一实施方案中，其是张力环辛烯。在所述预靶向探针中，所述主要靶向部分和所述第一生物正交反应性基团可以彼此直接相连。它们还可以通过连接体彼此结合，此外它们可以都与主要靶向支架(scaffold)例如生物聚合物如多肽连接。适合的连接体部分包括但不限于聚乙二醇（PEG）链。

效应物探针

效应物探针包含能够提供想要的诊断、成像和/或治疗效果的效应物部分。所述效应物探针进一步包含次级靶向部分。

所述次级靶向部分涉及形成用于可用的次级靶（即所述预靶向探针中包含的一个或多个生物正交反应性基团）的反应参与者的效应物探针部分。将理解，在所述次级靶是环辛烯的情况下，所述次级靶向部分将是四嗪，反之亦然。

所述效应物部分可以是例如可检测的标记物。这里使用的“可检测标记物”涉及使得例如当存在于细胞、组织或有机体中时所述探针能够被检测的效应物探针部分。在本发明的内容中，所设想的可检测标记物的一种类型是对比提供剂。在本发明的内容中设想了不同类型的可检测标记物并在下文加以描述。

因此，根据本发明的一个特定实施方案，本发明的预靶向试剂盒和方法被用于成像，特别是医学成像。为了识别所述主要靶，使用包含一种或多种可检测标记物的成像探针作为所述效应物探针。所述成像探针的可检测标记物的特定例子是用于常规成像体系对比提供部分例如可MRI-成像的结构、自旋标记物、光学标记物、超声响应结构、X射线响应部分、放射性核素、（生物）发光和FRET类型染料。在本发明的内容中所设想的示例性的可检测标记物包括但不一定局限于荧光分子（例如自发荧光分子(autofluorescent molecules)、与试剂接触时发荧光的分子等）、放射性标记物；生物素（例如将要经由用抗生物素蛋白结合生物素进行检测的生物素）；荧光标签，用于MRI的成像结构，包括顺磁性金属，成像试剂，例如在U.S. Pat. No. 4,741,900和5,326,856中描述的那些）等。用于成像的放射性核素可以例如是选自由以下组成的组的同位素：³H、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、¹⁹F、⁵¹Cr、⁵²Fe、⁵²Mn、⁵⁵Co、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Zn、⁶²Cu、⁶³Zn、⁶⁴Cu、⁶⁶Ga、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁰As、⁷¹As、⁷²As、⁷⁴As、⁷⁵Se、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、^8OBr、⁸²Br、⁸²Rb、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁸⁹Sr、⁸⁹Zr、⁹⁷Ru、⁹⁹Tc、¹¹⁰In、¹¹¹In、¹¹³In、¹¹⁴In、¹¹⁷Sn、¹²⁰I、¹²²Xe、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁹Yb、¹⁹³Pt、¹⁹⁵Pt、²⁰¹Tl、和²⁰³Pb。

在某些应用中也可以将其它元素和同位素例如被用于治疗的元素或同位素用于成像。

所述可MRI成像部分可以是顺磁性离子或超顺磁性颗粒。所述顺磁性离子可以是选自由以下组成的组的元素：Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce、Dy、Tl。所述超声响应部分可以包含微泡，其壳由磷脂和/或（可生物降解的）聚合物、和/或人血清白蛋白构成。所述微泡可以用氟化气体或液体填充。

所述X射线响应部分包括但不限于碘、钡、硫酸钡、gastrografin或可以包含用碘化合物和/或硫酸钡填充的囊泡、脂质体或聚合物胶囊。

此外，本发明的内容中所设想的可检测标记物还包括能够通过抗体结合进行检测的肽或多肽，例如通过结合可检测的经标记的抗体或通过经由夹心式检验检测结合的抗体。在一个实施方案中，所述可检测标记物是小尺寸有机PET和SPECT标记物，例如¹⁸F、¹¹C或¹²³I。由于它们的小尺寸，有机PET或SPECT标记物完美地适合用于监控细胞内的事件，因为它们一般不会很大地影响靶向器件的性能并且特别是其膜输送。包含PET标记物和作为次级靶向部分的任一逆Diels-Alder活性部分的成像探针是亲脂性的并且能够被动地扩散进和扩散出细胞直到它找到它的结合参与者。而且，两种组分都不妨碍越过血脑屏障并从而使得能够在脑内区域成像。

当所述效应物探针打算包含基于金属例如用于MRI对比增强的镧系金属（例如Gd）的可检测标记物时，其优选以螯合物的形式提供。在这种情况下，所述效应物探针优选包含能够与此类金属形成配位络合物的结构部分。关于此的好例子是衍生自1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸（H₄dota）和1,4,7,10-四氮杂环十二烷-α,α’,α,”α’”-四甲基-1,4,7,10-四乙酸(H₄dotma)的大环镧系元素（III）螯合物。

所述效应物部分还可以是治疗部分例如药学活性化合物。本文提供了药学活性化合物的例子。治疗探针还可以任选地包含可检测标记物。

因此，根据另一实施方案，本发明的预靶向试剂盒和方法被用于靶向的治疗。这通过利用含有次级靶向部分和一个或多个药学活性试剂（即药物或用于放射疗法的放射性同位素）的效应物探针实现。用于靶向的药物递送情况的适合药物已为本领域所知。任选地，所述治疗探针还可以包括可检测的标记物，例如一种或多种成像剂。用于治疗的放射性核素可以是选自由以下组成的组的同位素：²⁴Na、³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁷⁶As、⁷⁷As、⁸⁰Br、⁸²Br、⁸⁹Sr、⁹⁰Nb、⁹⁰Y、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹²¹Sn、¹²⁷Te、¹³¹I、¹⁴⁰La、¹⁴¹Ce、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁴⁴Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁹Tb、¹⁵¹Pm、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶¹Tb、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷²Tm、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹⁴Bi、²²³Ra和 ²²⁵Ac。

作为选择，所述治疗探针中的药物选自用于光动力疗法的感光剂（sensitizers）。

在所述效应物探针中，所述次级靶向部分即所述第二生物正交反应性基团和所述效应物部分可以直接彼此连接。它们还可以通过连接体彼此结合，此外它们可以都与次级靶向支架连接。如上所述，所述连接体可以独立地选自相同的部分，例如聚乙二醇。所述次级靶向支架可以是例如生物聚合物如多肽。

本发明还涉及利用逆Diels-Alder反应的预靶向方法。在这里，将包含主要靶向部分（例如抗体和抗体片段或受体结合性肽）的预靶向探针注入到受试者中，其中所述预靶向探针分别用适合的二烯，优选根据上述式（2）-（7）任意一个的化合物，或用根据上述式（1）的环辛烯或环辛炔官能化。在结合到靶（例如主要或转移性肿瘤病变、动脉粥样硬化斑块、梗死区域、炎症或感染位置等）并从循环系统和从非靶组织（例如血液、肝脏、脾脏肾脏等）清除之后，注入效应物探针，其含有次级靶向部分例如分别携带E-环辛烯或四嗪衍生物（即存在于所述预靶向探针中的生物正交反应性基团的反应性对应物）和药物或可成像标记物。所述效应物探针结合到所述主要靶向部分并提供高对比或选择性治疗所述疾病位点。

本发明还涉及一般的代谢途径的靶向，所述一般的代谢途径在疾病（例如感染或癌症）期间表达上调如DNA、蛋白质和膜合成以及碳水化合物摄取。适合的探针包含被二烯或亲双烯体标记的氨基酸、糖、核酸和胆碱，类似于本领域中目前使用的代谢示踪剂，[¹¹C]-蛋氨酸、[¹⁸F]-氟脱氧葡萄糖 (FDG)、脱氧-[¹⁸F]-氟胸苷 (FLT) 和[¹¹C]-胆碱。具有高代谢或增殖的细胞具有对这些构建单元（building block）的较高摄取。在该方法中，例如四嗪或E环辛烯衍生物进入这些或其它通路并在细胞内和/或细胞上积累。在充分积聚并清除游离探针后，将经可检测的标记的或携带药物的（细胞可透过）的四嗪探针或E-环辛烯探针（或携带根据本发明的其它二烯/亲双烯体的探针）送入以分别结合积累的E-环辛烯和四嗪代谢物。作为优于普通FDG（氟18氟脱氧葡萄糖）类型成像的一个益处，可以获得足够的时间使得能够在送入放射性之前高度积聚所述靶向部分，从而增大靶对非靶比。作为选择，可以靶向疾病特异性的代谢途径和/或代谢物。

本发明还涉及细胞内靶的预靶向。由于它们的小尺寸，有机PET标记物（¹⁸F, ¹¹C）非常适合用于监控细胞内事件，因为它们通常不会很大地影响所述靶向器件的性能，特别是其膜输送（和大的和极性的放射金属螯合物构造的缀合物相反）。尽管在本发明中使用的被取代的四嗪部分和所述E-环辛烯不一定是小的，但是它们是相对非极性的，并且能够用于蛋白质、mRNA、信号通路等的分子内成像。所述次级（PET标记的）取代的四嗪部分或E-环辛烯探针（即所述效应物探针）能够被动地扩散进和扩散出细胞直到它找到它的结合参与者。这些性能还允许将逆Diels-Alder反应用于脑内预靶向，因为两种组分都不妨碍越过血脑屏障。

本发明还涉及预靶向的信号放大和/或多价装配。至少一个主要靶向器件与含有多个四嗪部分的树枝状聚合物（dendrimer）或聚合物连接。在受体结合后，注入与用于核成像（例如放射金属螯合物、放射性卤素等）或MRI（例如Gd螯合物）的一个或多个对比部分结合的（一种或多种）环辛烯或环辛炔。随后的逆Diels-Alder反应导致在靶组织处MRI对比剂的高浓度。此外，在靶位点的多价将增大与所述环辛烯或环辛炔效应物缀合物的反应动力学，提供例如MRI对比剂的有效靶积累。当然，所述环辛烯或环辛炔也可以用于所述靶向器件缀合物而所述四嗪（或本发明的其它二烯）连接到reporter。

连接途径和试剂盒

本发明进一步涉及使用逆Diels-Alder反应作为用于将成像剂和药物连接到靶向结构例如肽的途径。所述效应物可以包含有机PET标记的辅基、用于PET/SPECT/MRI的金属络合物和用于超声成像的微泡，以及用于放射疗法的α和β辐射源和通常细胞毒素抗癌剂。所述成像/治疗剂可以用侧链四嗪或其它适合的二烯部分官能化和用环辛烯或环辛炔衍生物将靶向基团官能化，反之亦然。

本发明的途径对用于核成像和放射疗法的试剂特别有利：考虑到放射性核素的衰变，作为预靶向步骤实施最耗时的步骤（受试者体内的实际靶向）是有益的。根据本发明，选择上述非常快速的逆Diels-Alder化学用于次级靶向，使得能够使用多种放射性核素，包括与现有方法相比使用寿命更短的那些。环辛烯或环辛炔官能化的效应物探针和适合的二烯例如携带四嗪的预靶向探针能够在极低浓度在体内耦合而不需要效应物部分（例如所述放射性核素）的持续血液循环。将理解，这对与二烯特别是四嗪官能化的效应物探针结合的带有环辛烯/环辛炔的预靶向探针同样适用。而且，所述反应性基团有利地是稳定的，并因此展现了较长寿命的反应性而不太容易地发生副反应。

将理解，以上提供了益处例如最小化对病人的放射剂量。而且，其导致能够利用PET即正电子发射断层成像剂代替SPECT即单光子发射计算机断层成像剂（single photon emission computerized tomography agents）。

本发明特别适合用于多模式成像，任选地使用不同的成像剂以使相同的靶可视化。作为选择，所述成像探针包含至少两种不同的标记物以使得能够实现多模式成像。

所述[4+2]逆Diels-Alder化学在分子成像中的应用向所有类型和尺寸的靶向结构打开了预靶向之门。这允许细胞内和代谢成像以从可通过预靶向积聚获得的高靶积累和低背景受益。同样，对于较小的和更多种多样的靶向器件，预靶向的信号放大方案例如多四嗪和/或多烯树状分子或脂质体变得可行。

由于所述反应参与者是非生物的和生物正交的，因此使用上述[4+2]逆Diels-Alder反应的预靶向不受内源性竞争和代谢/分解限制，并提供稳定的共价键。选择靶代谢途径，以及相应的四嗪-代谢物衍生物凭借其与正常细胞相比在例如肿瘤细胞中的高通量，提供了在细胞中或在靶细胞表面上高密度人工四嗪受体或其它化学柄的装配，避免有时可能处于低水平的内源细胞表面受体的使用。

本发明的进一步的特定实施方案涉及包含代谢前体和成像探针，更特别地是包含可检测标记物的成像探针的试剂盒，所述可检测标记物是用于常规成像体系的对比剂。此类可检测标记物可以是但不限于选自由可MRI成像的结构、自旋标记物、光学标记物、超声响应试剂、X射线响应试剂、放射性核素和FRET类染料组成的组的标记物。在本发明的一个特定实施方案中，使用了报告探针。这种报告探针可以是酶的底物，更特别地是对于所述细胞不是内源性的，但已经通过基因疗法或使用外来试剂感染而引入的酶。在本文中涉及细胞或组织内的基因的非内源性用于表示所述基因在所述细胞或组织内并不天然存在和/或表达。作为选择，此类报告探针是通过受体或泵引入到细胞中的分子，其可以是内源性的或通过基因疗法或使用外来试剂感染引入到细胞内。作为选择，所述报告探针是对细胞或组织环境中的某些（变化）条件起反应的分子。

本发明还包括用于上述试剂盒的试剂。一种此类试剂是包含主要靶向部分和生物正交反应性基团的预靶向剂，其中所述生物正交反应性基团是用于[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。特定反应参与者在上文描述，即通常是上述缺电子四嗪或其它适合的二烯，或是环辛烯（优选E-环辛烯）或环辛炔。本发明还涉及这些试剂在靶向的医学成像或靶向的治疗中的用途，和涉及这些试剂在这种方法中的用途。特别地，本发明涉及这些试剂在靶向方法中的这些用途，和涉及在这种方法中使用的这些试剂。另一种此类试剂是包含可检测标记物和生物正交反应性基团的成像探针，其中所述生物正交反应性基团是[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

本发明还涉及包含可检测标记物和生物正交反应性基团的成像探针，其中所述生物正交反应性基团是[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。本发明进一步涉及包含药学活性化合物和生物正交反应性基团的治疗探针，其中所述生物正交反应性基团是 [4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

本发明的一部分还是预靶向方法，包括将如上所述的预靶向试剂给予受试者并使所述试剂在受试者的体系中循环有效实现主要靶向部分对主要靶的结合的一段时间，接着从身体清除未结合的试剂。用于其的典型时间为12到96小时，特别地为约48小时。

此外，本发明提供了成像方法，包括如上所述实施预靶向方法，接着给予同样根据本发明的成像探针，其中所述预靶向试剂中和所述成像探针中的生物正交反应性基团一起形成[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。类似地，本发明提供了受试者中靶向的医学治疗方法，其包括如上所述实施预靶向方法，接着给予同样根据本发明的治疗探针，其中所述预靶向试剂中和所述成像探针中的生物正交反应性基团一起形成[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

本发明还涉及用于如上所述的成像或治疗方法的上述预靶向试剂。

总结而言，在逆Diels-Alder化学的基础上，生物正交预靶向的分子成像和治疗用于给病人带来极大益处。一方面，其用于承担获得靶组织例如癌症和心血管病变的优良图像。另一方面，能够大大减少源自放射性化合物和通常潜在毒性药物给予的固有副作用，同时增加到达患病组织的有效剂量。此外，其将大大扩展引起疾病的可追踪分子事件的收集。特别地，这种技术能够允许使用远离血管的靶组织并将促进信息丰富的细胞内环境的成像。

将参考以下非限定性实施例和随附的非限定性附图说明本发明。

实施例1

如图3a中所示，作为将四嗪衍生的部分连接到抗体的一个实例，制备了分子1（见图4）。相应的探针2（衍生自E-环辛烯）的一个实例在图5中示出。两种分子都含有PEG链。分子1包含用于将所述分子与抗体中存在的氨基基团耦合的N-羟基琥珀酰亚胺基部分。2中DOTA衍生的部分可以用于携带稀土金属离子例如用于MR成像的Gd或用于核成像和治疗（SPECT）的Lu-177。

图4中示出了1的合成。根据Blackman等（Blackman, ML; Royzen, M; Fox, JM, Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (41), 13518-19）制备了起始四嗪衍生的分子5。通过与琥珀酸酐反应将其转化成酸6，接着形成它的N-羟基琥珀酰亚胺基酯7。通过与商购获得（IRIS biochem）的PEG衍生物8反应这种N-羟基琥珀酰亚胺基酯被用于形成酸9，其进而被转化成它的羟基琥珀酰亚胺基酯1。

图5中示出了2的合成。根据Yap等（Yap, GPA; Royzen, M; Fox, JM, Journal of The American Chemical Society, 2008, 130 (12), 3760 –61）制备（E）-环辛-4-烯醇（10）。其在商购获得的（Aldrich）异氰酸酯衍生物11的帮助下被转化成酯12，接着皂化成酸13。使由13形成的N-羟基琥珀酰亚胺基酯与衍生自DOTA和PEG的胺18反应，以形成终产物2。使17脱保护后制备DOTA衍生物18，所述17进而由DOTA衍生物15和PEG衍生物16（都可商购获得）（分别来自Macrocyclics和 IRIS biotech）制备。

实施例2

与实施例1相比，本实施例说明了相反的分子对，即1）在连接到抗体之后将形成所述预靶向部分的E-环辛烯衍生物3和，2）衍生自所述四嗪/DOTA的探针4，其能够用作图3b中所示的效应物探针，分别在图6和7中示出。

通过商购获得的（IRIS biochem）PEG衍生物8与N-羟基琥珀酰亚胺基酯14（见图5）的反应以形成酸19，接着形成源自这种酸的N-羟基琥珀酸亚胺基衍生物，形成E-环辛烯衍生物3。

图7中示出了衍生自四嗪/DOTA的探针4的合成。通过衍生自DOTA和PEG的胺18（见图5）与N-羟基琥珀酰亚胺基酯7（见图4）的反应制备这种探针。

实施例3：体内成像

所有试剂和溶剂都从商业来源获得（从Sigma-Aldrich、Acros、ABCR、Invitrogen和Merck获得试剂，从Biosolve、Merck和Cambridge Isotope Laboratories获得常规和氘代溶剂），并除非另外说明外都不经进一步的纯化即使用。1-氨基- 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十二氧杂三十九烷-39-酸（S11）和（35-氨基- 3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂三十五烷基）氨基甲酸叔丁酯（S3）分别从Polypure (Norway) 和Iris Biotech (Germany)获得。2,2',2''-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸 (S6)作为与HPF₆和大约3当量三氟乙酸（TFA）的盐从Macrocyclics (USA)获得。利妥昔单抗溶液（MabThera?）购自Roche (Switzerland)。[¹¹¹In]氯化铟和[¹²⁵I]碘化钠溶液购自PerkinElmer (USA)。通过milli-Q水过滤系统（Millipore, USA）使水经过蒸馏和去离子化（18 mΩcm^-1）。用Chelex-100树脂（BioRad Laboratories, USA）处理标记缓冲液过夜，然后经过0.22μm过滤并在4℃贮存。indogen碘化管、用于二喹啉甲酸（BCA）检验的试剂盒和凝胶蓝色蛋白染色溶液购自Pierce Protein Research (Thermo Fisher Scientific, USA)。用于制备磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH7.4的片剂从Calbiochem (Merck, Germany)获得。Amicon Ultra-4和Ultra-15离心过滤器单元（50 kDa MW切断）购自Millipore。小鼠血清购自Innovative Research (USA)。

使用Bruker DPX300波谱仪或Bruker Avance600波谱仪(Bruker BioSpin, The Netherlands)在氘代氯仿（CDCl₃）或六氘代二甲基亚砜（DMSO-D₆）中记录了NMR谱。使用DEPT脉冲序列区分¹³C-NMR多重性（q=四重、t=三重、s=二重和p=一重（primary））。在Agilent ESI-TOF质谱仪（Agilent Technologies, USA）上记录了高分辨率ESI质谱（HRMS），以正离子模式测量。在Combiflash Companion设备 (Teledyne Isco, USA)上使用硅胶柱（SiliCycle，Canada）实施了制备柱层析。使用装配有C18 Zorbax柱（21.2×150mm, 5μm颗粒）的Agilent 1200仪器应用含有0.1%TFA的水和乙腈（ACN）梯度实施制备HPLC。在装配有Gabi放射性探测器（Raytest, Germany）的Agilent 1100系统上实施了分析放射-HPLC。将试样加载在Agilent Eclipse XDB-C18柱（4.6×150mm, 5μm颗粒）上，其用含有0.1%TFA的ACN在水中的线性梯度以1mL/min洗脱（10%ACN 2min，接着在11min内增大到45%ACN）。将UV波长预设在254nm。在装配有Gabi放射性探测器的Agilent 1200系统上实施体积排阻（SEC）HPLC。将试样加载在BioSep-SEC-S 2000柱（300×7.8mm，5μm颗粒，Phenomenex，USA）上并用20mM磷酸盐、150mM NaCl（pH6.8）以1mL/min洗脱。UV波长预设在260和280nm。

使用用在0.9% NaCl水溶液中的200mM乙二胺四乙酸洗脱的ITLC-SG 条（Pall，UAS）通过放射-TLC测定¹¹¹In标记产率，并在磷光体成像仪（FLA-7000，Fujifilm，Japan）上成像。在这些条件下，游离¹¹¹In以R_f=0.9迁移，而¹¹¹In-四嗪保留在原位。¹²⁵I标记产率也通过放射TLC使用用20mM柠檬酸溶液（pH 5.2）洗脱的ITLC-SG条测定，并在磷光体成像仪上成像。在这些条件下，游离¹²⁵I以R_f=0.9迁移，而¹²⁵I-mAbs保留在原位。

在Phastgel系统上分别使用IEF-3-9凝胶和7.5%PAGE均匀凝胶（GE Healthcare Life Sciences，USA）实施等电聚焦（IEF）分析和SDS-PAGE。IEF校准溶液（宽PI，pH3-10）购自GE Healthcare和蛋白质MW标准溶液（Precision Plus双色标准）购自BioRad。在电泳时，用凝胶蓝将所述凝胶染色2小时，在水中脱色过夜然后用常规平板扫描仪数字化。

用NanoDrop 1000分光光度计（280nm处的吸光率；Thermo Fisher Scientific, The Netherlands）或采用BCA测试测定CC49和利妥昔单抗溶液的浓度。

DOTA四嗪（S7）的合成

图8中示出了2,2',2''-(10-(2,40,44-三氧代-44-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十一氧杂-3,39-二氮杂四十四烷基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸 (S7)的合成概览。

5-氧代-5-(6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基氨基)戊酸 (S2)

根据文献方法（M. L. Blackman, M. Royzen, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130, 13518 (2008)）合成了6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-胺(S1)。在密封的烧瓶中将S1（103mg，0.410mmol）和戊二酸酐（234mg，2.05mmol）在四氢呋喃（12mL）中的混合物在70℃加热18小时。冷却后，用二氯甲烷（DCM）（2×12mL）和乙酸乙酯（12mL）洗涤沉淀物以获得紫色固体形式的S2（62mg，42%）。1H NMR (DMSO-D6, 300 MHz, δ): 12.13 (s, 1H), 10.58 (s, 1H), 9.05 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.94 (d, J = 4.2 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.43 (dd, J1 = 2.3 Hz, J2 = 8.8 Hz, 1H), 8.16 (td, J1 = 7.8 Hz, J2 = 1.7 Hz, 1H), 7.73 (ddd, J1 = 1.1 Hz, J2 = 4.4 Hz, J3 = 7.4 Hz), 2.50 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.33 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 1.86 (q, J = 7.3 Hz, 2H). 13C NMR (DMSO-D6, 75 MHz, δ): 174.1 (q), 172.0 (q), 163.0 (q), 162.7 (q), 150.6 (t), 150.2 (q), 143.8 (q), 141.3 (t), 138.4 (q), 137.7 (t), 126.5 (t), 126.1 (t), 124.8 (t), 124.1 (t), 35.4 (s), 32.9 (s), 20.2 (s). HRMS (ESI, m/z): 计算值C₁₇H¹⁶N₇O₃ ⁺ ([M+H]⁺): 366.1314; 实测值: 366.1313。

(37,41-二氧代-41-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一氧杂-36-氮杂四十一烷基)氨基甲酸叔丁酯 (S4).

将N,N-二异丙基乙基胺（95 μL, 0.41 mmol）加入S2 (15 mg, 0.041 mmol)、S3 (29 mg, 0.045 mmol)和六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基) 鏻(19 mg, 0.043 mmol)在二甲基甲酰胺（DMF）（1mL）中的搅拌混合物中。在室温（RT）搅拌16小时后，蒸发所述混合物并通过柱色谱在硅胶上使用甲醇在DCM中（0-10%）的梯度纯化产物，得到紫色固体形式的S4（30mg，74%）。¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, δ): 9.07 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.97 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 8.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 8.63 (dd, J₁ = 2.3 Hz, J₂= 8.8 Hz, 1H), 8.03 (td, J₁ = 7.8 Hz, J₂ = 1.7 Hz, 1H), 7.59 (ddd, J₁ = 1.1 Hz, J₂ = 4.6 Hz, J₃ = 7.4 Hz), 7.01 (s, 1H), 5.14 (s, 1H), 3.9-3.2 (宽s, 48H), 2.60 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.37 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 2.09 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 1.43 (s, 9H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz, δ): 173.8 (q), 173.1 (q), 163.8 (q), 163.7 (q), 151.3 (t), 150.5 (q), 144.0 (q), 142.7 (t), 139.2 (q), 137.9 (t), 127.0 (t), 126.9 (t), 125.5 (t), 124.7 (t), 79.5 (q), 70.5 (s), 70.1 (s), 40.7 (s), 39.7 (s), 36.5 (s), 35.5 (s), 28.8 (p), 21.9 (s). HRMS (ESI, m/z): 计算值C₄₆H₇₄N₉O₁₅ ⁺ ([M+H]⁺): 992.5304; 实测值: 992.5301。

2,2’,2’’-(10-(2,40,44-三氧代-44-((6-(6-(吡啶-2-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)吡啶-3-基)氨基)-6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-十一氧杂-3,39-二氮杂四十四烷基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸 (S7).

将产物S4（30mg，0.030mmol）在RT在TFA（1.5mL）和DCM（5mL）的混合物中搅拌30min。蒸发后，将残余物（主要是S5）溶解在DMF（5mL）中，并加入S6（27mg，0.028mmol）和三乙胺（40μL，0.27mmol），将混合物在RT搅拌2小时。蒸发后，将粗产物溶解在DMSO中并通过制备HPLC纯化。冷冻干燥后，如通过¹³C-NMR分析（δ=158.7ppm, q, J=32.3Hz和δ=117.6ppm, q, J=298.2Hz）所证实，获得紫色TFA盐形式的S7（24mg，69%）。¹H NMR (DMSO-D₆, 600 MHz, δ): 9.22 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 9.10 (dd, J₁ = 4.7 Hz, J₂ = 1.1 Hz, 1H), 8.78 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 8.75 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.59 (dd, J₁ = 2.4 Hz, J₂= 8.7 Hz, 1H), 8.32 (td, J₁ = 7.8 Hz, J₂ = 1.7 Hz, 1H), 8.08 (ddd, J₁ = 1.1 Hz, J₂ = 4.7 Hz, J₃ = 7.8 Hz), 3.9-3.1 (m, 80H), 2.60 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.02 (q, J = 7.3 Hz, 2H). ¹³C NMR (DMSO-D₆, 150 MHz, δ): 172.8 (q), 172.5 (q), 163.8 (q), 163.5 (q), 151.3 (t), 150.9 (q), 144.5 (q), 142.0 (t), 139.3 (q), 138.5 (t), 127.3 (t), 126.9 (t), 125.6 (t), 124.9 (t), 70.5 (s), 70.3 (s), 69.9 (s), 69.5 (s), 39.2 (s), 36.4 (s), 35.2 (s), 21.7 (s). HRMS (ESI, m/z): 计算值C₅₇H₉₂N₁₃O₂₀ ⁺ ([M+H]⁺): 1278.6582; 实测值: 1278.6557。

TCO-NHS，S13的合成

图9中示出了(E)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基 1-(4-((环辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38-十二氧杂-2-氮杂四十一烷-41-酸酯(S13)的合成。

(E)-2,5-二氧代吡咯烷酮-1-基 4-((环辛-4-烯基氧基)甲基)苯甲酸酯 (S10)

根据文献方法（M. Royzen, G. P. A. Yap, J. M. Fox, J. Am. Chem. Soc. 130, 3760 (2008)）合成了（E）-环辛-4-烯醇（S8，主要异构体，含有约13%所述Z-异构体）。将60%氢化钠分散体（1.8g，45mmol）加入冰浴冷却的S8（1.70g，13.5mmol）在60mL DMF中的溶液中。在RT搅拌4小时后，将4-溴甲基苯甲酸（3.85g，17.9mmol）分份加入并在RT将悬浮液搅拌过夜。将混合物倒入水（100mL）中，加入叔丁基甲基醚（100mL），接着加入37%盐酸（5mL）。分离后，用叔丁基甲基醚（2×100mL）萃取水层。用水（25mL）洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥并蒸发。使所述残余物通过用4:1己烷/乙酸乙酯的薄硅胶层。将蒸发后获得的残余物在70℃溶解在庚烷（50mL）中，然后冷却，提供S9。将所述产物溶解在DCM（40mL）中，加入N-羟基琥珀酰亚胺（0.57g，4.9mmol），将混合物在冰浴中冷却，接着加入N,N’-二环己基碳二亚胺（1.03g，4.99mmol）。30分钟后除去冰浴并在RT搅拌所述反应混合物18小时。过滤并蒸发后，通过柱色谱在硅胶上使用乙酸乙酯在庚烷（0-15%）中的梯度纯化残余物。接着，将残余物溶解在叔丁基甲基醚（20mL）中并倒入庚烷（50mL）中，得到白色固体形式的S10（1.42g，29%）。¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz, δ): 8.10 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.45 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.60 (m, 1H), 5.34 (m, 1H), 4.54 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 4.47 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 3.09 (m, 1H), 2.91 (s, 4H), 2.43-1.40 (m, 10H). ¹³C NMR (CDCl₃, 75 MHz, δ): 169.0 (q), 161.5 (q), 146.7 (q), 135.1 (t), 132.1 (t), 130.4 (t), 127.0 (t), 123.7 (q), 85.3 (t), 68.0 (s), 40.5 (s), 37.7 (s), 34.2 (s), 32.7 (s), 31.4 (s), 25.4 (s). HRMS (ESI, m/z): 计算值C₂₀H₂₃NO₅Na⁺ ([M+Na]⁺): 380.1474; 实测值: 380.1472。

(E)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基1-(4-((环辛-4-烯-1-基氧基)甲基)苯基)-1-氧代-5,8,11,14,17,20,23,26, 29,32,35,38-十二氧杂-2-氮杂四十一烷-41-酸酯 (S13).

将S10（100mg，0.280mmol）在DCM（2mL）中的溶液滴加入在冰浴中搅拌的S11（175mg，0.283mmol）和三乙胺（290μL，2.08mmol）在DCM（2mL）中的溶液中。将所述反应混合物在RT搅拌16小时。将蒸发后所获得的粗中间体S12溶解在DCM（5mL）中并在冰浴中冷却。加入双（2,5-二氧代吡咯烷-1-基）碳酸酯（170mg，0.664mmol）和吡啶（28μL，0.35mmol），并在RT将反应混合物搅拌3小时。过滤并蒸发所述混合物，通过柱色谱在硅胶上使用甲醇在DCM（5-10%）中的梯度纯化产物，得到粘性油形式的S13（119mg，39%）。¹H NMR (CDCl₃, 600 MHz, δ): 7.79 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.36 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.00 (s, 1H), 5.59 (m, 1H), 5.33 (m, 1H), 4.49 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 4.42 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 3.85 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.8-3.5 (m, 48H), 3.09 (m, 1H), 2.90 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.85 (s, 4H), 2.43-1.40 (m, 10H). ¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz, δ): 167.0 (q), 165.4 (q), 164.8 (q), 140.8 (q), 133.5 (t), 131.7 (q), 130.4 (t), 125.3 (t), 83.4 (t), 68.7 (s), 68.4 (s), 68.0 (s), 67.6 (s), 68.4 (s), 63.9 (s), 38.9 (s), 37.9 (s), 36.1 (s), 32.6 (s), 31.1 (s), 30.3 (s), 29.8 (s), 23.7 (s). HRMS (ESI, m/z): 计算值C₄₇H₇₆N₂O₁₈Na⁺ ([M+Na]⁺): 957.5171; 实测值: 957.5174。

抗体制备

由从American Type Culture Collection (ATCC, USA)获得的CC49杂交瘤细胞系制备CC49。杂交瘤细胞在CELLine CL 1000生物反应器（Integra Biosciences AG, Switzerland）中在用青霉素（10U/mL）和链霉素（10μg/ml）补充的不含血清的杂交瘤培养基（H-SFM, Gibco, USA）中生长。每两周收集细胞上清液，所述CC49通过使用Mab Trap试剂盒（GE Healthcare Biosciences，USA）的蛋白质G亲和色谱根据制造商的说明进行纯化。使用Amicon Ultra-15离心单元用PBS洗涤经纯化的CC49。如通过SDS-PAGE和SEC-HPLC分析所证实的那样，该过程提供了含有约150kDa的单一物类的CC49溶液。

抗体改性

典型地，用在总体积为500μL的PBS中的 10摩尔当量TCO-NHS（S13，在12.8μL DMSO中127.6μg）改性2mg CC49（在PBS中的5mg/mL溶液）。用2M碳酸钠缓冲溶液将pH调节到9。在搅拌下在黑暗中在RT实施所述反应30分钟。随后，使用Amicon Ultra-15离心装置用PBS充分地洗涤经TCO改性的mAb。如通过四嗪滴定（参见下文）所证实，该过程提供了平均7.4个TCO基团/抗体。由TCO结合导致的MW增加通过SDS-PAGE不可检测。如所预料的那样，如通过IEF分析观察到的那样，所述mAb改性导致等电点降低（从6.5-6.8到大约5.8）。使用相同的过程制备用于对照体内实验的TCO改性的利妥昔单抗（Rtx-TCO），具有类似结果。

抗体放射性标记

将在PBS（500μL）中的原样或经TCO改性的CC49（200μg）转移到预先用1mL PBS冲洗的碘化管。加入[¹²⁵I]碘化钠（10-15MBq），在轻柔搅拌下在RT培养所述溶液5分钟，之后将所述溶液转移到Amicon Ultra-4单元。用500μLPBS冲洗所述碘化管两次，并将洗涤物与所述标记混合物倒在一起。经¹²⁵I标记的mAb用PBS充分洗涤，随后从Amicon回收。通过该方法，对于原样CC49获得88.3±9.3的放射性碘化产率（n=5），和对于经TCO改性的CC49为30.4±4.3% (n=6)。Amicon纯化之后，如通过放射-TLC和SDS-PAGE分析所证实的那样，两种经放射性标记的mAb的放射化学纯度都大于98%。使用相同的过程以放射碘化Rtx-TCO用于对照体内实验，结果类似。对于动物实验，通过加入适当量的相应未标记mAb将经纯化的¹²⁵I标记的mAb的比活度（SA）调节到2kBq/μg。

四嗪放射性标记

将经DOTA改性的四嗪（探针S7）溶解（1mg/mL）在0.2M醋酸铵（pH7.0）中并在使用前在-80℃贮存。将一份S7等分试样与适合量的[¹¹¹In]氯化铟合并，并在轻柔搅拌下在37℃培养10分钟。然后，加入5μL 10mM二亚乙基三胺五乙酸，并将所述溶液再培养5分钟。典型地，如通过放射-HPLC和放射-TLC所证实，通过这种方法获得了定量标记产率和大于98%的放射化学纯度。对于动物实验，用无菌盐水稀释所述¹¹¹In-四嗪溶液。用于体内实验和用于生物分布研究的¹¹¹In-四嗪溶液的SA典型地为50-100 kBq/μg S7；用于成像实验的SA为1-2 MBq/μg S7。

体外反应性

在PBS（n=3）、50%小鼠血清（n=3）和含有肝磷脂的大鼠血液中测试了¹¹¹In-四嗪对CC49-TCO的反应性。典型地，用0.43、4.30和6.40μg ¹¹¹In标记的S7（相对于所述mAb为1、10和15摩尔当量）在37℃在100μL总体积中培养50μg经TCO改性的mAb。未经改性的CC49和15当量经¹¹¹In标记的S7的混合物用于评价非特异性结合。10分钟之后，通过SDS-PAGE和磷光体成像仪分析等分量的各混合物。我们观察到在体外在半等摩尔条件和在低浓度（3.3μM）在PBS、血清和血液中在10分钟之内两种成分之间的快速反应。相同的方法用于评估¹¹¹In-四嗪对Rtx-TCO的反应性。在所有三种培养基中，¹¹¹In-四嗪和CC49-TCO之间的反应都在10分钟之内完成（表1）。

在所述经标记的四嗪和未改性的CC49或其它培养基成分之间没有检测到明显的结合，说明不存在非特异性相互作用。

表1：培养10分钟之后¹¹¹In-四嗪（相对于mAb的当量）和CC49-TCO之间的反应产率（%）（括弧：每个mAb结合的#四嗪探针）

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体内研究

所有动物实验都根据实验室动物护理原则（NIH publication 85–23, 1985年修订）和荷兰国家法律 “Wet op de Dierproeven” (Stb 1985, 336)实施。从ATCC获得人克隆癌细胞系LS174T并保持在用10%热失活的胎牛血清（Gibco）、青霉素（100U/mL）、链霉素（100μg/mL）和2mM Glutamax 补充的Eagle’s最小必需培养基（Sigma）中。用在100μL无菌PBS中的5×10⁶细胞对裸雌性Balb/C小鼠（20-25g体重，Charles River Laboratories, The Netherlands）进行皮下接种。在成像和生物分布实验时肿瘤重量为0.38±0.28g。将具有不同肿瘤尺寸的动物随机分配到不同的实验组。

用¹²⁵I-CC49或¹²⁵I-CC49-TCO (每小鼠100 μg/100 μL，约0.2 MBq)对携带肿瘤的小鼠（n=4）进行静脉注射。在选择的时间点（5分钟，3和6小时，1、2和3天）从隐静脉抽取血液试样。注射四天后，用异氟醚麻醉所述小鼠，并通过心脏穿刺抽取血液。将所述血液试样进行称重并用PBS稀释到1mL。在γ-计数器（Wizard 1480, PerkinElmer）中与标准一起测量试样的放射性，来确定每克百分比注射剂量（%ID/g）。使用T_1/2 = Ln2×AUC/C₀由图10中的曲线（AUC, GraphPad Prism v. 5.01）下的面积计算血液中所述经放射性标记的mAb的半衰期。在这项研究中，所述经TCO改性的CC49与未经改性的mAb的血液半衰期（19.8小时）相比显示出更短的血液半衰期（11.0小时）。我们将这归因于由7.4Lys残基/mAb官能化导致的等电点改变。为了研究该体系的全部潜力，我们选择了mAb和探针给予之间的相对短的24小时间隔。

生物分布实验

通过用¹²⁵I标记的mAb（CC49-TCO、CC49或Rtx-TCO，每小鼠100 μg/100 μL，约0.2 MBq）对携带肿瘤的小鼠（n=3）进行静脉注射，并且在24小时之后用¹¹¹In-四嗪（每小鼠21μg/75 μL，约0.8 MBq）进行静脉注射实施双同位素生物分布实验。在图11中将结果可视化。给予四嗪三小时后，用异氟醚麻醉所述动物并通过颈椎脱臼处死。通过心脏穿刺抽取血液并收取感兴趣的器官和组织，剥离干并称重。在γ-计数器中与标准一起测量所述试样的放射性以确定%ID/g。对于¹²⁵I和¹¹¹In分别将能量窗口设定到10-80keV和100-510keV。实验3周后，再次测量所述试样的放射性，以检查¹²⁵I值对于潜在¹¹¹In的交叉污染。在体内评价期间，如由在甲状腺和胃部中测量的少量¹²⁵I所证实的那样，碘化的物类不发生显著的脱卤，并显示出长循环抗体的典型分布模式。注射后27小时，在血液中（约10%ID/g）和在富血器官例如心脏和肺（其被剥离干但在计数前不用盐水灌注）中仍可检测到残留的¹²⁵I-mAb。所有物类都显示出肝胆清除（在肝脏和肠中的¹²⁵I活性）和一些肾脏排泄（较小的放射代谢物）。在肌肉、骨和脑中观察到了低摄入。在肿瘤中，CC49和CC49-TCO都显示出高积累，分别具有3.2±2.2和2.8±0.8的肿瘤对血液比（T/B）和22.0±10.8和34.2±23.8的肿瘤对肌肉比（T/M）。在两个组中都观察到了肿瘤摄入的变化，这很可能是由于快速和不规则的肿瘤生长（并且因此肿瘤尺寸变化）所导致。但是，两种CC49的肿瘤积累都明显高于Rtx-TCO（T/B = 0.6±0.0, T/M = 4.9±0.8），表明了抗原特异性结合。

在用CC49-TCO或Rtx-TCO预处理的小鼠中¹¹¹In-四嗪分布与¹²⁵I的相同。在这些组中，在血液、心脏、肺和肝脏中观察到高的¹¹¹In摄入，而在脾、肌肉、骨和脑中则发现了低活性。其中没有发现¹²⁵I-CC49-TCO和¹²⁵I-Rtx-TCO摄入间的明显差异的器官（血液、心脏、肺、脾、肌肉、骨和脑）也没有显示在¹¹¹In-四嗪积累方面的差异。在含有18.8±4.7 %ID/g ¹²⁵I-CC49-TCO的肿瘤中，与含有6.3±1.2 %ID/g ¹²⁵I-Rtx-TCO的那些相比，发现5.2倍高的¹¹¹In-四嗪摄入。另一方面，在用未改性的¹²⁵I-CC49预处理的组的大多数组织中，几乎检测不到¹¹¹In摄入。重要的是，尽管¹²⁵I-CC49的肿瘤摄入在三组中是最高的，但是在相同的组中¹¹¹In肿瘤摄入是¹²⁵I-CC49-TCO组的16倍低。此外，尽管存在8.7±5.9 %ID/g ¹²⁵I-CC49，但是在该组中几乎检测不到¹¹¹In-四嗪的血液保留。作为经放射性标记的四嗪排泄的结果，在所有3个组中只有肾脏显示出相对高的¹¹¹In摄入。

所述四嗪只在含有经TCO改性的物类的器官和组织中积累的发现说明了体内发生了这两个实体间的化学反应。我们通过分别由¹²⁵I和¹¹¹In的%ID/g计算存在于组织中的TCO和四嗪的绝对量，测定了体内DA反应的产率。与体外观察到的四嗪和mAb-TCO之间的高反应性和选择性相符，血液和肿瘤存在的56.7±2.0% 和52.1±3.0%的TCO部分已经分别与用CC49-TCO预处理的组中与四嗪探针反应。考虑到所述反应中涉及的成分的低浓度（对于TCO在血液和肿瘤中分别为0.42±0.20和0.93±0.23 nmol/g，注射后即刻所述四嗪在血液中最大为2.3nmol/g）、反应环境的复杂性和所述四嗪的短生物半减期（11.8min），这些产率是不寻常的。

成像实验

在接收100μg mAb（CC49-TCO、CC49或Rtx-TCO）24小时后，用¹¹¹In-四嗪（每小鼠21μg/75μL，20-42MBq）对携带肿瘤的小鼠进行注射。约1小时后，将所述小鼠麻醉并安置在装配有用于麻醉的鼻锥和用于呼吸监控的传感器的动物床上。注射四嗪2小时后用四头多针孔小动物SPECT/CT成像系统（NanoSPECT, Bioscan Inc., USA）实施单光子发射计算机断层成像（SPECT）。用1.4mm直径的针孔和120-140秒收集时间/视图（24次投射）实施所述SPECT收集（总共1小时）。对于¹¹¹In将能量窗口设定在245keV±15%和171 keV ±20%。注射四嗪3小时后用过剂量麻醉对所述小鼠实施安乐死。随后，用1.0mm直径的针孔和750秒收集时间/视图（32次投射）实施死后高分辨扫描。在每次SPECT进程之前实施CT扫描（2秒/投射，360次投射）以获得关于放射性分布的解剖信息。采集之后，用制造商的软件（InVivoScope 1.39, 补丁1）迭代进行数据重建。对于肿瘤、肝脏、肾脏和大腿肌肉，手工绘制感兴趣的区域（ROI）一式三份。将填充有已知量的¹¹¹In的模型用于校准用于组织放射性定量的扫描仪。

通过注射后直到3小时的活小鼠SPECT/CT成像（图12A/D；肿瘤对肌肉比 (T/M)=13.1）证实了所述¹¹¹In-四嗪的显著肿瘤摄入。在非靶组织中的有限摄入归因于与残留的循环CC49-TCO的反应。重要的是，在用未改性的CC49处理的小鼠中，不能从周围组织区分肿瘤（图12B/E，T/M=0.5）。由于所述探针通过尿道的快速排出，在血液和非靶器官中几乎没有保留放射性，说明了它的生物正交性。用经TCO改性的利妥昔单抗处理的小鼠（其缺乏对TAG72的特异性），显示出预料中的¹¹¹In四嗪在血液和非靶器官中的保留和大大降低的肿瘤积累（图12C/F）。

Claims

1.用于靶向的医学成像和/或治疗的试剂盒，其包含至少一种预靶向探针和至少一种效应物探针，其中所述预靶向探针包括主要靶向部分和第一生物正交反应性基团，和其中所述效应物探针包括效应物部分，例如标记物或药学活性化合物，和第二生物正交反应性基团，其中所述第一和第二生物正交反应性基团的任意一个是亲双烯体并且所述第一和第二生物正交反应性基团的另一个是二烯，其中所述亲双烯体是符合式（1）的8元张力环亲双烯体：

（1）

其中，每个R独立地代表H，或至多六次代表选自由以下组成的组的取代基：烷基、O-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、SO₂、NO₂、NR’R’’其中R’和R’’各自独立地是H或烷基、C(=O)O烷基、C(=O)O芳基、CONR’R’’其中R’和R’’各自独立地是H、芳基或烷基、OCO烷基、OCO芳基、NR’CO烷基其中R’是H或烷基、NR’CO芳基其中R’是或者烷基、NR’C(=O)O烷基其中R’是H或烷基、NR’C(=O)O芳基其中R’是H或烷基、OCONR’烷基其中R’是H或烷基、OCONR’芳基其中R’是H或烷基、NR’CONR’’烷基其中R’和R’’各自独立地是H或烷基，NR’CONR’’芳基其中R’和R’’各自独立地是H或烷基、NR’CSNR”烷基其中R’和R’’各自独立地是H或烷基和NR’CSNR”芳基其中R’和R’’各自独立地是H或烷基；其中至少一个R包含在，任选地通过间隔体，至所述预靶向探针或效应物探针的连接体部分中，其中X和Y各自独立地代表H或选自由以下组成的组的取代基：烷基、O-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、SO₂、NO₂和NRR’，其中R和R’各自独立地是H或烷基，或一起形成键；和其中选择所述二烯从而能够通过经历Diels-Alder环加成接着是逆Diels-Alder 反应与所述亲双烯体反应。

2.根据权利要求1的试剂盒，其中所述二烯选自由以下规定的式（2）、（3）、（4）、（5）和（6）的化合物组成的组：

（2）

其中R¹选自由烷基、芳基、O-烷基、C(=O)O-烷基、O-和NH₂组成的组；A和B各自独立地选自由烷基取代的碳、芳基取代的碳、氮、N⁺O^-、其中R是烷基的N⁺R组成的组，条件是A和B不都是碳；X选自由O、N-烷基和C=O组成的组，和Y是CR，其中R选自由H、烷基、芳基、C(=O)O烷基组成的组；

（3）

其中R¹和R²各自独立地选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃和NO₂组成的组；A选自由N-烷基、N-芳基、C=O和CN-烷基组成的组；B是O；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC（=O）O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组；

（4）

其中R¹和R²各自独立地选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃和NO₂组成的组；A选自由CO、C烷基-烷基、CN-烷基、N-烷基、和N-芳基组成的组；B是O；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组；

（5）

其中R¹和R²各自独立地选自由H、烷基、芳基、OH、C(=O)O-烷基、CF₃和NO₂组成的组；A选自由N、C-烷基、C-芳基和N⁺O^-组成的组；B是N；X选自由CH、C-烷基、C-芳基、CC(=O)O-烷基和N组成的组；Y选自由CH、C-烷基、C-芳基、N和N⁺O^-组成的组；

（6）

3.根据权利要求2的试剂盒，其中所述二烯满足式

（7）

其中R¹和R²各自独立地代表选自由以下组成的组的取代基：2-吡啶基、苯基或被一个或多个吸电子基团例如NO₂、CN、COOH、COOR、CONH₂、CONHR、CONR₂、CHO、COR、SO₂R、SO₂OR、NO和Ar取代的苯基，其中R是C₁-C₆烷基和Ar代表芳基，特别是苯基、吡啶基或萘基。

4.根据上述权利要求任意一项的试剂盒，其中所述预靶向探针包括抗体作为主要靶向部分。

5.根据上述权利要求任意一项的试剂盒，其中所述效应物探针包括作为效应物部分的可探测标记物，优选是用于成像体系的对比剂，选自由以下组成的组：可MRI-成像的试剂、自旋标记物、光学标记物、超声响应试剂、X射线响应试剂、放射性核素、FRET类染料、（生物）发光或荧光分子或标签、生物素、顺磁性成像试剂和超顺磁性成像试剂。

6.根据上述权利要求任意一项的试剂盒，其中所述效应物探针包括药学活性化合物作为效应物部分。

7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述药学活性化合物是选自由以下组成的组的同位素：²⁴Na、³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁷⁶As、⁷⁷As、⁸⁰Br、⁸²Br、⁸⁹Sr、⁹⁰Nb、⁹⁰Y、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹²¹Sn、¹²⁷Te、¹³¹I、¹⁴⁰La、¹⁴¹Ce、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁴⁴Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁹Tb、¹⁵¹Pm、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶¹Tb、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷²Tm、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹⁴Bi、²²³Ra、和²²⁵Ac。

8.预靶向试剂，其包含主要靶向部分和生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是说明书中规定的式（2）-（7）任意一个的二烯与权利要求1中规定的式（1）的亲双烯体之间[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

9.成像探针，其包含可探测的标记物，优选是选自由以下组成的组的同位素：³H、¹¹C、¹³N、¹⁵O、¹⁸F、¹⁹F、⁵¹Cr、⁵²Fe、⁵²Mn、⁵⁵Co、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Zn、⁶²Cu、⁶³Zn、⁶⁴Cu、⁶⁶Ga、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷⁰As、⁷¹As、⁷²As、⁷⁴As、⁷⁵Se、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、^8OBr、⁸²Br、⁸²Rb、⁸⁶Y、⁸⁸Y、⁸⁹Sr、⁸⁹Zr、⁹⁷Ru、⁹⁹Tc、¹¹⁰In、¹¹¹In、¹¹³In、¹¹⁴In、¹¹⁷Sn、¹²⁰I、¹²²Xe、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁷Tm、¹⁶⁹Yb、¹⁹³Pt、¹⁹⁵Pt、²⁰¹Tl和²⁰³Pb，和生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是说明书中规定的式（2）-（7）任意一个的二烯与权利要求1中规定的式（1）亲双烯体之间[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

10.治疗探针，其包含药学活性化合物，优选是选自由以下组成的组的同位素：²⁴Na、³²P、³³P、⁴⁷Sc、⁵⁹Fe、⁶⁷Cu、⁷⁶As、⁷⁷As、⁸⁰Br、⁸²Br、⁸⁹Sr、⁹⁰Nb、⁹⁰Y、¹⁰³Ru、¹⁰⁵Rh、¹⁰⁹Pd、¹¹¹Ag、¹²¹Sn、¹²⁷Te、¹³¹I、¹⁴⁰La、¹⁴¹Ce、¹⁴²Pr、¹⁴³Pr、¹⁴⁴Pr、¹⁴⁹Pm、¹⁴⁹Tb、¹⁵¹Pm、¹⁵³Sm、¹⁵⁹Gd、¹⁶¹Tb、¹⁶⁵Dy、¹⁶⁶Dy、¹⁶⁶Ho、¹⁶⁹Er、¹⁷²Tm、¹⁷⁵Yb、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁹⁸Au、¹⁹⁹Au、²¹¹At、²¹¹Bi、²¹²Bi、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹⁴Bi、²²³Ra和²²⁵Ac，以及生物正交反应性基团，其中所述生物正交反应性基团是权利要求2中规定的式（2）-（7）任意一个的二烯与权利要求1中规定的式（1）亲双烯体之间[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

11.预靶向方法，其包括向受试者给予根据权利要求8的预靶向试剂并使所述试剂在所述受试者的体系中循环有效完成所述主要靶向部分到主要靶的结合的一段时间，接着从身体清除未结合的试剂。

12.成像方法，其包括实施根据权利要求11的预靶向方法，接着给予根据权利要求9的成像探针，其中所述预靶向试剂中和所述成像探针中的所述生物正交反应性基团一起形成所述[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

13.受试者中的靶向的医学治疗方法，其包括实施根据权利要求11的预靶向方法，接着给予根据权利要求10的治疗探针，其中所述预靶向试剂中和所述治疗探针中的所述生物正交反应性基团一起形成所述[4+2]逆Diels-Alder反应的反应参与者。

14.根据权利要求10的试剂用于根据权利要求13到15任意一项的方法。

15.用于动物或人类中的预靶向方法的化合物，其符合式（1），

（1）

并优选选自由式（8）的化合物

（8）

和式（9）的化合物

（9）

组成的组，其中每个R独立地代表H，或至多六次代表选自由以下组成的组的取代基：烷基、O-烷基、S-烷基、F、Cl、Br、I、SO₂、NO₂、NR’R”其中R’和R” 各自独立地是H或烷基、C(=O)O烷基、C(=O)O芳基、CONR’R”其中R’和R” 各自独立地是H、芳基或烷基、OCO烷基、OCO芳基、NR’CO烷基其中R’是H或烷基、NR’CO芳基其中R’是或者烷基、 NR’C(=O)O烷基其中R’是H或烷基、NR’C(=O)O芳基其中R’是H或烷基、OCONR’烷基其中R’是H或烷基、OCONR’芳基其中R’是H或烷基、NR’CONR”烷基其中R’和R”各自独立地是H或烷基、NR’CONR”芳基其中R’和R”各自独立地是H或烷基、NR’CSNR”烷基其中R’和R”各自独立地是H或烷基和NR’CSNR”芳基其中R’和R”各自独立地是H或烷基。