CN102389424B - 异烟肼在制备预防或治疗肺癌、结肠癌的药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明申请是200610113436.7的分案申请。本发明公开了式(I)所示的异烟肼作为组蛋白去乙酰酶抑制剂的新用途，异烟肼用于制备预防和/或治疗与组蛋白去乙酰酶相关的多种疾病的药物。

Description

异烟肼在制备预防或治疗肺癌、结肠癌的药物的应用

本发明专利申请是分案申请。原案的申请号事200610113436.7，申请日是2006年09月28日，发明名称是：异烟肼作为组蛋白去乙酰酶抑制剂的应用。

背景技术

本发明涉及异烟肼作为组蛋白去乙酰酶抑制剂的新用途，异烟肼用于制备预防和/或治疗与组蛋白去乙酰酶相关的多种疾病的药物。

背景技术

组蛋白是与基因组DNA共同构成染色质的基本物质。组蛋白在细胞核内形成八聚体，染色体DNA双螺旋分子反复缠绕其上，构成染色质。染色质缠绕紧密程度的改变，是相关基因表达开放与关闭的调节机制之一。组蛋白乙酰化水平的调控，是这种调节机制的一个基础。组蛋白氨基末端数个赖氨酸残基乙酰化时，其正电荷被中和，与负电荷的DNA静电引力减少，染色质处于松解状态，使转录因子可以接近基因组DNA，基因转录呈活跃状态。组蛋白去乙酰酶催化赖氨酸残基去乙酰化，染色质处于紧密状态，使基因转录受到抑制。

抑癌基因的失活，是肿瘤发生发展的重要因素。组蛋白去乙酰酶能够抑制抑癌基因的转录表达，而组蛋白去乙酰酶抑制剂则可恢复受抑制的抑癌基因的转录表达。一些组蛋白去乙酰酶抑制剂，在体外和体内有明确的抗肿瘤活性，而通常毒性较小；临床实验也证实了它们的药理作用(Kelly WK，O′Connor OA，Marks PA.Histone deacetylaseinhibitors：from target to clinical trials.Expert Opin Investig Drugs2002；11：1695-1713)。组蛋白去乙酰酶抑制剂作为一类新的抗肿瘤药物，具有高效、低毒、广谱的特点。以组蛋白去乙酰酶抑制剂为基础的肿瘤药物治疗，被称为“肿瘤转录治疗”。

近来发现，组蛋白去乙酰酶抑制剂的抗肿瘤作用，可发生在多个环节。一些转录因子如p53、E2F、c-Myb等和一些结构蛋白如微管蛋白，也是乙酰化调节的底物(Sterner DE，Berger SL.Acetylation ofHistones and Transcription-Related Factors.Microbiol Mol Biol Rev2000；64：435-459)，组蛋白去乙酰酶抑制剂促进它们的乙酰化，对其功能有直接的影响。组蛋白去乙酰酶抑制剂对热休克蛋白HSP90、EGF受体的活性和表达也有直接影响(Fuino L，Bali P，Wittmann S，et al.Histone deacetylase inhibitor LAQ824 down-regulates Her-2 and sensitizeshuman breast cancer cells to trastuzumab，taxotere，gemcitabine，andepothilone B.Mol Cancer Ther 2003；2：971-984)，它们是重要的已知抗肿瘤药物靶点。除对肿瘤细胞有直接的杀伤作用外，组蛋白去乙酰酶抑制剂还可抑制肿瘤组织的血管形成过程，从而抑制肿瘤的生长和转移。组蛋白去乙酰酶抑制剂的血管形成抑制作用可能与其对血管内皮生长因子的分泌(Sawa H，Murakami H，Ohshima Y，et al.Histone deacetylaseinhibitors such as sodium butyrate and trichostatin A inhibit vascularendothelial growth factor(VEGF)secretion from human glioblastoma cells.Brain Tumor Pathol 2002；19：77-81)和信号转导过程的抑制(DeroanneCF，Bonjean K，Servotte S，et al.Histone deacetylases inhibitors asanti-angiogenic agents altering vascular endothelial growth factor signaling.Oncogene 2002；21：427-436)有关。

此外，组蛋白去乙酰酶抑制剂还对其它多种疾病有治疗作用。HDACI对氧化应激引起的神经变性有明显的保护作用(Ryu H，Lee J，Olofsson BA，et al.Histone deacetylase inhibitors prevent oxidativeneuronal death independent of expanded polyglutamine repeats via anSp1-dependent pathway.PNAS 2003；100：4281-4286)；Huntington氏病和脊髓性肌萎缩的动物模型中，组蛋白去乙酰酶抑制剂可以明显改善动物的功能损害(Hockly E，Richon VM，Woodman B，et al.Suberoylanilidehydroxamic acid，a histone deacetylase inhibitor，ameliorates motor deficitsin a mouse model of Huntington′s disease.PNAS 2003；100：2041-2046；Minamiyama M，Katsuno M，Adachi H，et al.Sodium butyrate amelioratesphenotypic expression in a transgenic mouse model of spinal and bulbarmuscular atrophy.Hum Mol Genet 2004；13：1183-1192)。组蛋白去乙酰酶抑制剂还可减小脑缺血引起的脑组织损害，缩小脑梗塞面积(Ren M，Leng Y，Jeong M，et al.Valproic acid reduces brain damage induced bytransient focal cerebral ischemia in rats：potential roles of histonedeacetylase inhibition and heat shock protein induction.J Neurochem2004；89：1358-1367)。组蛋白去乙酰酶抑制剂对多种细胞因子有调节作用，小鼠服用组蛋白去乙酰酶抑制剂，可抑制脂多糖诱导的炎性介质如TNF-α、IL-1-β、IL-6和IFN-γ的产生，并可减少注射ConA引起的肝细胞损伤(Leoni F，Zaliani A，Bertolini G，et al.The antitumor histonedeacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid exhibitsantiinflammatory properties via suppression of cytokines.Proc Natl AcadSci USA 2002；99：2995-3000)。组蛋白去乙酰酶抑制剂还可抑制CD4型T细胞的增殖，并完全抑制激活T细胞的聚集，其作用环节与环胞霉素不同，可作为新型的免疫抑制剂治疗自身免疫性疾病和组织器官移植的免疫排斥反应(Skov S，Rieneck K，Bovin LF，et al.Histonedeacetylase inhibitors：a new class of immunosuppressors targeting a novelsignal pathway essential for CD154 expression.Blood2003；101：1430-1438)。在骨髓移植动物模型中，组蛋白去乙酰酶抑制剂对供体抗肿瘤活性没有影响，而抑制供体抗宿主的排斥反应(Reddy P，Maeda Y，Hotary K，et al.Histone deacetylase inhibitor suberoylanilidehydroxamic acid reduces acute graft-versus-host disease and preservesgraft-versus-leukemia effect.Proc Natl Acad Sci USA2004；101：3921-3926)。在系统性红斑狼疮小鼠模型中，HDACI对病鼠脾细胞一些细胞因子如IL-12、IFN-、IL-6和IL-10的表达有明显的抑制作用，并降低小鼠的蛋白尿水平，减小脾重，改善肾小球肾炎等器官损害(Mishra N，Reilly CM，Brown DR，et al.Histone deacetylaseinhibitors modulate renal disease in the MRL-lpr/lpr mouse.J Clin Invest2003；111：539-552)。组蛋白去乙酰酶抑制剂对病理性心肌肥厚有抑制作用，并改善心肌肥厚引起的心力衰竭(Kook H，Lepore JJ，Gitler AD，et al.Cardiac hypertrophy and histone deacetylase-dependent transcriptionalrepression mediated by the atypical homeodomain protein Hop.J ClinInvest 2003；112：863-871)。体外实验发现，组蛋白去乙酰酶抑制剂可促进胰岛素的合成分泌(Mosley AL，Ozcan S.Glucose regulates insulingene transcription by hyperacetylation of histone h4.J Biol Chem2003；278：19660-19666)，提高肌肉细胞对葡萄糖的摄取(Takigawa-Imamura H，Sekine T，Murata M，et al.Stimulation of glucoseuptake in muscle cells by prolonged treatment with scriptide，a histonedeacetylase inhibitor.Biosci Biotechnol Biochem 2003；67：1499-1506)。组蛋白去乙酰酶抑制剂可诱导胎儿血红蛋白的合成，用于治疗贫血性疾病如地中海贫血、镰刀细胞病(Cao H.Pharmacological induction of fetalhemoglobin synthesis using histone deacetylase inhibitors.Hematology2004；9：223-233)。组蛋白去乙酰酶抑制剂也可抑制脂肪形成过程(Lagace DC，Nachtigal MW.Inhibition of histone deacetylase activity byvalproic acid blocks adipogenesis.J Biol Chem 2004；279：18851-18860)，促进骨骼肌细胞的损伤修复和再生(Iezzi S，Di Padova M，Serra C，et al.Deacetylase inhibitors increase muscle cell size by promoting myoblastrecruitment and fusion through induction of follistatin.Dev Cell2004；6：673-684)；还可抑制小鼠的精子形成，引起雄性小鼠可逆性不育(Fenic I，Sonnack V，Failing K，et al.In vivo effects of histone-deacetylaseinhibitor trichostatin-a on murine spermatogenesis.J Androl2004；25：811-818)。

组蛋白去乙酰酶抑制剂的酶抑制作用不限于哺乳细胞，组蛋白去乙酰酶抑制剂还有明显的抗原虫、抗真菌和抗病毒作用(Meinke PT，Liberator P.Histone deacetylase：a target for antiproliferative andantiprotozoal agents.Curr Med Chem 2001；8：211-235)。

综上所述，组蛋白去乙酰化酶在调节基因转录中起重要作用，组蛋白去乙酰化酶抑制剂介导组蛋白乙酰化并影响基因表达。因而，对于异常基因表达所致的多种疾病，组蛋白去乙酰化酶抑制剂是一种有效的治疗和预防药物。

异烟肼的化学结构.

现有技术中异烟肼的作用

异烟肼是公认的一线抗结核药，其作用强，疗效好，价格低廉，服用方便，口服吸收快、安全。异烟肼对分枝杆菌，主要是生长繁殖期的细菌有效，对其他细菌几乎无作用。其作用机理尚未阐明，可能与抑制敏感细菌结核环脂酸的合成而使细胞壁破裂有关。临床上，异烟肼主要作为治疗和预防结核的药物。有时，异烟肼还用于卡介苗免疫治疗浅表膀胱癌以降低卡介苗的毒副作用(Al Khalifa M，Elfving P，Mansson W，et al.The effect of isoniazid on BCG-induced toxicity inpatients with superficial bladder cancer.Eur Urol 2000；37 Suppl 1：26-30)。实验研究发现，异烟肼对机体免疫功能有一定影响，如抑制补体成分的活性(Sim E，Gill EW，Sim RB.Drugs that induce systemic lupuserythematosus inhibit complement component C4.Lancet1984；2：422-424)，调节外周血单核细胞增殖活性(Kucharz EJ.Studies onimmunomodulatory properties of isoniazid.Influence of isoniazid onresponsiveness of peripheral blood mononuclear cells to interleukin-2.CentEur J Public Health 1995；3：65-66)。美国专利4,082,846发现，异烟肼局部用药可治疗银屑病。一些个案报道发现，异烟肼能有效治疗皮肤慢性湿疹(Kubota Y，Kiryu H，Nakayama J.Generalized lichen nitidussuccessfully treated with an antituberculous agent.Br J Dermatol2002；146：1081-1083)，下肢红斑结节性皮损(李秉煦，蔡剑锋，林孝华.下肢红斑结节性皮损与结核关系的探讨.中国皮肤性病学杂志16：165-167)，IgA肾病(De Siati L，Paroli M，Ferri C，et al.ImmunoglobulinA nephropathy complicating pulmonary tuberculosis.Ann Diagn Pathol1999；3：300-303)和黑热病(Peters W，Lainson R，Shaw JJ，et al.Potentiating action of rifampicin and isoniazid against Leishmaniamexicana amazonensis.Lancet 1981；1：1122-1124)。这些作用或归结为异烟肼的抗结核作用，或机制不明。

发明内容

本发明的目的是提供一种新结构的组蛋白去乙酰酶抑制剂，即异烟肼，换而言之，异烟肼在制备组蛋白去乙酰酶抑制剂中的应用。

本发明的优点是发现了异烟肼在体外和体内均具有抑制组蛋白去乙酰酶活性、促进组蛋白乙酰化的作用。作为一个新结构的组蛋白去乙酰酶抑制剂，异烟肼可用于制备治疗多种疾病的药物。此项发明的包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂药剂组分，能作为药物治疗和预防由不正常的基因表达所致的疾病，例如炎症、糖尿病、糖尿病并发症、纯合子型地中海贫血、纤维化、肝硬化、急性粒细胞白血病(APL)、原虫感染或类似疾病。而且，它也是很有用的抗肿瘤药和免疫抑制剂，能抑制和预防下述的器官移植排斥和自身免疫性疾病。

移植器官或组织，例如心脏、肾、肝、骨髓、皮肤、角膜、肺、胰腺、小肠、手足、肌肉、神经、椎间盘、气管、成肌细胞、软骨等等所产生的排斥反应，骨髓移植后产生的移植物对宿主的反应，自身免疫性疾病例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本氏甲状腺炎、多发性硬化症、重症肌无力、I型糖尿病等；病原微生物(烟曲霉、尖孢镰刀菌、星样毛藓菌等)所致的感染。

此外，组蛋白去乙酰化酶抑制剂的药剂制备能有效治疗和预防以下疾病。

1)炎性或过度增生性皮肤病或者免疫学介导的皮肤表现(例如银屑病、特征性皮炎、接触性皮炎、湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、扁平苔藓、类天庖疮、大庖性类天庖疮、大庖性表皮松解症、荨麻疹、血管神经性水肿、血管炎、红斑、皮肤嗜酸性粒细胞增多症、红斑狼疮、痤疮、斑秃)；其它皮肤病例如皮肌炎、白斑病vulgaris、光过敏和皮肤T细胞淋巴瘤；

2)眼睛的自身免疫性疾病(例如角膜结膜炎、春季角膜炎、与白赛氏病相关的色素层炎、角膜炎、疱疹性角膜炎、锥形角膜炎、锥形上皮营养障碍、巩膜炎、Graves’眼病、干燥性角结膜炎、小水庖、虹膜睫状体炎、类肉瘤病、内分泌眼病等)；其它眼部疾病(例如白内障、铁贮积病，视网膜炎、色素瘤，老年斑、玻璃体结瘢、角膜碱烧伤；

3)可逆性气道性阻塞病-哮喘(例如慢性哮喘、过敏性哮喘、内源性哮喘、粉尘性哮喘)，尤其是慢性或顽固性哮喘(例如晚期哮喘和气道高度过敏)，过敏等；其它呼吸疾病例如良性淋巴肉芽肿病、肺纤维症和特发性间质肺炎；

4)黏膜或血管炎症(例如胃溃疡、缺血性或血栓性血管损伤、局部缺血性疾病、肠炎、坏死性小肠结肠炎、与热灼伤有关的肠损伤、白三烯B4介导的疾病)；

5)肠的炎症/变态反应(例如腹部疾病、直肠炎、嗜酸细胞性胃肠炎、肥大细胞增生、局限性肠炎和溃疡性结肠炎)；通过非胃肠症状表现出的食物相关的变态反应疾病(例如偏头痛、鼻炎和湿疹)；其它胃肠的疾病例如内毒素休克、假性膜结肠炎、药物或辐射介导的结肠炎；

6)肾疾病(例如间质性肾炎、肾出血综合征、溶血性尿毒性综合征和糖尿病肾病)；其它肾疾病如局部缺血的急性肾机能不全、慢性肾衰；

7)神经疾病(例如多发性肌炎、Guilain-Barre综和征、Meniere’s病、多发性神经炎、单体神经炎、脑梗塞、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、神经根病)；

8)脑缺血病(例如，脑损伤、脑内出血(例如，蜘蛛膜下腔出血、脑内出血)，脑血栓形成、脑栓塞、心脏停搏、休克、短暂性脑缺血发作(TIA)和高血压性脑病)；

9)内分泌疾病(例如甲状腺功能亢进、巴西多氏病(甲状腺突出)、高铁血红素疾病(例如纯红细胞再生障碍、再生障碍性贫血、再生不良性贫血、特发性血小板减少性紫癜、自体免疫性溶血性贫血、粒细胞缺乏症、恶性贫血、巨幼细胞贫血、anerythroplasia)；

10)骨疾病(例如骨质疏松症)；

11)其它疾病如环境疾病(例如动脉硬化、主动脉炎综合征结节性多动脉炎和[非炎性]心肌病)；胶原蛋白疾病(例如硬皮病、Wegener肉芽肿、Sjogren综合征)；肥胖症；嗜酸细胞性胃炎；牙周疾病(例如牙龈、牙周组织、牙槽骨、牙本质的损伤)；肾炎综合征(例如肾小球肾炎)；男性脱发、老年性脱发；肌营养不良；脓皮病和Sezary综合征；染色体异常相关性疾病(唐氏综合征)；Addison’s疾病；活性氧介导的疾病[例如与保存、移植或缺血性疾病(例如血栓形成、心脏梗塞等)相关的器官损伤(例如心脏、肝、肾、消化道等器官的局部缺血的循环紊乱等)；血管成形术后的冠状动脉再狭窄和术后粘连的预防；自身免疫性疾病和炎症(例如原发的黏膜水肿、自身免疫性萎缩性胃炎、更年期提前、男性不育、少年糖尿病；寻常性天疱疮、类天疱疮、交感性眼炎、晶状体诱发的色素层炎、特发性白细胞减少症、活动性慢性肝炎、特发性肝硬化、盘状红斑狼疮、自身免疫性睾丸炎、动脉炎(例如动脉炎变形)，或多软骨炎；人类免疫缺陷性(HIV)病毒感染，AIDS；变应性结膜炎；创伤、烧伤或手术所致的肥大的瘢痕和瘢痕瘤。

此外，此发明的制剂组分对于治疗和预防肝病[例如免疫源性疾病(例如免疫自发性肝病、原发性胆汁性肝硬化或硬化性胆管炎等慢性免疫自发性肝病)、部分肝切除、急性肝坏死(例如毒素、病毒性肝炎、休克或缺氧所致坏死)、A型肝炎、非A非B性肝炎、肝硬化和肝衰竭(例如爆发性肝炎、迟发性肝炎和″acute-on-chronic″肝衰竭(慢性肝病导致的急性衰竭))]。

此项发明的制剂组分可用制剂制备的形式，例如以组蛋白去乙酰化酶抑制剂为活性成分与一种有机或无机载体或赋形剂相混合制备得的固体、半固体或者溶液形式，以体外、肠道、胃肠道以外形式给药。

活性成分可以是混合的，例如，加常用的无毒，制剂可用的载体做成片剂、颗粒剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、悬浮液、注射剂、软膏、擦剂、滴眼液、凝胶、乳膏以及其他可用的形式。

载体可以用水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯树胶、明胶、D-甘露醇、淀粉糊剂、谷物糊剂、角蛋白、胶体硅、马铃薯糊剂、尿素和其他适于生产制备的载体，在固体、半固体或液体形式下，使药物稳定、变厚、可溶、着色，也可以用香料。

此组分应用于人时，推荐用静脉、肌内、局部或口服给药。组蛋白去乙酰化酶抑制剂的的治疗效应剂量依赖于病人年龄和状况而调整。

优选的给药剂量随临床适应症的不同而不同。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。每单位剂量中化合物的有效量取决于体重、生理状况和所选的给药方案等。单位剂量的化合物是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。

用于实施本发明的化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。

对于任何特定患者，具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的疾病、疾病严重程度、所用具体剂型的活性、给药途径、该具体剂型的清除速度、治疗持续时间、与该具体剂型联合或同时使用的具体药物、患者的年龄、体重、性别、饮食和一般健康状况等医药科学领域众所周知的因素。剂量水平通常为约1-20mg/kg/天，优选为约2-5mg/kg/天。

附图说明

图1.异烟肼对组蛋白去乙酰酶活性抑制作用的量效曲线。

图2.异烟肼对体外培养的结肠癌细胞HCT-8组蛋白H4组分乙酰化的影响。

图3.异烟肼对在体小鼠脾细胞组蛋白H4组分乙酰化的影响。

图4.Lewis肺癌小鼠肺转移灶计数比较(各数据点为每只小鼠肺转移灶计数)。

具体实施方式

下述实施例具体显示本发明的应用。但本实施例不限定本发明的使用范围。

实施例1：异烟肼对组蛋白去乙酰酶的抑制作用

组蛋白去乙酰酶活性测定方法参照文献(Heltweg B，Jung M.Amicroplate reader-based nonisotopic histone deacetylase activity assay.Anal Biochem 2002；302：175-183)并作了部分改变。

组蛋白去乙酰酶粗制剂的制备：取健康昆明种小鼠肝脏，剪碎，加PBS在100目筛网上研磨过滤，得到的细胞悬液离心后用PBS清洗2次，细胞沉淀加等体积PBS，振荡混匀，冻融法裂解细胞，离心(4℃，12000rpm，10min)，吸取上清，加入甘油至终体积为30％，蛋白浓度为5mg/ml。-20℃冷冻保存。

以PBS为缓冲液的100μl反应体系中，加入反应成分的终浓度分别为：MAL 20μmol/L，酶粗制剂30％，Triton 0.1％。反应中含异烟肼1，3.2，10，32，100mmol/L，并设置不含异烟肼样品和不加酶样品两个对照。加入样品后于37℃水浴中反应。反应均作4个重复。24小时后，每个样品加入100μl 1mol/L HCl终止反应，用220μl乙酸乙酯抽提酸化样品，有机相真空蒸发，用40％甲醇溶解残留固体，移入96孔荧光检测板。在荧光检测仪(SpectraMax GeminiXS，Molecular Devices)上检测荧光：激发波长325nm，发射波长390nm。

抑制率计算：以不加酶样品对照的荧光抑制为100％抑制率，不含异烟肼样品为阴性对照(抑制率为0)，计算各样品不同浓度的抑制率。

研究表明，异烟肼在1-100mmol/L浓度时，对组蛋白去乙酰酶活性有剂量依赖性的抑制作用(图1.所示)。计算异烟肼对组蛋白去乙酰酶抑制作用的IC50为44mmol/L。

实施例2：异烟肼对培养细胞组蛋白乙酰化的影响

细胞培养和药物处理：体外培养的结肠癌细胞HCT-8接种于含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液的90mm培养皿中，置于37℃，5％CO₂孵箱中培养。24小时细胞生长至对数生长期后，加入异烟肼至终浓度为100mM，继续培养16小时。

组蛋白提取：按文献(Yoshida，M.，Kijima，M.，Akita，M.，Beppu，T.(1990)J.Biol.Chem.265，17174-17179)方法提取细胞组蛋白。细胞孵育结束后，弃去培养液，用细胞刮刀刮下细胞，移入Eppendorf管，4℃1500转/分离心5分钟收集细胞，经含5mmol/L丁酸钠的冰冷PBS洗涤2次，加入100μl细胞裂解液(1xPBS，5mmol/L丁酸钠，0.5％TritonX-100，5mM PMSF，0.2％NaN3)，4℃裂解细胞10分钟。4℃2000转/分离心8分钟收集细胞核，经冰冷裂解液洗涤2次，加入100μl 0.3NHCl，振荡混匀，冰浴1小时。4℃12000转/分离心10分钟，收取上清液，加入1ml丙酮，混匀置-20℃过夜。次日，4℃12000转/分离心10分钟，丙酮洗涤沉淀，用0.3N HCl溶解组蛋白，测定蛋白浓度。

组蛋白电泳：按文献(Sourlingas T.G.；Tsapali D.S.；Kaldis A.D.；Sekeri-Pataryas K.E.Eur J Cell Biol 2001.80，726-732)方法制备酸性尿素Triton(AUT)凝胶，取40-50ug组蛋白电泳以分离组蛋白H4的乙酰化和非乙酰化组分，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，并作光密度扫描。

结果表明，异烟肼在100mmol/L浓度时，对培养细胞组蛋白的乙酰化有促进作用(图2.所示)。

实施例3：.异烟肼对整体小鼠脾细胞组蛋白乙酰化的影响

健康昆明种小鼠，腹腔注射异烟肼100mg/kg或等体积PBS。4小时后，颈椎脱臼处死。取小鼠脾脏，剪碎，加PBS在100目筛网上研磨过滤，得到的细胞悬液离心后经含5mmol/L丁酸钠的冰冷PBS清洗2次，加入500μl细胞裂解液(1xPBS，5mmol/L丁酸钠，0.5％Triton X-100，5mM PMSF，0.2％NaN3)，4℃裂解细胞10分钟。4℃2000转/分离心8分钟收集细胞核，经冰冷裂解液洗涤2次，加入100μl 0.3N HCl，振荡混匀，冰浴1小时。4℃12000转/分离心10分钟，收取上清液，加入1ml丙酮，混匀置-20℃过夜。次日，4℃12000转/分离心10分钟，丙酮洗涤沉淀，用0.3N HCl溶解组蛋白，测定蛋白浓度。-20℃冷冻保存。取40-50ug组蛋白AUT电泳，以分离组蛋白H4的乙酰化和非乙酰化组分，凝胶用考马斯亮蓝R-250染色，并作光密度扫描。

结果表明，腹腔注射异烟肼100mg/kg，对小鼠脾脏组蛋白的乙酰化有促进作用(图3.所示)。

实施例4：对小鼠Lewis肺癌肺转移的抑制作用：

荷Lewis肺癌的C57BL/6小鼠，颈椎脱臼处死。固定后碘酒酒精消毒，无菌条件下取出瘤块，研磨、匀浆，得到的细胞悬液离心后用PBS清洗2次，细胞沉淀以PBS 1/10稀释，给每只C57BL/6雌性小鼠腋下接种0.15ml瘤液。将动物随机分组。于接种24小时后腹腔注射异烟肼100mg/kg/天(15只)或PBS对照(16只)，每周给药5天。4周后，两组小鼠均有5只在接种部位产生肿瘤。颈椎脱臼处死，称取小鼠瘤重、体重。如表1所示，腹腔注射异烟肼100mg/kg/天对小鼠体重和肿瘤生长无明显影响。小鼠肺用Bouin’s液固定，在解剖显微镜下计数转移灶数目。如图4所示，异烟肼在此剂量时明显降低小鼠肿瘤的肺转移发生率(Fisher′s准确检验，p＜0.05)。

表1.Lewis肺癌小鼠体重与瘤重比较(平均数±标准差，n＝5)。

	体重	瘤重
			异烟肼	22.8±1.5	6.3±2.5
对照	23.4±1.9	6.5±3.2

Claims (1)

1.异烟肼在制备预防或治疗肺癌的药物的应用。

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