发明内容
本发明的目的之一是提供一种化合物菊苣酸及其新的制备方法。
本发明的另一个目的是提供该化合物菊苣酸的用途,包括在制备治疗脑梗塞疾病药物,尤其是急性脑缺血的药物的用途;在测定抱茎苦荬菜有效成分含量中的用途和在测定苦碟子注射液有效成分含量中的用途。
本发明所述的化合物是菊苣酸,为白色针状结晶。结构式为:
本发明所述化合物的提取分离方法为:
取抱茎苦荬菜药材,加水煎煮两次,合并煎煮液,浓缩至每1ml相当于原生药1.0g,在搅拌下加20%氢氧化钙乳调节pH值至12,放置8小时,离心,离心沉淀物称重,悬浮于6.3倍量95%乙醇中,使含醇量达90%,加20%硫酸溶液调节pH值至2.9,充分搅拌使反应完全,离心,上清液加20%氢氧化钠溶液中和pH值至8.0,过滤,滤液回收乙醇,加1.0倍量乙醚脱脂两次,水液经过大孔树脂D101处理,收集水洗液,调节pH值至2.5,再用石油醚(30-60℃)萃取3次,合并萃取液,减压(50℃)挥干溶剂,得到粗酚酸提取物,干法上聚酰胺柱,以15:5(ml/ml)的乙醇一冰醋酸溶液洗脱,应用TLC法监测,截取第二组分,挥干溶剂,残渣经甲醇处理,应用1500×200mm大型高压制备柱,以乙腈0.4%磷酸溶液(ml/ml)(16:84)为流动相,进行分离制备,得无色针状结晶。经HPLC分析,证明纯度均在98.0%以上。
该无色针状结晶可溶于甲醇,易溶于甲醇一水混合溶剂,三氯化铁反应呈阳性,且1.0%水溶液酸性较强,pH值3.0,提示为酚酸类化合物。
薄层色谱检查: 取上述无色针状结晶适量,加甲醇制成每1m1含0.2mg的溶液,作为供试品溶液。照薄层色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥB)试验,吸取上述供试品溶液5μl,点于硅胶G预制板,以氯仿-甲醇-甲酸(7:3:1)为展开剂,展开, 晾干,置紫外光灯(365nm)下检视,供试品色谱中,应呈单一的蓝色荧光斑点,表明本品为单一化合物。
结构鉴定方法:
1、仪器和材料
红外光谱用岛津FTIR一8400型傅立叶红外转换分光光度计;紫外吸收光谱用岛津UV-2550紫外分光光度计;质谱用IonSpec HiResESI型质谱仪测定,采用正离子检测;核磁共振Bruker AV600型核磁共振仪测定;薄层层析及柱层析硅胶均为青岛海洋化工厂产品,溶剂和显色剂均为分析纯。
2、结构鉴定
化合物为白色针状结晶,可溶于甲醇、水,三氯化铁反应呈阳性,水溶液酸性较强,提示可能为酚酸类化合物。
紫外光谱分析:样品的紫外光谱图,在219.50,244.50,327.50处分别显于最大吸收峰,与菊苣酸的紫外图谱基本一致,进一步确认该化合物为菊苣酸。
高分辨质谱:样品的高分辨质谱,[M-1]峰473可知该化合物分子量为474,经检索分子式应为C22H18O12,与菊苣酸分子式相同。
红外吸收光谱检测
IR(KBr)λcm-1:3600~3050(OH),1745,1718(C=O),1609,1508为苯环吸收。
核磁共振测定
结果见表1。
表1 菊苣酸的NMR测定数据(DMSO)
位置 |
H1-NMR |
C13-NMR |
1 |
|
126.1 |
2 |
7.12 |
111.2 |
3 |
|
144.5 |
4 |
|
147.4 |
5 |
6.82 |
116.3 |
6 |
7.15 |
122.2 |
7 |
6.33 |
146.6 |
8 |
7.62 |
114.8 |
9 |
5.64 |
166.2 |
10 |
|
71.7 |
-COOH |
13.52 |
167.5 |
经UV、IR、MS、NMR和TLC鉴别证明该化合物为菊苣酸。
菊苣酸对照品系可从苦碟子注射液中分离出来,纯度可达98%以上。菊苣酸在苦碟子注射液中含量相对较高,故选其为定量质控指标,采用高效液相色谱法测定其含量,方法简便,重现性好,且灵敏度高,专属性强。具体方法如下:
1、仪器与试药
仪器:岛津SHIMADZU-2010AHT 液相色谱仪及工作站。
试剂:乙腈为色谱纯,其它试剂为分析纯。
菊苣酸(北京恒元启天化工技术研究所,纯度:98%以上,批号:20100302)
2、色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈 - 0.5%磷酸溶液(15:85)为流动相;检测波长为327nm。理论塔板数按菊苣酸峰计算应不低于4000。
3、对照品溶液和供试品溶液的制备
3.1对照品溶液的制备 精密称取菊苣酸对照品适量,加甲醇制成每1ml含0.05mg的溶液,即得,必要时可以超声5min。
3.2供试品溶液的制备 取本品适量,用0.45μl滤膜滤过,即得。
4、方法学考察
4.1色谱条件的考察
色谱柱的选择:曾选用ZORBAX Eclipse XDB-C18 (4.6×250mm,5μm)、Diamonsil C18(4.6×250mm,5μm),Kromasil- C18 (4.6×250mm,5μm)三种色谱柱,菊苣酸均可达到基线分离,以第一根色谱柱柱效最高。
检测波长的选择
取菊苣酸对照品溶液于200~400nm波长范围内进行紫外扫描,结果菊苣酸在219nm,244nm,327 nm波长处有最大吸收,以在327nm下,供试品色谱中杂质峰少,因此选定检测波长为327nm。
流动相筛选
分别试验了两种流动相系统,①乙腈-0.4%磷酸水溶液(ml/ml)(15:85);②乙腈(A)-0.4%磷酸溶液(B)(ml/ml), 梯度洗脱(0~40 min:10% A~31% A; 90% B~69%B)。两种方法均可以使本品中各成分达到基线分离,而流动相乙腈-0.5%磷酸溶液(15:85)对仪器要求较低,适用性更广,因此采用乙腈-0.5%磷酸溶液(15:85)为本试验中菊苣酸含量测定的流动相。
4.2标准曲线的制备
精密称取菊苣酸对照品10.08mg,置10ml棕色量瓶中,加甲醇溶解并定量稀释至刻度,摇匀,精密吸取1ml,置10ml棕色量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,制成每1ml含菊苣酸0.1008mg的溶液。分别精密吸取上述溶液(0.1008mg/ml)2、6、10、14、18 μl注入液相色谱仪中,测定色谱峰面积,测定结果见表2.
表2 菊苣酸对照品线性范围考察结果
对照品进样体积( μl ) |
2.0 |
6.0 |
10.0 |
14.0 |
18.0 |
对照品进样量( μ g ) |
0.2016 |
0.6048 |
1.008 |
1.4112 |
1.8144 |
色谱峰面积 |
905825 |
2760505 |
4576684 |
6505573 |
8243033.5 |
以菊苣酸对照品进样量为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,回归方程为: y = 4568324.65 x -6547.45,r=0.9999。
结论:菊苣酸对照品进样量在0.2016~1.8144μg范围内峰面积和进样量呈良好的线性关系,符合外标法定量测定的要求。
4.3精密度试验
精密吸取同一批号样品溶液10μl,按上述色谱条件,重复进样6次,测定色谱峰面积,测定结果见表3。
表3精密度试验结果
结果表明所用仪器具有良好的精密性
4.4稳定性试验
精密吸取同一批号样品溶液10μl,按上述色谱条件,每间隔2小时进样1次,测定色谱峰面积,测定结果见表4。
表4 稳定性试验结果
结果表明,菊苣酸色谱峰峰面积积分值基本一致,RSD为0.43%。说明供试品溶液中的菊苣酸在8小时内具有良好的稳定性。
4.5重复性试验
取同一批号样品,按正文方法操作,独立测定五次,测定结果见表5。
表5重复性试验结果
结果表明该方法重现性良好。
4.6回收率试验考察
取已知含量的样品5份,每份5ml,置10ml棕色量瓶中,精密加入菊苣酸对照品溶液(0.1008 mg/ml)4ml,用甲醇稀释至刻度,摇匀即得,制得供试品溶液,同法进行测定,计算回收率,测定结果见表6。
表6回收率试验结果
如上表所示,测得菊苣酸回收率在98.83~101.31%之间,RSD为1.40%,结果表明回收率较好,准确度较高。
5.样品测定结果及含量限度确定 依法测定本企业的的十批样品,按正文方法操作,在上述色谱条件下,用外标法测定,结果见下表7。
表7 样品含量测定结果
生产企业 |
批号 |
菊苣酸含量(mg/ml) |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110321 |
0.0654 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110330 |
0.0701 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110404 |
0.0682 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110411 |
0.0732 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110429 |
0.0674 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110509 |
0.0751 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110523 |
0.0743 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110602 |
0.0759 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110618 |
0.0746 |
沈阳双鼎制药有限公司 |
110720 |
0.0733 |
根据上述样品测定结果,暂定本品每1ml含菊苣酸0.020mg。
本发明所述的化合物还可以作为药材抱茎苦荬菜定量质控指标用于该药材的质控测定方法中。具体测定方法如下:
测定方法照高效液相色谱法(中国药典2010年版一部附录ⅥD)测定。
色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-O.5%磷酸溶液(15:85)为流动相a;检测波长为327nm。理论塔板数按菊苣酸峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备 精密称取菊苣酸对照品适量,加甲醇制成每1ml含菊苣酸0.2mg的溶液,摇匀,即得。(必要时超声5分钟)
供试品溶液的制备 取抱茎苦荬菜药材20g,粉碎,过40目筛,混匀,精密称取2g,加50%甲醇50ml,密塞,摇匀,称定重量,加热回流2h,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm滤过,即得。
测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
按照上述方法测定不同产地的药材,测定结果如下:
表8抱茎苦荬菜药材含量测定结果
批次 |
菊苣酸含量(mg/g) |
1 |
0.256 |
2 |
0.644 |
3 |
0.343 |
4 |
0.725 |
5 |
0.777 |
6 |
0.263 |
7 |
0.476 |
8 |
0.554 |
9 |
0.818 |
10 |
0.465 |
|
0.532 |
根据上述试验结果,暂定本品含菊苣酸不得低于O.10mg/g。
下列实验表明了本发明菊苣酸对脑梗塞的药理作用,选用相近似的动物模型或试验方法,对本发明药物用于预防和治疗脑梗塞作用进行研究,为其有效性做出科学的评价。
具体实施如下
1、试验药品与试剂:
⑴受试药物:菊苣酸(沈阳双鼎制药有限公司,纯度:98%以上),
⑵戊巴比妥钠(Serva进口分装,上海化学试剂采购供应站试剂厂)
⑶氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(2,3,5- Tiphenyl terazolium chloride,TTC,E Merck 进口分装,上海化学试剂分装厂),用PBS配置,避光低温保存;
⑷阳性对照药:尼莫地平(nimodipine)针剂(德国Bayer公司产品),甲醛为国产分析纯。
⑸谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)试剂盒,批号:20100515,南京建成生物制剂公司产品。
(6)丙二醛(MDA)试剂盒,批号:20100515,南京建成生物制剂公司产品。
(7)超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒,批号:20100515,南京建成生物制剂公司产品。
试验动物:SD大鼠200只,雌雄不拘,体重250-300g,由沈阳医学院动物研究所提供,
统计学处理:实验数据以均数±标准差(
±SD)表示,采用SPSSl3.0统计学软件处理数据,单因素方差分析(Oneway-ANOVA)进行显著性检验,P<0.05为有统计学意义。
、试验方法:
200只体重为250~300g SD大鼠按体质量、性别均衡分为2组,即预防组和治疗组,每组100只。
⑴预防组将动物按体质量、性别均衡分为5组,即正常对照组(不造模),模型对照组、阳性对照组(尼莫地平组)、菊苣酸低、高剂量组,每组20只。菊苣酸低剂量组0.5mg/kg,高剂量组2.0mg/kg,阳性对照组2.0mg/kg,模型对照组和正常对照组给予等体积的生理盐水,腹腔注射,每天1次,连续7天,其中每组10只大鼠第7天灌胃后1h进行MACO手术,缺血2h后,再灌注48h后进行血液生化学检查。其余每组10只在第7天灌胃后1h,行MCAO造模术,缺血2h后,再灌注48h行水迷宫、大鼠脑梗塞率、脑组织含水量实验。预防组大鼠在造模后24h进行神经功能缺损评价,用于观察菊苣酸对MCAO大鼠的预防作用。
⑵治疗组大鼠在造模清醒后lh即行神经功能缺损评分,符合标准的入选,并按体质量、性别均衡分为5组,即正常对照组(不造模),模型对照组、阳性对照组(尼莫地平组)、菊苣酸低、高剂量组,给药方法和剂量同预防组。其中每组10只第7天灌胃后1h进行缺血再灌注48h后进行血液生化学检查。其余各组第7天灌胃后1h进行缺血再灌注48h后进行水迷宫、大脑梗塞率、脑组织含水量实验,用于观察菊苣酸对MCAO大鼠的治疗作用。
造模方法:参照Zea-Longa法制作大脑中动脉阻塞(MCAO)模型:大鼠称重,腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液(1ml/kg)麻醉,仰卧固定于恒温手术台上,温度(37.0±0.5)℃。颈部皮肤用碘酒消毒后,作正中皮肤切口,游离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉,电灼颈内外动脉小分支或吻合支。将颈外动脉剪断,分别结扎,在颈外动脉残端距颈总动脉分支约3mm处剪一小口,插入尼龙线,同时将颈外动脉残端牵向外下方,使之与颈内动脉平行,拉直与颈内动脉的夹角,将尼龙线顺颈内动脉走向,轻柔缓慢推进(不可强推,以免穿通动脉壁),直到尼龙丝在动脉内稍遇阻力时即停止插入,此时线栓插入深度约18-20mm,与颈总动脉同时结扎以固定线栓。此时插入的线栓正好封闭大脑中动脉开口,阻断大脑中动脉的血流并缝合伤口,即为大脑中动脉梗死缺血模型。再灌注组从插入线栓开始记时至缺血2h,抽出栓子实行再灌注,即将栓线的线头抽至颈外动脉残端内,松开小动脉夹,恢复大脑中动脉的血流。术后切口缝合,涂以碘酒,并用青霉素抗炎,然后将大鼠单笼饲养。
大鼠神经功能缺损评分:大鼠清醒后,观察其行为学变化,评分标准:无神经损伤症状: 0分;不能完全伸展左侧前爪: 1分;爬行时向左侧转圈: 2分;行走时向左侧倾倒: 3分;不能自发行走,意识昏迷: 4分。以1~3分为入选标准。
、测定指标
1.水迷宫实验:
各组造模后48h进行水迷宫实验,具体操作如下: Morris水迷宫的组成包括直径120cm的圆形水池,水温保持(25±1℃),水池壁上标有东南西北四个入水点,由此将水池等分为四个象限,任选一个象限,正中放一平台。测试内容包括定位航行试验(place navigation test,PNT)和空间探索实验(spatial probetest,SPT)。
⑴定位航行试验:用于测试脑梗塞大鼠对水迷宫的学习能力。实验历时5d,第ld让大鼠自由游泳2min,以后每天分上、下午两段,每段训练4次,训练时将大鼠面向池壁分别从4个不同入水点放入,记录其在2min内找到平台的时间(逃避潜伏期,escape latency,EL)和游泳路径。如果大鼠在2min中内未找到平台,潜伏期记为120s,并将其引至平台上,停留lOs后再放回笼中。
⑵空间探索实验:用于测试大鼠学会寻找平台后对平台位置空间位置记忆能力,即在第6d的第5次训练时撤出平台,然后任选一个入水点将大鼠面向池壁放入水中,记录2分钟内大鼠穿越站台位点的次数即穿越次数和游泳轨迹。
2.脑梗塞面积的测定:
⑴TTC染色及脑梗塞体积的测定:TTC染色原理:氯化-2,3,5-三苯基四氮唑(2,3,5-Tiphenyl terazolium chloride,TTC)有还原型和氧化型两种状态,还原型呈红色,氧化型呈无色。正常脑组织内含有还原型尼克酰胺腺苷二核苷酸(NADPH),能将无色的氧化型TTC还原成红色还原型的TTC。脑缺血后,梗死区域的神经细胞缺血坏死,NAPH丧失,不能将TTC还原,该区域脑组织呈灰白色,而正常脑组织内NADPH还存在,将氧化型TTC还原为还原型,该区域呈现红色,从而可区分梗死区和正常区。
⑵TTC染色方法:各组大鼠脑缺血恢复再灌注7d后,断头取脑,去除嗅球、小脑和低位脑干,称取大脑湿重,-20℃冷冻10min,冠状切面,切成5~6片。脑片置于2%TTC液中,37℃染色20min,10%甲醛固定,24h后拍照,应用医用计算机彩色图像分析系统测定,以梗死组织重量占大脑重量的百分比作为大鼠脑梗塞率。
3.脑组织含水量的测定:将染色后的脑组织置于105℃烘箱中24h干燥至恒重。烘干后称重,对照大脑湿重求出脑含水量如下:
4.血液生化学检查
从预防组和治疗组提出的100只脑梗塞模型鼠分别于缺血再灌注48h后,腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液(1ml/kg)麻醉。背位固定于大鼠手术台上,开胸暴露心脏,从左心室抽取血液4ml,置于预备好的生化管内,放入离心机,以2000r/s转速离心10min,取上清液。按试剂盒的说明书方法,测定SOD、GSH-PX、MDA指标数据。
(1)血清中SOD活力的测定
测定原理:采用黄嘌呤氧化酶法测定,通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O2 -),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,在550nm处有最大吸收峰,可用可见光分光光度计测定其吸光度。
测定方法:将收集好的样本,按照试剂盒的操作步骤进行,而后蒸馏水调零,于分光光度计550nm处测定其吸光度值。根据血清SOD活力计算公式计算SOD活力。
(2)血清中GSH-PX活力的测定
测定原理:GSH-PX可以促进H202与还原型谷胱甘肽 (GSH)反应生成氧化型(GSSG),GSH-PX活力可用其酶促反应的速度来表示,测定此酶促反应中GSH的消耗,即可求出酶的活力。而GSH量的测定是根据GSH和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现叫稳定的黄色,在412nm处测其吸光度即可计算出GSH的量。
测定方法:将收集好的样本,按照试剂盒的操作步骤进行,而后蒸馏水调零,于分光光度计412nm处测定其吸光度值。根据血清GSH-PX活力计算公式计算GSH-PX活力。
(3)血清中MDA含量的测定
测定原理:采用硫代巴比妥酸(Thibabituric Acid,TBA)法测定。过氧化脂质降解产物中的MDA可与TBA缩合,形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰,可用可见光分光光度计测定其吸光度。
测定方法:将收集好的样本,按照试剂盒的操作步骤进行,而后蒸馏水调零,于分光光度计532nm处测定其吸光度值。根据血清MDA含量计算公式计算MDA含量。
、实验结果
4.1菊苣酸对预防组MCAO大鼠学习记忆功能的预防效果
表10 菊苣酸对预防组MCAO大鼠学习记忆功能的预防效果(
±SD)
#P<0.01 vs 正常组,▲P>0.05 vs 正常组,△P>0.05 vs 尼莫地平组,*P<0.05 vs 模型组,★P>0.05 vs 低剂量组
4.2 菊苣酸对治疗组MCAO大鼠学习记忆功能的治疗效果
表11 菊苣酸对治疗组MCAO大鼠学习记忆功能的治疗效果(
±SD)
#P<0.01 vs 正常组,▲P>0.05 vs 正常组,△P>0.05 vs 尼莫地平组,*P<0.05 vs模型组,★P>0.05 vs 低剂量组
4.3菊苣酸预防组MCAO大鼠神经功能缺损症状
表12 预防组MCAO大鼠神经功能缺损症状评分、脑梗塞率、脑水肿百分率(±SD)
组别 |
n |
神经功能缺损评分 |
脑塞梗率(%) |
脑组织含水量(%) |
正常组 |
10 |
0 |
0 |
76.22±0.78 |
模型组 |
8 |
3.58±0.31# |
15.28±0.84# |
81.06±0.65# |
尼莫地平组 |
9 |
0.88±0.50* |
13.77±0.77* |
79.14±0.9*3 |
低剂量组 |
9 |
1.22±0.67*△ |
14.63±0.92*△ |
80.75±0.70*△ |
高剂量组 |
10 |
0.79±0.53*△★ |
12.55±1.02*△★ |
78.58±1.02*△★ |
#P<0.01 vs 正常组,△P>0.05 vs 尼莫地平组,*P<0.05 vs 模型组,★P>0.05 vs 低剂量组。
4.4 菊苣酸治疗组MCAO大鼠神经功能缺损的研究结果
表13 菊苣酸治疗组MCAO大鼠神经功能缺损症状评分、脑梗塞率、脑水肿百分率(
±SD)
组别 |
n |
神经功能缺损评分 |
脑塞梗率(%) |
脑组织含水量(%) |
正常组 |
9 |
0 |
0 |
76.22±0.78 |
模型组 |
7 |
4.28±0.11# |
15.88±0.66# |
82.36±0.75# |
尼莫地平组 |
8 |
0.81±0.38* |
12.17±0.53* |
78.21±0.89* |
低剂量组 |
7 |
1.32±0.67*△ |
14.98±0.82*△ |
80.02±0.60*△ |
高剂量组 |
9 |
0.85±0.83*△★ |
13.55±0.95*△★ |
79.87±0.82*△★ |
#P<0.01 vs 正常组,△P>0.05 vs 尼莫地平组,*P<0.05 vs 模型组,★P>0.05 vs 低剂量组。
4.5 菊苣酸对预防组MCAO大鼠血液生化的影响
表14菊苣酸对预防组MCAO大鼠血液生化的影响(
±SD)
组别 |
n |
SOD |
GSH-PX |
MOD |
正常组 |
10 |
165.23±6.02 |
225.87±12.15 |
6.22±1.48 |
模型组 |
7 |
119.27±7.21# |
175.56±19.84# |
13.06±0.85# |
尼莫地平组 |
9 |
145.31±10.50*▲ |
197.11±20.77*▲ |
9.14±0.94*▲ |
低剂量组 |
8 |
151.61±8.67*▲△ |
209.32±18.92*▲△ |
9.75±0.70*▲△ |
高剂量组 |
9 |
146.05±11.53*▲△★ |
218.55±21.02*▲△★ |
9.08±0.74*▲△★ |
#P<0.01 vs 正常组,▲P>0.05 vs 正常组,△P>0.05 vs 尼莫地平组,*P<0.05 vs 模型组,★P>0.05 vs 低剂量组。
4.6 菊苣酸对治疗组MCAO大鼠血液生化的影响
表15 菊苣酸对治疗组MCAO大鼠血液生化的影响(±SD)
组别 |
n |
SOD |
GSH-PX |
MOD |
正常组 |
10 |
156.43±9.02 |
210.09±12.55 |
4.82±0.48 |
模型组 |
6 |
129.25±5.21# |
163.05±29.84# |
12.02±0.75# |
尼莫地平组 |
9 |
144.21±11.50*▲ |
189.19±21.77*▲ |
9.48±0.84*▲ |
低剂量组 |
8 |
146.71±10.67*▲△ |
192.23±12.92*▲△ |
9.78±0.88*▲△ |
高剂量组 |
9 |
143.86±13.53*▲△★ |
196.35±19.06*▲△★ |
9.16±0.94*▲△★ |
#P<0.01 vs 正常组,▲P>0.05 vs 正常组,△P>0.05 vs 尼莫地平组,*P<0.05 vs 模型组,★P>0.05 vs 低剂量组。
、实验结论
5.1 在水迷宫实验中, (1)MCAO模型组大鼠于术后48h进行的5d水迷宫实验结果与正常对照组的比较,P<O.01,说明MCAO线栓法造模是成功的,同时也证实MCAO模型可引起大鼠空间学习记忆和探索障碍。(2)菊苣酸预防组和治疗组与模型组比较,定位航行潜伏期缩短,穿越平台次数增多,提示菊苣酸组MCAO大鼠在学习记忆方面好于模型组大鼠(P<O.05),说明菊苣酸在预防和治疗方面的有效性,能够改善MCAO大鼠的学习记忆能力。 (3)菊苣酸实验组和尼莫地平组与正常组比较,P>O.05,说明菊苣酸对MCAO大鼠的干预作用可使其认知功能恢复到正常水平。(4)菊苣酸高、低剂量组比较,P>O.05,无统计学意义,效应未随剂量的增加而出现线性增强。综上可以看出,菊苣酸能改善MCAO大鼠胆碱能神经系统的功能、从而改善MCAO大鼠的认知功能,说明菊苣酸对MCAO大鼠的学习记忆损伤有较好的预防和治疗作用。
5.2 菊苣酸对MCAO大鼠脑梗塞率及脑组织含水量的影响,文献报道MCAO大鼠可造成局部的脑缺血,即局灶性脑梗塞。临床脑梗塞大都发生在大脑半球的一些区域,大脑中动脉是临床上脑缺血及脑梗塞的易患部位,所以MCAO模型在脑血管病的研究中占有极其重要的地位。(1)MCAO脑缺血模型组在造模后出现明显神经症状改变,即Horner征、对侧前肢的瘫痪、向对侧倾倒、认知障碍等,且损伤侧脑均出现明显的脑梗塞灶,与正常组比较,P<O.01,有明显统计学意义。(2)菊苣酸高、低剂量组比较,P>0.05,无统计学意义,即菊苣酸在本实验中未发现有剂量-疗效关系。⑶菊苣酸实验组和尼莫地平组可明显缩小MCAO大鼠缺血后脑梗塞范围及脑组织含水量,改善神经缺损症状,与模型组比较,P<O.05,统计学有差异,表明菊苣酸对大鼠脑缺血有良好的保护和治疗作用。
5.3 菊苣酸对MCA0大鼠抗氧化能力的影响,目前对缺血性脑卒中神经元损伤的机制进行了深入的研究,大多数学者认为自由基的生成增加是脑缺血损伤的主要发病机制之一,同样,国外研究也认为自由基诱导的脂质过氧化损伤是脑缺血时脑损伤的主要机制,大量实验室研究资料已证实自由基是造成脑缺血组织损伤的原因之一。
SOD是需氧生物体内一种含有不同金属离子的酶蛋白,其主要作用是清除体内具有毒性的氧自由基。脑缺血缺氧可导致自由基的产生,而清除氧自由基需消耗大量SOD,使SOD活性降低,因此,SOD活性的高低间接反映脑缺血脑细胞的损害程度,也反映机体清除氧自由基的能力。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)是机体内广泛存在的一种含硒抗氧化酶,它可以非酶促反应的形式直接与氧自由基结合,达到清除氧自由基的目的,也可作为GSH-PX催化反应中的底物,起到清除氧自由基的作用。MDA是氧自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化作用的终产物,其含量可直接反映机体内脂质过氧化程度,并间接反映氧自由基对细胞的损伤程度。因此,测定血液中这些物质的活性或含量变化可反映药物抗脑缺血损伤作用的强弱。
5.4 从实验结果表明,菊苣酸能够降低血清中MDA的含量,增强血清SOD和GSH-PX的活力。从这一点可以看出,菊苣酸具有抗脑缺血损伤的作用,对局灶性脑缺血具有保护作用。
综上,通过本实验对菊苣酸在MCAO大鼠认知、脑梗塞率、脑组织含水量、神经功能损伤症状、血液生化几方面的研究证实,菊苣酸对MCAO大鼠有一定的预防和治疗作用。