CN102391974A - 一种产accd的植物内生细菌及其土壤修复菌剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种产ACCD的植物内生细菌及其土壤修复菌剂和应用。植物内生细菌Jp3-3，分类命名为Pantoea agglomerans Jp3-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月13日菌种保藏号为CCTCC NO：M 2011250。该细菌的ACCD酶活性最高可达402μM α-KB·h-1·mg-1；液体制剂含有有效活菌数为10亿个以上/毫升，固体制剂含有效活菌数2亿个以上/克。土壤修复菌剂直接施用可促进植物生长并吸收重金属，强化植物修复重金属污染土壤的效率。
Description
技术领域
本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种产ACCD的植物内生细菌及其土壤修复菌剂和应用。
背景技术
矿产资源开采和矿山开发引起的环境问题是全球普遍关注的问题，越来越受到人们的重视，主要由于其中镉、铅、锰、锌等重金属有毒元素向环境的释放。重金属污染土壤的植物修复技术因其成本低廉、环境友好而成为世界各国关注的热点，成为矿区环境恢复的最佳策略。但其在实施过程中也存在不少问题，如土壤重金属的生物有效性低，不利于植物对重金属的吸收和清除；超积累植物通常生长缓慢、生物量小等，这些缺点严重影响了植物修复的效率。如何促进超积累植物生长、提高重金属吸收是植物修复技术中的关键。
重金属污染等多种胁迫环境均能导致植物体内乙烯的大量积累，而内源乙烯的过量产生将导致植物根部生长发育受阻或死亡。高等植物体内乙烯的合成前体物质为ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)。研究发现，多种植物促生细菌可分泌ACC脱氨酶(ACCD)，将植物乙烯前体ACC分解成为α-丁酮酸和氨，这样可大大减少植物有害乙烯的产生，促进植物的生长发育。研究已证明接种ACCD产生细菌的植物会增大根部的长度及根密度。Belimov等首次报道了细菌ACCD活性与促进植物组织中Cd的积累量的增多呈正相关。Rajkumar和Freitas、Jiang等和Rodriguez等的研究都已表明产ACCD的菌株能够通过促进植物生长，来增强植物-微生物联合修复土壤重金属污染，在植物修复重金属污染土壤中具有应用潜力。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高产ACCD的植物内生细菌。
本发明的另一目的是提供由该高产ACCD的植物内生细菌制备的土壤修复菌剂。
本发明的又一目的是提供该细菌的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种高产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的植物内生细菌Jp3-3，分类命名为Pantoeaagglomerans Jp3-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月13日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2011250。Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)是从中国江西省某铜尾矿区生长的小飞蓬(Comnyza canadensis)茎中分离得到，经鉴定为Pantoea agglomerans。主要生物学特性为：G-，菌体为短杆状；乙酰甲基甲醇(V.P.)、柠檬酸盐、精氨酸脱羧酶反应阳性，淀粉水解、过氧化氢酶反应阴性；能在以ACC为唯一氮源的培养基上生长良好，ACCD酶活性最高达402μM α-KB h-1mg-1。LB培养基上生长良好，单个菌落圆形，边缘整齐，直径1～3mm，白色，不透明。
一种含有所述的保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株的生物修复制剂。
所述的生物修复制剂优选为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株有效活菌数为10亿个/毫升以上。
其中，所述的液体制剂是通过常规的液体深层发酵方法发酵Jp3-3菌株制备得到。
所述的生物修复制剂还可优选为固体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株有效活菌数为2亿个/克以上。
所述的固体制剂是使用草炭、蛭石或其他载体吸附保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株发酵液配制成颗粒剂或粉剂。
所述的保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株在土壤重金属污染的植物修复中的应用。
所述的含Jp3-3菌株的生物修复制剂在土壤重金属污染的植物修复中的应用。
一种所述的含Jp3-3菌株的生物修复制剂用于土壤重金属污染的植物修复方法：在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，每千克土壤接种108个细菌/mL的菌液10～20mL，分1-2次接种。
有益效果
本发明所述的植物内生细菌Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)能耐受多种重金属(Cu、Pb、Cd、Ni的最小抑制浓度分别为3.1、4.8、4.5、0.9mM)。
本发明所述的高产ACCD的植物内生细菌Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)及其强化植物土壤重金属污染修复的方法与现有技术相比有如下优点：
(1)本发明所述的Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)具有ACC脱氨酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase)活性，酶活性最高可达402μMα-KB·h-1·mg-1，在重金属污染土壤中定殖于植物体内的具ACC脱氨酶活性的内生细菌通过将乙烯的前体ACC转换为α-丁酮酸和氨，可以直接调控植物体内乙烯的含量，抑制乙烯的生物合成，促进植物生长；高产铁载体，有助于提高植物抗逆性(抗旱、抗涝、抗盐碱、抗病虫害)；该菌株能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达14mg·L-1；具有溶磷特性，有助于促进植物生长。
(2)利用本发明植物内生细菌Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)促进植物生长，提高植物提取修复效率。
(3)可以回收重金属，无二次污染。
生物样品保藏信息
高产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的植物内生细菌Jp3-3，分类命名为Pantoeaagglomerans Jp3-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是中国武汉武汉大学，保藏日期为2011年7月13日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2011250。
具体实施方式
实施例1
本发明中高产ACCD的植物内生细菌Jp3-3菌株是从中国江西省某铜尾矿区生长的小飞蓬(Comnyza canadensis)茎中分离纯化得到，分离方法如下：
先用自来水将小飞蓬茎表面清洗干净，然后用无菌水再清洗一遍，接着用75％乙醇浸泡消毒5min，无菌水冲洗后再浸入2.5％次氯酸钠溶液中消毒5min，无菌水冲洗数遍。将表面消毒的茎置于研钵内研磨至匀浆，取0.1ml匀浆液涂布于LB平板(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，水1000mL，琼脂20g，pH 7.0)，28℃培养3d，挑取单菌落在LB平板上划线纯化后保存。将菌株接种于LB培养液中，30℃摇床振荡培养18h，取1.0mL菌液于Eppendorf离心管中，10000rpm离心5min收集菌体，按常规方法提取细菌总DNA，PCR扩增细菌16SrDNA，扩增产物经测序后与GenBank中已知16S rDNA序列进行比对分析，与Pantoeaagglomerans的16S rDNA序列相似性达到99％，将其鉴定为这个种。
实施例2
将Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)划线接种于含不同重金属浓度的LB培养基，30℃培养3d，观察其能否生长及生长情况。结果见表1。Jp3-3菌株能耐受多种重金属(Cu、Pb、Cd、Ni的最小抑制浓度分别为3.1、4.8、4.5、0.9mM)。
表1菌株在含不同重金属浓度的LB培养基上的生长情况
上表中“+”表示生长良好，“-”表示不生长。
实施例3
将Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)接种于LB培养液中摇床振荡培养20h，4℃离心收集菌体，用SM培养液(葡萄糖1.0g，蔗糖1.0g，柠檬酸钠1.0g，苹果酸1.0g，甘露醇1.0g，醋酸钠1.0g，KH2PO40.4g，K2HPO42.0g，MgSO40.2g，CaCl20.1g，CuSO41mg，NiSO41mg，ZnSO45mg，FeSO45mg，MnSO43mg，CoSO41mg，Na2MoO41mg，H3BO32mg，生物素2(VB6)10mg，硫胺(VB1)2mg，氰钴维生素(VB12)0.1mg，泛酸(VB3)5mg，叶酸2mg，核黄素5mg，烟酸5mg，蒸馏水1000mL，pH 6.4。维生素过滤除菌后加入。)洗涤离心两次，菌体悬浮于SM培养液，并按5％(v/v)接种量接种于SMA培养液【在无菌的SM培养基中加入过滤除菌的ACC(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid deaminase)，使终浓度为3mM。】，28℃150rpm的条件下培养48h，以诱导产生ACC脱氨酶。
4℃离心收集菌体，用0.1mol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH值为7.6)洗涤离心两次，重悬浮于600μL 0.1mol·L-1Tris-HCl缓冲液(pH值为8.5)中，加入30μL甲苯并迅速振荡30s以破碎细胞。取100μL含甲苯的细胞提取物于1.5mL离心管中，加入10μL0.5mol·L-1ACC混匀，30℃反应30min。加1.0mL 0.56mol·L-1HCl终止反应，14000rpm离心5min去除细胞碎片，吸取1mL上清液于7mL离心管中，加入0.15mL 0.1％的2，4-二硝基苯肼(溶于2mol·L-1HCl)，30℃反应15-30min。取出加1mL 2mol·L-1NaOH。以加1mL Tris-HCl缓冲液(pH值为8.5)进行同样反应为空白管调零，以1mL浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mM的α-丁酮酸为标准溶液，测定540nm波长下吸光值。菌体总蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。以1mL浓度为0、20、40、60、80和100mg·L-1的牛血清白蛋白为标准溶液，加5mL考马斯亮蓝G250染色液，反应5min后测定595nm波长下吸光值。ACC脱氨酶的活性以在测酶体系中每毫克蛋白每分钟形成的α-丁酮酸的量表示，单位为μmolα-丁酮酸.mg-1protein·min-1。Jp3-3菌株具有ACC脱氨酶活性，酶活性最高可达402μMα-KB·h-1·mg-1。
实施例4
根据王平等的方法测定铁载体。将Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)接种于LB液体培养基中，30℃150rpm振荡培养48h。发酵液12000rpm离心5min，取上清液与等体积CAS检测液充分混匀，显色1h后测定630nm波长处的吸光值(A)，以去离子水作对照调零。另以等体积无菌LB液体培养基与CAS检测液充分混匀的处理，同法测定吸光值即为参比值(Ar)。A/Ar值＜1，可被认为高产铁载体。结果表明Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)发酵液的A/Ar为0.5，高产铁载体。
实施例5
根据Gordon和Weber(1951)的测定方法，用试管分装LB液体培养基，每管4mL，121℃高温灭菌后加入过滤除菌的2.5mg mL-1色氨酸溶液1mL，使培养基中色氨酸的终浓度为0.5mg mL-1。将Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)接种于上述培养基中，30℃摇床振荡培养3d。发酵液于12000r min-1离心5min，取上清液1mL，加入10mM的正磷酸50μL，再加2mLSackowski′s显色剂，充分混合，黑暗下25℃显色30min，于530nm波长下测定吸光值。无菌培养基同上做相同的处理作为对照调零。以浓度为0、5、10、20、40、60mg L-1的IAA标准液同法作标准曲线，计算发酵液中IAA的浓度。结果表明Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)能产生吲哚乙酸，IAA最高产量可达14mg·L-1。
实施例6菌株Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)溶解磷酸三钙
将在LB培养基中培养18-24h所得的Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)种子液按5％(v/v)的接种量接种到磷酸钙培养基(葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，Ca3(PO4)25.0g，H2O 1000ml，pH 7.0-7.5，115℃灭菌30min)中，摇床150rpm·min-1培养96h后，发酵液离心后上清液测定pH值，同时用钼锑抗比色法测定磷含量。结果见表2。菌株Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)处理使得溶液中磷含量显著增加4倍，具有溶解磷酸钙的能力。
表2菌株溶解难溶性Ca3PO4的作用
| 菌株 | 发酵液中磷含量(mg L-1) | 发酵液pH值 |
| 不接菌 | 35.1 | 6.2 |
| Jp3-3 | 178.1 | 5.65 |
实施例7含有Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)的液体生物修复制剂
将LB固体培养基培养48h所得的Jp3-3(CCTCC NO：M 2011250)斜面菌种接种于有氮培养基(蔗糖10g，(NH4)2SO41g，KH2PO42g，MgSO40.5g，NaCl 0.1g，CaCO30.5g，酵母膏0.5g，水1000mL)中，培养18小时后接入种子罐。种子罐为0.5吨，种子罐培养基成分为蔗糖2.0kg，(NH4)2SO40.25kg，KH2PO40.7kg，MgSO40.17kg，NaCl 0.07kg，CaCO30.4kg，酵母膏0.2kg，水0.35吨。种子罐须先用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，接种量为体积比5％(以培养基体积为基准)，种子罐培养温度控制在28-32℃，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1∶0.8，培养20小时后将种子液全部接入生产罐。生产罐为7吨，培养基成分为蔗糖8kg，淀粉18kg，(NH4)2SO44.5kg，KH2PO49.0kg，MgSO42.3kg，NaCl 0.9kg，CaCO34.5kg，酵母膏0.9kg，水4吨。生产罐预先用蒸汽灭菌并冷却至28-30℃，培养温度控制在28-32℃，搅拌速度为250转/分，无菌空气通入量为1∶0.8。培养结束后培养液中菌体数量达到10亿/ml以上。培养液即可灌装为生物修复制剂。
实施例8含有Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)的固体生物修复制剂(粉剂)
将实施例4所得的培养液用草炭吸附，培养液与草炭之比为1∶3.5(L∶Kg)，搅拌混合、粉碎，即得含有Jp3-3菌株(CCTCC NO：M 2011250)的粉剂。经检测，该固体生物修复制剂中Jp3-3菌株有效活菌数为2亿个/克以上。
实施例9重金属污染土壤中产ACC脱氨酶的植物内生细菌Jp3-3强化油菜吸收重金属铜
将重金属Cu污染的土壤分装，各1.5kg一盆。将油菜种子播种于重金属Cu污染土中，每盆播种6粒种子，出苗2周后间苗，留油菜苗4棵。每盆接种实施例7所得的以Jp3-3菌株为有效成分的生物修复菌剂10ml，穴施于油菜根处，覆土，对照接等量无菌水。待苗生长1月后，每盆再次接种实施例7所得的以Jp3-3菌株为有效成分的生物修复菌剂5ml，穴施，覆土。定期浇水、除草。3个月后收割，烘干至衡重，测定生物量及重金属情况。结果见表3。接菌处理的油菜地上部干重提高1.3倍，根部干重增加33％，菌株Jp3-3可以促进油菜地上部生长。与对照相比，接菌处理的油菜地上部和根部铜浓度分别增加56％和11％，地上部Cu积累量增加1.5倍，达到极显著水平。
表3重金属污染土壤中耐重金属的植物内生细菌Jp3-3强化油菜吸收重金属铜
Claims (9)
1.一种高产1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的植物内生细菌Jp3-3，分类命名为Pantoeaagglomerans Jp3-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2011年7月13日，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2011250。
2.一种含有权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株的生物修复制剂。
3.根据权利要求2所述的生物修复制剂，其特征在于该生物修复制剂为液体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株有效活菌数为10亿个/毫升以上。
4.根据权利要求3所述的生物修复制剂，其特征在于所述的液体制剂是通过常规的液体深层发酵方法发酵Jp3-3菌株制备得到。
5.根据权利要求2所述的生物修复制剂，其特征在于该生物修复制剂为固体制剂，其中含有保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株有效活菌数为2亿个/克以上。
6.根据权利要求5所述的生物修复制剂，其特征在于所述的固体制剂是使用草炭、蛭石或其他载体吸附保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株发酵液配制成颗粒剂或粉剂。
7.权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M 2011250的Jp3-3菌株在土壤重金属污染的植物修复中的应用。
8.权利要求2所述的含Jp3-3菌株的生物修复制剂在土壤重金属污染的植物修复中的应用。
9.一种权利要求2所述的含Jp3-3菌株的生物修复制剂用于土壤重金属污染的植物修复方法，其特征在于：在含重金属的湿润土壤中播种植物种子，接种Jp3-3菌株生物修复制剂，每千克土壤接种108个细菌/mL的生物修复制剂10～20mL，分1-2次接种。
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| Date | Code | Title | Description |
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| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130410 Termination date: 20211124 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |